Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine Molécule de créatinine Source: wikipédia...
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Transcript of Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine Molécule de créatinine Source: wikipédia...
Projet de Biologie:Mesure in vitro de la
créatinine
Molécule de créatinineSource: wikipédia
Test papier pHSource: www.teesfrance.com
GUILBOT Nils ISMAN Julien KONCKI AriellePOMATTO LauriannePOUJOL Julie
Soutenance projet créatinine - 13/05/2011
Plan
I. Qu’est ce que la créatinine?
II. La détection de la créatinine
III. La réaction de Jaffé
IV. Test de dépôt sur papier
V. Test de dépôt sur microbilles
VI. Test sur gel d’agarose
VII.Bilan, perspective et coût du projetSoutenance projet créatinine - 13/05/2011
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I. Qu’est ce que la créatinine?
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Qu’est ce que la créatinine?
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Qu’est ce que la créatinine?
Taux constant, hors effort
Dégradation par les reins et évacuation dans l’urine
Concentration sanguine faible (30 mg/L)
Gamme de valeurs de concentration chez l’homme :
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II. La détection de la créatinine
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Pourquoi vouloir détecter la créatinine?
L’insuffisance rénale
3 millions de personnes touchées La filtration glomérulaire n’est plus assurée Augmentation de la créatinine sanguine Diminution de la clairance
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Comment on la détecte?
Où trouve-t-on la créatinine? Sang : méthode actuelle Urine : on doit détecter une diminution de la
clairance Salive : méthode la plus simple
Actuellement, on mesure la créatinine par voie sanguine Méthode invasive Problèmes à long terme Obligation de faire appel au personnel médical
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Avantage de détecter la créatinine dans la salive
Méthode non invasive
Aucun problème de contamination
Possibilité de faire le test soi même, à la maison
Résultat quasi immédiat
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Objectifs initiaux
Trouver une méthode de mesure de la créatinine Moins invasive Moins contraignante Moins chère
Test papier
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III. La réaction de Jaffé
La réaction de Jaffé
Simple
Avec une cinétique de réaction
Mais réaction sensible à différents facteurs (sérum: drogue, glucose ….)
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La Gamme de concentration
Nécessité d’avoir 1/3 créatinine
1/3 acide picrique
1/3 soude
Volume puits: 200µL
Cinétique: 15 minutes
Extension de la gamme
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La Gamme de concentration
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La Gamme de concentration
Décalage de la gamme de concentration
=> zone à risque dans la zone de virage de la
couleur.
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La Gamme de concentration
Gamme décalée
Mais écart réduit
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V. Test de dépôts sur papier
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Test de dépôts sur papier
Objectifs : Etude du comportement des liquides sur les
différents papiers Détermination d’un papier optimal pour la
réaction Etude de la réaction : visualisation de la couleur
Protocole expérimental : Dépôt d’une goutte de 10 μL de picrate Choix du papier optimal pour la réaction Dépôt d’une goutte de 5μL de créatinine à 800
μM
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Test de dépôts sur papier
Dépôt d’une goutte de 10μL de picrate : Test sur 10 papiers différents : plus ou moins
absorbant Dépôt sur chaque face des papiers
Résultats :
Papier blanc épaisCalque
Papier carton face 1Papier carton face 2
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Test de dépôts sur papier
Analyse des résultats : Dépôts de couleur différente selon les papiers Diffusion différente entre deux papiers différents Diffusion différente entre les faces d’un même
papier Pénétration plus ou moins lente dans les papiers :
immédiatement 30 minutes
Contour plus foncé des gouttes : conséquences sur la réaction?
Goutte de picrate
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Test de dépôts sur papier
Dépôt d’une goutte de 5 μL de créatinine à 800 μM :
Choix des papiers où la goutte de picrate a pénétré rapidement
Résultats : Limite picrate
Limite créatinine
Diffusion des molécules
On observe un liseré orangé : Réaction qui se produit ?
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Test de dépôts sur papier
Analyse des résultats : Molécules de picrate chassées par la goutte de
créatinine Présence d’un liseré orange : la réaction
« semble » se produire
MAIS faux positif ?
VS
picratepicrate + créatinine
Différence aisée pour public non
averti ?
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Test de dépôts sur papier
Cependant un espoir : le papier n° 7 Papier standard créé par les élèves de Pagora en
TP Pénétration du liquide dans le volume
Diffusion homogène dans le papierGoutte de picrate :
Couleur jaune Couleur homogène
Réaction semble se produire
MAIS diffusion des molécules de picrate par la créatinine Méthode pour les fixer sur le papier
V. Tests de dépôt sur micro billes
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Colonne PD 10
Elimination du tampon par Lavage
Saturation de la colonne en picrate
microbilles poreuses imbibées de picrate
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Observation au microscope
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Réalisation d’une gamme sur billes
50 mg de mélange bille/picrate+15 μlitres de créatinine à différentes concentrations
Changements de couleur peu discernables entre 0 et 600 μMolaires.
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Expériences et résultats complémentaires
- La réaction ne marche que sur des billes humides
La réaction marche que les billes soient mises au frais ou laissées à l’air ambiant.
- La réaction est limitée dans le temps: les billes redeviennent jaune clair après quelques heures
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Combinaison billes papier
Sur papier peu diffusif:
50 mg mélange Billes picrate +15 μlitres deCréatinine
200 400 600 800
ConcentrationCréatinine(μmolaires)
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Combinaison billes papier
Sur papier diffusif:
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Une limite: la fixation des billes
Scotch : Peu efficace
Colle scolaire : empêche la réaction
VI. Test sur gel d’agarose
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Comment empêcher le dessèchement des
billes ? Si le billes restent en
contact avec l’air
Þ Assèchement du picrate et absence de réaction après ajout de créatinine
Þ Problème de conservation du test
Conclusion: nécessité d’isoler les billes de l’air
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Effectuer la réaction dans un gel d’agarose
Agarose 0,5%
Puits1 : gel 60μL + picrate en solution 60μL
Puits2 : billes (50mg) + gel 60μL
Puits3 : mélange homogène billes + gel 60μL
Ajout de 30 μL de créatinine après solidification du gel
Agarose 0,25%
Puits1 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 50μL créatinine
Puits2 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 25μL créatinine
Stœchiométrie 2/3, picrate 1/3 créatinine
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Résultats
Agarose 0,5%
Puits1 : la réaction a lieu => coloration orangée
Puits2 : billes au fond du puits, présence d’une couche de gel en surface => le gel s‘est-il glissé entre les billes? La créatinine ne semble pas pénétrer le gel
Puits3 : pas de coloration, la créatinine ne pénètre pas le gel
Agarose 0,25%
Puits1 : coloration orangée au bout de 15-30min
Puits 2 : idem
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Réalisation d’une gamme colorimétrique
réalisation d’une gamme colorimétrique sur gel d’agarose mélangé à 50μL de picrate en solution
Ajout de créatinine de 300 à 1000mM
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Test de conservation
Réalisation de la même gamme colorimétrique après 48h de repos du mélange gel+picrate
La réaction a lieu mais intensité très faible => différence indiscernable.
Bilan
L’utilisation d’un mélange picrate en solution + gel d’agarose semble être une solution exploitable.
Problématique1: déplacer la gamme pour distinguer les couleurs correspondant à différentes concentrations en créatinine ?
Problématique2: problème de conservation du test, inexploitable à moyen terme.
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VII. Bilan, perspectives et coût du projet
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Bilan des expériences
Réactions sur trois types de support :
Support Avantages Inconvénients
Papier Peu couteuxFacilité d’utilisation
Diffusion de picrate lors de l’ajout de la créatinine
Micro billes Pseudo réaction en solutionObservation de la gamme de couleur
CouteuxAssèchement des billes si mauvais conditionnement
Gel d’agarose Peu cherObservation de la gamme de couleur
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Perspectives du projet
A développer : Fixation du picrate sur le papier :
Structure du picrate à étudier Réaction dans le gel d’agarose :
Conditionnement du gel pour faciliter le test
Dans des micro-puits
Sur une bandelette
Gel d’agarose + picrate
Goutte de salive
Gel d’agarose + picrate salive
Analyse
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Coût du projet
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Merci de votre attention !
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bibliographie An Enzymic Reaction-Rate Assay for Serum Creatinine with a Centrifugal
Analyzer, Patrick K. Jaynes, Ronald D. Feld, and George F. Johnson
Enzymic Creatinine Assay: A New Colorimetric Method Based on Hydrogen Peroxide Measurement, Piero Fossati, Lorenzo Prencipe, and Giovanni Bert
Kinetic Enzymatic Method for Determining Serum Creatinine, Gerald A. Moss, Richard J. L. Bondar, and Diane M. Buzzelli
Direct detection of renal function markers using microchip CE with pulsed electrochemical detection, Carlos D. Garcia and Charles S. Henry
Method for the microassay of endogenous creatinine in blood and urine of small murid rodents, S. HEWITT
Mechanism of Interference with the Jaffé reaction for Creatinine, Martin H. Kroli, Nell A. Roach, Brent Poe, and Ronald J. EIIn
Reaction of Alkaline Sodium Picrate with Creatinine: Kinetics and Mechanism of Formation of the Mono-Creatinine Picric Acid Complex John Vasillades