4 *

i

- R A P P O R T Ai\TNUEL I 9 6 7 - M. NEIFFR3N -------...-

Au cours de l'année des progrès sensibles ont ét6 réalis& dans les recher- ches sur la pourritv-co brune des cabosses du cacaoyer et la mise au point de l'antibio- tique isolé des feuilles de Prunus Lusitmica.

I

----------Uy_-

LI étude des antifongiques présents dans les feuilles des végétaux supérieurs

permet d'ores et déjà de les répartir en quelques groupes d'après la position systéma- tique de la plante source,

. *

*

Le stage effectué au Laboratoire par deux chercheurs vénézuéliens nous a

donné 1 occasion d' échanges de vue intéressants sur des problèmes phytopathologiques

concernant le cacaoyes.

Rappelons que ces travaux ont pour but de rassembler des données susceptibles

de permettre 1' obtention de matériel rSsistant et qu' une collaboration Qtroite S I est établie entre l'Institut FranGais du Café et du Cacaoyer et le Laboratoire.

Comme l'année précédente k e séance de travail a réuni les chercheurs de ces

deux organismes en présence de Mmsieur le Président du Comité Teclmique de Phytopa- thols@.e et de Zcoldgie Appliquée et de Monsieur le Directeur Gnéral de 1' I.F.C.C.

Monsieur TARJOT a fait le point des recherches qu'il conduit en Côte d'Ivoire. I1 inocule désormais concuremment les cabosses détachées et en place. Cette technique doit lui permettre de détecter plus sQrement des caractères de résistance ou de toié- rance. I1 s'agit l a en effet d'un problème majeur : dès que nous disposerons d'un in- dice de résistance les recherches devraient progresser rapidement.

2

Bous avons, Mademoiselle TANGUY et moi-m8me, exposé les résultats de nos travaux qui ont fait l'objet d'une note à l'Académie des Sciences, d'un article dms

la revue "Café, Cacao, Thétt qui sont préseiltés en annexe et dont-nous donnons ici un résumé .

Un certain nombre de substances phénuliques de 1'Qpicarpe de cabssses tri-

nitario et amelonado ont été caractérisées et purifiées. L'action de ces substances SIX Phytophtora palmivora a été étudiBe. La plupart présentent un pouvoir f ongistatique . Nous donnons pour les plus intéressantes d'entre elles la concentration minimale inhi- bitrice de la croissance de ce champignon et de Pestalozzia coffeicola utilisé dans les essais de routine pour la recherche de substances antifongiques. I1 est ainsi pos- sible dl en évaluer 1l intérêt. Les esters des acides férulique et c) oumarique présentelit une' C.M.1. remarquable.

--------c.----

-------u---c---U--

On peut concevoir que ces composés qui slaccmulent dans les tissus en réac-

tioz? à l'invasion du parasite jouent un6r61e dans les mQcanismes de défense de la plante

h9te I1 au seuil d'inhibition de la croissance du champignon. Ceci est possible si on admet avec TOMY1fj.l'l.A et ses collaborateurs (1) qu'ils migrent de la cellule saine vers la cel-

lule infectée. Ces auteurs estiment en effet que si la migration se fait d'une couche de cellules voisines la concentration augmente cinq fois et vingt fois si deux couches de cellules sont impliquées. Nous avons noté qu'une accumulation se produisait globa- lement d a s la zone marginale. Ce processus a dont lieu et notre hy-pothèse parait ac- ceptable e

reste & démontrer qu' ils atteignent les concentrations supérieures ou égales

Nonsieur et Nadame REYES, chercheurs v6nézuéliens7 ont effectd. dn stage au

Laboratoire en septembre et octobre. Ils étudient une grave maladie du cacacyer dite "de la unchette" provoquée par Ceratocystis fimbriata. hk collaboration avec Mademoi- selle TANGUY ils ont caractérisé et purifié des substances phénoliques des feuilles et tiges de cacaoyers résistants et sensibles, sains et inoculés.

-----------I-----

Une substance qui sLaccumule en réaction à l'infection, dans le cas du maté-

riel résistant, l'ester acide gentisique-glucose s'est rdvélée fongistatique.

( I ) TOIVLYIAMA K., SAIW R., SkKulvlA T., ISHIZKKII N, - The role of polyphenols in the de- i______--___-_ - - - ~ - - - - - - - - -_ - - - - - -

fense reaction in plants induced by infection, in Procceedings of a conference held at GAKAGORI, Japan, 1 5-21 mai 1 966.

3

Cette convergence de r6sultats obtenus pour une même plante hôte avec des parasites ayant une position systématique éloignée, agissant sur des organes différents, constitue une 'indication encourtgeante.

Par ailleurs nous avons étudié avec ces chercheurs les activités pectinoly-

tiques et cellulolytiques de deux souches de Ceratocystis fimbriata, l'une isolée de criollo, l'autre de trinitario. Les deux souches possèdent une polyga lacturonase très active et une cellulase peu active. La première présente en outre une activité de pee- tinsméthylestérase intéressante.

-----I----IuI--̂ -----

Yamille des liliacées. - De nombreux représentants de cette famille retien- ------u-------------

nent l'attention. On trouve en effet dans différents organes des substances ayant un pouvoir antofongique élevé. I1 s f agit essentiellement de saponines et de composés phé-

noliques. Chez une même espèce les deux types de substances coexistent parfois et, dans un cas, un phénomène de synergie a pu &re noté.

L'étude des composés phénoliques de ce groupe est 8n cours. Pour une espèce Polygonatum multiflorum, le seeax de Salomon, une saponine a été extraite. Ce travail a fait l'objet d'mie note qui est donnée en annexe. Des saponines antifongiques ont pu être isolées d'autres espèces, Ainsi à partir de l'extrait mkthanolique de feuilles de fragon, Ruscus acculeatus Yucca aloifolia, des saponines voisines de celle du seeau de Salomon par chromatographie sur papier.

---Yu~I-----.y---

de muguet, Convallaria mialis et de Yuque à feuilles d'aloGs, ---I- ...I----.----- f

ont ég6 purifiées --------------

Peu de temps après la rédaction du précédent rapport la substance active a 6 t b obtenue par distillation. Un distillat très ccnceiitré a été remis 'a Monsieur le Dmteur DROUHET de l'Institut Pasteur. Celui-ci a procédé à des essais in vitro

----Y--

.t- - *,

4

qui ont donné les résultats attendus. Par cqntrc: les essais de traitement de la teigne du cobaye n'ont pas reprohuit les guérisons obtenues précédemment avec une préparation

de "corps jaune" dissous dans l'huile minérale. On sait que le "corps jaune" contient autre la substance phénolique un caxtbnoïde (cf rapport 1966)

11 a pu Qtre démontré que le carotènoïde ne joue aucun rôle in ---u-- vitro. Des es-

sais qui porteront sur son action Qventuelle in I------ vivo et SUT la nature de l'excipient vont être entrepris B l'Institut Pasteur.

Sur *e sujet, une note en collaboration avec le Docteur DKOUHET est en prd-

parat i on

Nous traiterons successivement les points suivants :

1 O ) Distillation-Influence de l'hydrolyse préalable 2 O ) Ciaractérisation de la substance active

3.) Mise au point 8une néthode de "dosage" 4O) Recherches sur la nature de l'excipient.

1 O ) Distillation ------v--

La concentration sous vide des extraits aqueux s'accompagnait d'une baisse re- lative des seuils d'activité. De plus l'odeur caractéristique de la substance se re-

trouvait dans le ballon récepteur. Ceci nous a conduit à essayer l'entrainement à la

vapeur.

Un dispositif classique a été utilisé : un g6nérateu.r de vapeur est relié au récipient contenant 1' extrait aqueux. Les vapeurs sont entrainées, condensées sur les parois d'un réfrig6rant et recueillies. La liqueur obtenue est active à des consentra-

tions sensiblement égales 2 celles de l'extrait aqueux.

Dans une seconde serie d'essais on a procede par distillation fractionnée.

Les distillats se sont révélés plus actifs que l'extrait aqueux et en définitive, la méthode suivante a été retenue.

I '

5

Le matériel sec r i d u i t en poudre e s t mélangé Qnergiqueient avec de l ' e a u

dans l a proportion de 20 5; de poids f r a i s , s o i t 8

macération on d i s t i l l e sans f i l t r e r . Le d ispos i t i f suivant e s t u t i l i s é : un ballon

surmonté d'un tube & pointes de VIGF3UX e s t relié par un coude à un ré f r igérant dro i t .

Les vapeurs sont r ecue i l l i e s clans ui récipient plon& dans un bac d'eau glacde a f i n

d ' & i t e r les pertes au maximum.

de poids sec. Après 48 heures de

Par des d i s t i l l a t i o n s successives e t en recue i l lan t la m o i t i 6 du volume

i n i t i a l on au$gmente l a teneur en substance act ive.

Bydrolyse préalable. - J3n procédant à une hydrolyse acide avant d i s t i l l a t i o n

l a teiieur eli substance act ive e s t doublée s ' i l s ' a g i t de inateriel f r a i s . Dans l e cas

du mat6riel sec l e gain e s t beaucoup moins marqué.

La techniqua de I-IERISSEY e t LAFOREST ( 1 ) e s t u t i l i s Q e : après macération le

mélange e s t maintenu 31130 au bain-marie bouillaiit sous r6frig6raiit après addition

d'acide sulfurique B raison de 1,5 YL.

Comparaison de l a substance act ive obtenue par d i s t i l l a t i o n h c e l l e qui e s t J ---------L-----I-P--_---llll-UI-l-.-..-----------------------------------------

séparée du llcorps jaune". --------------------__I__

!i p a r t i r du corps jaune deux taches avaient é t é a i se s en évidenee par chro-

matographie en couches minces en u t i l i s a n t comile solvant l e mélange &her sulfurique-

tr ichloréthylène 1/2 (V/V). El les avaient pour Rf respectivement O, 56 e t 0,92. Aprhs

é lut ion e t contrôle bio1oP;ique il apparaissai t que la suhstaiice act ive se t rouvai t

dans l a bande ayant pour l?.f O, 56.

En u t i l i s a n t l a même technique avec l e d i s t i l l a t on obtient -une tache de

meme R f e t de même couleur, On constate q u ' i l y a superposition complète en plaçant

comme "spot" de départ l e mélange d i s t i l l a t 'lcorps jaunett.

r

b

2O) Caractdrist:ttion de la substance ac t ive --------------------I__L_I__________

Bn préparant des chromatoplaques avec la substance act ive obtenue suivant

l ' m e QU l ' a u t r e méthode e t en u t i l i s a n t comme rgvélateur l e r6ac t i f de FOLIN-CIOCLLTEU

deux taches g i s - b l e u sont mises en Qvidence. LI une d' elle-nous 1' avms d i t - correspond

à l a substance an t i f oiiglque dont la nature phénoligue é t a i t a i n s i indiqu6e.

Au cours du stage qu 'e l le a effectué à l"Universit8 de Liverpool sous l a di-

rect ion de ivIonsiew l e Professeur HAPBOEWE, Nademoiselle TANGUY a é t a b l i l e spectre de

la substance act ive dam di f fé ren ts solvants. Eli l e comparnnt à ceux de phénols siinples:

eugknol, gayacol, mkta e t para-crésol e l l e a constaté que l a courbe de la substance

act ive e t c e l l e du p-cr6sol prgsentaieiit deux pics pour l e s memes longueurs d1 onde.

D'autre par t H3dISYEY e t LAFORk3ST ( 1 ) ont e x t r a i t en 1932 des f e u i l l e s de

Prunus lus i tan ica u n glucoside dont l e sucre e s t l e rutinose e t l 'aglycone WL dérivé

benziylé q u ' i l s --------..-------

ont i den t i f i é en 1934 au chavicol.

I1 s e r a i t intéressant de v é r i f i e r par spectrographie de masse s i la substance

que nous avons i so lée e s t identique B c e l l e qui a ét6 caractdrisée p r ces auteurs 'a l

, I l

, ce t t e épdque. i - -"A 1

3 O ) Nise au point d'une méthode de "dosage". -----------.----U_--_----------------.-

Des mesures spectrales ont é t é effectuées sur la substance purif ige e t sur des

d i s t i l l a t s

avec un spectropli2tomètre ui\JICkl?lI SP 500.

e t sans hydrolyse préelable d'une par t , SUT l e p-crésol d 'au t re pr t ,

La purif icat ion de l a substance a d té réa l i sée p a r t i r de dist i l lat ou d'ex-

trait éther de pétrole e t 1 'Q lu t ion f a i t e avec du chloroforme. Après concentration du

solvant l e rés idu e s t r ep r i s par l 'eau. C 'es t 8. p a r t i r de c e t t e solut ion que l e spectre

a 6 t h é t ab l i e

Dans tous l e s cas l e s pics se s i tuent effectivement dans l e s memes zones que

ceux du p-cr6sol (cf graphique no 1 ) . - - - - - - - - - - _ _ _ _ _ _ - - - - - _ - - +- ', - - - - -

I \

Graphique not

. - . - . a .

, , . -

I

1

1.40

_ .

. + i

. i'. . . . . - . . -. . - .., . . -... '.

. - . .

7

Longueur d' onde maximale

mf.l dans 1' eau

...................... p-Cr6SO1 219 e t 274

Disti l lat 1 .!.1.. 221 275

Distillat I après hydrolyse, * . 221 275

274

........... .... Eluat substance act ive (a) .... 222

Les %osages" des d i s t i l l a t s qui sont effectués couramment correspondent bien avec l e s

concentrations minimales inh ib i t r ices exprimées en milligrammes de poids frais de Eaté-

r i e l de départ par millilitrs de milieu, I1 e s t désormais a i sé de f i x e r des doses u t i l e s

pour l e s essa is biologiques o

Cuncentration des d i s t i l l a t s

Nous avoiis indiqué que par des d i s t i l l a t i o n s successives (DI D2, D3? D4) e t

en ne recuei l lant que l a moitié du volume i n i t i a l il Qta i t possible d'augmenter l a te-

neur en substame act ive (cf graphique no 2). La densit6 optique du pic pr incipal aug-

mente avec l a concentration e t par l à même avec l ' a c t i v i t é biologique. Toutefois B p a r t i r

de l a quatrième d i s t i l l a t i o n il y a saturat ion de l a solut ion,

L'estimation comparative avec l e p-cresol comme témoin donne l e s teneurs

suivantes :

DI 2.300 pg/ml D2 3.950 D3 7.200 I l

l?4 7.300 II

I I

Pour Dl l a concentration minimale inh ib i t r i ce s '6 tabl i . t 2ì 220 p g / m l pour la plupart des champignons f ilaillenteux o

'f

Graphiqu-e no2

225 -250

8

4O) Recherches portaiit sur l a nT'tu2.e de 1' excipient. 1---------111-------_-1-------11------------------

Les guérisons de teigne provoquée sur animaux obtenues avec l e llcorps jaune!'

n' ont pas

d i s t i l l a t o Le "corps jaune" comprenant la substance act ive e t -m.c:troGnoTde é t a i t dis-

sous dans l ' h u i l e de vaseline. Les résu l ta tx de divers essa is ont montré que l e c a n -

tènoxde ne joue aucun rô l e i n v i t r o , I1 doi t e t r e vé r i f i é prochainement s ' i l en e s t de

meme i n vivo. En solution dans 1' ether de pétrole son spectre d'absorption e s t vois in

de ce lu i du carotène dans l e même solvant (cf graphique no 3 ) o Le carotènoïde lipo-

soluble peut e t r e l e véhicule naturel de l a substance pliéiiolique e t Q t r e nécessaire à

son a c t i v i t é dans l e s t i s sus aiinaux eiivahis par l e chxnpignoii,

reprodu.ites en u t i l i s a n t la seule substance ph&iolique que c o n t i m t l e

-.-,e-----

---I---

Nature de l ' h u i l e à u t i l i s e r comme excipient,

Le d i s t i l l a t e s t mélangé en tube 'a diverses hui les : hui le d 'o l ive , d'arachide,

de palme, de colza, de r i c i n , de l i n e t à deux hui les mingrales de v iscos i té différente .

Le mglalige e s t agi t6 à i n t e rva l l e régul ier sur un "automatic-mixer" pendan% une jouriiie.

On l a i s s e reposer une nui t . L 'ac t iv i té antifonTique e s t recherchée dans l e s deux pliases

aprhs décantation. El le lie se retrouve que dans l e s hui les minérales. Les hui les vé&-

t a l e s doivent donc $ t r e QcartBes.

Etant donné l'importance que présentent l e s mycoses viscérales - mycoses

pulmonaires notamment - e t l e peu de moyens thérapeutiques dont on dispose, l'admiiiis-

t ra t iol i par voie interne e s t envisagQe. Des so lu t i s de chlorure de sodium à 0,9 $ e t

10 $, glucos8s ou non, ont i t 6 prQpar6s. Ils sont a c t i f s i i i v i t ro , Le pH du d i s t i l l a t

02, l e plus employé e s t de 3, I . Amen6 à 5,5 par addition de c i t r a t e de sodium normal

il conserve int6g:ralemant son ac t iv i t é . Des essa is de traitemen t de mycoses internes

provoquées vont Q t r e tentés aTlec ces préparations.

-----"..--

Nous nous proposoiik enfin de rechercher dans d6s plantes plus courantes que

Prunus Lusituiica l a substance act ive ou un composé proche qui permettrait une synthèse

p a r t i e l l e , Des indications intéressantes o n t g j a é t6 r ecue i l l i e s sur ce point. -----I--------

Graphique n03

absorption

A partir des feuilles et de tiges aériennes de Polyp.onatum ---,1------------- multiflorum 1111.

(liliacée) , a été isolée une saponine présentant des propriétés f ongistatiques

La recherche de substances antifongiques dans la série végétale (1) a permis

de constater qu'un extrait de plantes appartenant à la famille des liliacées présentait une action foiigistatique remarquable,

NZTHODES . Des extractions successives ont 6% faites avec divers solvants, B patir

de feuilles et de tiges aériennes de Polygonatum miLtiflorum All. séchées B llair, à

température ambiante, puis réduites en poudre. _-_--------*-u

Le pouvoir inhibiteur est vérifié à chaque stade de purification sur la crois- sance d'une l%lanconnGe, le Pestalozzia coffeicola Av. Sacca, soit en milieu liquide soit en milieu solide.

-----------------u

Dans le premier cas, le milieu nutritif est versé dans le tube après évapo- ration sous vide du solvant. Dans le second cas, l'évaporafion s'effectue en présence de poudre de cellulose pour faciliter la répartition dans le milieu gSilos6 maintenu à

50° C. i

Des extraits obtenus avec l'eau, le méthanol, lléthanol 70°, l'éthanol 95' et le trichloréthylène 3n-b présente une action "cif ongique les extraits préparés 3 partir dléther de pétrole, d'éther éthylique, d'acétone et d'acétate d'éthyle ont été sans ac- tion sur la croissance du champignon.

D'autre part, des extractions directes et la comparaison des concentrations m i -

nimales dtinhibition nous ont conduit à choisir le méthanol et à préciser m e méthode d'ex- traction. L'extrait méthanolique, concentré à sec, est repris par du dthanol 50 $ et lavé avec de l'éther de pétrole. Après une nouvelle concentration sous vide, l'extrait est repris, soit par le m&thanol, soit par l'eau pour effectuer les contrôles clvomatogaphiques et bio:

logiques.

DETEWIIHATION ET CiLRACTERISATIOi\T DE LA SUBSTANCE ACTIfJ3 I )

Par chromatographie ascendante sur papier, 8. une dimension, neuf bandes ont 6th séparées en utilisant comme solvant la phase supérieure du mélange butanol, acic?e acétique/

eau, 4/1/5. Les bandes ont 6th délimitées en lumière ultra-violette.

Le contrôle biologique a mis en Qvidence une action fongistatique pour l 'élm%

méthanolique de la bande no 7 , dont le Rf est voisin de 0,20.

Des chromatographies à deux dimensions ont été réalisées sur cet extrait, dans le but de caractériser la substance active. Le même type de papier a été utilisé ainsi que le m%me solvant pour la première dimension et l'acide acétique 10 $ pour la seconde.

Les chromatoqammes examinés en lumière ultra violette -tdsentaient des taches

dont la fluorescence pouvait laisser supposer la présence de composés phénoliques. Les ré- actifs suivants ont alors été utilisés : chlorure d'aluminium, borohydrure de sodium, "fast blue salt BB" (sels diazotés) , carbonate de sodium, trichlorure d' antimoine dans le chloroforme.

Le chlorure d'aluminium a révélé la présence de trois taches, doiit deux, de colo-

ration jaune visible et jaune-vert en lumière ultra-violette, correspondent à des flavono-

sides, dont la rutine ; et une tache brun jaune ayant un Rî voisin de 0,20 dans le sens du solvant butanol/acide acétique/eau, et de 0,91 dans le sens acide acétique.

Ces trois taches ont été gluées par du méthanol. Un contrôle biologique a montré que la substance active correspondait à la troisième tache, l e s flavonosides étant sans action.

Après les cornposés phénoliques, notre attention est portée sur les saponines,

substances qui se rencontrent fréquemment chez les liliacées.

3

Effectivement l'extrait actif a réagi positive ment avec la p-diméthy- laminobenxaldéhyde : coloration rose dans le visible et en lunlihre ultra-violette Elle réagit aussi avec; l'anisaldéhyde, l'aldéhyde cinnamique, la vanilline chlorhy- drique et le trichlorure d'antimoine (2).

Cette sanonine se caractérise en outre par le p-aminoéthyldiphényl-borPte, appelé aussi "réactif A pour produits naturels" ( 3 ) , et borohydrure de sodium, Elle

n' est pas hémolytique ; son indice de mousse est de 200.

La croissance du champignon témoin Pestalozeia coffeicola Av, Sacca est in- ...................... hibée à la dose de 25 milligrammes de poids sec de matiriel vegetal de départ par mil- lilitre de milieu pour l'extrait mgthandique et à la dose de 15 mg/ml pour la substance obtenue par élution,

Précisons cue cette substance purifiée est f ongistatique et non fongicide.

(1 ) l!jI.l!~TEIPFREN, J.TANGUY, l"I.HARDY, Conf e Intern, Rech, Agron. Cacaoyères, Abidjan,

15-20 NOV. 1965, PA?Us (1967), p b 184-194. (2) C,SA"IE, H.LAPIlV, Bull. Soc. Chim. Fr,, 1952, p. 1080-1085.

(3) K.W-DER.ATH, Chromatographie sur couches minces, Gauthier-Villars, Paris, 21 4 p.

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