11

Benoit GRELIERHela KOUADALaureline MAHEFanny MARTICKE

Projet créatinineProjet créatinine

Régulation de la fonction rénale

22

PLANPLAN

I- Le projet

II- Démarche expérimentale : les réactions

III- Etalonnage électrochimique

I- Le projet

II- Démarche expérimentale : les réactions

III- Etalonnage électrochimique

33

I-Le projetI-Le projet

44

produit de dégradation du phosphate de créatine dans le muscle.

Le sangLa sueur

La saliveLes urines

REINREIN

1) Le projet

La créatinineLa créatinine

55

Le dosage sanguinLe dosage sanguin

Taux normal = 65 – 120 µmol/L ± 20 % (homme) 50 – 100 µmol/L ± 20 % (femme)

Insuffisance = 600 – 700 µmol/L ± 20 %Prises de sang régulière

A jeun / sans effort physique

1) Le projet

Le dosageLe dosage

66

Insuffisance rénaleInsuffisance rénale

Inconvénient du dosage

Inconvénient du dosage

Sanguin

Invasive

Source d’infection / douleur

3 millions de personnes

60 % de séniors

25 % de diabétiques

Nécessite du personnel médical

I- Le projet

ActuellementActuellement

77

I- Le projet

• Utilisation simple

• Fiable à ± 10 %

• Miniaturisation

•Dosage par Électrochimie•Sueur ? •Salive ?

•Dosage par Électrochimie•Sueur ? •Salive ?

•Utilisation simple•Utilisation simple

•Fiable à ± 10 %•Fiable à ± 10 %

•Méthode non invasive•Méthode non invasive

• Miniaturisation• Miniaturisation

Notre butNotre but

88

Rencontre avec le P. JAOUIRencontre avec le P. JAOUI

Expériences au CIMEExpériences au CIME

Achat des réactifsAchat des réactifs

Définir plus précisément les objectifs/ les contraintes du projet

Etablir le cahier des charges

Se rendre compte de la réalité du projet

1) Le projet

Recherches…Recherches…Recherches préliminairesRecherches préliminaires

Rencontre avec le P. ZAOUIRencontre avec le P. ZAOUI

Expériences au CIMEExpériences au CIME

SaliveSalive

Déroulement…Déroulement…

99

II-LES REACTIONSII-LES REACTIONS

1010

Objectif : savoir si les réactions qui mènent à H202 fonctionnent

?3 réactions

II- Les réactions

Est-ce que ca marche?Est-ce que ca marche?

1111

II- Les réactions

De la créatinine à H 2O2De la créatinine à H 2O2

créatinine + H2Ocréatinine + H2O créatine (1)

créatine + H2Ocréatine + H2O

créatininase

sarcosine (2)

sarcosine + H2Osarcosine + H2O H2O2 (3) sarcosine oxidase

créatinase

12

•peroxydase•H2O2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) peroxydase•H2O2(en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge)

•Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H2O2 et donc de la sarcosine=> Avoir une quantité raisonable de H2O2 de l’ordre du µmol•La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL

•peroxydase•H2O2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) peroxydase•H2O2(en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge)

•Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H2O2 et donc de la sarcosine=> Avoir une quantité raisonable de H2O2 de l’ordre du µmol•La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL

II- Les réactions

Détection du HDétection du H22OO22Détection du HDétection du H22OO22

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La troisième réactionLa troisième réactionLa troisième réactionLa troisième réactionII- Les réactions

•7 puits7 puits•Différentes quantités de sarcosine oxydase Différentes quantités de sarcosine oxydase la meilleure obtenue pour 1/ 2 µLla meilleure obtenue pour 1/ 2 µL vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif …vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … A priori tout marche bien, mais …A priori tout marche bien, mais …

•7 puits7 puits•Différentes quantités de sarcosine oxydase Différentes quantités de sarcosine oxydase la meilleure obtenue pour 1/ 2 µLla meilleure obtenue pour 1/ 2 µL vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif …vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … A priori tout marche bien, mais …A priori tout marche bien, mais …

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Mais…Mais…Mais…Mais…II- Les réactions

•Les résultats sont très aléatoires: en variant les Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…??trop…??

•On n’arrive pas à contrôler la réaction On n’arrive pas à contrôler la réaction génant pour la détectiongénant pour la détection

•Les résultats sont très aléatoires: en variant les Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…??trop…??

•On n’arrive pas à contrôler la réaction On n’arrive pas à contrôler la réaction génant pour la détectiongénant pour la détection

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créatine + H2O créatine-amidinohydrolase sarcosine + urée(créatinase)

Solution de créatinase (μL)

Sol

utio

n de

sar

cosi

ne (

μL)

Tableau croisé avec concentration=3 U/mol

Sarcosine : 50 μL à 1,53 U/mol Créatine : 50 μL à 3 U/mol

Sol

utio

n de

sar

cosi

ne (

μL) 0 20 40 60 80 100

0 Contrôle négatif

20 coloration

40 optimum

60 2nde oxydation

80

100

Propriétés de l’enzyme :- Transforme 1μmol de créatine / minute

- Enzyme à diluer à 2,0-3,0 U/mol

II- Les réactionsc

La deuxième réactionLa deuxième réactionLa deuxième réactionLa deuxième réaction

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La première réactionLa première réactionLa première réactionLa première réactionII- Les réactions

•On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mLOn prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL•Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo conservées au frigo La réaction ne marche pas La réaction ne marche pas

•On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mLOn prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL•Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo conservées au frigo La réaction ne marche pas La réaction ne marche pas

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ConclusionConclusionConclusionConclusionII- Les réactions

•Problème de conservation des enzymes à -20°C et à Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C4°C•Incompatibilité des solutions tampon pour les Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes différentes enzymes réactions perturbées (sachant réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différentsdifférents•Changement de pH après la 1ère réaction Changement de pH après la 1ère réaction inhibation des autresinhibation des autres

•Problème de conservation des enzymes à -20°C et à Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C4°C•Incompatibilité des solutions tampon pour les Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes différentes enzymes réactions perturbées (sachant réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différentsdifférents•Changement de pH après la 1ère réaction Changement de pH après la 1ère réaction inhibation des autresinhibation des autres

1818

III- Etalonnage électrochimiqueIII- Etalonnage électrochimique

AnodeH2O2-> O2 + 2H+ + 2e-

Cathode2H+ + 2e- -> H2

CEI

- +

WE

EDTA/Tris Hcl +H2O2

REF

VA

Potentiostat

Palier de diffusion

PrincipePrincipePrincipePrincipeIII- Etalonnage

Gamme:50 -> 300 mMGamme:50 -> 300 mM

Le courant détecté est proportionnel à la concentration en H2O2

Le courant détecté est proportionnel à la concentration en H2O2

20

Balayage: 20 mV/s500pts mesurepH=8

WE: Au

CE: ITO

ERAg,AgCl

1ère cellule électrochimique1ère cellule électrochimique1ère cellule électrochimique1ère cellule électrochimique

Pas d’oxydation de H2O2 et ITO non inerte

Pas d’oxydation de H2O2 et ITO non inerte

III- Etalonnage

21

CE: Pt

ERAg,AgClWE: Pt

Balayage: 20mV/spH=8

V=450 mV

FAUX!

Courant capacitif ou autre réaction

2ème cellule électrochimique2ème cellule électrochimique2ème cellule électrochimique2ème cellule électrochimique

•Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel• Concentration des ions non constante (tampon dilué!)

=>Réfléchir avant d’agir!!

•Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel• Concentration des ions non constante (tampon dilué!)

=>Réfléchir avant d’agir!!

III- Etalonnage

/ Ag,AgCl

22

ERAg,AgCl

V=450 mV

CE: PtCE: Pt

WE: Au

Oxydation de H2O2

650/ Ag,AgCl

Balayage: 20mV/spH=8

• Fuites• Mauvaise connection• Fuites• Mauvaise connection

3ème cellule électrochimique3ème cellule électrochimique3ème cellule électrochimique3ème cellule électrochimique

Problèmes possibles:• Cinétique H+• Capacité tampon

Problèmes possibles:• Cinétique H+• Capacité tampon

III- Etalonnage

23

Conclusion généraleConclusion généraleConclusion généraleConclusion générale

• Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier• Echec courbe étalon: Montage, cinétique H+, capacité tampon• Frustration : pas de dosage de la créatinine dans de la salive• Perspectives : Cinétique H+ sur Pt (pH=8) => CE plus grande? Vérifier si on dépasse la capacité tampon

• Expérience de la recherche

• Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier• Echec courbe étalon: Montage, cinétique H+, capacité tampon• Frustration : pas de dosage de la créatinine dans de la salive• Perspectives : Cinétique H+ sur Pt (pH=8) => CE plus grande? Vérifier si on dépasse la capacité tampon

• Expérience de la recherche