Projet Créatinine

Carole AMIOT, Farah BEN MIMOUN, Guillaume ELLENA, Marine MUGNIER, Margot PASTERNAK

Position du problème

• Les insuffisances rénales : ~ 3 millions de personneso Les reins ne fonctionnent plus, certaines

molécules ne sont pas évacuées.

• Détection actuelle : mesure de la créatinineo Molécule produite par le corps, et éliminée par les

reins. Augmentation de sa concentration = dysfonctionnement rénal

• Mesure actuelle faite par des prises de sang régulièreso Inconvénients : Invasif, problèmes à long termes,

obligation de se rendre à l’hôpital

• Enjeux du projet :o Trouver un moyen moins invasif de mesure :

dans la salive 5/27/2010 Projet Créatinine

Créatinine

Formule : C4H7N3O

• Produite par le corps à partir de la créatineo Taux constant, hors

effort• Dégradation par les reins et

évacuation dans l’urineo Concentration

sanguine faible (30 mg/L)

• Concentration dans la salive = concentration sanguine

• Gamme de valeurs de concentration chez l’homme

 Sain Malade 45 60 90 110 200 300+ µmol/LFemme Homme

Détection : Méthode de Jaffé :

Créatinine + Acide picrique (jaune)

pH alcalin

Complexe jaune-orangé

5/27/2010 Projet Créatinine

But : le patient ne doit plus être obligé de se rendre à l’hôpital pour faire les mesures

Stratégie

• Utiliser une méthode de mesure par cinétique de réaction

• Tracer une courbe d’étalonnage : o Pente cinétique

=f[Créatinine]

Contraintes

• Quantité de salive à recueilliro ~5 mL pour l’étalonnageo ~100µL pour la mesure

• Présence d’autres protéines dans la salive. Contenu propre à chacuno Courbe d’étalonnage

personnelle

• Nécessité d’un spectroscope (à étudier)

5/27/2010 Projet Créatinine

Plan d’action

• Chercher une gamme de longueur d’ondes adaptées pour la mesure de DO

• Vérification du modèle cinétique de la réaction dans du tampon

• Vérification du bon déroulement de la réaction dans la saliveo Présence d’interférents ?

• Gamme de concentrations de créatinine dans la salive

• Influence d’autres paramètreso Variation du pH de l’échantillono Concentration de protéines dans l’échantillono Réaction parasite de la créatineo Contenu de la salive (Tests sur 2 personnes différentes)

5/27/2010 Projet Créatinine

Choix de la longueur d’onde

• Pour λ>490 nm, pas d’influence de l’acide picrique n’ayant pas réagi• Pour λ>550nm, peu de signal dû au complexe coloré• Pas de point où le réactif est visible et pas la créatinine

5/27/2010 Projet Créatinine

Zone de travail

Projet Créatinine

Linéarité des pentes : on pourra a priori utiliser cette méthode28/05/10

Résultats et Méthodes

• Premiers résultats pas exploitables : problème de ratio

• Tests sur quelques tubes pour voir quel ratio est optimal : 80/120

• Deuxième série de tests : ça marche !

• Tests sur la salive artificiellement augmentée en concentration : ça marche!

Prochains tests à faire : - test sur des patients avant et après traitement.- protéines qui influent (ajout BSA)- Tester si les réactifs réagissent avec la créatine

EXPLIQUER LES RESULTATS, EXTRAIRE LA CINETIQUE

Tests avec la salive

• On réalise la même gamme de concentration que précedemment (0, 100, 120, 140, 200, 400, 600 et 800 µM) mais en remplaçant le tampon par de la salive.

• Il faut noter que la salive utilisée provient de sujets sains et qu'elle contient donc de la créatinine mais en faible quantité.

Premiers résultats dans la salive

Influence de la personne et de la longueur d'onde sur la courbe d'étalonnage

évolution cinétique et influence du spectromètre

Calcul de la constante cinétique

validation de la méthode 

Absence d'interférents notables à la réaction dans la salive mais nécessité d'établissement d'une courbe d'étalonnage propre à la personne

Quelques limitations

• influence de la personne observée en partie due à la quantité de créatinine présente dans la salive au départ différente pour les 2 personnes

• origines de l'erreur : - elle n'est calculée qu'à partir de 2 mesures- les échantillons de salive ont été prélevés à des moments différents (le matin après brossage de dents et après le repas de midi)- la salive n'a pas été filtrée et des dépôts dans certains puits ont faussé la mesure (ces données ont été retirées)

• l'influence de la température n'a pas été évaluée.

Résultats et Méthodes

• Premiers résultats pas exploitables : problème de ratio

• Tests sur quelques tubes pour voir quel ratio est optimal : 80/120

• Deuxième série de tests : ça marche !

• Tests sur la salive artificiellement augmentée en concentration : ça marche!

Prochains tests à faire : - test sur des patients avant et après traitement.- protéines qui influent (ajout BSA)- Tester si les réactifs réagissent avec la créatine

EXPLIQUER LES RESULTATS, EXTRAIRE LA CINETIQUE

Discussion 

Projet de l'an dernier : reposait sur 3 réactions enzymatiques, partant de la créatinine en passant par la créatine donnant de l'eau oxygénée. Le dosage de H2O2 permettait de remonter à la concentration de la créatinine mais problème de conservation des enzymes. En effet, pas de tampon où les 3 enzymes sont stables. Notre projet : plus simple, utilisation d'un seul réactif directement sur la créatinine, pas d'interférents gênants, pas d'inhibition de la réaction par la salive (valeurs DO de même ordre de grandeur quand créatinine dans de l'eau ou dans de la salive). Cependant, il reste à savoir d'où vient cette couleur orangé afin d'avoir toutes les clefs en main. Cela permettrait de connaitre l'enjeu chimique posé par ce complexe orange et ainsi d'éviter de passer à côté d'une donnée potentiellement importante. Ce qu’il reste à faire… : - développer une interface pour rendre cette méthode utilisable à tous !

Projet d’instrumentation – Cahier des charges

Mini spectrophotomètre à une longueur d’onde (495 nm) Système électronique qui fait les calculs et donne le résultat Etudier le problème de l’étalonnage (courbe personnelle) Programme « normal » : On met l’échantillon dans le puit, et le programme donne la concentration ! (Calculée à partir de la courbe d’étalonnage et de la pente trouvée).     Comment mettre le réactif ? Etant donné que c’est dangereux, ce n’est pas le patient qui doit le faire => trouver un système d’instrumentation précis et fiable sous forme de distributeur automatique par exemple.Le patient doit mettre la bonne dose de salive. Attention : la quantité de salive à demander doit rester raisonnable (ici 80µL suffisait).

L’hôpital fait une courbe à partir d’échantillons

Critère arbitraire, fixé à partir de moyennes

Projet d’instrumentation – Cahier des charges

Autre solution :  on voit qu'à t fixé, la DO n'est pas la même suivant la concentration de créatinine.   

Projet d’instrumentation – Cahier des charges

Donc variation de DO => changement de couleur Dans notre cas, visible à l'oeil nu donc visible par une caméra => un logiciel dans un téléphone portable avec caméra ou appareil photo permettant de donner la concentration de créatinine suivant le changement de couleur perçu par l'appareil et tenant compte de la vitesse à laquelle ce changement a eu lieu. Mais attention : faire les mesures dans le même environnement, dans les mêmes conditions. Et le prix sera nettement supérieur à celui d'un spectrophotomètre (1825 euros pour une gamme spectral large 360 à 900 nm). 

Merci pour votre attention et

place aux questions !