STALPour la deuxième année consécutive, STAL publie quatre numéros par an. Ce numéro de STAL,...

Sciences & Techniques de l’Animal de Laboratoire

STAL STAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

Publiée par l’Afstal Association Française des Sciences et Techniques de l’Animal de Laboratoire

TRIBUNEDu sens des mots expérience et habilité

ARTICLESL'AAALAC International en Europe

Génétique de la pigmentation chez la sourisIntérêts de la QPCR en transgénèse lentivirale

Evaluation de la douleur chez la sourisIntérêts du modèle C. elegans

ACTUALITÉS2ème journée du RAM

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SCIENCES ET TECHNIQUESDE L'ANIMAL DE LABORATOIRE

Revue à comité de lecture publiéepar l'association françaisedes sciences et techniques de l'animal de laboratoire

Pour tout ce qui concerne :

RÉDACTION DE LA REVUES'adresser au Rédacteur en Chef :M. A. DORIERE-mail : [email protected]

ABONNEMENTSET CHANGEMENT D’ADRESSES'adresser à A.F.S.T.A.L.28, rue Saint-Dominique75007 ParisE-mail : [email protected]

France : 80 € - Etranger : 92 €Le numéro : 30 €

PUBLICITÉ DE LA REVUEE-mail : [email protected]

Les textes publicitaires insérésdans la revue n'engagentque la responsabilité des annonceurs

CRÉATION / IMPRESSION IMPRIMERIE REY6, rue du Périgord69330 MEYZIEUTél. 04 37 44 3000

STALSOMMAIRE

EDITORIAL .......................................................................................... p 5

ACTUALITÉS- En bref ................................................................................................ p 7

- Deuxième journée du Réseau des Animaleries de Montpellier ................p 9

- BALINA ................................................................................................p 15

TRIBUNE- Parler les mots mal..............................................................................p 19

ARTICLES - Les activités de AAALAC INTERNATIONAL en Europe ............................p 22

- Pourquoi on en voit de toutes les couleurs ...? ....................................p 27

- Souris lentigéniques : détermination du nombre de copies par QPCR ..p 38

- Mesure de la fiabilité et de la précision des expressions faciales pour évaluer la douleur chez la souris ..................................................p 49

- Du nématode Caenorhabditis elegans et de son utilisation en laboratoire ..........................................................p 59

INFORMATIONS DIVERSES- En bref ................................................................................................p 75

- Instructions aux auteurs .................................................................... p 77

- Comment adhérer à l'AFSTAL et s'abonner à STAL ..............................p 79

- Statuts de l’Association Française des Sciences et Techniques de l’Animal de Laboratoire (A.F.S.T.A.L.)....................................................p 80

Photographie de couverture : Nos remerciements à Marion Bérard

STAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

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Sciences & Techniques de l’Animal de Laboratoire

STAL STAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

Publiée par l’Afstal Association Française des Sciences et Techniques de l’Animal de Laboratoire

TRIBUNEDu sens des mots expérience et habilité

ARTICLESL'AAALAC International en Europe

Génétique de la pigmentation chez la sourisIntérêts de la QPCR en transgénèse lentivirale

Evaluation de la douleur chez la sourisIntérêts du modèle C. elegans

ACTUALITÉS2ème journée du RAM

L'expérience auservice de la recherche.

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En quête debien-être ?

Pour la deuxième année consécutive, STAL publie quatre numéros par an. Cenuméro de STAL, va clore une année 2010 riche en actualités pour notre asso-ciation et notre environnement professionnel. Notre colloque de Lyon qui s’estdéroulé du 24 au 26 novembre 2010 a été un franc succès. En effet, la fré-quentation a été plus élevée que pour les colloques d’automne organisésprécédemment par l’AFSTAL et nous avons pu constater une affluenceconstante d’un public attentif et curieux dans la salle de conférence. Les expo-sants, ont, nous l’espérons, bénéficié de l’évènement pour initier de nouveauxcontacts et aller à la rencontre de leur clientèle. Ils ont une fois de plus réponduprésents à nos sollicitations et ont largement participé au succès de cetteréunion. Je tiens à les remercier au nom de l’association. Ce colloque a été l’occasion d’une Assemblée Générale au cours de laquelle leConseil d’Administration et le bureau ont été modifiés. Je remercie lesmembres sortants pour leur engagement dans l’association et plus particu-lièrement Michel Provence, et Marion Bérard pour leur implication dans la miseen place de la nouvelle formule de STAL, colorée et attrayante. Marion, qui endeux ans de présidence de l’AFSTAL, par son dévouement et son enthou-siasme communicatif, a notamment dynamisé les relations avec les autresassociations francophones, stimulé la refonte de notre site internet et conso-lidé la présence de l’AFSTAL dans les instances européennes. En cette occasion, le Pr Hélène Combrisson a remis, au nom de l’AFSTAL, pour lapremière fois, le Prix Chantal Autissier, en présence de M. Autissier, qui nous a faitl’honneur de sa présence, et d’une œuvre d’art qui symbolisera ce prix. M. Char-let a reçu ce prix pour son travail sur la détection de la douleur chez le Rat. Dans ce numéro, nous poursuivons la présentation des acteurs du paysage del’expérimentation animale au travers d’un article sur l’AAALAC (Association forAccreditation and Assessement of Laboratory Animal Care). La souris tient tou-jours une place majeure dans nos laboratoires ; ainsi, vous pourrez lire troisarticles qui lui sont dédiés. Parmi eux, l’article proposé par Maud Scotto tientune place particulière : son travail a été tout d’abord aidé par une boursed’étude de l’AFSTAL puis, la présentation orale qu’elle a faite le 25 novembreà Lyon a été élue par les congressistes « meilleure communication courte ».A ce titre, elle a reçu un second prix de l’AFSTAL. Nous découvrirons un nou-veau modèle, au travers d’une revue sur l’intérêt de l’utilisation de C. elegans. Petite innovation, un poster vous est proposé au centre du numéro, afin d’illus-trer les théories sur la génétique de la robe des souris par un petit clin d’œil. Cet éditorial est l’occasion, au nom du Conseil d’Administration de l’AFSTAL,de vous souhaiter une excellente année 2011. STAL est votre journal, grâce àses 4 numéros annuels, il est aussi un lien entre nous. N’hésitez pas à sou-mettre vos articles originaux, traductions d’articles, revues et actualités quiseront toujours les bienvenus.

■ Samuel VidalPrésident de l’AFSTAL 5


EDITORIAL

Crédit photo : Marion Bérard


Vie de l’AssociationColloque annuelLe colloque annuel a eu lieu à Lyondu 24 au 26 novembre 2010 et aconnu un grand succès en rassem-blant 650 participants dont360 exposants avec leurs invités.Lors de la soirée de gala du colloque,le 1er prix Chantal Autissier a été attri-bué à Alexandre Charlet pour sontravail de thèse sur l’évaluation de ladouleur en expérimentation animale.Les premiers retours ont été trèspositifs quant à l’intérêt des sujets, laqualité des présentations et de l’or-ganisation. Afin d’améliorer lesprestations des futurs colloques, unquestionnaire de satisfaction va vousêtre envoyé. Merci à tous pour votreparticipation.L’Assemblée Générale de l’AFSTALs’est tenue pendant le colloque et lenouveau bureau a été élu à cetteoccasion.Florence Arnal (Secrétaire sup-pléante), Stéphanie Durand,Sébastien Paturance (Trésorier), AlainDorier (Vice président), Hervé Pointuet Charles Henri Cottart intègrent leconseil d’administration de l’associa-tion, les autres membres sont SamuelVidal (Président), Catherine Maison-neuve, Christophe Charnay (Trésoriersuppléant), Elodie Bouchoux (Secré-

taire), Jean Louis Thoumas, ChantalMartin et Hugues Contamin.Le prochain colloque se déroulera enrégion parisienne du 25 au 27 mai2011. Le thème vous sera bientôtcommuniqué. ■

Ateliers du Tour de FranceL’atelier « Sanitaire » s’est finalementdéroulé à l’Université de Nice –SophiaAntipolis (UNS) – Valrose le jeudi14 octobre 2010 avec la participationde 23 personnes. Nous voudrionsremercier tout particulièrement Nico-las GUY et les sponsors qui ontactivement concouru au succès decette journée.Poursuivant son tour de France, cetatelier fera étape au Centre de Neu-rochimie de Strasbourg, le mardi14 décembre 2010. Ouvert à nos col-lègues suisses, il est accréditécomme une journée de perfectionne-ment par la Société Suisse desVétérinaires Cantonaux.Le programme du prochain atelierintitulé « Observation et suivi des ani-maux de laboratoire : bonnespratiques au quotidien » est achevé.Les thèmes abordés et les conféren-ciers sont présentés ci-après :> Approche globale du bien-être ani-

mal : Dominique Autier-Derian> Reconnaissance des signes cli-

niques chez les rongeurs etlagomorphes : Aurélie Girod

> Détection et prévention de la dou-leur : Stéphane Junot

> Mise en place de points limites :Sophie Picavet

> Prévention et traitement du stress :Dominique Autier-Derian

< Questions diverses : tous les ora-teurs.

Cet atelier pourrait commencer sontour de France au cours du premiertrimestre 2011.Vous trouverez bientôt toutes lesinformations relatives à son déroule-ment en vous connectant sur leportail du site Internet de l’AFSTALhttp://www.afstal.com/. Nous nous permettons de vous rap-peler qu’il est indispensable que vousvous inscriviez au préalable auprèsde l’AFSTAL (cf. affiche :[email protected]) et de vous signalerque nous sommes contraints de limi-ter le nombre de participants à 80. Si,après votre inscription, vous voustrouviez dans l’impossibilité d’assis-ter à cet atelier, merci de nous enavertir afin de nous permettre d’offrirvotre place à un autre candidat.L’adresse complète et les moyensd’accès vous seront communiquéslors de la confirmation de votre ins-cription par le secrétariat del’AFSTAL.

ComTech AFSTAL

L'équipe de la ComTech a le plaisir devous convier gracieusement à son9e Symposium qui aura lieu le jeudi27 janvier 2011 à Paris. Ce sympo-sium, animé par Bernard Andrieux, apour thème : « Son et lumière - Pleinfeu sur l'ambiance ». Vous trouverezle programme et toutes les informa-tions utiles relatives à cette journéeen vous rendant sur le site : 7


ACTUALITÉS

En bref

ACTUALITÉSSTAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

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www.alphavisa.com/comtech2011/ où vous pourrez : soit télécharger etimprimer le bulletin d'inscription quevous renverrez complété à Alpha VisaCongrès, soit remplir le formulaire d'ins-cription en ligne. Nous vous invitonségalement à porter une attention parti-culière sur les modalités du concoursphotos qui vous est proposé. ■

ComVet AFSTALAprès l’Ecole Vétérinaire d’Alfort en2009 pour une journée dédiée aumédicament vétérinaire en expéri-mentation animale, c’est l’EcoleNormale Sup’ de Lyon qui a accueillile cru 2010 de la réunion ComVet le23 novembre avec la participation de32 personnes.

Cette journée a permis d’aborder dif-férents thèmes chers à la ComVet :sanitaire, réglementaire et éthique.La session Sanitaire a permis d’abor-der des cas pratiques decontamination au parvovirus murin(MPV), de faire un état des lieux sur lenorovirus murin (MNV) et d’aborderen détails l’état des connaissancessur la pathologie jusqu’alors associéeau Rat Respiratory Virus et qui faitl’objet actuellement de remises enquestion.

En matière de Réglementation, unerevue de la Directive 2010/63/EC aété effectuée afin d’aborder les diffé-rents points qui posent question.

Enfin, la Bientraitance animale a étéau centre de discussions relativesaux techniques d’euthanasie des ron-geurs au CO2 et à la mise en placed’un programme d’enrichissement del’environnement. Ces derniers pointsdonneront lieu à de futurs développe-ments au sein de la ComVet sousforme de groupes de réflexiondédiés. ■

STALNous vous rappelons que vous pou-vez soumettre vos articles pourpublication dans STAL en lesenvoyant à [email protected]. ■

Site WebNous vous rappelons que le site com-prend désormais un espace adhérent(avec accès sécurisé et réservé auxadhérents à jour de leur cotisation)destiné à héberger les supports decertaines présentations qui auront étéfaites dans le cadre des colloques etréunions des groupes de travailAFSTAL, ainsi que les archives decertains numéros de la revue STAL.Plus généralement, le sitewww.afstal.com est le vôtre et nousavons besoin de vous pour le fairevivre. N’hésitez pas à nous communi-quer toutes remarques etinformations qui pourront l’enrichir etêtre partagées par l’ensemble denotre communauté. Pour cela, écrivezà [email protected]. ■

Réglementation Révision de la directive 86/609 Rappel : Le Parlement Européen aadopté le 8 septembre le texte réviséde la Directive 86/609.Le travail de transposition en droitfrançais doit être finalisé d’ici 2 ans(novembre 2012).Deux réunions ont déjà eu lieu avecles représentants des ministères dela santé, de l’agriculture, de larecherche, des représentants desorganismes privés et publics afin deréfléchir et démarrer ce travail detransposition. ■

SYMPOSIUM9e

Jeudi 27 janvier 2011

ACTUALITÉSSTAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

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Deuxième journée du Réseau des Animaleries de Montpellier

■ Florence ArnalJean-Damien ArnaudKarim Chebli

Pour plus d’informations, n’hésitez pas à visiternotre site web :http://www.ram.cnrs.fr/

Pour sa deuxième journée annuellequi a eu lieu le 14 octobre 2010 àMontpellier, le Réseau des Animale-ries de Montpellier (RAM) a réuni plusde 100 personnes. Le RAM vous invite chaque année àpartager nos connaissances pourtendre vers la qualité indispensableaux enjeux de la recherche et auximpératifs de protection et de bien-être animal. Cette journée a été l’occasion de vousprésenter différents savoir-faire pré-sents au sein du RAM, decommuniquer sur de nouvelles tech-niques, de nouer des contacts etenfin de promouvoir le réseau. Cette année, cette journée avait pourthème : la création de modèles ani-maux et l’éthique. Une présentation des différentsmodèles animaux (au sens large) déjàen place sur le réseau et des possibi-lités de créations de modèlesanimaux ont été faites. La création denouveaux modèles animaux plus per-tinents s’inscrit dans une démarcheéthique. L’éthique a également étémise en avant au cours de cette jour-née.

La première session s’estintéressée à la création demodèles animaux. C Begon-Pescia a présenté la plate-forme de recombinaison homologuede l’institut de génétique moléculairede Montpellier. S Ménoret (Plateforme de transgé-nèse des rats de Nantes) a présentéla génération de rats déficients enimmunoglobulines en utilisant des

zinc finger nucleases pour cibler lelocus des IgM. Les zinc finger nucleases constituentun outil puissant permettant lagenèse de modèles KO et KI dans lesespèces animales où les cellules ESne sont pas disponibles ou sont tropcoûteuses. De plus, il ne faut que troissemaines pour générer un rat KOcontrairement aux techniques clas-siques de recombinaison homologuequi nécessitent 1 à 1,5 an pour obte-nir un KO. Un des freins à l’utilisationde ces zinc finger nucleases restenéanmoins leur coût.

La deuxième session s’estfocalisée sur des modèlesVertébrés autres que lesRongeurs de laboratoire.

P de Santa Barbara (Inserm ERI25) aprésenté le modèle aviaire qui a large-ment contribué à établir nosconnaissances sur le développementdes Vertébrés supérieurs grâce aux dif-férentes expériences d’embryologieexpérimentale qui lui ont été appliquées(recombinaison caille-poulet). Aujour-d’hui, le développement de nouvellesapproches telles que la transgénèserétrovirale, l’électroporation in vivo oul’analyse transcriptomique remet enlumière les potentialités de ce modèleanimal. La combinaison des expé-riences d’embryologie expérimentale etdes nouvelles approches d’étude molé-culaire devrait permettre de faire dumodèle aviaire un modèle de choix pourl’étude de la biologie du développe-ment, des cellules souches, du canceret de l’environnement.

Remerciements Toute l’équipe d’organisation decette journée remercie chaleu-reusement nos sponsors (Basan,Charles River, DSI, Harlan, Jan-vier, Safe, Serlab, Souralit, Tecni-plast, Viewpoint) ainsi que lesIFR3 et IFR122 sans qui cettejournée n’aurait pu avoir lieu. Un grand merci enfin au comitéd’organisation de cette journée :Florence Arnal, Jacques-DamienArnaud, Karim Chebli, égalementà Mickael Autuori pour la gestion,à Monique Anoal pour la coordi-nation, et à Muriel Gien-Asari pourl’infographie.

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D Ciocca du Chronobiotron de Stras-bourg a présenté le modèleArvicanthis ansorgei. C’est un Ron-geur d’origine africaine qui présentela particularité d’être diurne. Ces der-nières années, il s’est imposé commeun modèle fort pour l’étude desrythmes biologiques car par compa-raison avec les Rongeurs classiquesde laboratoire (tous nocturnes), il apermis une meilleure compréhensiondes mécanismes expliquant la noc-turnalité et la diurnalité, challengedes chronobiologistes. En effet, lecaractère diurne ou nocturne d’uneespèce ne reposerait pas sur un fonc-tionnement différentiel de l’horlogecentrale mais sur la manière dont lessignaux générés par cette horlogeseraient intégrés au niveau des struc-tures cibles. L’homme étant diurne, Arvicanthis estun bon modèle pour les approchesbiomédicales et permet de modéliserles troubles du rythme qui conduisentplus ou moins rapidement au déve-loppement de certaines pathologies.Egalement, pour l’étude de la rétine,Arvicanthis est un modèle intéressantpour modéliser certaines pathologiesrétiniennes observées chez l’homme,qu’elles soient associées ou non àdes troubles des rythmes biologiques.Arvicanthis niloticus (espèce jumelled’Arvicanthis ansorgei) développespontanément un diabète de type 2,ce qui peut être utile pour mieuxappréhender l’étiologie du diabète detype 2 et tenter d’ouvrir de nouvellespistes thérapeutiques. N Mestre-Frances (INSERM U710) aensuite introduit le microcèbe qui estun modèle Primate de maladies neu-rodégénératives. C’est un Primate de petite taille (faiblecoût d’hébergement), de longévité

modérée (8 à 12 ans) et disponiblecar il est élevé au sein de l’animale-rie de l’Université Montpellier 2. Sonvieillissement peut être accru avec uncycle photopériodique accéléré :5 mois d’été (jours longs) et 3 moisd’hiver (nuits longues). 10 % desmicrocèbes âgés développent desplaques amyloïdes. Un essai desélection génétique est en cours afind’avoir plus de chances d’avoir desanimaux porteurs de plaques. Il est également utilisé en tant quemodèles induits : maladie d’Alzhei-mer par transfert du gène APP avecun adénovirus canin, maladie de Par-kinson par transfert du gène LRK2.Enfin, le microcèbe sert égalementpour l’étude de maladies à prions.Selon la souche de prion inoculée, ildéveloppe ou non la maladie. Cette session s’est terminée avecl’évaluation et l’efficacité de théra-peutiques innovantes chez le Primateprésenté par Oumeya Adjali de l’Ins-titut de Recherche Thérapeutique deNantes. Les modèles de Rongeursont permis de faire la preuve deconcept de diverses stratégies théra-peutiques innovantes telles que letransfert de gène thérapeutique.L’évaluation de ces protocoles théra-peutiques nouveaux dans desmodèles animaux plus pertinentsd’un point de vue clinique est de plusen plus recommandée, voire exigéepar les autorités réglementaires sani-taires avant toute translation clinique. Dans le domaine de la thérapiegénique à l’aide de vecteurs AAV(Adeno-Associated-Virus), des proto-coles divers et variés chez le rongeurrésultent en général en un transfertde gène efficace à long terme aprèsune seule administration de vecteur.Néanmoins, la translation préclinique

de ces protocoles dans les modèlesgros animaux a révélé un obstaclemajeur. En effet, l’efficacité du trans-fert de gènes s’est révélée dans cecas souvent transitoire en raisond’une immunotoxicité dirigée contrele transgène et/ou capside virale. Cetexemple illustre l’intérêt du modèlePrimate qui reste malgré ses défautsinhérents (coût, éthique, manque deréactifs spécifiques, études longueset complexes, variabilité entre lesindividus…) un modèle très pertinentpour l’évaluation préclinique, aussibien en terme d’efficacité que detoxicité, de protocoles de thérapiegénique, cellulaire et d’immunomo-dulation avant l’essai clinique chezl’homme.

La troisième session s’est intéresséeaux modèles d’Invertébrés. S Galas (Université Montpellier 1) aintroduit le modèle Caenorhabditiselegans : un modèle de 959 cellulesau laboratoire. D’une longueur de1 mm, le nématode Caenorhabditiselegans s’impose progressivementgrâce à ses contributions pionnièresdéjà récompensées par les Prix Nobelde Médecine (2002; 2006) et PrixNobel de Chimie (2008) pour lesdécouvertes de l’apoptose, du méca-nisme d’interférence ARN(épigénétique) ou encore de la GFP. La publication du génome du Néma-tode Caenorhabditis elegans en 1998a marqué un tournant dans l’en-semble des programmes deséquençage puisque, pour la pre-mière fois, le génome d’un organismemétazoaire était décrypté. Depuis cet inventaire moléculaire, ilest rapidement apparu que près de67 % des gènes associés à despathologies chez l’homme avaient un

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équivalent chez ce petit ver de 1 mmde long. Caenorhabditis elegans peutêtre maintenu au laboratoire de plu-sieurs façons (milieux de cultures,alimentation, etc) qu’il est possible decombiner avec des traitements pardes molécules exogènes ou métabo-lites secondaires tout en tirantavantage du grand nombre demutants génétiques déjà disponiblesou encore des ciblages moléculairespar ARN interférence ou transgénèse.Grâce à ces caractéristiques, plu-sieurs stratégies ont d’ores et déjàété développées afin de générer describles intéressants pour la santéhumaine ou encore pour décryptercertains programmes à l’origine demécanismes physiologiques régula-teurs complexes.S Galas a également illustré commentl’utilisation combinée des informa-tions déjà disponibles sur ce modèlepermet encore à Caenorhabditis ele-gans de contribuer à l’émergence denouveaux concepts de recherches etde travail.A Garces (Institut des Neurosciencesde Montpellier) a présenté la droso-phile : un cobaye épatant. Sur un plan génétique, la drosophile(la mouche du vinaigre) et les verté-brés (dont l’Homme) sont similaires.En effet, environ 75 % des gènes res-ponsables des maladies humainessont retrouvés dans le génome de cetinsecte. Au cours des dix dernièresannées des lignées de drosophilesatteintes de cancers, de la maladied’Alzheimer, de Parkinson, ou d’Hun-tington ont été établies. Ces mouchesmutantes sont utilisées comme de

puissants modèles génétiques quipermettent de décortiquer les voiesde signalisation et les mécanismesmoléculaires mis en jeu dans cesmaladies. De façon générale, l’utilisa-tion de la drosophile permet des’affranchir des limitations éthiqueset financières posées par l’expéri-mentation animale. M Deage de l’IGF a ensuite soulignél’intérêt du venin de mygales pour larecherche de ligands analgésiques,potentiels médicaments de demain. Les mygales sont des prédateurs quise nourrissent d’une grande variétéde proies vertébrées et invertébrées.La diversité des niches écologiquesassociées à la diversité des compor-tements de prédation corrèlent avecla diversité importante de leursvenins. Le venin est très efficace et renfermeun cocktail de neurotoxines qui agis-sent rapidement sur le systèmenerveux de leurs proies pour lesparalyser. Cette caractéristique fait deleurs venins une source très intéres-sante de nouveaux ligands trèssélectifs destinés notamment àl'étude des canaux ioniques et desrécepteurs membranaires.

La quatrième et dernière sessionde la journée s’est focalisée surl’éthique.La société Viewpoint a présenté lacage Marlau. Celle-ci permet unestandardisation de l’enrichissementet contribue au raffinement zootech-nique au service de l’animal et de lascience.

L’enrichissement vise à accroitre lebien être physique et psychologiquepar l’apport de stimuli conformes auxbesoins spécifiques de l’espèce del’animal. Il est suivi de l’améliorationdes capacités cognitives. Il soutient ledéveloppement de mécanismes per-mettant une meilleure adaptation austress, une meilleure résistance auxprocessus pathologiques et uneréponse thérapeutique qui peut êtredifférente de celle obtenue en condi-tion non enrichie.

A Michel (Université Montpellier 1) aensuite introduit l’éthique enexpérimentation animale. L’éthiquec’est répondre à ces trois questions :que veux-je faire ? Que puis-je faire ?Que dois-je faire ? Dans le respect dela règle des 3R et du rapportcoût/bénéfice.

Enfin, JP Martinolle (Sanofi-AventisMontpellier) a présenté le comitéd’éthique du site Sanofi Montpellier :CEPAL (Comité d’Ethique pour la Pro-tection des Animaux de Laboratoire)en mettant en lumière les spécificitésd’un comité d’éthique encadrant desactivités de recherche et de dévelop-pement préclinique dans le secteurpharmaceutique.

Cette journée a rencontré un très bonaccueil et nous vous donnons rendez-vous en octobre 2011 pour unenouvelle édition.

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BalinaSTAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

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Eau douce, eau dure, au secours !

Crédit photo : : UAR

Dans chaque numéro, cette rubrique BALINA pré-sentera le reflet d’un thème qui a été débattu sur lesite ANILAB, rédigé par Bernard Andrieux avec lacomplicité de ceux qui sont intervenus dans ledébat suscité par les questions.

Avec l’aide de : ■ Jacques-Damien Arnaud■ Elizabeth Huc ■ Michèle Pauchard

Que choisir comme eau d’abreuve-ment dans les établissementsd’expérimentation animale ?

Une eau est potable quand elle satis-fait aux caractéristiques du décret de2001-1220 qui la rendent propre à laconsommation humaine. La qualitéd’une eau dépend de critères organo-leptiques (couleur, turbidité, odeur,saveur), de paramètres physico-chi-miques naturels (température, pH,chlorures, sulfates, …), de la pré-sence de substances indésirables(nitrates, nitrites, pesticides, ...), et dela présence de substances toxiques(arsenic, cadmium, plomb, hydrocar-bures, ...) et de micro-organismespathogènes. Dans la mesure où leshommes disposent d’une eau durobinet « potable », tout laisse à pen-ser que cette eau devrait pouvoirconvenir aussi aux rats et aux souris.

Ce n’est pas si simple, car, selon lesrégions, cette eau n’a pas la mêmequalité. Certes, elle est exempte demicro-organismes, mais sa composi-tion en sels dissous est fonction de lagéologie dans laquelle les eaux sontcapturées pour être renduespotables. Particulièrement, elle vaêtre plus ou moins chargée en sels decalcium : dans les massifs grani-tiques l’eau est « douce » (moins de200 mg de calcaire par litre) alorsque dans les bassins sédimentairescalcaires elle est « dure » (jusqu’à1000 mg/L). Cette dureté s’exprimeaussi par le titre hydrotimétrique endegrés français (°F), l’eau douce estinférieure à 15°F, l’eau dure est supé-rieure à 24°F, et certains disent

qu’une bonne eau pèse 7°F. Si l’eaudu robinet est le reflet de l’eau cap-turée, aucune norme cependant n’estexigible dans la mesure où le taux decalcium n’a pas de répercussionsanitaire, dit-on. D’ailleurs, quand onexamine les teneurs en sels des eauxen bouteille (= minérales) qui sont envente libre on peut constater que lestaux de calcium vont de 11 à 550mg/L, sans parler de ceux du magné-sium de 8 à 110 mg/L et du sodiumde 5 à 1700 mg/L, ce qui prouve bien( ?) que ces taux ne doivent pas avoirune grande incidence sur la santéhumaine, surtout quand on saitqu’une eau douce peut apporter0,2 % des besoins en calcium alorsqu’une eau dure apporte 17 % del’apport nutritionnel recommandé quipréconise un minimum de 11mg/kg/jde calcium, un minimum de5 mg/kg/j de magnésium, et un maxi-mum de 34 mg/kg/j de sodium.

Les sels sont peut-être inoffensifs,mais l’eau peut contenir, en plus, desoligoéléments ou des polluants enquantités variables. La preuve en estque des seuils de potabilité ont étédéfinis par précaution : l’arsenic estlimité à 10 μg/L, le fluor à 1,5 mg/L,le fer à 0,2 mg/L, les nitrates à50 mg/L, et les pesticides (plus de800 substances différentes) à0,5 μg/L sans qu’une seule sub-stance ne dépasse 0,1 μg /L, sansparler du radon, si bien que on peutaffirmer que selon les localités, lesanimaux ne seront pas lotis de lamême eau.

Néanmoins, hommes et bêtes qui ne


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vivent pas que d’eau fraîche, survi-vent, quelle que soit l’eauconsommée, car c’est la nourriturequi est capable de subvenir à leursbesoins.

Adoptons donc cette conclusion,même si un certain nombre d’auteurset de pathologies indiquent que dessurcharges ou des carences peuventavoir des répercussions sanitairesdans certains cas.

Une fois acquis que la composition del’eau n’a pas une grosse incidencesur les résultats expérimentaux,compte-tenu de la durée de vie desanimaux et de la pratique quoti-dienne, on pourrait cependant sedemander s’il n’est pas impossiblequ’elle en ait. L’idéal serait donc desavoir quelle est l’eau bonne et deconnaître les limites d’une eauacceptable, il semblerait que ce nesoit pas très simple déjà pourl’Homme, alors pour les Rongeurs !

Les réponses faites sur Anilab reflè-tent cette complexité, puisque lesméthodes proposées, témoignagesde nombreuses années de pratiquessatisfaisantes, qui sont rapportés(hélas sans que des détails soientfournis sur l’eau traitée qui a pu évo-luer au cours du temps à la suite detravaux dans l’usine de traitement

des eaux, de la pollution de la nappeou de la qualité des canalisations)montrent une belle diversité de véri-tés ou d’incertitudes.

Première méthode : ne pas utiliserd’eau adoucie car les filtres sont vitecolonisés, mais faire une analyse aurobinet pour s’assurer de la qualité duréseau interne de distribution, etcomparer les résultats aux normes del’eau de ville…

Deuxième méthode : utiliser de l’eauadoucie mélangée à 50/50 avec del’eau du robinet pour prévenir desrisques d’infertilité…

Troisième méthode : si l’eau n’estpas trop calcaire, la filtrer sur dusable et des fibres de polypropylèneavant de la traiter aux UV et de l’au-toclaver dans les biberons…

Quatrième méthode : autoclaverl’eau brute, puis la filtrer pour élimi-ner les dépôts…

Cinquième méthode : utiliser del’eau adoucie ou de l’eau distillée enévitant l’eau osmosée inverse…

Sixième méthode : acidifier l’eaudure…

Septième méthode : filtrer à22 microns malgré le coût et la colo-nisation des filtres par desmicroorganismes)…

Huitième méthode : éviter l’eaudéminéralisée qui n’est pas compa-tible avec la vie, comme l’eauosmosée inverse, et la milli Q…

On le voit, la variété des méthodes, etdes contre-vérités, montre que l’idéaln’est pas défini car les paramètres nesont pas bien cernés et les solutionsne sont pas bien fondées. Mais c’estpeut-être aussi que la compositionminérale de l’eau, si tant est qu’ellen’est pas polluée, n’a finalement pasune grande importance.

Quoi qu’il en soit, de nombreux éta-blissements, pour lever touteincertitude, abreuvent désormaisleurs rongeurs avec de l’eau osmoséeinverse, parfois filtrée à 0.22μm.Même si en Belgique celle-ci n’estpas autorisée à la consommation, ilest admis cependant ( ?) qu’elle estassez pure pour garantir un bonabreuvement à condition qu’elle necontienne pas plus de 250 mg/ desels minéraux. Son pH est de 6,5généralement, elle est exempte detout micro-organisme et ne nécessitepas de complémentation alimentaire.

Il en coulera encore beaucoup sous lepont avant que l’on sache quelle estla bonne eau, néanmoins ce seraitassez intéressant de le savoir.


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Quelle est la dose de DMSO qui est bien toléréepar les rongeurs en intra veineux ?Avec l’aide de : ■ Véronique Vives ■ Valérie Polard

Le Diméthylsulfoxide est un véhiculeclassique pour la dissolution de pro-duit non-soluble dans l’eau ou lesérum physiologique. Mais jusqu’àquelle dose demeure-t-il inoffensifpour l’animal ?

Dans leur revue de 2006, Gad et al.rapportent que des doses de 200mg/kg chez le Rat, de 1 ml/kg chez leCochon d’Inde, de 1,25 ml/kg chez leChien sont bien tolérées. Le DMSOest toujours associé à d’autres vec-teurs en ne représentant que 5% dumélange (par exemple avec : sérumphysiologique 80%, éthanol 10% etCrémophore ®EL 5%), mais on peutmonter jusqu’à 10%. Par ailleurs, laDL 50 du DMSO se situe entre 2,5 et8,9 g/kg (http://www.gaylordchemi-cal.com/bulletins/Bulletin174/Bulletin174.pdf).

On pourra d’ailleurs consulter la ficheDEM 028 de l’INRS pour constaterque le DMSO est très peu suspect detoxicité à faibles doses.

Concernant une autre question poséesur Anilab, on trouvera aussi réponsedans la revue de Gad, 2006, elleconcerne les doses bien tolérées dePEG 300 et PEG 400 chez la Souris, leRat, le Cochon d’Inde et le mini porc.

Néanmoins, dans les deux cas, il nes’agit pas des doses qui sont à lalimite de la toxicité mais des constatsd’innocuité...

Dans cette revue plus de 60 molé-cules sont référencées concernantdifférents animaux et les différentesvoies d’administration.

Bibliographie

Shayne C. Gad, Crystal D. Cassidy, NicolasAubert, Bart Spainhour and Heide Robbe,2006. Nonclinical vehicle use in studies bymultiple routes in multiple species, Int. J.Toxicol. 25, 499-521.

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TRIBUNESTAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

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Parler les mots mal

Crédit photo : E. Servoz

■ B. Andrieux

En expérimentation animale, commepartout, les mots ont un sens. Les gal-vauder, sans que ce soit grave, estsource de confusion, alors, mau-gréons un peu…

Par exemple, les mots « expérience »et « habilitation (- des expérimenta-teurs) » recouvrent des concepts dontles contours sont bien définis, maistrop souvent ils sont élargis, dans laconversation, de façon troublante aupoint de tendre vers l’erreur.

Le mot « expérience », certes, peutconcerner, dans une de ses accep-tions un ensemble de connaissancesacquises par une longue pratique as-sociée, ou non, à une fine analyse, àde minutieuses observations et à depertinentes critiques. Cette expé-rience peut servir d’appui à une rela-tive vérité, mais relative seulement,car il n’est pas impossible que cetempirisme généreux et sympathiqueconduise à des certitudes qui n’ont

rien de scientifique. L’autre acceptiondu mot concerne le test qui est réalisépour vérifier une hypothèse. C’est decette expérience la, qui a descontours parfois mous dans la bouchede certains, nous en avons tous faitl’expérience, dont nous allons parler.

Le concept d’expérience est très biendéfini, il est constituée de trois blocsindissociables : l’hypothèse, le proto-cole et la comparaison, il est doncsurprenant qu’on se laisse aller par-fois à des abus de langage qui s’écar-tent de cette définition.

L’hypothèse est le point de départ obli-gatoire de l’expérience, elle a la formed’une affirmation de type « le facteur Ajoue un rôle dans le processus B »(qu’on peut exprimer sous la formed’une question : « le facteur A joue-t-il un rôle dans le processus B ?). Leprotocole expérimental va modifier laprésence de « A », en excès ou en dé-ficit, dans le processus, toute la diffi-culté étant de s’assurer que seul lefacteur A a bien été modifié, et, enfin,au regard des résultats obtenus (ex-primés la plupart du temps sous formede valeurs chiffrées) et de leur compa-raison avec la « normale », un constatsera fait qui confirmera ou infirmeral’hypothèse de départ, et parfois ou-vrira une nouvelle piste d’investiga-tions si les résultats obtenus ont étésurprenants.

Mais attention, nous ne devons pascéder à la facilité en qualifiant d’ex-périence toute utilisation d’animaux àdes fins scientifiques. En effet, cer-taines utilisations ne procèdent pasde la démarche expérimentale, par

exemple celles où les animaux sontutilisés comme de simples réactifsbiologiques sans surprises pourmaintenir une souche de micro-orga-nismes, pour étudier la cinétiqued’une molécule, pour titrer un com-posé ou pour élaborer des anticorps.Il est clair aussi que les procéduresqui sont destinées à fournir du maté-riel biologique, directement ou aprèscontamination des animaux, neconstituent pas des expériences. Eneffet, dans tous ces cas, font défautprincipalement la modulation du fac-teur « A », et souvent l’hypothèse estréduite à la connaissance du proces-sus dont les résultats sont en principeconnus et attendus. Il faudra doncveiller à ne réserver le terme d’expé-rience qu’à des protocoles vraimentexpérimentaux même si la nouvelledirective 2010/63 a légèrement re-culé dans la clarté de son propospuisque le titre de la directive 86/609« protection des animaux utilisés àdes fins expérimentales ou à d'autresfins scientifiques » est devenu désor-mais « protection des animaux utili-sés à des fins scientifiques ».

L’amalgame ne change en rien le faitque toutes les utilisations d’animauxdevraient être soumises à l’avis d’uncomité d’éthique, mais, on l’imagineassez bien, l’évaluation éthique sera,selon la nature des projets présentés,légèrement différente qu’il s’agissed’une expérience sensu stricto oud’une procédure où l’animal vivant nesera pas directement l’objet del’étude. Il est vrai que le titre de laCharte nationale d’éthique qui « portesur l’expérimentation animale » pour-

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rait favoriser cette approximation delangage en laissant accroire quetoutes les utilisations sont des expé-riences, ou que seules celles qui sontréellement des expériences sontconcernées par une démarcheéthique, mais la remarquable asté-risque qui est associée au titre ren-voie à une explication lumineuse quiindique que le terme « expérimenta-tion animale » est pris au sens de laréglementation en vigueur, donc à «toute utilisation d’animaux à des finsscientifiques ».

Cette précision étant faite, qu’en est-il,justement dans la réglementation del’expérimentateur habile « habilité » ?Son habileté n’est pas en cause, maisjamais dans notre pays en expérimen-tation animale il n’y a de personnes «habilitées ». Ce terme n’existe pas, ilsemblerait vouloir dire, dans l’esprit deceux qui l’utilisent encore, que des per-sonnes sont reconnues par l’adminis-tration comme suffisamment expéri-mentées pour pouvoir entreprendre desexpérimentations, dans ce cas la ré-glementation dit que ces personnes

sont « autorisées à expérimenter ». Dela même façon les zootechniciens nesont jamais habilités, mais ils doiventêtre identifiés par l’administration etavoir satisfait à des enseignements ré-glementaires en fonction de leurs acti-vités, et les établissements d’expéri-mentation animale doivent être agréés.

On le voit, les mots ont un sens, et ilserait dommage qu’il y ait une pénu-rie des sens, parce que, en un sens,c’est assez censé.

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Remerciementsà M. Berard pour la traduction decet article

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ARTICLES

■ Javier Guillén

European Activities, AAALAC International. Apdo Correos 266, 31080 Pamplona, [email protected]

RésuméCes dernières années, le processusd’accréditation par AAALAC Interna-tional en Europe soulève de plus enplus l’intérêt. Depuis 1996, AAALAC arejoint définivement la scène interna-tionale en établissant en particulierune structure européenne impliquantles activités de professionnels recon-nus des sciences de l’animal de labo-ratoire. Ceci a conduit de plus en plusd’institutions à rechercher l’accrédi-tation AAALAC en Europe.Cet article décrit la démarche d’AAA-LAC pour devenir plus européenne,mais aussi les activités européennesliées à l’accréditation des pro-grammes d’utilisation et de soins desanimaux, ainsi que l’implicationd’AAALAC dans différents forums etpublications.

IntroductionEn 1996, quand Anne-DominiqueDegryse devint la première Euro-péenne à être nommée au conseil in-ternational d’accréditation d’AAALAC(COA : AAALAC International Council onAccreditation), il était difficile d’imaginerle développement qu’AAALAC Inter-national allait avoir en Europe les an-nées suivantes. Actuellement, grâce ausoutien d’un bureau européen per-manent, une section entière du COAcomposée exclusivement de profes-sionnels européens s’occupe d’évaluerplus de 55 programmes d’utilisation etde soins aux animaux dans 15 pays eu-ropéens, et d’autres programmes dansd’autres zones géographiques tellesque l’Ile Maurice et l’Afrique du Sud. Deplus, le nombre d’institutions qui cher-chent à être accréditées par AAALACne cesse de croître.L’internationalisation d’AAALAC a suiviplusieurs étapes à partir de 1996. Toutd’abord, le nom de l’organisation achangé, et depuis, signifie "Associa-tion internationale pour l’évaluationet l’accréditation des programmes desoins aux animaux de laboratoire"(Association for Assessment and Ac-creditation of Laboratory Animal CareInternational). Précédemment, elleétait connue comme l’associationaméricaine pour l’accréditation desprogrammes de soins aux animauxde laboratoire. Le premier membreeuropéen du COA a été nommé en1996, le second en 2000 et le troi-sième en 2003. Un an plus tard, en2004, la section européenne du COA,composée de 9 membres, a été éta-blie. Depuis 2009, il existe également

Les activités de AAALAC INTERNATIONAL en Europe

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ARTICLES

une section du COA pour le Littoral Pa-cifique. Au regard de ces change-ments, un poste à temps partiel a étécréé en 2002 pour un Directeur Asso-cié pour les Activités Européennes(Associate Director of European Acti-vities), lequel s’est transformé enposte à temps plein de Directeur Su-périeur et Directeur des Activités Eu-ropéennes (Senior Director and Di-rector of European Activities ) début2008. Un Directeur Régional pour leLittoral Pacifique a aussi été nomméen 2009. Finalement, plusieurs orga-nisations européennes incluant FE-LASA, l’EFPIA, l’ESLAV et l’IAT, ont re-joint le conseil d’administration cesdernières années.

Les activités d’accréditationLa première accréditation AAALAC enEurope a eu lieu en 1986 auRoyaume-Uni, mais en 1996 seules2 institutions supplémentaires (toutesdeux françaises) avaient égalementobtenu leur accréditation. En 1996,quand AAALAC est devenue AAALACInternational, le nombre d’institutionsaccréditées a commencé à croître enEurope. Cette augmentation a étébeaucoup plus flagrante depuis que la

section européenne du COA a été éta-blie en 2004 (Figure 1). Il y a mainte-nant à peu près 60 institutions accré-ditées en Europe (Israël est inclusdans les analyses faites pour cet ar-ticle), et de nouvelles demandes sontreçues chaque trimestre. L’Allemagne,le Royaume-Uni et la France sont lespays où le plus d’institutions ont ob-tenu leur accréditation (Figure 2). Les membres européens du COA diri-gent les visites des sites et l’évalua-tion des programmes d’utilisation etde soins aux animaux dans les insti-tutions européennes, et aussi dansd’autres pays tells que l’Ile Maurice oul’Afrique du Sud. Ils peuvent éven-tuellement diriger les visites des sitesdans d’autres régions du monde. Ungroupe de 35 professionnels euro-péens experts ad hoc AAALAC ("AAA-LAC ad hoc Specialists") aident lesmembres du COA à réaliser les vi-sites de sites. Au cours du dernier tri-mestre, 4 nouvelles institutions ayantsoumis une demande d’accréditationauprès d’AAALAC International(2 d’entre elles viennent de France)ont été évaluées et le COA décidera sielles peuvent être accréditées lors desa réunion de Janvier 2011. Le COA

se réunit 3 fois par an, en janvier, maiet septembre.Les institutions qui demandent ac-tuellement une accréditation sontprincipalement issues du secteurprivé, et comprennent des compa-gnies pharmaceutiques et des centresde recherche sous-traitants. Cepen-dant, il y a déjà aussi des institutionsuniversitaires accréditées, et certainesorganisations à but non lucratif ontégalement rejoint ce processus d’ac-créditation (Figure 3). L’environnementuniversitaire est souvent plus compli-qué en termes d’organisation, et àl’avenir l’un des principaux défis pourAAALAC est de soulever l’intérêt de cetype d’institutions vis-à-vis du pro-cessus d’accréditation. Au cours dudernier congrès FELASA à Helsinki,un représentant d’une institution uni-versitaire a présenté son expérienceet les bénéfices qu’il a tirés en obte-nant l’accréditation AAALAC. Cetteprésentation a soulevé l’intérêt et lesquestions de collègues travaillantdans des institutions universitaires.Les référentiels utilisés pour évaluerles programmes d’utilisation et desoins aux animaux sont les principesdu Guide ILAR pour l’Utilisation et les

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10

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Institutions accréditées par période

Figure 1: Nombre d’institutions européennes accréditées de 1986 à 2010

1986-1995 1996-2003 2004-2010

Total cumulé

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Croatie

Israël

Pays Bas

Hongrie

Russie

Norvège

Autriche

Suisse

Belgique

Danemark

Italie

Espagne

France

UK

Allemagne

Figure 2 : Nombre d’institutions accréditées par pays européen (Israël estinclus dans le cadre de cet article).

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Soins des Animaux de Laboratoire(Guide), la convention européenneSTE123, les textes de loi applicablesaux sites visités (Directive 86/609 etloi nationale/régionale), et une listede documents spécialisés dans lesdifférents domaines des sciences del’animal de laboratoire et qui sont ap-pelés "ressources de référence“.Etant donné qu’il y a toujours des dif-férences dans les exigences régle-mentaires à travers l’Europe, les avisprofessionnels et l’utilisation de réfé-rence par objectif/performance sontindispensables pour harmoniser l’éva-luation des programmes d’utilisationet de soins. Une des conséquencesimportante de l’internationalisationd’AAALAC a été que le Guide n’estplus la seule référence, mais qued’autres, également européens, sontaussi pris en compte. Par exemple, laconvention STE123 et son Annexe Aavec ses standards par objectif/per-formance est devenue une autre desréférences les plus importantes.Une autre activité qui a été mise enplace en Europe est l’évaluation du ni-veau des programmes (ProgrammeStatus Evaluation (PSE)). Le PSE peutêtre demandé par des institutions dé-s i -

rant obtenir l’accréditation, et qui veu-lent tout d’abord avoir une pré-éva-luation de leurs programmes d’utili-sation et de soins des animaux. Dansce cas, cette évaluation sera réaliséepar le(s) directeur(s) supérieur(s)d’AAALAC et des anciens membresdu COA, indépendamment du futurprocessus d’accréditation réalisé parles membres du COA. Au cours del’année 2010, une PSE a été réaliséeen Europe.

Représentation InternationaleAAALAC est représentée de différentesmanières à de nombreux congrès na-tionaux ou internationaux sur lessciences de l’animal de laboratoire,des cours ou des ateliers à traversl’Europe : en participant à des sémi-naires, en ayant un stand dans les ex-positions, ou en combinant ces 2 typesde représentation. Par exemple, AAA-LAC a participé cette année pour latroisième fois consécutive à l’exposi-tion AFSTAL. Des présentations ontaussi été données lors d’autrescongrès scientifiques, tel que le "2010Transgenic Technology meeting" àBerlin et le “2010 IUTOX Meeting" àBarcelone, pour essayer de tisser des

liens entre la communauté dessciences de l’animal de laboratoire etles autres disciplines scientifiques. La participation d’AAALAC a été par-ticulièrement importante lors du der-nier congrès FELASA à Helsinki oùplusieurs présentations eurent lieudans le cadre du programme scienti-fique : l’amélioration des programmesd’utilisation et de soins des animauxgrâce aux revues AAALAC, l’accrédi-tation AAALAC du point d’une institu-tion universitaire, et l’accréditationAAALAC des programmes asiatiques.Il y avait un stand AAALAC dans lazone d’exposition, et également unséminaire d’orientation pour les "adhoc specialists" européens.La commission européenne a pris encompte AAALAC lors de la création dugroupe de travail chargé d’établir leclassement éthique des procédures.Un membre du COA représentait AAA-LAC à ce groupe de travail, dont lesrecommandations ont servi de base àla révision de l’une des annexes de laDirective 86/609.AAALAC a aussi été représentée à unautre groupe de travail soutenu parl’EFPIA et FELASA, et qui a établi lescritères de l’étude de faisabilité del’utilisation des F2 de primates nonhumains, demandée par la nouvelleDirective. Le but de cette initiative aété d’offrir à la Commission Euro-péenne des conseils sur la façon deréaliser une telle étude.

Conférence européenne AAALACAAALAC International a organisé sapremière conférence européenne le4 mai à Rome (Italie). 125 profession-nels de l’animal de laboratoire venusde 18 pays ont assisté à cette confé-rence. La discussion portait sur lesapproches utilisées pour réaliser une

Figure 3 : Distribution des institutions accréditées en Europe par typed’activités

Compagniespharmaceutiques

32Centres de Recherche

sous-traitants12

A but non lucratif

5

Accadémiques5

Eleveurs5

Autresprivés

2

revue éthique, et les perspectives ontété partagées avec les représentantsde 8 institutions accréditées AAALACet un membre de la commission eu-ropéenne. La conférence a aussifourni une information liée à l’Hygiène,la Sécurité et la Santé au Travail, l’uti-lisation de référence par objectif/per-formance, et les tendances identifiéesdepuis les 6 dernières années de vi-sites AAALAC à travers l’Europe.Les présentations données pendantcette conférence sont toujours dispo-nibles à la page web suivante :http://www.aaalac.org/resources/Eu-rope/EuropeanConference_Login.cfm.Le login doit être demandé par emailen contactant Dr. Javier Guillen à[email protected]

Etant donné l’intérêt soulevé par cettepremière conférence européenne, ilest dans l’intention d’AAALAC d’en or-ganiser d’autres régulièrement, en es-sayant d’aborder le plus de sujetsd’actualité des sciences de l’animalde laboratoire qui pourraient influen-cer le processus d’accréditation desinstitutions européennes.

PublicationsLa Newsletter de l’ESLAV inclut régu-lièrement une mise à jour des activi-tés d’AAALAC en Europe. Cette com-munication est importante car ellefacilite le transfert d’informationsentre AAALAC et les adhérents de l’undes membres du conseil d’adminis-tration européen d’AAALAC.

Un article a été publié dans le numérode Février du journal LabAnimal, surl’utilisation par AAALAC Internationalde standards par objectif/perfor-mance, pour évaluer les revueséthiques dans les institutions euro-péennes. L’article expliquait com-ment dans le contexte européen, oùcoexistent plusieurs approches diffé-rentes de la revue éthique, l’utilisationde standards par performance est in-dispensable pour évaluer commentelles fonctionnent en pratique. AAA-LAC peut accepter différentes façonsde faire les choses, y compris enterme de revue éthique, en considé-rant toujours que le résultat final estbien défini et celui attendu.

ARTICLESSTAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

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Crédit photo : JL Guénet

■ Jean-Louis Guénet1

Fernando Benavides2

1 [email protected] de Service honoraire à l'Institut Pasteur àParis

2 [email protected] Agrégé au M.D. Anderson Cancer Cen-ter, Smithville, Texas USA

Que ce soit pour obtenir un grandnombre d'embryons à un stade pré-coce du développement ou pourconstruire des chimères tétraparen-tales faciles à identifier dès la nais-sance, les techniques de productiond'animaux génétiquement modifiésimpliquent presque toujours le croi-sement de souris appartenant à des li-gnées consanguines différentes. Laconséquence directe de ces croise-ments tous azimuts est que l'on voittrès souvent apparaître dans la des-cendance des souris transgéniques,parfois à plusieurs générationsd'écart, des variantes dans la colora-tion de la robe des animaux. Ce festi-val de couleur ne manque jamaisd'impressionner les expérimentateursqui, selon les cas, sont admiratifs d'unphénotype nouveau et séduisant ouau contraire soupçonneux sur le degréde pureté des lignées utilisées. En ef-fet, rien plus qu'une portée de souri-ceaux dans laquelle existent des va-riations de la pigmentation ne peutéveiller la curiosité ou la suspicion,surtout si apparaissent des couleursinhabituelles et n'étant pas suppo-sées exister chez les parents ....

Toutes ces variations de couleur ré-sultent de l’action individuelle d'unpetit nombre d'allèles aux locus im-pliqués dans le déterminisme de lapigmentation du pelage et traduisent,à leur manière, le passé "génétique"des individus observés. Nous allonsessayer de faire une présentationsimple de la situation, avec quelquesexemples choisis de telle sorte quechacun retrouvera peut-être une si-tuation vécue ... et, espérons-le, l'ex-plication qui va avec.

1. – Les gènes qui gouvernent lapigmentation des rongeursLa coloration du pelage des mammi-fères1 est déterminée par cinq locus2

majeurs désignés par les symbolesA, B, C, D et P, par les généticiens dudébut du vingtième siècle (références1 et 2)3. Dans l'ensemble des diffé-rentes lignées consanguines de sou-ris (et de rat) de laboratoire, deux ourarement trois formes alléliques diffé-rentes ont été identifiées à ces cinqlocus et ce sont les combinaisons deces diverses formes alléliques qui dé-terminent les variations de la couleurde la robe que l'on peut observer4. Au


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Pourquoi on en voit de toutes les couleurs ...?… une présentation simplifiée de la génétique de la pigmentation chez la souris, destinée à expliquerl'apparition de phénotypes inhabituels dans les progénitures de souris transgéniques.

1 Ce que nous allons décrire à propos de la pigmentation chez la souris est valable pour la plupart des mammifères.2 Pour le pluriel de locus, il est d'usage d'utiliser locus ou loci. Locus a néanmoins été recommandé par les rectifications orthographiques de

1990. Nous nous conformerons à ces recommandations dans cet article.3 Parmi les généticiens du début du vingtième siècle deux plus que les autres méritent d'être mentionnés pour leurs travaux avec la souris

comme modèle expérimental. Le premier est Lucien Cuénot, Professeur de Biologie animale à l'Université de Nancy, qui démontra dès 1902,que les lois de Mendel découvertes avec les pois étaient aussi applicables aux souris et par conséquent aux animaux. Pour cela il utilisa des"souris de compagnie", de pigmentation variée (souris blanches, jaunes, noires, tachetées, etc...) et retrouva dans la descendance des proportionsmendéliennes classiques. Grâce à Cuénot et à ses travaux on peut dire que la génétique de la souris est née en France. Le second généticienest Clarence C. Little, le fondateur et premier Directeur du célèbre Jackson Laboratory, qui établit, à partir de 1909, la première lignée consan-guine de souris (la lignée DBA) en associant, dans un même génome, les allèles récessifs de coloration : d, b et a.... la lignée DBA/2 est tou-jours très utilisée de nos jours.

4 Dans cet article, nous nous limiterons aux lignées consanguines de souris les plus fréquemment utilisées. La pigmentation du rat est gouver-née par les gènes homologues des gènes de la souris avec, en plus, un allèle (hooded - ho - lignée Long Evans et August) qui ne se rencontrepas dans les lignées consanguines de souris.

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delà de ces cinq locus, d'autres gèneset un très grand nombre d'autres al-lèles ayant un effet sur la colorationdu pelage (couleur proprement dite,intensité, reflets, tâches, brigeures5,etc.) ont été identifiés, en général sousforme de mutations survenues spon-tanément dans les élevages, mais ilsne se rencontrent pas dans les lignéesmajeures et nous n'en parlerons doncpas6.Pour rendre les choses le plus simplepossible, nous allons commencer parexpliquer comment s'établit la pig-mentation et à quel niveau les diffé-rents gènes exercent leur action. Ilfaudra simplement retenir que les al-lèles impliqués dans le déterminismede la pigmentation, contrairement àbeaucoup d'autres, sont toujours to-talement exprimés. Pour rendrecompte de cette caractéristique lesgénéticiens disent que leur expressi-vité est complète. En termes simplescela veut dire, par exemple, que l'al-lèle "albinos", récessif, lorsqu'il est àl'état homozygote, entraîne toujoursun phénotype blanc pur, avec œil rose,sans aucune variations d'intensité.

1.1. - Les mélanines à la base detoutLes molécules de base de la pigmen-tation sont les mélanines. Ce sont desmacromolécules biologiques pro-duites par des cellules spécialiséesde l'épiderme, les mélanocytes, stoc-

kées et transportées à pied d'œuvredans des organites intracellulaires euxaussi spécialisés : les mélanosomes.Il existe deux types (principaux) demélanine : l'eumélanine - un pigmentnoir/brun foncé - produit par conden-sation de monomères formés à partirde la tyrosine et la phæomélanine - unpigment jaune - produit par conden-sation de monomères à base de tyro-sine et de cystéine. La synthèse desmélanines est relativement complexeet certaines étapes ne sont pas en-core totalement élucidées. La molé-cule de départ est la tyrosine, qui estd'abord convertie en 3,4-dihydroxy-phénylalanine ou DOPA, puis en DO-PAquinone. Ensuite, la synthèse del'eumélanine ou de la phæomélaninedépend de la présence ou non de cys-téine. Pour se former, ces macromo-lécules ont donc besoin d'une enzymeactivant l'oxydation de la tyrosine :c'est la tyrosinase.Chez un mammifère normal, les deuxformes de mélanines sont produitesensemble et sont réparties différem-ment selon les différents tissus. Dansl'œil, par exemple, il y a surtout del'eumélanine et c'est pour cette raisonqu'il apparaît presque toujours noirintense lorsque la souris est pigmen-tée. Dans le poil, par contre, les deuxformes de mélanines sont produites etharmonieusement mélangées avecdes variations génétiquement déter-minées dont nous parlerons.

1.2. - Le gène de la tyrosinase etl'albinisme : être ou ne pas être ...(pigmenté) !Lorsque le gène C (aujourd'hui sym-bolisé par Tyr, pour tyrosinase - chro-mosome 7)7 est inactif, les mélaninesne sont plus produites, c'est l'albi-nisme - la souris est uniformémentblanche avec les yeux rouges8. L'albi-nisme est une des plus vieilles muta-tions connues chez la souris et prati-quement toutes les lignées albinos desouris de laboratoire (A, AKR, BALB/c,FVB, SJL,...) ont le même allèle an-cestral9. Ceci n'est d'ailleurs pas sur-prenant si l'on considère qu'une robeblanche est évidemment plus sédui-sante et convient mieux à un animalfavori que le pelage sauvage, moins"clean". Les scientifiques ne s'en plai-gnent d'ailleurs pas non plus, tant ilest vrai qu'il est plus facile de trouverune veine caudale, pour y faire une in-jection, sur une souris albinos que surune souris pigmentée.Les souris de certaines sous-lignéesdu groupe 129 (mais de certainessous-lignées seulement) portent à lafois l'allèle albinos classique (c ouTyrc) et un autre allèle au locus Tyr quel'on appelle chinchilla (cch ou Tyrch)pour rappeler l'aspect du pelage desanimaux mutants. Nous reviendronssur ce point car les sous-lignées enquestion, qui sont très utiliséescomme source de cellules embryon-naires totipotentes (cellules ES), por-

5 Bandes ou rayures de poils foncés dans la robe – très évidentes chez le boxer "bringé".6 Le lecteur intéressé pourra consulter le site http://www.informatics.jax.org/ - puis commander "coat color". Il se verra retourner plusieurs cen-

taines de génotypes …. Avec, heureusement, beaucoup de redondances.7 Dans cet article, nous donnerons, dans tous les cas, les deux symboles correspondants aux locus impliqués dans la pigmentation : l'ancien, tra-

ditionnel et le moderne. Les deux écritures sont correctes tant qu'elles ne conduisent pas à des ambigüités. Mais il est vrai qu'il est plus rapided'écrire c que Tyrc.

8 A vrai dire l'œil est, lui aussi, "non pigmenté" et c'est la couleur des vaisseaux sanguins qui, par transparence, lui confère la couleur "rouge".Ceci explique pourquoi l'œil change de couleur après le sacrifice des animaux albinos.

9 L'albinisme est également rencontré dans de nombreuses espèces de mammifères, homme compris, même s'il ne s'agit pas toujours de mu-tations au même locus Tyr.


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tent aussi d'autres allèles ayant uneinfluence sur la coloration.L'allèle Tyrc masque les effets de tousles autres allèles impliqués dans lapigmentation (on dit qu'il est épista-tique sur tous les autres gènes). Celaveut dire qu'une souris homozygoteTyrc/Tyrc apparaîtra albinos quel quesoit l'assortiment d'allèles qu'elle peutavoir par ailleurs, dans son génome.Cette observation est importante carles allèles masqués par l'épistasiecontinuent néanmoins de ségréger ensilence dans la population, pendantun nombre indéterminé de généra-tions, et peuvent donc resurgir à tousmoments et révéler leurs effets lors-qu'ils sont dans un contexte ou la ty-rosinase est active. Un exemple de ceque nous venons de dire pourrait setrouver illustré en observant la des-cendance d'un croisement entre unesouris "albinos" d'un stock nonconsanguin (par exemple CF1, NMRI,OF1, Swiss, etc..) et une souris noirede lignée C57BL/6 dans laquelle il nefaudrait pas être surpris de trouverdeux couleurs de robe : le gris (agouti)et le noir (non-agouti) !Les mutations spontanées au locusTyr sont rarissimes (taux inférieur à10-6 par gamète). Il en existe néan-moins toute une collection, dans desfonds génétiques très variés (ce sontdes lignées co-isogéniques10), quipeuvent se révéler très utiles. Ainsi, onpeut créer au laboratoire des chi-mères tétraparentales albinos pig-mentées en injectant dans la cavitéd'un blastocyste C57BL/6 - Tyrc/Tyrc

(albinos) des cellules ES génétique-ment modifiées provenant de souris

C57BL/6 Tyr+/Tyr+ normalement pig-mentées. Ceci présente l'avantage detravailler dans un fonds génétique-ment uniforme tout en permettant dereconnaître très facilement l'originedes cellules ayant participé à laconstitution de la chimère.

1.3. - Le gène Agouti Pour un harmonieux mélange desgenres (… de mélanines !)Le gène agouti a été dénommé ainsiparce que ses effets sur la pigmenta-tion confèrent aux animaux une robequi les fait ressembler au rongeursud-américain agouti (ou acouchi). Lesymbole générique est A (chromo-some 2) et le gène possède un trèsgrand nombre d'allèles. Dans les li-gnées de souris de laboratoire les pluscommunes seuls trois allèles sontprésents : A l'allèle sauvage, a (non-agouti) un allèle récessif et Aw (lightbellied agouti ou white bellied agouti)l'allèle le plus dominant des trois, pré-sent seulement dans les lignées 129.Le locus agouti gouverne la répartitionde la mélanine dans le poil et danscertains autres organes ou tissus.Dans un poil d'une souris de phéno-type sauvage, celui d'une souris C3Hou CBA par exemple, il existe troiszones : une zone basale, noire ou trèsfoncée, colorée principalement parl'eumélanine, une zone apicale, demême couleur que la zone basale etpour finir une bande subapicale ouintermédiaire, de couleur jaune et co-lorée surtout par la phæomélanine (Fi-gure 1). Pour percevoir les effets desallèles A et a au niveau du pelage, ilsuffit de souffler à rebrousse poil dans

la toison d'une souris C3H ou CBA etde faire la même chose dans la toisond'une souris de lignée C57BL/6 : ondécouvrira alors l'illustration de ladescription que nous venons de faire :un poil uniformément pigmenté denoir chez la souris C57BL/6 et troisbandes chez la souris C3H. C'est trèsclair ...! (Figure 1)Un petit coup de ci-seau dans la toison serait encore plusdémonstratif puisqu'il laisserait unemarque pendant quelques jours chezla souris C3H (la bande apicale étantéliminée) mais pas de marque chez lasouris C57BL/6. Essayez ... !L'allèle Aw, se trouve dans toutes lessous-lignées du groupe 129. Ses ef-fets sont les mêmes que ceux du lo-cus A pour la toison dorsale, parcontre la couleur du ventre des ani-maux est notablement éclaircie tiranttantôt sur le jaune tantôt carrémentsur le blanc. Les effets de l'allèle Aw

ne sont perceptibles, bien sûr, quechez les souris du groupe 129S1 à129S8 qui ne sont pas albinos ouchinchilla par ailleurs11.

10 Ces lignées co-isogéniques sont très nombreuses et résultent toujours de mutations survenues dans une lignée consanguine et élevée à part.Dans ce cas un seul locus diffère entre les deux lignées qui peuvent être importées si besoin est du conservatoire du Jackson Laboratory -http://jaxmice.jax.org/

11 Pour une explication relative aux génotypes des différentes sous-lignées 129 il est recommandé au lecteur de se reporter au site : http://www.in-formatics.jax.org/mgihome/nomen/strain_129.shtml

Figure 1: Le schéma représente deux poils préle-vés dans la région dorsale d'une souris. Le poil"sauvage" (à droite), est celui d'une souris agouti(CBA ou C3H par exemple). Il possède une bandesub-apicale de phæomelanine alors que l'extré-mité (l'apex) et la base sont noirs (eumélanine). Lepoil non-agouti (à gauche) est entièrement noir(eumélanine).

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Le gène Agouti est un petit gène (18kb- quatre exons, dont trois codants).Lorsque la mutation non agouti (a),que l'on observe dans les lignéesconsanguines de laboratoire C57BL/6,C57BL/10 ou NZB entre autres, setrouve à l'état isolé (c'est-à-dire horsde l'influence d'aucun autre allèle) : lasouris est toute noire poil et œil com-pris et c'est à peine si l'on peut voir,sur le ventre des animaux, à la ren-contre des toisons dorsales et ven-trales, et dans le pavillon de l'oreille,quelques poils jaunes.Cet allèle a, non agouti, qualifié d'his-torique, est la conséquence de l'inser-tion d'un ADN d'origine virale (pour lesspécialistes, il s'agit d'une insertion,de type VL30 de 5.5kb, dans le premierintron du gène). L'insertion a provo-qué un remaniement de la séquenced'ADN empêchant la transcription cor-recte du gène (l'ARN transcrit est pluscourt et huit fois moins abondant chezla souris mutante a/a que chez la sou-ris normale). Cependant, il n'est pasrare que l'insertion se détache de soncontexte génomique, le gène peutalors, dans certains cas, reverser versune forme fonctionnelle et l'on voitalors apparaître une souris Agouti(Am/a) dans une portée de souriceauxnoirs. Impressionnant vraiment ! Nousavons observé, par deux fois, un telévénement dans notre laboratoire etnous avons pu confirmer qu'il s'agis-sait bien d'une mutation réverse et pasd’une toujours redoutée contaminationgénétique. Ici encore, une sourisC57BL/6-Am co-isogénique peut avoirun intérêt pour marquer un lignagecellulaire particulier.

1.4. - Le gène dilute : une questiond'organisation (… des moléculesde mélanines !)Le gène dilute (chromosome 9 - sym-bole ancien d - devenu Myo5a unefois le gène identifié au niveau molé-culaire) dilue la couleur de la robe. Al'origine, cette mutation était connuesous le nom de dilution maltese pourrappeler la robe de certains chats del'île de Malte. Le phénotype de dilutionest dû à l'agglutination des grains demélanine en grains plus gros et plusirréguliers ce qui, vu à l'échelon ma-croscopique, donne l'impression d'unéclaircissement de la pigmentation.Beaucoup d'allèles ont été identifiésau locus dilute, certains s'accompa-gnent de manifestations patholo-giques avec des effets neurologiquesou des effets sur le système immuni-taire12. L'allèle dilute qui ségrége dansles lignées de laboratoire (essentiel-lement les lignées DBA/1 et DBA/2)n'a d'effets que sur la pigmentation.Ici encore, comme dans le cas de lamutation non agouti (a) décrite plushaut, la mutation dilute originale estdue à l'intégration d'un virus onco-gène écotropique (pour les spécia-listes, il s'agit d'un ecotropic murineleukemia virus - Emv3). Le virus estinséré dans une région d'ADN non co-dant et les réversions sont bien moinsfréquentes que celles du locus A. Lamutation dilute ancestrale (Myo5ad)est, nous l'avons dit, à l'état homozy-gote dans la lignée DBA/2 mais, dansle génome des souris de cette lignée,elle n'est pas la seule mutation ayantune influence sur la pigmentation. Siles souris DBA/2 n'étaient pas "di-

lute" elles auraient une robe d'unecouleur très proche de celle du cho-colat (Figure 3). Chez ces souris, lapigmentation observée est la résul-tante de trois allèles récessifs : a, bque nous allons considérer ci-des-sous et d. Contrairement à ce qui sepasse pour les locus agouti et albinos,aucune lignée consanguine de sourisn'est homozygote seulement pour lamutation d (Myo5ad)13.

1.5. - Le gène brown : tout en demi-teinte...Les mutations au locus brown (chro-mosome 4 - symbole ancien b - de-venu Tyrp pour Tyrosinase relatedprotein) ont pour effet d'éclaircir l'eu-mélanine qui devient brune au lieu denoire à l'état sauvage. Il en résulte, iciencore, une dilution de tout le pelagemais cette dilution est de nature fon-damentalement différente puisque,dans le cas de brown, elle est laconséquence d'une mélanine de cou-leur différente alors que pour dilute,elle est due, nous l'avons mentionné,à la compaction des pigments. La mu-tation brown (Tyrpb) est la même danstoutes les lignées de laboratoire oùelle est fixée à l'état homozygote : ils'agit de l'allèle ancestral. Dans ces li-gnées, et comme pour dilute, ellen'est pas seule mais au contraire as-sociée soit à l'albinisme (c) (A,BALB/c, …) et dans ce cas on ne per-çoit pas ses effets (épistasie), soit ànon agouti (a) et dilute (d) (DBA/1 etDBA/2).

12 La maladie de Griscelli de l'homme, ou Chediak-Higashi-like syndrome, OMIM 214450, est une maladie immunitaire très grave mais heureu-sement rare, dont un allèle de la série dilute est le modèle parfait chez la souris.

13 Chez la souris, il existe une autre mutation, leaden (ln - Chr1) dont les effets sont strictement analogues à ceux de dilute. La lignée C57L esthomozygote pour cette mutation (et pour a, comme toutes les souris consanguines du groupe C57).


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1.6. - Le gène pink-eyed : la vie enrose ...La mutation pink-eyed dilution (chro-mosome 7 - symbole ancien p - de-venu Oca2 - pour oculocutaneous al-binism II) dilue elle aussi la couleur dela robe. Ici encore, ce locus comportede très nombreux allèles ayant un ef-fet plus ou moins prononcé sur la pig-mentation du pelage et de l'œil. Sil'on se réfère aux estampes japo-naises traitant du sujet, la mutationpink-eyed dilution est connue depuisles temps les plus reculés. Elleconfère aux yeux des animaux homo-zygotes une très belle coloration roserubis (et non pas rouge comme dansle cas de l'albinisme Tyrc) et c'est trèsprobablement pour cette raisonqu'elle a fait partie des allèles sélec-tionnés par les collectionneurs de "petanimals". Le pelage des sourisOca2p/Oca2p est dilué assez sensi-blement et on observe que la dilutionest essentiellement due à une dimi-nution de synthèse de l'eumélaninetandis que la synthèse de la phæo-mélanine se maintient à un niveauquasi normal. Les allèles récessifs aulocus P sont très peu représentésdans la panoplie des lignées de labo-ratoire (SJL et 129/J seulement) et,dans les deux cas leurs effets sontmasqués par une interaction épista-tique avec l'allèle albinos Tyrc. Lessouris de génotype a/a; p/p - a/a; d/d;p/p ou a/a; b/b; p/p; que l'on ren-contre assez fréquemment sur lesmarchés aux fleurs ont parfois desnoms romantiques "lilas" – "cham-pagne" – "bleue" – "café au lait"etc… leur rareté (qui va de pair avecle plus grand nombre d'allèles réces-

sif à l'état homozygote) contribue àfaire monter le prix !Pour conclure avec le locus pink eyeddilution - Oca2p, il faut savoir qu'il estporté par le même chromosome 7 quele locus Tyrc. Dans la plupart des cas,nous l'avons dit, les souris qui sontOca2p/Oca2p sont aussi Tyrc / Tyrc,elles sont albinos, et par conséquentcela n'attire l'attention de personnejusqu'au jour où se produit une re-combinaison14 entre les deux locusOca2p et Tyrc car c'est à ce moment-là qu'apparaît un phénotype totale-ment inattendu … nous en reparle-rons !Après cette description analytique del'effet des cinq locus majoritairementimpliqués dans la pigmentation, nousallons à présent décrire le génotypedes différentes lignées consanguines.Munis de ces renseignements fonda-mentaux nous pourrons alors prédirece à quoi on peut s'attendre dans ladescendance d'un croisement entredeux de ces lignées ou, inversement,nous pourrons reconstituer la généalo-gie la plus vraisemblable à partir desrobes observées dans une progéniture.

2. - Le génotype des quatorze prin-cipales lignées consanguines desourisLe tableau 1 présente, de manière sy-noptique, le génotype des quatorzeprincipales lignées consanguines desouris pour chacun des cinq locusmajeur de la pigmentation. Sur ce ta-bleau, il faut remarquer que la lignée129/J présente la particularité raris-sime (et à vrai dire paradoxale) de sé-gréger pour deux allèles (c et cch) aulocus Tyr. Cette particularité a une ex-

plication historique si l'on se souvientque la lignée 129/J a été utilisée parLeroy C. Stevens pour mettre au pointles transplantations d'ovaires chez lasouris. Leroy Stevens, en effet, greffaitdes ovaires de souris de génotype c/cdans les bourses ovariques de sourisde génotype cch/cch, ayant une robebien plus foncée et pouvait ainsi sa-voir, d'un seul coup d'œil15 et aprèsaccouplement avec un mâle c/c, sil'embryon produit dérivait du greffonou d'un reliquat d'ovaire de l'hôteayant servi de "porte greffe" …. Lefait que les souris de la lignée 129/Jsoient totalement consanguines bienque ségrégeant pour deux allèles dif-férents au locus Tyr, garantissait apriori une totale histocompatibilitéentre le greffon et la souris receveuseet permettait donc d'évaluer la tech-nique de la greffe per se sans obs-curcir le tableau par des problèmes derejet immunitaire. Astucieux … non ?Le tableau 2 donne le génotype desF1 qui pourraient naître des croise-ments interlignées s'ils étaient réali-sés effectivement. Les F1 notés engras sont les plus utilisés pour des rai-sons pratiques… ou commerciales !Jusqu'ici, les choses ont donc étésimples et elles le resteront (autre-ment dit, on aura aucune surprise)tant que l'on se bornera à faire descroisements simples et directs, c'est-à-dire entre lignées pures. Par contre,dès que l'on va croiser des F1 leschoses vont se compliquer beaucoupcar les allèles récessifs de colorationvont s'exprimer dans la descendanceet ceci en fonction d'associations sefaisant au hasard ... le feu d'artifice vacommencer ! Nous allons prendre

14 Les deux locus étant distants de 20 centiMorgans environ, un gamète sur cinq seulement est recombinant. Etant donné que les effets d'Oca2p

sur la pigmentation de la robe ne seront perçus que lorsque l'haplotype recombinant sera à homozygote pour Oca2p on conçoit que cela puisseprendre plusieurs générations …. d'où la surprise !

15 Un œil, même peu exercé, reconnaîtra facilement les trois génotypes c/c – c/cch et cch/cch.

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Lignées Locus A Locus B Locus C Locus D Locus P Robe129S1 à S8 Aw/Aw B/B C/C D/D P/P Light belied Agouti

129P1, P2, P3 Aw/Aw B/B cch/c D/D p/p Blanc crème œil rubis129T1 et T2 Aw/Aw B/B cch/c D/D P/P Gris chinchilla

A a/a b/b c/c D/D P/P AlbinosAKR a/a B/B c/c D/D P/P Albinos

BALB/c A/A b/b c/c D/D P/P AlbinosC3H A/A B/B C/C D/D P/P Agouti

C57BL/10 a/a B/B C/C D/D P/P NoireC57BL/6 a/a B/B C/C D/D P/P Noire

CBA A/A B/B C/C D/D P/P AgoutiDBA/1 a/a b/b C/C d/d P/P Chocolat au laitDBA/2 a/a b/b C/C d/d P/P Chocolat au laitFVB A/A B/B c/c D/D P/P AlbinosNZB a/a B/B C/C D/D P/P NoireSJL A/A B/B c/c D/D p/p Albinos

Tableau 1 : Présentation synoptique du génotype des quatorze principales lignées consanguines de souris pour chacun des cinq locus majeur de la pigmentation.Le locus A est porté par le chromosome 2 - le locus B par le chromosome 4 - les locus C et P sont sur le même chromosome 7 à 20 cM d'intervalle - le locusD est sur le chromosome 9. Tous ces locus ont une nomenclature officielle définie dans le texte.

Tableau 2 : Génotype de différentes hybrides F1.Le signe * indique qu'il y aura deux couleurs (albinos et crème) dans les portées car un des parents est hétérozygote cch/c.

Lignées 129S1 à S8129P1 à P3

A AKR BALB/cC3H

ou CBA

C57BL/6ou

C57BL/10

DBA/1 ou DBA/2

FVB NZB SJL

129S1 à S8 -

129P1 à P3Light belied

Agouti-

ALight belied

AgoutiBlanc crèmeou blanc *

-

AKRLight belied

AgoutiBlanc crème ou blanc *

Albinos -

BALB/cLight belied


Albinos Albinos -

C3HLight belied

AgoutiLight belied

AgoutiAgouti Agouti Agouti -

C57BL/10Light belied

AgoutiLight belied

AgoutiNoire Noire Agouti Agouti -

C57BL/6Light belied

AgoutiLight belied

AgoutiNoire Noire Agouti Agouti Noire

CBALight belied

AgoutiLight belied

AgoutiAgouti Agouti Agouti Agouti Agouti Agouti

DBA/1Light belied

AgoutiLight belied

AgoutiChocolat Noire Brown Agouti Noire

Chocolatau lait

Agouti

DBA/2Light belied

AgoutiLight belied

AgoutiChocolat Noire Brown Agouti Noire

Chocolatau lait

Agouti Noire

FVBLight belied


Albinos Albinos Albinos Agouti Agouti Agouti - Agouti Albinos

NZBLight belied

AgoutiLight belied

AgoutiNoire Noire Agouti Agouti Noire Noire Agouti - Agouti

SJLLight belied


Albinos Albinos Albinos Agouti Agouti Agouti Albinos Agouti -


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deux exemples qui correspondent àdes situations concrètes, communeset assez fréquentes.

3. - Deux exemples pour illustrer lepropos3.1. - Premier exemple : la produc-tion de souris transgéniques parinjection in ovo d'ADNs linéarisés :du classique !Dans de nombreux cas l'expérimen-tateur induit la super ovulation chezdes souris femelles impubères hy-brides entre C57B/6 et SJL (autre-ment dit B6SJF1, si la mère de ces F1est de la lignée C57BL/6) ou C57BL/6et DBA/2 (autrement dit B6D2F1). Il lesaccouple ensuite avec des mâlesC57BL/6 (par exemple) et récolte debeaux œufs stade 1 dans les pronu-cleus desquels il injecte l'ADN linéa-risé et retrouve finalement un pour-centage assez élevé de nouveau-néstransgéniques. L'expérience est unsuccès. Mais à partir de maintenant ilfaut savoir que les nouveau-néstransgéniques ségrègent pour les al-lèles A/a au locus A, C/c au locus del'albinisme et P/p au locus pink-eyeddilution, si les petites femelles F1étaient B6SJF1 - ou qu'ils ségrègentpour les allèles B/b au locus B, D/d aulocus dilute, si les petites femelles F1étaient B6D2F1 - et que ces allèlesrisquent bien de "ressortir" un jourau hasard des croisements ..... et cecià plusieurs générations d'écart. Si lessouris transgéniques une fois recon-nues, testées, caractérisées et esti-mées convenables au regard de l'ex-pression du transgène, sont croiséessystématiquement avec des souris delignées pures (des souris de lignéesC57BL/6 par exemple ou C3H) au-cune surprise n'est à attendre : pas-sée la deuxième génération, les sou-

ris à venir seront toujours de la cou-leur de la lignée choisie pour consti-tuer le fonds génétique (noire dans lecas de C57BL/6). Par contre, si cesont des frères ou des sœurs destransgéniques qui sont croisés entreeux pour assurer la propagation dutransgène, alors, il ne faudra pas êtresurpris de retrouver, plus tard, un al-lèle de coloration à l'état homozygotequi donnera un phénotype inhabituel :par exemple une souris de couleurchocolat (a/a, b/b ...) ou gris acier(a/a, d/d ...) ou ... des couleurs quin'existent pas dans les lignées pa-rentales. Cette situation est une desplus classiques, elle se produit sou-vent lorsque la lignée transgéniqueest importée d'un autre laboratoire,sous la forme de géniteurs ayant unerobe "classique" et que, brutalement,un phénotype inattendu apparaît.

3.2. - Deuxième exemple : la pro-duction de souris génétiquementmodifiées à partir de cellulessouches embryonnaires (cellulesES)Les cellules embryonnaires utiliséespar les généticiens pour l'invalidationde gènes (knockout), ou pour d'autresmanipulations plus complexes du gé-nome, sont issues d'un petit nombredes lignées consanguines seulement.A l'origine, il n'existait de cellules ESque de la lignée 129 (129/Sv ou129/J) depuis, d'autres lignées ontété établies (C3H, BALB/c, C57BL/6,etc ...). Si l'on souhaite que ces li-gnées cellulaires, maintenues et ma-nipulées in vitro, se matérialisent dansun organisme vivant autonome (c'est-à-dire une souris), il faut qu'elles par-ticipent, d'abord, à la formation d'unechimère allophénique tétraparentale –autrement dit à la formation d'une

souris produite par agrégation d'unembryon normal avec les cellules ESgénétiquement modifiées – et que cescellules ES en question participent à laformation de la lignée germinale de lachimère. Pour repérer facilement lesanimaux chimériques puis l'originedes embryons nés de cette chimère(cellules ES ou embryon normal), lesgénéticiens choisissent en générald'associer aux cellules ES un embryonde phénotype très différent qui permetla reconnaissance rapide du chimé-risme sans se soucier des autres al-lèles de coloration du pelage. Mal-heureusement, même si tous lescroisements et toutes les manipula-tions sont soigneusement consignésdans les cahiers de laboratoire, il estclair qu'il peut y avoir dans la chi-mère un mélange assez complexed'allèles de coloration et que tout celane demande qu'à s'exprimer un jourou l'autre au hasard des croisementsà venir. L'affaire se complique assezsouvent lorsqu'une souris porteused'un allèle knock-out est importéedans un laboratoire nouveau, avecune fiche génétique très abondam-ment documentée en ce qui concernela technique du knock-out, mais oùrien n'est expliqué au sujet des croi-sements ayant servi à produire le spé-cimen importé et c'est évidemmentdans ce cas qu'apparaissent des phé-notypes inattendus. Dans ce cas clas-sique, le "knockout" est le centre d'in-térêt majeur, le fonds génétique n'estpas pris en compte : un arbre cache laforêt !

4. – Quelques conseils… en guisede conclusion !L'observation d'un phénotype nou-veau et inhabituel dans la descen-dance d'une souris transgénique n'a

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bien souvent rien de surprenant etencore moins d'inquiétant. Il s'agit,dans la plupart des cas, de la résur-gence d'un allèle récessif impliquédans le déterminisme de la colora-tion du pelage, provenant d'une li-gnée consanguine traditionnelle et quipré-existait sous forme cryptique de-puis un nombre indéterminé (qui peutêtre très grand) de générations (Fi-gure 3). Un pédigrée complet et biendocumenté permettrait sans doute deconforter l'hypothèse d'un tel allèle"auto-stoppeur" et quelques PCR ju-dicieusement choisies permettront detirer l'affaire au clair puisque la struc-ture moléculaire de tous les allèlesde pigmentation, aux cinq locus ma-jeurs, est maintenant parfaitementconnue.Dans la routine de l'entretien d'une li-gnée transgénique, le tri "sélectif" desphénotypes qui apparaissent àchaque génération et l'éliminationsystématique de certains d'entre euxpeut se révéler d'une efficacité trèsdifférente selon les allèles. Parexemple, l'élimination systématiquedes souris albinos dans les progéni-tures successives d'une lignée trans-génique ne garantit pas contre desrésurgences ultérieures du mêmephénotype alors qu'au contraire, lasélection de deux géniteurs albinoséteint définitivement la possibilité derésurgence d’allèle non albinos.Un expérimentateur qui le souhaiteraitvraiment pourrait connaître de ma-nière précise, au prix de quelques PCRou de quelques typages à l'aide de"SNPs", la structure génétique et lescomposantes principales de la lignéetransgénique qu'il vient d'importer.Mais s'il est certain que cela aura uncoût non négligeable, il n'est pas sûrque cela présente un intérêt majeur

pour l'expérience qu'il veut faire … !Parvenu à la fin de cette petite revuesur la pigmentation de la robe chez lasouris nous pouvons tirer trois conclu-sions importantes :> L'observation de variations dans lacoloration de la robe dans les progé-nitures des lignées transgéniques estassez banale. Il s'agit, dans la plupartdes cas, de la résurgence d'allèlesrécessifs aux locus A, Tyr ou Oca2,plus rarement Tyrp ou Myo5a, misfortuitement à l'état homozygote à lasuite des croisements réalisés enamont. L'observation de phénotypes"pink-eyed dilution", un allèle raredans les lignées consanguines tradi-tionnelles, est souvent la consé-quence du choix de certaines lignéesde cellules ES utilisées pour l'étape invitro de la manipulation génétique,plus rarement de l'utilisation d'un hy-bride impliquant la lignée SJL.> Il faut recommander, avec insis-tance, à tous les importateurs/utilisa-teurs de lignées transgéniques de serenseigner sur les pédigrées des sou-ris importées (origine du fonds géné-tique et croisements effectués enamont de l'expédition) et pas seule-ment sur la nature de la manipulationgénétique et/ou le phénotype observé.> Indépendamment de ce que pourraêtre la réponse apportée à cette ques-tion, il faut choisir un fonds génétiqueet commencer sans tarder la créationd'une lignée congénique (speedcongenic par exemple) pour le trans-gène importé. Nous avons abordé cetimportant sujet dans un numéro an-térieur de cette revue (Guénet J-L. &Benavides F., STAL, vol 35, pp 45-54,2009). Il faut savoir que le choix d'unfonds génétique est une démarchequi peut avoir des conséquences trèsimportante sur l'expression du trans-

gène et que rien ne peut permettre deformuler la moindre prédiction encette matière. Hélas, il n'y a pas defonds génétique universel…Les lecteurs désireux d'en savoir pluslong sur la génétique de la colorationde la robe chez la souris pourrontavantageusement se référer au Livreintitulé "The Coat Colors of Mice" deWillys K. Silvers – Springer Verlag1979 en accès libre sur le site deMouse Genome Informaticshttp://www.informatics.jax.org/wksil-vers/index.shtml.

Références bibliographiques Castle, W.E. & C.C. Little. The peculiar in-heritance of pink eyes among coloredmice. Science. 30, 313–314 (1909).

Cuénot, L. La loi de Mendel et l’héréditéde la pigmentation chez les souris. Arch.Zool. Exp. Gen. 3, 27–30 (1902).

Linder, C.C. & M.T. Davisson. Historicalfoundations, in The Laboratory Mouse. He-drich HJ (ed). Elsevier, London. pp. 15–24(2004).

Searle A.G. Comparative Genetics of CoatColour in Mammals. Academic Press(1968).

Staats, J. “The Laboratory Mouse,” in Bio-logy of the Laboratory Mouse. Dover Pu-blications, Inc. NY. pp. 1. (1968).


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Figure 2 : La pigmentation de cette souris est presque exclusivement composée de phæomélanine, la mélanine jaune. L'eumélanine, la mélanine noire, n'estcependant pas absente puisque l'œil est intensément noir. Le gène Agouti règle la répartition des deux pigments mélaniques. Ici, nous sommes dans un casextrême – la souris est hétérozygote pour l'allèle yellow (Ay) létal à l'état homozygote. A l'autre extrémité de la "gamme" il y aurait l'allèle ae – extreme nonagouti, la souris serait alors entièrement noire.

Figure 3 : Lorsqu'on croise une souris DBA/2 (génotype a/a; b/b; C/C; d/d) avec une souris AKR (genotype a/a, B/B; c/c; D/D) on obtient des descendant homo-gène de couleur noire (a/a; b/B; C/c; d/D). Un croisement DBA/2 x A (a/a; b/b; c/c; D/D) donne au contraire des souris chocolat (a/a; b/b; C/c; d/D). Finalement,un croisement DBA/2 x BALB/c (A/A; b/b; c/c; D/D) donne des souris de couleur canelle (a/A; b/b; C/c; D/D). Ce schéma comporte deux messages : 1) il illustrela notion d'épistasie (les souris A, AKR et BALB/c sont uniformément albinos en dépit d'une constitution génétique différente) et 2) il montre que l'on peut testersimplement la pureté d'une lignée en analysant la pigmentation d'une progéniture F1 : une F1 doit toujours être entièrement homogène !

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Cette souris est homozygote pour la mutation al-binos c ou Tyrc. La tyrosinase étant inactive, lasouris ne produit aucune mélanine et la robe esttotalement dépigmentée.

Cette souris est homozygote pour la mutation di-lute d ou Myo5ad. Les pigments de mélanine onttendance à se compacter donnant l'illusion d'unedilution.

Cette souris est homozygote pour la mutationpink eyed dilution p ou Oca2p. La dilution du pe-lage est essentiellement due à une diminution desynthèse de l'eumélanine tandis que la synthèsede la phæomélanine se maintient à un niveauquasi normal. Cette mutation est très ancienne,associée à d'autres mutations au trois autreslocus A, B ou D, elle donne des phénotypes auxtrès belles couleurs. C'est une mutation trèscommune sur les "marchés aux fleurs" et dansles "pet shops".

Cette souris est homozygote pour la mutationnon agouti a/a et brown b/b (ou Tyrpb/Tyrpb).

Les souris représentées sur cette image provien-nent toutes les trois d'un F2 C57BL/6 x DBA/2. Lasouris sur le poivron rouge est a/a ; d/d(Myo5ad/Myo5ad), celle qui est sur le poivron vertest a/a ; b/b (Tyrpb/Tyrpb), celle qui est sur le poi-vron jaune est a/a.

Cette souris est homozygotes pour la mutation Tyrpb

Cette souris est homozygote pour la mutation nonagouti a. La robe est intensément noire. La sourisa cependant quelques poils jaunes dans lesoreilles et sur le ventre.

Souris de phénotype sauvage pour les cinq locus


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Crédit photo : PBES

■ Teixeira M.1

Blanquier B. 2

Nègre D.2,3

Ghittoni R.5

Szecsi J.3

Henry F.1

Coupet CA.4

Aubert D.1

Cosset FL.3

Marvel J.4

1 Plateau PBES, AniRA, IFR128, ENS-Lyon 46 Alléed’Italie, Lyon, F-69364, France;

2 Plateau Analyse Génétique et Véctorologie,AniRA, IFR128, ENS-Lyon 46 Allée d’Italie, Lyon,F-69364, France ;

3 INSERM, U758, ENS-Lyon 46 Allée d’Italie, Lyon,F-69364, France;

4 INSERM, U851, 21 Avenue Tony Garnier, Lyon, F-69007, France.

Contact : [email protected]

RésuméJusqu'à présent, les souris transgé-niques sur-exprimant un gène d’inté-rêt ont été obtenues principalementpar injection d’un fragment d’ADNdouble brin, dans l’un des pronucléide l’embryon au stade 1 cellule.Néanmoins, une autre méthode ba-sée sur les vecteurs lentiviraux peutêtre utilisée. Elle présente unemeilleure efficacité d'intégration del'ADN dans le génome. Les animauxtransgéniques obtenus par transgé-nèse lentivirale sont souvent porteursde plusieurs copies du transgène, in-sérés dans des sites différents du gé-nome. Il est important de caractériserprécisément ces fondateurs (en parti-culier le nombre de copies du trans-gène inséré) afin de mieux choisirceux qui permettront d’établir la li-gnée transgénique. Le but de ce tra-vail est de fournir une méthodesimple, rapide et universelle permet-tant de déterminer précisément lenombre de copies du transgène insérédans le génome des fondateurs et deleurs descendants. Cette méthodeprésente également l’avantage d’êtreindépendante du transgène utilisé.Nous avons utilisé la PCR Quantitative(QPCR) pour déterminer le nombre decopies du vecteur lentiviral intégré.Les amorces choisies sont spécifiquesdes vecteurs dérivés de VIH (Virus del'Immunodéficience Humaine). Cetteméthode peut être utilisée aussi biensur un lysat de tissu que sur une pu-rification d’ADN génomique. Deuxpaires d'amorces ont été dessinées.La première vise un gène de réfé-rence cellulaire alors que la seconde

reconnaît une partie constante de laséquence des LTR (Long Terminal Re-peat), régions promotrices de l’ex-pression du génome viral. Pour démontrer l'efficacité et la fiabi-lité de cette méthode, nous l’avonsappliquée à des animaux transgé-niques pour un transgène GFP (GreenFluorescent Protein) obtenus à l’aided’un vecteur lentiviral dérivé du VIH.Ces animaux ont été parallèlementanalysés par QPCR en utilisant desamorces GFP ou LTR-HIV. Trente-deuxsouris ont été testées. Deux fonda-teurs différents ainsi que leur des-cendance ont été analysés sur plus de3 générations. La sensibilité de latechnique QPCR qui permet de dé-tecter moins d’une copie par cellule,démontre la mosaïcité des fondateurs. De plus, les résultats de quantificationobtenus pour les séquences GFP ouLTR-HIV sont équivalents. De ce fait,cette technique est maintenant utili-sée en routine dans notre structurepour caractériser les animaux trans-géniques obtenus par lentigénèse.

AbstractUp until now transgenic mice weremainly obtained by DNA pronuclearmicroinjection. Another method ba-sed on lentiviral vectors is now used,providing better efficiency of DNA in-tegration. Transgenic animals obtai-ned by lentiviral transgenesis oftencarry several copies of the transgene,inserted in different sites of the ge-nome. Moreover most founders ob-tained, even those with many inte-grated copies, are mosaics. Therefore,it is very important to fully characte-

Souris lentigéniques : détermination du nombrede copies par QPCR

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rize each founder in terms of copynumbers to choose the most suitablefounder to establish the trangenic line.The aim of this work was to provide ageneral and simple method to deter-mine the transgene copy number inthe genome of founders and of theirprogeny. This method detects the vec-tor backbone and hence is indepen-dent of the transgene used.We used quantitative PCR (QPCR) todetermine the number of copies of in-tegrated lentiviral vector. Oligonucleo-tides used are specific for HIV (HumanImmunodeficiency virus) based lenti-viral vectors. This method uses geno-mic DNA prepared without extensivepurification. Two pairs of primers weredesigned : the first one is used as areference gene and the second onerecognizes the LTR sequences of HIVto quantify the copy number.To demonstrate efficiency and reliabi-lity of the results obtained, we ap-plied our method to lentigenic ani-mals carrying a GFP transgene. Theseanimals were analysed by QPCR (pri-mers in the GFP gene) and by thegermline transmission rate obtainedby breading each founders with wildtype mice. Thirty-two mice were tes-ted. Two different founders and theirprogeny over 3 generations were ana-lysed. Results obtained by both me-thods were statistically coherent thusdemonstrating the validity of ourQPCR method. We now routinely usethis method to determine copy num-bers for all lentigenic animals produ-ced in our facility.

IntroductionLes expériences de transgénèse sesont développées au cours des an-nées 80 avec l’essor de la micro-in-jection et des cellules embryonnairestotipotentes. Depuis quelques annéesdes vecteurs dérivés de lentivirus ontété développés afin, notamment, derépondre aux exigences de la thérapiegénique (Pfeifer 2004). Les lentivec-teurs utilisés sont intégratifs mais pasréplicatifs, et permettent de délivrer letransgène à la cellule ou à l’embryonqu’ils infectent de façon efficace etcontrôlée. L’utilisation de ces vecteursen transgénèse depuis une dizained’année a validé une nouvelle ap-proche méthodologique applicable àde nombreuses espèces animales. Latransmission germinale du fragmentinséré a ainsi été démontrée chez lasouris (Lois et al. 2002 ; Pfeifer et al.2002), le rat (Lois et al. 2002), le pou-let (McGrew et al. 2004), le porc (Hof-mann et al. 2003 ; Whitelaw et al.2004) et le bovin (Hoffman et al.2004).La membrane pellucide protège l’em-bryon des pathogènes et notammentdes virus. L’infection des embryonspar un lentivecteur nécessite doncune étape préalable de dé-pellucida-tion avant l’ajout des particules infec-tieuses dans le milieu de culture(Ikawa et al. 2003). Une autre solutionest d’injecter la suspension lentiviraledans l’espace compris entre l’em-bryon et la membrane pellucide (Loiset al. 2000 ; Pfeifer et al. 2002). Cetteinjection se fait au stade 1 cellule.L’ensemble des cellules d’un individuprovient de la cellule initiale mais lesintégrations du lentivecteur peuventse produire après la première divi-sion. Les cellules de cet individu sontdifférentes en terme de site d’inté-

gration du lentivecteur et du nombrede copies insérées (Tenenhaus et al,2007 ; Sauvain et al, 2008). Les ani-maux sont donc mosaïquesAu sein du PBES (Plateau de BiologieExpérimentale de la Souris) nousavons développé cette technique detransgènèse lentivirale car elle pré-sente l’avantage d’obtenir rapidementune grande quantité d’animaux trans-géniques sur un fonds génétique dé-fini. De plus, les fondateurs obtenusdivergent par leur site d’intégrationdu transgène. Cela laisse la possibilitéde sélectionner les fondateurs pré-sentant les sites d’intégration les plusfavorables à l’expression du trans-gène. Un inconvénient de cette mé-thode réside dans le fait que les ani-maux obtenus peuvent présenter ungrand nombre de sites d’intégrationdu transgène dans leur génome. Lefondateur transmettra à sa descen-dance tout ou une partie de ces copiesde façon aléatoire. Il est donc difficiled’obtenir une lignée stable généti-quement, lignée dont tous les indivi-dus présenteraient le même nombrede copies intégrées aux mêmes sites.Le moyen le plus sûr d’établir une li-gnée génétiquement stable est departir de fondateurs présentant uneseule intégration du transgène. Dansce cas, les descendants transgé-niques présenteront forcément lamême intégration que le fondateur.Nous avons donc mis au point uneméthode simple et rapide pour déter-miner le nombre de copies de trans-gène pour chaque animal.Jusqu'à présent le seul moyen de dé-terminer approximativement lenombre de copies était le Southern-blot. Cette technique, beaucoup moinssensible et plus longue à mettre enœuvre que la PCR, permet en effet de


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quantifier un faible nombre de copiesà l’aide de sondes spécifiques.La PCR Quantitative ou la PCR entemps réel est une réaction d’amplifi-cation par polymérase en chaîne(PCR) dont on va suivre le signal entemps réel grâce à un marqueur fluo-rescent. Il existe deux technologiesde marquage fluorescent de l’ADN.Les sondes d’hybridation spécifiquesde la cible, portant à leurs extrémitésdes fluorophores, permettent une me-sure séquence spécifique de l’ampli-con (sondes Taqman, Beacon etc.),alors que les marqueurs fluorescentsdu double brin ADN comme le SYBR®

Green permettent la mesure de tousles produits d’amplification qu’ilssoient spécifiques ou non de la cibleétudiée. La spécificité et la qualité desamplicons sont alors analysées aucours d’une étape supplémentaire dela réaction de PCR qui est la dissocia-tion des produits formés. Cette étapede dissociation permet la mesure duTm (Melting Temperature) de l’ampli-con qui est une mesure spécifique dela séquence et de la taille de l’ampli-con d’intérêt. Pour cette étude nous avons choiside travailler avec la technologieSYBR® Green (sybr). Le sybr a la par-ticularité de devenir fortement fluo-rescent lorsqu’il s’intercale dans lepetit sillon de la double hélice : il per-met donc de suivre le signal d’ampli-fication de façon très sensible (1 mo-lécule fluorescente toutes les 20 à25 paires de bases). L’étape de dis-sociation des produits formés permetde vérifier la spécificité des amorces(Tm de l’amplicon) et la qualité desamorces (dimérisation etc.).La quantité de fluorescence mesuréesera proportionnelle à la quantitéd’ADN présente. Un seuil de détection

sera positionné au-dessus du bruit defond dans la phase exponentielle de lacinétique d’amplification. Le croise-ment de ce seuil sur la cinétiqued’amplification dans la phase expo-nentielle s’appelle Cq ou Cycle dequantification. Le Cq est inversementproportionnel à la quantité d’ADN. Afin de normaliser les résultats et évi-ter tous les biais techniques dus à lapréparation ou à la conservation deséchantillons, nous avons quantifié enmême temps que les cibles GFP etLTR, un gène de référence cellulaire(CD8) présent systématiquement àdeux copies par cellule. Nous avonschoisi des amorces dans la régionpromotrice du gène. Grâce à cettenormalisation il est possible de tra-vailler soit sur de l’ADN génomiquepurifié soit directement sur le lysatcellulaire.Pour mettre au point cette méthode etvérifier sa fiabilité nous avons pro-cédé en trois temps. Dans un premier temps nous avonschoisi une lignée exprimant la GFP,obtenue par recombinaison homo-logue. Le nombre de copie du gènecodant pour la GFP au stade homozy-gote est de 2 et de 1 copie à l’état hé-térozygote. Ces animaux nous ontpermis de mettre en place le protocolede QPCR pour la GFP. Dans un second temps, en utilisant latechnique lentigénèse, nous avonsétabli des lignées de souris contenantle gène GFP. Pour les fondateurs etleurs descendants, nous avons déter-miné le nombre de copies de GFP parQPCR en utilisant des amorces spéci-fiques du transgène GFP. Finalement, nous avons utilisé cesmêmes animaux afin de valider la dé-termination du nombre de copies enutilisant les amorces spécifiques des

LTR-HIV. Ces amorces nous permet-tent donc de déterminer le nombrede copies par cellule de tous les ani-maux obtenus avec la technique len-tigénique indépendamment du trans-gène d’intérêt.

Matériel et MéthodePréparation de l'ADNLa préparation de l'ADN est réaliséepar lyse alcaline à partir de prélève-ments de tissu. Un volume de 100 μl d’une solutionNaOH 25 mM, EDTA 0.2 mM estajouté au prélèvement de tissu Lestubes sont placés à 95 °C pendant30 minutes, puis mélangés, et un vo-lume de 100 μl de solution Tris HCl 40mM, est ajouté. Après homogénéisa-tion, le lysat est conservé à 4 °C jus-qu’à 3 jours. L’ADN de chaque échan-tillon est dosé au nanodrop puis diluédans l’eau afin d’obtenir approximati-vement 4 ng/μl d’ADN.

Les séquences d'amorce Le gène CD8 est ubiquitaire et présenten une copie par génome haploïde.Une paire d’amorces spécifiques de larégion promotrice CD8 a été dessinéepour la normalisation des échantillons Prom.CD8 sens : 5’-GGTGCATTCT-CACTCTGAGTTCC-3’Prom.CD8 anti-sens : 5’-CAGACA-GAGCTGATTTCCTATGTG)-3’La seconde paire d’oligonucléotidescible les gènes d’intérêt : GFP sens :5’-ATGGTGAGCAAGGGC-GAGGA-3’GFP anti-sens :5’-TCGCCGGA-CACGCTGAACT-3’LTR-HIV sens : 5’-CCTCAA-TAAAGCTTGCCTTGA-3’LTR-HIV antisens :5’-GGCGCCACTGC-TAGAGATTTT-3’ Les amorces ont été validées pour

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leur spécificité (un seul produit d’am-plification), leur efficacité de PCR etleur linéarité de détection.Pour chaque échantillon testé, deuxmélanges réactionnels sont préparés ;l’un contenant les amorces du pro-moteur CD8, l’autre les amorces GFPou LTR-HIV.

Préparation du mélange réactionnel Les amorces sont commandées à lasociété Invitrogen et préparées à uneconcentration de 10 μM sous H2O.Les amorces sont diluées ensuitedans le MIX QPCR (kit commercialisépar Invitrogen, réf : 11744-500). Cemélange réactionnel est préparé ex-temporanément. Chaque point deQPCR nécessite 15 μl de mélange ré-actionnel auquel on ajoute 5μl de so-lution d’ADN à 4 ng/μl.

Détermination de l’efficacité pourune paire d’oligonucléotidesAu cours d’une PCR, si tous les brinsmatrices servent à donner une copiecomplète de l’amplicon, alors l’effi-cacité (notée E) de la PCR est de 2.Cela n’est pas toujours vrai. Parconséquent, il faudra déterminer, pourchaque paire d’oligonucléotides, cettevaleur E. Pour cela l’ADN est amplifiépar PCR. A partir de ce produit de PCR,10 dilutions en cascade de 10 en 10sont réalisées. Pour chaque dilution,une valeur de Cq est déterminée. Unerégression linéaire du log de laconcentration en fonction des Cq ob-tenus permet de calculer l’efficacité àpartir de la pente de la droite obtenue.(E= 10-1/pente). Cette mesure d’effica-cité permet de déterminer la linéaritéet la limite de détection du coupled’amorces (fig.1) et sert en outre àstandardiser notre système de quan-tification.

Préparation de la plaque de QPCRChaque plaque de 96 puits est prépa-rée comme indiqué sur le schéma I.Chaque point est dupliqué. Sur cetteplaque, sont déposés deux mélangesréactionnels contenant soit lesamorces de référence (prom.CD8),soit les amorces spécifiques (LTR-HIVou GFP). A ces mélanges, on ajouteensuite 5 μl d'échantillons (F0-2, F0-3, F0-4). Sur chaque plaque, on

dépose également un ou plusieurscontrôles internes dont on connaît lenombre de copies (G2-5F2, G2-10F2,G2-14F2), un échantillon ne conte-nant pas d’ADN (H2O) et un standardinterne (S). Les calculs de quantification se fonten utilisant la correction d’efficacitéet donc en utilisant l’efficacité réellede chacun des couples d’amorces(Pffafl, 2001).

Pour chaque couple d’amorces il y aplusieurs contrôles :1-Un ou deux point(s) standard(s) (S)issus de la gamme d’efficacité etpréalablement aliquotés permettentde valider les résultats d’une plaquedonnée et de comparer les plaquesentre elles : les Cq ou nombre de co-pies de ces standards doivent êtreidentiques à ceux obtenus dans lagamme. 2-Un contrôle négatif sans ADN ( H2O)pour vérifier les contaminations (am-plification en absence d’ADN).

0

5

10

15

20

25

30

35

Fig 1: Détermination de l’efficacité des oligonu-cléotides Prom.CD8. : Régression linéaire desCq obtenus en fonction du log de la concentra-tion ADN. L’équation de la droite est y=-3.5438+ 41.773 (R2=0.999). E=10(-1/pente) par conséquent E= 1.9151

Schéma I : 15 μl de chaque Mélange Réactionnel : sont placés de la plaque QPCR. Un mé-lange contient les amorces de référence: PromCD8 (en vert), l’autre les amorces spécifiques dutransgéne: LRT-HIV (en bleu). Puis 5 ul d'échantillons (F0-2, F0-3, F0-4. …) sont déposés. De plus, onutilise plusieurs contrôles internes dont on connaît le nombre de copies: G2-5F2, G2-10F2, G2-14F2;un contrôle négatif (eau) et enfin un standard interne (S). Chaque détermination est en duplicate.


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3- Des ADN issus de prélèvementsd’animaux dont le nombre de copiesGFP ou LTR-HIV est connu (G2-5F2,G2-10F2, G2-14F2). Ces échantillonspourront servir au calcul des nou-veaux échantillons.La quantification en parallèle du gènede référence prom.CD8 permet denormaliser les échantillons entre eux.Sur une même plaque il est impératifde placer plusieurs échantillons dontle nombre de copies est connu. La table I décrit les étapes de calculs La colonne (1) indique le nom del’échantillon. Chaque échantillon estdupliqué. La colonne (2) et (3) donne,pour chaque échantillon la moyennedes Cq lorsque l’on utilise les amorcesprom.CD8 ou LTR-HIV respectivement. La colonne (3) et (5) affiche unequantité arbitraire des produits obte-nus en utilisant les amorcesprom.CD8 ou LTR-HIV respectivement.Cette quantité arbitraire est calculéede la manière suivante : E-cq. La colonne (6) donne la Quantité Re-lative c’est à dire la quantité des pro-duits, obtenus avec les amorces LTR-HIV, normalisée par la quantité desproduits obtenus avec les amorcesprom.CD8. Cette normalisation per-met de tenir compte de la variabilitétechnique due à la préparation deséchantillons.La colonne (8) délivre le nombre decopies réel. Ce nombre est déterminéen tenant compte du nombre de co-pies des standards internes (G2-5F2,G2-10F2, G2-14F2).

Résultats.1. Détermination du nombre de co-pies par QPCR en utilisant lesamorces GFPNous avons réalisé une lyse alcalinesur l’ensemble des échantillons bio-

logiques. Cette technique, peu coû-teuse, permet d’obtenir rapidement(en 30 minutes) une préparationd’ADN. Comparée à l’ADN obtenu enutilisant des colonnes, cette prépara-tion d’ADN nous a permis d’obtenirdes résultats moins précis mais suffi-samment reproductibles. Nous avons analysé 44 échantillonsprovenant de souris obtenues par re-combinaison homologue. A l’état ho-mozygote, l’animal présente 2 copies,à l’état hétérozygote, 1 seule copie. Lenombre de copie mesuré est de 1.0 +/-0.1 (n=22) pour les hétérozygotes et

2.0 +/- 0.3 (n=22) pour les homozy-gotes. Ces résultats montrent une ex-cellente reproductibilité des expé-riences de QPCR, l’erreur sur la mesureétant en générale inférieur à 15 %. La figure 2 décrit les fondateurs ob-tenus après une micro-injection desembryons au stade 1 cellule. Le titredes lentivecteurs était de6.4 108UI/ml. 74 embryons ont ététransférés. Après gestation, on a ob-tenu 22 souris, dont 16 étaient posi-tives. Le nombre de copies du gènecodant pour la GFP varie de 0.25 co-pies à 50 copies par cellule.

((1) ééchantillon

(2) Moyenne

Cq

(3) Quantité

(Efficacité)-Cq

X 1108

(5) Quantité

(Efficacité)-Cq

((6) QQuantité RRelative

(5)/(3)

(7) Number oof ccopy

(8) Nombre dde ccopie

Réel

F0-2 24,035 16,502 24,79 3,459 0,21 1,09

FF0-3 24,59 11,506 26,94 0,777 0,07 0,35

F0-4 24,13 15,514 27,42 0,559 0,04 0,19

G2-5F2 24,055 16,289 24,95 3,096 0,19 Connu ((1 ccopie)

G2-10F2 23,55 22,615 24,71 3,644 0,16

24,21 14,728 25,05 2,879 0,2

Prom.CD8 ggene LTR-HIV ggene

((4) MMoyenne

Cq

Connu ((1 ccopie)

Connu ((1 ccopie)G2-14F2

Table I : Pour chaque échantillon (F0-2, F0-3 et F04), la moyenne des Cq (colonne 2 et 4). La quantitéd’ADN est calculée en utilisant l’efficacité réelle des amorces. Cette efficacité est de 1.9151 pourProm.CD8 (colonne 3) et de 2.00 pour les amorces LTR-HIV (colonne 5). Le calcul du nombre de co-pies réel tient compte de la quantité relative obtenu avec les amorces Prom.CD8 (colonne 3) et LTR-HIV (colonne 6) ainsi que des résultats obtenus avec des échantillons dont le nombre est connu(échantillon G2-5F2, G2-10F2 et G2-14F2).

Figure 2 : Au cours d’une microinjection de lentivecteurs, on obtient un grand nombre de souristransgéniques. Les valeurs montrées sont la moyenne de 3 mesures indépendantes.

45

La technique de QPCR permet doncde mesurer un spectre de nombre decopies très large (de 0.25 copie à50 copies par cellule). Les valeurs in-férieures à 1 copie par cellule suggè-rent la mosaïcité des souris F0 (Te-nenhaus et al, 2007 ; Sauvain et al,2008). Les nombres de copies obtenus parQPCR ont ensuite été validés par lagénétique. Nous avons réalisé denombreux croisements de fondateursavec des souris sauvages et nousavons mesuré le nombre de descen-dants auquel le transgène est trans-mis. La figure 3 décrit les résultats ob-tenus. Si le nombre de copie intégréedans le génome du fondateur est de 1,le pourcentage de F1 transgénique(positive pour le transgène) est de50 %. Ce pourcentage chute à 25 %ou 12,5 % si le fondateur possède 0.5ou 0,25 copie. La figure 4 reprend lesrésultats de QPCR pour 4 croisementsdistincts. La transmission des trans-gènes est de type Mendélien. Desfondateurs dont le nombre de copiesest inférieur à 1 ont été croisés avecune souris sauvage. Les individus ob-tenus présentent un nombre de copiesproche de 1 (> 0.8), ce qui confirmele statut mosaïque des F0. L’intégra-tion des lentivecteurs injectés sous lamembrane pellucide, peut s’effectuertardivement aux stades 2 et 4 cel-lules du développement.

2. détermination du nombre de co-pies par QPCR avec les amorcesuniverselles LTR-HIVLa même méthode a été appliquée àla détermination du nombre de co-pies du transgène avec les oligonu-cléotides spécifique du LTR-HIV. Lesrésultats obtenus ont été comparésavec les précédents obtenus avec les

oligonucléotides spécifiques de la GFP.Les résultats sont similaires (figure 5).Ces oligonucléotides LTR-HIV sontmaintenant utilisés en routine auPBES pour quantifier les animaux len-tigèniques obtenus quelque soit letransgène inséré.

DiscussionAfin d’établir rapidement une lignéestable de souris lentigénique, il estpréférable de sélectionner des fonda-teurs ayant un faible nombre de pro-virus intégrés. En effet, les transgènessont intégrés au hasard dans le gé-

nome de la souris et sont donc répar-tis sur les différents chromosomes.Un fondateurs ayant intégré plusieurscopies du transgène transmettra lesdifférentes copies de façon aléatoire àses descendants, qui seront alors dif-férents génétiquement. Nous avons mis au point une méthodede QPCR qui nous permet de déter-miner le nombre de copies de trans-gènes pour chaque animal lentigé-nique produit. Nous avons validé lesrésultats obtenus par la génétique.Certains animaux testés présentaientdes nombres de copies nettement in-

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0 11 22 33 55 5

4

Figure 3 : Pourcentage de souris transgéniques F1 obtenu en fonction du nombre de copie du fonda-teur F0. L’accouplement effectué est F0 x souris sauvage. Le graphique de gauche est une résolutionplus importante du graphique de droite.

Figure 4 : Nombre de copies des souris en fonction de la génération des animaux. Les fondateursapparaissent en bleu. On a procédé à un accouplement de ces fondateurs avec une souris sauvage.Sur cet histogramme seuls les petits F1 (en vert) transgéniques ont été représentés. Les F1 sau-vages n’apparaissent pas sur cet histogramme.


46

férieurs à 1. L’analyse du nombre decopies dans les descendants F1 deces individus nous a permis de confir-mer la nature mosaïque des fonda-teurs. Ce mosaïsisme a déjà été décrit(Tenenhaus et al, 2007 ; Sauvain et al,2008) et peut s’expliquer par l’inté-gration tardive du virus après les pre-mières divisions embryonnaires. Laméthode que nous décrivons utilisedes amorces universelles permettantde caractériser de façon fiable les ani-maux lentigéniques quelque soit letransgène inséré.L’analyse du nombre de copies peutcependant s’avérer difficile. Pourexemple, on peut déduire, pour lesindividus ayant 0.25 copie, que l’inté-gration du provirus s’est réalisée tar-divement au stade 4 cellules ; demême, pour les souris contenant0.5 copie une seule intégration se se-rait produite au stade 2 cellules. Ce-

pendant, le nombre de copie déter-miné étant un nombre moyen par cel-lule on ne peut pas exclure qu’un fon-dateur à 0.5 copie ait deuxintégrations de provirus différentesqui se seraient alors produites austade 4 cellules. L’intérêt de la technique de transgé-nèse lentivirale réside aussi dans lapossibilité d’obtenir à partir d’un faiblenombre d’embryons injectés, de nom-breux sites d’intégration différents. Eneffet, lors de la méiose, la ségrégationdes transgènes sera identique à laségrégation des chromosomes. Encroisant une souris ayant un grandnombre de copies, avec une sourissauvage, on obtiendra des descen-dants qui diffèreront par leur nombrede provirus et/ou par le site d’insertiondu provirus. Le site d’insertion modulel’expression du transgéne. En fonc-tion du site d’intégration l’expression

du transgène peut être éteinte. Il estdonc important de sélectionner unfondateur ayant un faible nombre deprovirus qui exprime le transgène. Cequi permet d’obtenir rapidement unelignée de souris dont le phénotypen’évolue pas au cours des généra-tions. L’utilisation de la QPCR décriteici permet d’identifier rapidement lesfondateurs remplissant ces condi-tions.

ConclusionSouvent, il est intéressant d’établirplusieurs lignées génétiquementstables exprimant un transgène. Lebut est de conforter les phénotypesobservés en s’affranchissant d’unéventuel effet du site d’insertion dutransgène. A cet effet, l’utilisation delentivecteurs permet de générer plu-sieurs fondateurs transgéniques enmanipulant un nombre limité d’em-bryons. Le nombre de copies peutêtre rapidement évalué grâce au pro-tocole de QPCR que nous décrivonsici.Mais, il est également utile deconnaître la position des copies insé-rées. Nous envisageons maintenantde mettre au point au PBES la mé-thode de LAM-PCR (Linear Amplifica-tion-Mediated PCR), (Schmidt et al.,2002, Mantovani et al, 2006) qui nouspermettra de suivre chaque copie detransgène inséré par l’identificationdu point d’insertion dans le génôme.

Figure 5 : Pour un même échantillon provenant de souris F1 ou F2, le nombre de copie du transgèneinséré a été déterminé en utilisant soit des amorces GFP ( en vert) soit des amorces LTR (en bleu).

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■ Maud Scotto di PerrotoloAmy L. MillerMatt C. LeachPaul A. Flecknell

Pour toute correspondance écrire à Maud Scotto di PerrotoloEmail : [email protected]

Comparative Biology Centre, The Medical School,Newcastle University, Framlington Place, Newcastle upon Tyne, NE24HH, Royaume Uni

Abréviations :FACS : Facial Action Coding SystemFAU : Unité d’Action Faciale (FacialAction Unit)MGS : Mouse Grimace ScalePré-op : Pré-opératoirePost-op : Post-opératoire

RésuméLes expressions faciales, mode decommunication à part entière, fasci-nent depuis plusieurs siècles la com-munauté scientifique. Utiliséescomme outil de détermination de ladouleur en clinique humaine, une ap-plication chez les animaux de labora-toire semble donc pertinente afind’améliorer la prise en charge de ladouleur engendrée lors de protocolesinvasifs. Nos connaissances sur lesexpressions faciales des animaux, àl’exception des primates non hu-mains, demeurent toutefois limitées.Cependant, Langford et al. ont ré-cemment mis au point une nouvelleméthode d’évaluation de la douleur,appelée MGS (Mouse Grimace Scale),applicable chez la souris. Celle-ci estbasée sur cinq modifications facialesspontanées, observables à la suite deprotocoles douloureux. Dans l’optiqued’étudier la haute précision et la fia-bilité du MGS, deux études utilisantdes caméras standards et des camé-ras Haute Définition ont été menées.Dans chacune d’elles, des participantsont été sollicités pour noter, selon cinqcritères, des images de faces de sou-ris capturées à l’état basal et uneheure après une vasectomie bilaté-rale. La précision des réponses don-nées par les participants sera discutéeen tenant compte de plusieurs fac-teurs pouvant influencer la fiabilité dela méthode. Enfin, les conditions d’uti-lisation et les limites du MGS serontabordées.Mots clés : expressions faciales, douleur, anal-gésie, vasectomie, souris

Measuring the accuracy and thereliability of facial expressions forassessing pain in miceAbstractThe facial expressions, way of com-municating in its own right, fascinatethe scientific community for severalcenturies. Used as an assessment toolof pain within the clinical field, an ap-plication in laboratory animals has thepotential to improve pain manage-ment during invasive procedures. Ourknowledge on facial expressions innon human species, except in pri-mates, remains incomplete though.However, Langford et al. recently de-veloped a new method to assess pain,called MGS (Mouse Grimace Scale),applicable in mice. This method is ba-sed on five spontaneous facial modi-fications, visible following a painfulprotocol. In order to study the highaccuracy and the reliability of theMGS, we performed two complemen-tary studies using Standard and HighDefinition cameras. In each study, par-ticipants were asked to score mouseface pictures, according five criteria,taken before and one hour after a bi-lateral vasectomy. The accuracy of theparticipants’ answers will be discus-sed by considering several factors thatcan influence the reliability of the me-thod. Finally, the conditions of use andthe limits of the MGS will be presen-ted.Key words: facial expressions, pain, analgesia,vasectomy, mouse

Mesure de la fiabilité et de la précisiondes expressions faciales pour évaluerla douleur chez la souris

RemerciementsLes auteurs tiennent à remerciertous les volontaires qui ont parti-cipé à cette étude, l’équipe duComparative Biology Centre pourson soutien technique et plus par-ticulièrement Jon Gledhil pour sonaide en informatique.Sponsors : AFSTAL et LaboratoryAnimals Limited


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IntroductionA travers les siècles, les travaux denombreux scientifiques ont permis dedévelopper nos connaissances sur lesexpressions faciales. Mode de com-munication à part entière, celles-cifont partie d’un comportement inné.C’est la conclusion qu’a émise Eibl-Ei-besfeldt après avoir découvert que lesmimiques faciales d’enfants atteintsde cécité congénitale et d’enfantsvoyants étaient identiques (Eibl-Ei-besfeldt, 1973). L’observation d’uneparfaite similitude entre les expres-sions faciales de coureurs non-voyants avec celles de coureursvoyants aux Jeux Paralympiques de2004 a permis de confirmer cette af-firmation (Matsumoto et Willingham,2009). Une meilleure compréhensiondes mécanismes à l’origine des émo-tions de base chez l’Homme (peur,dégoût, colère, joie, étonnement, tris-tesse) a été possible grâce aux re-cherches de Ekman et Friesen. En dé-veloppant le Facial Action CodingSystem (FACS), ils ont décomposéchaque émotion en Unités d’ActionFaciales (Facial Action Units, FAUs),correspondant à la sollicitation d’unou plusieurs muscles faciaux à l’étatcontracté ou relâché (Ekman et Frie-sen, 1978). Véritable outil d’évaluationde la douleur, les expressions facialessont aujourd’hui très utilisées dans ledomaine clinique chez les nouveau-nés ou les sujets incapables de com-muniquer verbalement. Darwin a étél’un des premiers à s’intéresser auxexpressions faciales et à soutenir lathèse que les animaux sont capablesde ressentir et d’exprimer des émo-tions telles que la douleur (Darwin,1872). Ses études menées en paral-lèle sur l’animal et sur l’Homme l’ontamené à penser que les expressions

faciales font partie d’un caractèretransmis à travers l’évolution.L’évaluation et la prise en charge de ladouleur des animaux de laboratoirelors d’un protocole invasif apparaîtcomme une nécessité afin de pro-mouvoir le respect du bien-être ani-mal et d’assurer la fiabilité scienti-fique. Parmi les méthodesdéveloppées pour évaluer la douleur,le comportement spontané a été lar-gement analysé chez le rat (Roughanet Flecknell, 2001) et la souris(Wright-Williams et al., 2007). Dessystèmes automatisés (HomeCageS-can) ont également été utilisés avecsuccès pour détecter des modifica-tions comportementales à la suited’une procédure invasive (Dickinsonet al., 2009). En plus des techniquesd’analyse du comportement spontané,des tests nociceptifs mécaniques, chi-miques, électriques et thermiques ontété développés pour évaluer la dou-leur chez les animaux de laboratoire(Flecknell, 1984 ; Le Bars et al., 2001).Cependant, la combinaison de plu-sieurs méthodes est souvent néces-saire pour pouvoir quantifier précisé-ment la douleur perçue et déterminerle degré d’analgésie à apporter. Ainsi,le récent développement de l’évalua-tion des expressions faciales pourraitconstituer un outil supplémentaire in-téressant, tel qu’il est employé chezl’Homme, pour évaluer la douleur chezles animaux de laboratoire.La majorité des travaux sur les ex-pressions faciales des animaux ontété menés chez le primate, de par saproximité phylogénétique et compor-tementale avec l’Homme (Preuschoft,2000 ; Parr et Waller, 2006). Ainsi,bien que les rongeurs représentent lapart la plus importante d’animaux delaboratoire utilisés en recherche bio-

médicale, leurs expressions facialesont été très peu étudiées. L’équipe deLangford a mis au point une nouvelleméthode d’évaluation de la douleurbasée sur les expressions facialeschez la souris présentée comme fai-sant preuve d’une “haute précision” etd’une “fiabilité certaine” (Langford etal. 2010). Cette méthode, appeléeMGS (Mouse Grimace Scale), s’ap-puie sur des modifications sponta-nées des expressions faciales chez lasouris, induites par des procéduresdouloureuses.Cinq critères morphologiques faciaux,ou unités d’action faciales (FAUs) sontdéfinis comme suit et des illustrationsont été données en exemple pourchacune d’eux (Figure 1):> Resserrement orbitaire (orbitaltightening) : rétrécissement de l’aireorbitaire par fermeture de la paupièreet pli visible autour de l’œil ; > Gonflement du museau (nosebulge) : bombement cutané visible surl’arête de celui-ci ; > Gonflement des joues (cheekbulge) : apparence convexe desmuscles malaires (entre les yeux et laracine des vibrisses) par rapport àleur état basal ;> Position des oreilles (ear position):oreilles écartées et situées en arrière> Modification de la conformationdes vibrisses (whisker change) :mouvement des vibrisses vers l’ar-rière (accolées à la face) ou versl’avant, comme étant tirées par leurextrémité. Les vibrisses peuvent éga-lement apparaître regroupées par rap-port à leur position de base.Dans l’optique d’étudier la haute pré-cision et la fiabilité du Mouse GrimaceScale développé par Langford et al.,deux études utilisant des camérasStandards et des caméras Haute Dé-

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finition ont été menées. Ainsi, desimages issues de séquences vidéoenregistrées lors de ces deux étudesont été analysées afin d’évaluer ladouleur associée à une vasectomiebilatérale chez la souris. Celle-ci a étéréalisée selon l’approche abdominalepour l’étude Standard et selon l’ap-proche scrotale pour l’étude HauteRésolution.

Figure 1 Images données en exemple parLangford et al. pour scorer l’intensité dechaque unité d’action faciale (FAU) : resserre-ment orbitaire, gonflement du museau, gon-flement des joues, position des oreilles,conformation des vibrisses. Les images sontrangées par intensité croissante pour chaqueparamètre étudié selon une échelle à 3 points.0 : non visible, 1 : modéré, 2 : sévère

Matériel et méthodes1) Animauxa) Etude StandardDans cette étude, l’analyse de vidéosde souris préalablement enregistréesdans le cadre d’une autre étude (Dic-kinson et al., 2009) a permis d’éviterle recours à des animaux. Ces vidéos

correspondaient à six souris CBA/Ca-Crl et six souris DBA/2JCrl mâles su-bissant une vasectomie abdominale,filmées la veille et le jour de la chirur-gie. 30 minutes avant le début de lachirurgie, trois souris de chaquesouche ont été traitées oralementavec une solution saline ou du para-cétamol introduit dans l’eau de bois-son à raison de 246 mg/kg. Pour plusde détails sur le protocole, voir Dic-kinson et al., 2009.

b) Etude Haute Résolution* TraitementsLes animaux utilisés dans cette étudefaisaient partie d’un programme deproduction de souris transgéniquesnécessitant l’utilisation de souris va-sectomisées. L’ensemble des procé-dures était en accord avec Animals(Scientific Procedures) Act 1986 (Loisur les animaux - Procédures scienti-fiques) et a été approuvé par le comitéd’éthique local. 18 souris CD1 mâles (Charles RiverLaboratories Inc, Margate, Kent, UK)pesant entre 29 et 39,4 g ont été hé-bergées individuellement dans descages ventilées en plastique (NorthKent Ltd, Kent, UK) à leur arrivée du-rant une période d’acclimatation de7 jours. La température dans l’anima-lerie était maintenue à 23 ± 1°C, avec35 % d’humidité et un cycle jour/nuit12/12h (éclairage à 7 heures). Lanourriture (CRM (P), SDS Ltd, Essex,UK) et l’eau étaient disponibles ad li-bitum. La litière était composée desciure de bois (DBM, Broxburn, UK) etde papier découpé (DBM, Broxburn,UK) pour permettre un environnementenrichi. Chaque animal a été attribuéau hasard dans un groupe de traite-ment le jour précédant la chirurgie.Six souris de chaque groupe ont subi

différents traitements 30 minutesavant le début de la chirurgie ou du-rant la chirurgie (Tableau I). Celles-ciont reçu une injection sous-cutanéed’une solution saline ou de meloxicam(20 mg/kg) (Metacam, Boehringer In-gelheim, Labiana Life Sciences S.A.Terrassa, Spain). Un autre groupe areçu une application de bupivacaïnehydrochloride sur la plaie (5 mg/kg)(Marcain 0,5%, AstraZeneca UK Ltd)durant la chirurgie, qui est un anes-thésique local possédant des proprié-tés analgésiques (Flecknell et Water-man-Pearson, 2000).

Tableau I : Groupes de traitements analgé-siques pour les souris de l’Etude Haute Réso-lution

* ChirurgieLa vasectomie a été effectuée selonl’approche scrotale. L’anesthésie a étéinduite par un mélange d’isoflurane etd’oxygène (induction 5 % 2 L/min)dans une chambre à induction pen-dant environ deux minutes. Les sourisont ensuite été placées sur une cou-verture chauffante pour maintenir latempérature corporelle constante etl’entretien de l’anesthésie a été réalisévia un masque libérant de l’isoflurane(2,5 % 0,5 L/min). La peau a été va-porisée avec de la chlorhexidine (Hy-drex Derma spray, Adams Healthcare,Leeds, UK) puis une incision verticalede 0,5cm a été faite dans la zone mé-diane du sac scrotal. Après identifica-tion des canaux déférents, une cauté-risation a permis leur obstruction. Lapeau a ensuite été refermée à l’aide

GroupeNombre

de sourisTraitement

A 6 Saline

B 6Meloxicam (20 mg/kg)

C 6Bupivacaine (5 mg/kg)


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de tissu-colle (Nexaband, Abbott la-boratories, Chicago).Le meloxicam a été choisi en raisonde sa capacité à soulager la douleuraprès une vasectomie chez la souris(Wright Williams et al., 2007). Bienque la bupivacaïne n’ait pas été testéesur des souris vasectomisées, cetanesthésique local a été choisi en rai-son de l’efficacité analgésique qu’ilprocure chez l’homme après une telleprocédure (Paxton et al., 1995).

2) Acquisition des imagesa) Etude StandardChaque souris a été filmée durant40 minutes, la veille de la chirurgie, àl’aide d’une caméra standard (SonyDCR-HC96) positionnée à une dis-tance fixe de la cage. Les souris ontensuite été filmées une heure post-vasectomie pour étudier leur compor-tement post-opératoire. A la fin dechaque acquisition vidéo, les sourisont reçu une injection sous-cutanéede Carprofen (Rimadyl 50 mg/mL, Pfi-zer plc, Allemagne) à raison de5 mg/kg et ont été remises dans leurcage d’hébergement (pour plus dedétails voir Dickinson et al., 2009).

b) Etude Haute RésolutionLa veille de la chirurgie, les souris ontété placées individuellement dans unecage en Plexiglas (44 cm x 28 cm x13 cm) possédant une paroi opaque.Chaque souris a été filmée séparé-ment à l’aide de deux caméras HauteDéfinition (Sony High Definition Han-dyCam modèle HDR-XR155) durant12 minutes. Les caméras ont été po-sitionnées comme présenté sur la Fi-gure 2, afin d’avoir la probabilité laplus élevée de visualiser les expres-sions faciales des souris. Une fois l’ac-quisition des images terminée,

chaque souris a reçu une injectionsous-cutanée de buprénorphine(0,05 mg/kg) sous la forme Vetergesic(Alstoe Animal Health) et a été remisedans sa cage d’hébergement.

Figure 2 : Disposition des caméras HauteDéfinition

3) Analyse vidéo et notation desimagesa) Etude Standard20 vidéos enregistrées en pré-op et20 en post-op ont été analysées aprèsnumérisation avec le logiciel Final CutPro 7. Les vidéos ont été visualiséesavec AVS Video Remaker (version3.1.1.83) et des captures d’écran ontété réalisées dès que la face de sou-ris était clairement visible. Les imagesainsi obtenues ont été sélectionnéespour ne garder que 100 images danschaque condition opératoire (pré-op etpost-op) et ont été rognées pour negarder que l’aire faciale. Cette étapeest importante pour éviter d’autresfacteurs, comme un pelage souillé,pouvant influencer les participantslors de la notation. En condition post-opératoire, parmi les 100 images sé-lectionnées, 50 correspondaient auxsouris traitées avec la solution saline,50 autres aux souris traitées au para-

cétamol. Des précautions ont étéprises lors du choix des images. Au-cune capture d’écran n’a été réaliséelorsque la souris présentait les com-portements d’exploration, de toilet-tage ou de repos. En effet, ceux-ciprovoquent une modification de l’ex-pression faciale de base et peuventinduire une grimace comparable àcelle que l’on peut observer lors-qu’une souris perçoit de la douleur(Langford et al., 2010).Les images ont ensuite été randomi-sées puis chacune d’entre elles a éténotée sur les différentes FAUs (res-serrement orbitaire, gonflement desjoues, position des oreilles, gonfle-ment du museau, conformation desvibrisses) et sur la douleur globaleperçue. Ce score de douleur globalecorrespond à une impression généralefaite par les participants sur la douleurque la souris est susceptible de res-sentir. 21 participants, plus ou moins expé-rimentés, ont contribué à la notationdes images en se basant sur un do-cument explicatif. Parmi eux, 1 vété-rinaire, 6 scientifiques, 7 techniciens,4 étudiants en sciences et 3 per-sonnes “inexpérimentées” (c'est-à-dire n’ayant aucune connaissance surle comportement des souris au préa-lable) devaient attribuer la note de “0”si l’unité d’action faciale semblait peuvisible, “1” si elle était modérémentvisible ou “2” si elle était sévèrementvisible (Tableau IIa). Pour la douleurglobale perçue, les participants de-

Notation de l’intensité des FAUs

Echelle

Non visible 0

Modérée 1

Sévère 2

Notation de la douleur globale

Echelle

Non visible 0

Légère / Modérée 1

Sévère 2(a) (b)

Tableau II : Légende de notation de l’intensité des unités d’action (FAUs) (a) et de la douleur glo-bale (b)

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vaient choisir entre “0” s’ils pensaientque la souris n’était pas en souffrance,“1” si elle l’était légèrement ou mo-dérément, “2” si elle l’était sévère-ment (Tableau IIb). Dans chaque cas,si l’image était jugée trop floue ou sile participant ne parvenait pas à noterun paramètre, la réponse “Ne saitpas” était attribuée.

b) Etude Haute RésolutionLes vidéos de souris filmées en pré-opet post-op ont été analysées à l’aidedu logiciel Quicktime (version 7.6.6).En utilisant la même méthodologieque dans l’Etude Standard, des cap-tures d’écran ont été réalisées à par-tir de chaque séquence. Une sélectiona permis de garder les images lesplus nettes possibles soit 60 imagesdans chaque condition chirurgicale(30 images en pré-op et 30 en post-op). Parmi les 30 images en conditionpost chirurgicale, 10 images ont étésélectionnées pour chaque traitement(saline, meloxicam et bupivacaïne). 21 participants ont contribué à la no-tation des images dont 4 techniciens,7 étudiants en sciences, 5 chercheurs,3 vétérinaires et 2 personnes “inex-périmentées” (Tableau II). Si l’image était jugée comme étanttrop floue, le participant devait attribuerla réponse “Ne sait pas” pour l’unitéd’action concernée ou la douleur.

4) Traitement des donnéesa) Etude StandardPour pouvoir évaluer la précision desréponses données par les participants,les moyennes des scores attribuéspour chaque FAU et par l’ensemble desparticipants ont été calculées danschaque condition opératoire (pré-op etpost-op). En théorie, les images issuesdes séquences filmées en pré-op ont

été évaluées comme correspondant àune situation sans douleur, soit à unscore théorique de “0” pour chaqueFAU et la douleur globale perçue.Comme suggéré par une précédenteétude menée chez la souris, la vasec-tomie bilatérale provoque une douleurintense associée à des comportementsdouloureux spécifiques (Wright-Williams et al., 2007). Ainsi, les imagesde souris prises à partir de séquencespost-op issues du groupe saline ontété supposées comme correspondantà un état de douleur “sévère”, soit àune note théorique de “2” pour l’en-semble des critères étudiés. Enfin, lesimages post-op issues du groupe traitéau paracétamol ont été considéréescomme correspondant à une douleur“faible à modérée”, soit à une notethéorique de “1”. Une analyse com-portementale réalisée précédemment asuggéré l’inefficacité du paracétamolpour soulager la douleur induite parune vasectomie chez la souris (Dickin-son et al., 2009). Cependant, il est rai-sonnable de considérer qu’à forte dose,le paracétamol permet une analgésie.Les différences entre les notesmoyennes pratiques (attribuées par lesparticipants) et les notes moyennesthéoriques ont été calculées.La précision des réponses donnéespar les participants est exprimée enpourcentage de faux positifs (lorsquele score attribué est supérieur auscore théorique), de réponses cor-rectes (lorsque le score attribué cor-respondait au score théorique),d’échec (lorsque le score attribué estinférieur au score théorique) et de ré-ponses “Ne sait pas” (Tableau III).

b) Etude Haute RésolutionLes données ont été traitées en utili-sant la même méthodologie que celle

utilisée pour l’Etude Standard pourpouvoir évaluer la précision des ré-ponses. Les souris du groupe salineont été considérées comme perce-vant une douleur sévère. Les imagescorrespondantes à ce groupe corres-pondaient donc à un score théoriquede “2”. Les images de souris issuesdu groupe meloxicam ont été suppo-sées comme correspondant à unedouleur faible à modérée et donc as-sociées à un score théorique de “1”.En effet, l'analyse comportementalede souris vasectomisées traitées avecdu meloxicam à raison de 20 mg/kga montré qu’une analgésie efficaceavait été induite (Wright-Williams etal., 2007). De plus, comme l’efficacitéde la bupivacaïne à soulager la dou-leur induite par une vasectomie chezl’homme a pu être mise en évidence(Paxton et al., 1995), les images is-sues de ce groupe de traitement ontégalement été supposées comme as-sociées à une douleur faible à modé-rée. En procédant de la même ma-nière que dans l’Etude Standard, lesnotes attribuées pour l’unité d’actionfaciale “vibrisses” n’ont pas été prisesen compte étant donné que la majo-rité des participants ne sont pas par-venus à visualiser ce critère.

Tableau III : Evaluation de la précision des ré-ponses données

Précision desréponses

Différence (score attribué -score théorique)

Faux positifScore attribué supérieur

au score théorique

CorrectScore attribué équivalent

au score théorique

EchecScore attribué inférieur

au score théorique

«Ne sait pas» /


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c) Vue globale sur la précision desréponsesLes différences moyennes entre lesscores pratiques et théoriques pourl’ensemble des paramètres (sauf lesvibrisses) ont été calculées danschaque étude. Les résultats sont pré-sentés en pourcentages moyens defaux positifs, réponses correctes,d’échec et réponses “Ne sait pas”pour l’ensemble des FAUs (sauf lesvibrisses) et dans chaque conditionopératoire (pré-op et post-op). Deplus, pour chaque FAU, le pourcentagemoyen de réponses correctes a étécalculé afin de d’évaluer la facilité denotation des différents critères.

d) Influence de l’expérience desparticipantsLes pourcentages de réponses cor-rectes pour chaque FAU ont été cal-culés dans chaque étude en fonctionde la connaissance des participantssur le comportement de douleur desanimaux de laboratoire (personnes“expérimentées” (scientifiques, étu-diants en sciences, vétérinaires, tech-niciens) et personnes “non-expéri-mentées”)). Pour chaque catégorie,les pourcentages moyens de ré-ponses correctes ont été calculés afinde déterminer si l’expérience des par-ticipants exerçait une influence sur lanotation des images.

Résultats1) Etude StandardComme présenté sur la Figure 3, laplupart des participants sont parvenusà noter correctement les images is-sues de la session pré-op pour le res-serrement orbitaire (72,9 % de ré-ponses correctes). Les pourcentagesde réponses correctes en pré-op pourla position des oreilles (56,9 %), le

gonflement du museau (42 %) et legonflement des joues (53,7 %) nesont pas aussi élevés. En conditionpost-opératoire, ces pourcentagessont faibles, notamment pour le res-serrement orbitaire (38,2 %), la posi-tion des oreilles (34,1 %), le gonfle-ment du museau (35,8 %) et legonflement des joues (27,6 %). A l’in-verse, ces mêmes unités d’action ontobtenu des pourcentages d’échec éle-vés (resserrement orbitaire : 41,8 % ;position des oreilles : 51,4 % ; gon-flement du museau : 47,4 % ; gonfle-ment des joues : 59 %). La plupartdes participants n’ont pas été ca-pables de noter l’unité “vibrisses”aussi bien en condition pré-opératoire(55,8 % de réponses “Ne sait pas”)que post-opératoire (46 % de ré-ponses “Ne sait pas”).Enfin, pour l’évaluation de la douleurglobale perçue, les proportions de ré-ponses correctes (52,6 %) et de faux-positifs (47,4 %) sont très proches encondition pré-opératoire. En post-op,les notes attribuées pour la douleurglobale ont donné lieu à 41,3 % defaux positifs et seulement 29 % deréponses correctes.

Figure 3 : Précision des réponses donnéesdans l’Etude Standard pour chaque critère :resserrement orbitaire (a), position des oreilles(b), gonflement du museau (c), gonflementdes joues (d), conformation des vibrisses (e) etévaluation de la douleur globale (f). Les résul-tats sont présentés en pourcentage de fauxpositifs, réponses correctes, d’échec et de ré-ponses “Ne sait pas” pour chaque conditionopératoire.

2) Etude Haute RésolutionLes réponses données pour lesimages de la session pré-op (Figure 4)sont majoritairement correctes pour leresserrement orbitaire (94,4 %), laposition des oreilles (58,9 %), le gon-flement des joues (68,4 %) et pour ladouleur globale (61,3 %). Les ré-ponses données en pré-op pour legonflement du museau et pour laconformation des vibrisses sont moinsprécises avec 52,4 % de réponsescorrectes dans chaque cas.L’unité “vibrisses” a obtenu le plus deréponses “Ne sait pas” en pré-op(25,6 %) et demeure élevé en post-op(35,4 %) par rapport aux autres FAUs.En session post-op, les pourcentagesd’échec pour le resserrement orbi-taire (78 %), la position des oreilles(55,1 %), le gonflement du museau(60,6 %), gonflement des joues(58,9 %) et la douleur globale(48,3 %) sont élevés.

Figure 4 : Précision des réponses donnéesdans l’Etude Haute Résolution pour chaquecritère étudié : resserrement orbitaire (a), po-sition des oreilles (b), gonflement du museau(c), gonflement des joues (d), conformationdes vibrisses (e) et évaluation de la douleurglobale (f). Les résultats sont présentés enpourcentage de faux positifs, réponses cor-rectes, d’échec et de réponses “Ne sait pas”pour chaque condition opératoire.

3) Vue globale sur la précision desréponses Les résultats des fréquences cumu-lées des réponses données pour l’en-

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semble des FAUs (à l’exception des vi-brisses) présentés sur la Figure 5 in-diquent que la majorité des partici-pants sont parvenus à noter lesimages en pré-op correctement danschaque étude (pourcentage de ré-ponses correctes : 56,4 % pourl’Etude Standard ; 68,5 % pour l’EtudeHaute Résolution). Le pourcentage defaux positifs demeure toutefois consé-quent en pré-op en particulier dansl’Etude Standard (41,9 %) par rapportà celui obtenu dans l’Etude Haute Ré-solution (28,2 %).Les résultats des fréquences cumu-lées des réponses données pour l’en-semble des FAUs (sauf les vibrisses)en post-op révèlent que le pourcen-tage de bonnes réponses est plusfaible qu’en condition pré-op, et ce,pour chacune des études réalisées(Etude Standard: 33,9 %; Etude HauteRésolution : 28,1 %). La plupart desparticipants ont échoué lors de la no-tation des images prises en post-op à49,9 % dans l’Etude Standard et63,2 % dans l’Etude Haute Résolution.

Figure 5 : Précision des réponses de l’EtudeStandard (a) et de l’Etude Haute Résolution (b)pour l’ensemble des FAUs (sauf les vibrisses).Les résultats sont présentés en pourcentagede faux positifs, de réponses correctes,d’échec et de réponses “Ne sait pas” pourchaque condition opératoire.

4) Influence de l’expérience desparticipantsLes résultats présentés dans le Ta-bleau IV indiquent que le pourcentagemoyen de réponses correctes pourl’ensemble des FAUs est inférieur à50% quelle que soit la catégorie desparticipants. Cependant, dans chaqueétude, le pourcentage moyen debonnes réponses des participants ex-périmentés (Etude Standard : 45,2 % ;Etude Haute Résolution : 46,5 %) estsupérieur à celui obtenu pour les per-sonnes inexpérimentées (Etude Stan-dard : 34,1 % ; Etude Haute Résolu-tion : 37,7 %).

De plus, l’analyse des scores attri-bués pour chaque FAU indique quel’unité “vibrisses” semble la plus dif-ficile à évaluer avec dans chaqueétude des pourcentages de réponsescorrectes les plus faibles par rap-port aux autres unités d’action, etce, quelle que soit l’expérience desparticipants (Etude Standard :33,5 % ; Etude Haute Résolution :28,8 %). Ce critère d’étude a égale-ment rassemblé le plus de réponses“Ne sait pas” pour l’ensemble desparticipants alors que très peu deréponses de ce type n’ont étéémises pour les autres unités d’ac-tion (données non présentées).

a

b

Tableau IV : Pourcentage de réponses correctes en fonction de l’expérience des participants pourl’Etude Standard (a) et l’Etude Haute Résolution (b). Ces deux tableaux présentent les pourcen-tages de réponses correctes pour chaque FAU et les pourcentages moyens de réponses cor-rectes. # indique le classement des FAUs en fonction des bonnes réponses obtenues.

CatégoriePourcentage de réponses correctes Pourcentage moyen de

réponses correctes enfonction de la catégorie

des participantsYeux Museau Joues Oreilles Vibrisses

Participantsexpérimentés

56,7 41,2 43,2 48,2 36,6 45,2

Participantsinexpérimentés

46 30,2 27,8 36,3 30,3 34,1

Pourcentagemoyen deréponses correctespour chaque FAU

51,4 #1

35,7 #3

35,5 #4

42,3 #2

33,5 #5

CatégoriePourcentage de réponses correctes Pourcentage moyen de

réponses correctes enfonction de la catégorie

des participantsYeux Museau Joues Oreilles Vibrisses

Participantsexpérimentés

56,1 42,3 49,4 49,1 35,5 46,5

Participantsinexpérimentés

58,3 30,6 33,3 44,4 22 37,7

Pourcentagemoyen deréponses correctespour chaque FAU

57,2 #1

36,5 #4

41,4 #3

46,8 #2

28,8 #5


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L’unité “resserrement orbitaire” a ras-semblé le plus de réponses correctesdans les deux études (Etude Stan-dard : 51,4 % ; Etude Haute Résolu-tion : 57,2 %). La classification despourcentages de réponses correctesmontre que l’unité “position desoreilles” se situe en seconde position(Etude Standard : 42,3 % ; EtudeHaute Résolution : 46,8% de réponsescorrectes). Enfin, les unités “gonfle-ment des joues” (Etude Standard :35,5 % ; Etude Haute Résolution :41,4 % de réponses correctes) et“gonflement du museau” (Etude Stan-dard : 35,7 % ; Etude Haute Résolu-tion : 36,5 % de réponses correctes)ont rassemblé moins de réponses cor-rectes que les deux unités d’actionprécédentes.

DiscussionBien que l’expérimentation animale de-meure une nécessité en recherche bio-médicale, son recours est aujourd’huisoumis à des règles éthiques strictes.La douleur constitue un des facteursmajeurs à prendre en compte à toutmoment lors d’une procédure invasive.Une prévention et une prise en chargerapide par l’utilisation d’analgésiquessont essentielles. Mais avant mêmed’envisager l’atténuation de la douleurchez un animal, il faut pouvoir l’évaluer.Diverses techniques, généralement uti-lisées de manière complémentaire,permettent aujourd’hui l’évaluation dela douleur chez la souris. Le nouveau“système d’évaluation comportemen-tale standardisé ”, nommé MGS parses créateurs, permettrait unemeilleure prise en charge de la douleurengendrée lors d’un protocole invasifchez la souris.En condition post-opératoire, les ré-sultats indiquent que la plupart des

participants n’auraient pas adminis-tré de traitement analgésique à dessouris qui étaient pourtant en détresse.Dans ce cas, la notation de l’ensembledes FAUs était incorrecte, avec unemajorité d’échec. Les scores attribuéspar les participants étant inférieursaux scores théoriques, la douleur dessouris vasectomisées a donc été sous-estimée. En effet, des analyses com-portementales conventionnelles desouris vasectomisées suggèrent quecette procédure est douloureuse (Dic-kinson et al., 2009 ; Wright-Williams etal., 2007). Bien que dans l’Etude Stan-dard l’évaluation de la douleur globaleen post-op avait tendance à être sur-estimée avec un taux important defaux positifs, il s’agit d’une situationunique. Cette sur-évaluation suggèreque les participants auraient adminis-tré un traitement analgésique à dessouris qui n’éprouvaient aucune dou-leur. A l’inverse, dans l’Etude HauteRésolution, la douleur globale a étémal évaluée en post-op, révélée parl’attribution de très nombreuses ré-ponses incorrectes.Malgré l’utilisation de caméras HauteDéfinition, la précision des réponsesdonnées pour les images capturéesen post-op n’a pas été améliorée parrapport à l’Etude Standard. Ceci estd’autant plus vrai pour l’unité vibrissequi nécessite une extrême précisionque nous ne sommes pas parvenus àatteindre malgré l’utilisation de maté-riel sophistiqué. Ainsi, la notation dece critère apparaît comme étant trèssubtil, avec des pourcentages de ré-ponses correctes les plus faibles parrapport aux autres FAUs. Ainsi, la plu-part des participants étaient inca-pables d’observer une modificationdes vibrisses et ont préféré ne pasattribuer de note. L’amélioration de la

précision des images obtenues ap-paraît comme un point primordial àconsidérer avant d’envisager la réali-sation d’autres études.Malgré ce manque de précision,l’unité “resserrement orbitaire” a ob-tenu le pourcentage de réponses cor-rectes le plus élevé dans les deuxétudes et semble être le critère le plusvisible, devant les unités “position desoreilles”, “gonflement du museau” et“gonflement des joues”. Ce critèresemble être le plus objectif et le plusfacile à utiliser pour mesurer la dou-leur chez la souris lors de l’observa-tion des expressions faciales.Par ailleurs, l’expérience des partici-pants semble influencer la notationdes images. En effet, les participantsayant des connaissances sur le com-portement des rongeurs au préalable,de par leur activité professionnelle,sont meilleurs observateurs que ceux“inexpérimentés”, c’est-à dire n’ayanta priori aucune connaissance sur lecomportement de ces animaux. Bienque les personnes spécialistes soientparvenues à évaluer les différents cri-tères d’étude plus aisément que lesnon-spécialistes, une formation del’ensemble des participants à la mé-thode MGS semble primordiale avantle début de l’observation des images.En effet, le MGS nécessite une exper-tise qui ne peut s’acquérir qu’aprèsavoir été sensibilisé à l’observationdes cinq critères morphologiques fa-ciaux. Comme toute méthode appliquéechez l’animal, le MGS est probable-ment soumis aux variations intra-in-dividuelles et inter-souches. De pré-cédentes analyses comportementaleschez la souris subissant une vasecto-mie abdominale ont permis de mettreen évidence l’existence de différences

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comportementales entre des sourisde souche CBA et DBA/2 (Dickinson etal., 2009). De plus, le fond génétiquepeut influer sur la perception de ladouleur et cette dernière peut varierselon les souches ou le sexe des sou-ris étudiées (Mogil et al., 1997). A tra-vers ces deux études, nous avons puobserver que la couleur du pelage dessouris semblait influencer la visibilitédes FAUs. En effet, chez les souris aupelage blanc ou gris (souris CD1 etDBA/2), l’observation des critèresmorphologiques faciaux était plus fa-cile que chez les souris au pelagemarron (CBA). Comme suggéré parLangford et al., l’utilisation d’un paroiopaque au fond de la cage utiliséepour l’acquisition vidéo doit créer uncontraste et limiter les reflets. Il sem-blerait que l’utilisation de cette paroiopaque a permis une amélioration dela visibilité des expressions facialesdes souris CD1 par rapport à l’EtudeStandard.Le choix du nombre d’images à ana-lyser représente une autre limite àcette méthode puisque la représenta-tivité des résultats en dépend. Ce-pendant, il faut considérer le fait qu’untrop grand nombre d’images a ten-dance à décourager les participants,comme cela a été le cas pour l’Etude

Standard (200 images). Par ailleurs,selon le nombre d’images sélection-nées, leur analyse nécessite un lapsde temps qui n’est pas tolérable si unanimal est en souffrance. Il est doncpréférable de considérer la méthodeMGS comme un outil complémentaired’évaluation de la douleur, parallèle-ment aux techniques d’analyse ducomportement spontané et aux testsnociceptifs traditionnels. Le MGSpourrait aussi être introduit lors deformations afin de fournir des infor-mations pertinentes relatives au com-portement de douleur chez la souris.Enfin, des tests gustatifs ont permisde mettre en évidence la présence duréflexe gusto-facial chez le rat (Grill etNorgren, 1978). Ceci suggère que lerat est capable de solliciter sesmuscles faciaux pour s’exprimer, dansce cas vis-à-vis de son aversion ou desa préférence envers les stimuli gus-tatifs testés. Les expressions facialesde la douleur chez le rat n’ont pasencore été étudiées. Cependant,l’existence d’un tel réflexe laisse pen-ser que le rat peut également expri-mer sa détresse par l’intermédiairedes expressions faciales. De plus, àl’exception des primates non-hu-mains, nos connaissances sur les ex-pressions faciales des émotions chez

d’autres animaux de laboratoire de-meurent limitées. Des investigationsdans ce sens pourraient contribuer àl’amélioration continue de la prise encharge de la douleur des animaux uti-lisés en recherche biomédicale.

ConclusionPour conclure, la méthode Mouse Gri-mace Scale développée par Langfordet al. apparaît comme un outil inté-ressant pour évaluer la douleur chezla souris. Son utilisation nécessite tou-tefois la prise en compte de multiplesfacteurs comme une formation préa-lable des participants et une percep-tion de la douleur variable selon les in-dividus et les souches de sourisétudiées. D’autre part, une utilisationdirecte du Mouse Grimace Scalesemble difficile. Les déplacements dela souris étant très rapides pour l’œilhumain, ils ne permettent pas une ob-servation précise des critères à tra-vers la cage. Ainsi, l’analyse desimages issues des séquences vidéonécessite également un délai incon-cevable si l’animal est en détresse. Ilest donc raisonnable de considérer leMGS comme une méthode complé-mentaire aux techniques pré-exis-tantes, afin d’affiner l’évaluation dela douleur.


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________________________________________________________________

P.O. Box 2170 Tel: + 31 13 4555189 5001 CD Tilburg Fax: + 31 13 4550175

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RésuméLe nématode Caenorhabditis elegans(C. elegans) est un invertébré combi-nant simplicité et complexité. Cettedualité permet de l’utiliser commemodèle pour étudier rapidement etrelativement aisément d’importantsprocessus biologiques relevant pourtous les eucaryotes. Dans cette revueseront présentés les aspects majeursde l’anatomie et de la physiologie dece nématode ainsi que certains desprincipaux outils utilisés en labora-toire. Des expériences marquantestant du point de vue méthodologiquequ’historique seront décrites pourillustrer les possibilités de l’animal.Finalement, l’étude de l’immunité an-tifongique de ce ver sera utiliséecomme exemple pratique pour pré-senter les ressources de C. elegans etmettre en contexte les outils décrits.

IntroductionDe l’humus à la géloseLes premières publications qui parlentde C. elegans datent de la fin du19ème siècle et sont le fruit du travail dubiologiste français Emile Maupas(http://wormbase.sanger.ac.uk/papers/1900-maupas/Maupas_1900.pdf). Cetarchiviste de formation passionné desciences naturelles, consacre sontemps libre à l’étude d’animaux mi-croscopiques présents dans le sol.L’académie des sciences remarque laqualité de ses travaux et le nomme en1901 correspondant pour l’institut enAlgérie. Ce naturaliste est particulière-ment intrigué par le mode de repro-duction hermaphrodite de certains verset il est le premier à décrire précisé-ment l’anatomie de C. elegans qu’ilisole d’un humus en Algérie. C’est ainsique ce vers fut sorti de terre !A partir des années 1940, des travauxde différents biologistes sur les néma-todes dont C. elegans vont permettrede mieux connaitre ce petit inverté-bré. On peut relever les travaux d’Ells-worth Dougherty (Dougherty and Cal-houn, 1948) et de Victor Nigon (Nigonand Dougherty, 1949) qui décrierontrespectivement le mode de nutritionet la croissance des nématodes Cae-norhabditides ainsi que le mode de re-production de C. elegans. C’est à partir de 1960 que la carrière decet animal en tant que modèle en bio-logie va prendre son essor. En effet, lebiologiste moléculaire Sydney Brennerà qui nous devons déjà des avancéesremarquables sur la nature du codegénétique (Crick et al., 1961) obtient deE. Dougherty des spécimens de C. ele-

Du nématode Caenorhabditis elegans et deson utilisation en laboratoire

RemerciementsÀ Jonathan Ewbank et Olivier Zu-gasti pour les commentaires etdiscussions.


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gans (la souche N2) isolée quelquesannées plus tôt à Bristol en Angleterre.Il en fait son modèle d’étude de prédi-lection car il recherche un animal ana-tomiquement simple et facile à mani-puler pour pouvoir établir les basesgénétiques et moléculaires du déve-loppement. Dans son laboratoire auMedical Research Council (MRC) deCambridge, S. Brenner va développerles outils génétiques permettant d’uti-liser C. elegans comme modèle. En1967 il expose des nématodes à l’EMS(Ethyl Methane Sulfonate), un puissantagent chimique mutagène et com-mence ce qu’il appelle sa première «chasse aux mutants ! » (Brenner, 1974).A partir des nombreuses constantesqui caractérisent cet animal, il isole denombreux mutants dont le premier estnommé dumpy (signifie boulot) car ilest plus petit et plus large que lasouche sauvage. Il publiera en 1974 «The genetics of Caenorhabditis elegans» (http://wormbase.sanger.ac.uk/pa-pers/31_Brenner74.pdf) (Brenner,1974), où il décrit la méthode qui luipermit l’étude de près de 300 mutantset la cartographie de 100 gènes. Cestravaux sont toujours cités comme LAréférence en génétique de C. eleganscar ils posent les bases de l’analyse gé-nétique chez ce nématode. La forcedans le travail de S. Brenner tient au faitqu’il va parvenir à mobiliser autour dece modèle toute une communauté debiologistes qui vont, grâce aux atoutsde cet animal, rapidement faire avan-cer la compréhension de ce nématodemais aussi de certains processus com-muns aux eucaryotes. La généalogiedes chercheurs qui dans les labora-toires à travers le monde travaillent surC. elegans a été faite et la racine com-mune les ramène à S. Brenner.

Anatomie et physiologieUn animal au mode de vie adaptéau travail en laboratoireC. elegans est un organisme modèleutilisé en biologie depuis plus de40 ans. L’étendue des connaissancesobtenues grâce à cet animal va desmécanismes de l’apoptose (Ellis andHorvitz, 1986) jusqu’à la machineriemoléculaire de l’ARN interférence (Fireet al., 1998) en passant par les neu-rosciences (Bargmann, 1993), le dé-veloppement (Rocheleau et al., 1997),les voies de signalisation (Shen et al.,2001), la résistance aux stress (Freed-man et al., 1993), les maladies géné-tiques humaines (Driscoll and Gerst-brein, 2003) et plus récemment lesinteractions hôte-pathogène (Sifri etal., 2005, Irazoqui et al., 2010 , Kurzand Ewbank, 2003). Dans la nature, ce ver qui mesure en-viron 1 mm de long à l’âge adulte setrouve dans le sol ainsi que sur lesfruits en décomposition où il se nour-rit de microorganismes (Barrière andFelix, 2006).Son mode de nutrition et sa petitetaille font qu’il est facile à cultiver. Enlaboratoire, les animaux sont élevés

dans des boîtes de pétri sur un milieugélosé ensemencé avec une souchede bactéries Escherichia coli soucheOP50 (Riddle et al., 1997) (Figure 1).Les températures optimales de cul-ture de ces nématodes sont com-prises entre 15 °C et 25 °C. C. elegansa un mode de reproduction particu-lier ; c’est un animal hermaphroditeautofécondant. Cette spécificité estextrêmement précieuse au laboratoirecar il est ainsi possible d’obtenir unepopulation clonale à partir d’un seulindividu homozygote pour un carac-tère considéré. Bien que majoritaire-ment hermaphrodite (figure 2), ilexiste néanmoins des mâles dont lafréquence dans la nature est estiméeentre 0.1 et 0.2 % (figure 3). Lesmâles sont le produit d’une « erreur »dans la répartition des chromosomesX à la méiose.Sous la lumière du microscope,C. elegans apparaît relativementtransparent et son anatomie est à pre-mière vue simple (figures 2 et 3). Labouche de l’animal donne sur le pha-rynx dont le rôle est d’aspirer pouramener la nourriture vers le broyeur.Constitué de chitine, il transforme la

E. coli

Figure 1 : Culture de C. elegans. A gauche ; boîte de Pétri contenant un milieu gélosé ensemencéavec E. coli, la bactérie qui sert de nourriture à C. elegans . A droite ; vue grossie du tapis bactériensur lequel C. elegans est cultivé.

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nourriture en un lysat qui passe en-suite dans l’intestin où il est assimilé.Les bactéries ingérées sont donc dé-truites et ne passent pas intactes labarrière du broyeur. La fin de l’intes-tin débouche sur le rectum dans la

partie postérieure du nématode. Chezl’hermaphrodite, la gonade possèdedeux bras qui sont réparties dans lapartie antérieure et postérieure del’animal. Chacune débouche sur unepoche contenant le sperme produit

par l’animal : la spermathèque qui ellemême est reliée à l’utérus (figure 2).Par conséquent, les oocytes se diffé-rencient en progressant dans la go-nade puis entrent en contact avec lesperme de l’animal. L’œuf ainsi fé-condé démarre son développementavant d’être pondus moins de 10heures plus tard. En ce qui concernele mâle, son système reproducteurprésente une gonade unique quicontient le sperme (figure 3). Elleaboutit sur un cloaque commun avecl’anus. Des excroissances dans la par-tie postérieure forment un éventailcriblé de terminaisons nerveuses quifacilite la reproduction avec l’herma-phrodite. Malgré le caractère autofé-condant, la reproduction entre lesmâles et les hermaphrodites donneune descendance à la ségrégationMendélienne car les gamètes du mâleprennent le dessus sur le sperme del’hermaphrodite. Cette particularitépermet des approches en routine degénétique classique.Une coupe transversale d’un herma-phrodite adulte révèle une structureen tubes intriqués (figure 4). L’animalest entouré et protégé par une cuti-cule faite d’un maillage de collagènes,protéines sécrétées par un tissus sousjacent, l’épiderme de C. elegans. Souset contre cet épiderme se trouventdes faisceaux de muscles ainsi quedes cordes nerveuses. L’intestin et lesgonades sont relativement au centre,baignés dans un fluide appelé liquidepseudocoelomique.La prolifération de cet animal est im-portante et rapide. A 20 °C, il ne fautque 3 jours à un œuf pondu par unadulte pour donner à son tour un adultecapable de pondre des œufs. La crois-sance d’un individu se fait au traversde mues successives qui rythment les

A

B

Figure 2 : Anatomie d’un hermaphrodite adulte. (A) Image en microscopie Nomarski d’un hermaphro-dite adulte et de deux embryons. (B) Schéma de l’anatomie d’un hermaphrodite adulte (vue latéralegauche). Adapté de wormatlas (http://www.wormatlas.org/).

A

B

Figure 3 : Anatomie d’un mâle adulte. (A) Schéma de l’anatomie d’un mâle adulte (vue latéralegauche). (B) Image en microscopie Nomarski d’un mâle adulte. Adapté de wormatlas (http://www.wormatlas.org/).

Cuticule

Corde nerveuse

Muscle

Gonade

Intestin

Epiderme

Pseudocoelome

Figure 4 : Schéma d’une coupe transversale d’un hermaphrodite adulte. Adapté de wormatlas (http://www.wormatlas.org/).


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4 stades larvaires. Chaque adulte peutpondre environ 300 œufs et ceci enseulement 5 jours. Par conséquent, unnématode peut engendrer en 10 joursune population de 90 000 animaux gé-nétiquement identiques.Dans les conditions standards de la-boratoire, les vers de génotype sau-vage peuvent vivre jusqu’à 20 joursmais il existe des mutations poussantcette limite à plus de 100 jours. Leplus remarquable est que les gènesdont les mutations accroissent la du-rée de vie du ver sont conservés chezles mammifères (Kenyon, 2010) cequi rend ce domaine de recherchetrès actif dans la communauté desutilisateurs de C. elegans.

De nombreuses constantes serventde repèresUn des intérêts majeur de ce néma-tode provient de sa constance tantd’un point de vu anatomique qu’auniveau de ses cycles. L’hermaphro-dite contient exactement 959 noyauxde cellules somatiques dont précisé-ment 302 appartiennent à des neu-rones. Le lignage cellulaire est inva-riant et a été identifié (Sulston et al.,1983). Cela signifie que la parentéainsi que la position de chaque cellulesont identiques d’un individu à unautre. Cette particularité a permis àJohn White (collaborateur de S. Bren-ner) et son équipe de reconstruire lesystème nerveux du nématode à par-tir de coupes sériées de vers et d’ob-servations en microscopie électro-nique (White et al., 1986). Lespositions et les connexions entreschaque neurones ont été déterminéesmême si la densité de ces derniers auniveau du pharynx a rendu la tachecomplexe. Ces cartes du système ner-veux de C. elegans, auxquelles

s’ajoute la possibilité de faire desablations spécifiques de cellules àl’aide d’un laser, sont des outils pré-cieux pour étudier et comprendre desmécanismes liés à la locomotion, lamécanosensation, la chémosensationou encore la thermosensation de cetanimal. Il n’y a pas que d’un point devue morphologique que ces animauxsont constants. La vie d’un ver est eneffet régie par de nombreux cyclesqui sont autant de standards qui at-testent de la bonne santé de l’animal.Par exemple, le broyeur se contracte3 fois par seconde pour casser lesparticules de nourriture et la déféca-tion se produit 1 fois toute les 45 se-condes. L’hermaphrodite, à un cer-tain âge, pond 6 œufs par heure et lemouvement de l’animal dans un li-quide implique 120 ondulations parminute (Wong et al., 1995). De même,le temps de développement, les pé-riodes entre chaque mues ainsi que ladurée de vie sont aussi desconstantes extrêmement utiles pourcaractériser un mutant ou une ré-ponse à de nouvelles conditions. Depart la régularité dans son dévelop-pement, il est possible de synchroni-ser des populations à très grandeéchelle de manière à s’astreindre desdifférences d’âge entre individus. Aplus petite échelle, il est aussi pos-sible de sélectionner des individusd’un stade spécifique car ils présen-tent des particularités morphologiquestel que le quatrième stade larvaire quipossède une zone plus claire en formede croissant de lune qui préfigure lavulve en devenir.

Techniques et outilsDe nombreux mutants présententdes phénotypes remarquablesLes constantes de forme, d’activité

ou de temps de développement ontété dès le début de l’utilisation du né-matode des atouts précieux pour dé-marrer la génétique. De nombreuxmutants ont rapidement été isolés surla base de phénotypes flagrants telsque des défauts locomoteurs (mu-tants unc : UNCoordinated), des taillesaberrantes (mutants sma : SMAll oulon : LONg) ou encore un rythme deponte anormal (mutants egl : EGgLaying defective). Ces mutants auxphénotypes évidents en comparaisonavec les standards des animaux sau-vages sont devenus autant de mar-queurs génétiques localisés sur les6 chromosomes de C. elegans (5 au-tosomes et 1 chromosome sexuel).Les travaux de S. Brenner que nousavons déjà évoqué ont permis d’initierl’élaboration d’une carte génétiquequi a été la pierre angulaire faisant deC. elegans un modèle précieux en bio-logie. Cette ressource ouvre la porteaux approches génétiques par muta-génèse qui font parties de ces tech-niques de choix permettant d’abor-der une problématique biologique demanière non-biaisée.

Les vers se conserventpar congélationUn avantage plus que conséquent dumodèle nématode concerne laconservation et le maintient à longterme des souches ou des mutantsobtenus. En effet, les nématodes peu-vent êtres congelés et sont conservésà -80 °C ou dans de l’azote liquide.Mise au point par John Sulston, lacongélation se fait dans une solutionà base de glycérol. Même si les résis-tances au procédé varient, tous lesstades larvaires sont congelables etseuls les œufs ne résistent pas. Aprèsdécongélation certains animaux vont

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se réveiller en à peine quelques mi-nutes et pondre le jour suivant. Lerythme de ponte de l’animal suffit àreformer des populations complètesen quelques jours à partir d’un seulanimal. Si cette méthode est correc-tement mise en œuvre elle permet derécupérer la majorité des animauxtraités. Les possibilités de stockagedes souches de nématodes sontpoussées à leur extrême au Caeno-rhabditis Genetic Center (CGC) quipossèdent plus de 12,000 souchesde C. elegans (mutants, lignées trans-géniques,…). De plus, tout labora-toire peut envoyer ses souches auCGC qui se chargera de les stocker etde les distribuer aux autres équipesselon leurs demandes (http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/). Cettecentralisation, lisibilité et libre distri-bution du matériel biologique est unimmense avantage pour accélérer letravail et éviter les redondances.

Plus de mutants générés que degens pour les caractériserLe criblage génétique est une ap-proche très précieuse pour la com-préhension globale d’un mécanismebiologique. Cette technique, qui vise àmodifier le génome pour altérer lephénotype des organismes, permetd’identifier les gènes requis pour unprocessus déterminé mais aussi lesséquences promotrices, les enhan-cers, les sites d’épissage ou encoreles régions 3’ UTR nécessaires à labonne expression et à la régulation dugène ciblé. De manière à obtenir unevision complète du mécanisme d’in-térêt, il faut en théorie pouvoir modi-fier chacun des gènes de l’organismece qui implique de manipuler une trèsgrande quantité d’animaux. L’idéal estd’atteindre un niveau théorique de

mutation de l’ordre de la saturation dugénome. Le nématode est particuliè-rement adapté à ces approches parson caractère hermaphrodite autofé-condant, sa taille et son faible coût. Eneffet, 1 million d’animaux mutagéni-sés et prêts à être testés pour un phé-notype donné sont aisément obtenusen quelques semaines, contenus dansseulement 20 boîtes de Pétri et cecipour un coût équivalent à celui d’unesouris. De plus, les très bonnesconnaissances dont nous disposonssur l’anatomie et la physiologie de cetanimal favorisent le développementde cribles génétiques qui portent no-tamment sur la locomotion, le com-portement ou le développement. Cettefacilité de mutagénèse et de cribleincite très souvent les laboratoires autiliser ces techniques dans leurs pro-jets de recherche. L’animal pouvant secongeler, les congélateurs de ces la-boratoires contiennent de nombreuxmutants qui nécessiteront le travailde beaucoup de collaborateurs surplusieurs années. Les études réali-sées par l’équipe de Robert Horvitz,qui travailla un temps avec S. Brenner,sont une bonne illustration de l’utili-sation des cribles génétiques. C’est àpartir de la connaissance du lignagecellulaire de C. elegans qu’ils ontidentifié par mutagénèse des animauxavec des défauts de différenciationou des cellules surnuméraires. Parmices nombreux mutants se trouvaientune lésion dans le gène ced-3 quis’est avéré être un homologue dugène humain codant la caspase-1.Cette découverte chez le ver a dé-montré le contrôle génétique del’apoptose et a grandement éclairéles découvertes de ces voies de si-gnalisation chez les mammifères(Yuan et al., 1993).

Des animaux transgéniques en unesemaineLa transparence des animaux est unatout majeur pour l’observation depatrons d’expression cellulaire. Il estrelativement aisé de créer des ani-maux génétiquement modifiés quicontiennent tout ou partie du gèneconcerné ainsi qu’un fluorochromecomme la Green Fluorescent Protein(GFP) (Chalfie et al., 1994). De plus, denombreuses expériences nécessitentle sauvetage d’une mutation par réin-troduction de la version sauvage ouplus simplement la surexpressiond’un gène d’intérêt ou son expressionectopique. Toutes ces approches, quinécessitent l’introduction de matérielgénétique pour établir des lignéestransgéniques, sont effectuées enroutine avec C. elegans. Différentesméthodes existent mais la plus cou-rante, développée en 1991 par CraigMello (Mello et al., 1991), consiste, àl’aide d’un fin capillaire de verre, à in-jecter le matériel génétique directe-ment dans les gonades des herma-phrodites. Moins d’une heure estnécessaire à l’injection d’une ving-taine d’animaux et une semaine d’at-tente est requise pour l’identificationde lignées stables issues de ladeuxième génération. Tous les typesd’acides nucléiques allant des ARNsau produit PCR en passant par leschromosomes artificiels peuvent êtresinjectés. L’ADN injecté est transformépar le nématode en un extrachromo-some contenant de multiples copiesdu produit. De part l’absence de zonecentromérique spécialisée sur leschromosomes du ver, l’extrachromo-some est reconnu comme matérielendogène à la mitose par la machi-nerie réplicative du nématode.


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Les constructions portées par les li-gnées ne sont généralement pas inté-grées et l’association d’un marqueur deco-injection est nécessaire pour attes-ter de la présence du transgène d’inté-rêt. Ces marqueurs sont généralementdes modificateurs de la morphologiedu ver ou permettent de produire de lafluorescence. Récemment, des mar-queurs de co-injection procurant unerésistance à un antibiotique ont été dé-veloppés. Ceci permet une sélectiontout comme avec les bactéries ou lescellules eucaryotes (Giordano-Santiniet al., 2010, Semple et al., 2010). Uneétude récente illustre particulièrementbien la facilité d’obtention des lignéestransgéniques ainsi que les avantagesassociés à la transparence du ver. De-nis Dupuy et ses collaborateurs ont gé-néré 900 souches transgéniques com-portant les promoteurs de 900 gènesfusionnés à celui codant la GFP. Parl’analyse de l’expression de la GFP lelong des animaux au cours du temps(voir plus bas l’explication concernant letrieur de nématode), ils ont déterminénon seulement le patron d’expressionspatial mais aussi temporel de ces dif-férents promoteurs (Dupuy et al., 2007).Un transgène étant rarement transmisà 100 % de la descendance, il est pos-sible d’intégrer les constructions dansle génome du ver pour pleinement uti-liser ces animaux. Cette intégration sefait de manière aléatoire en exposantles nématodes transgéniques à desrayonnements gammas qui provoquentd’importants dommages dans l’ADN.Si l’animal survit après réparation deson matériel génétique, il est possibleque le transgène soit intégré au gé-nome. Tout n’est qu’une histoire denombre et plusieurs lignées intégréessont généralement obtenues à partirde 500 animaux analysés. Les muta-

tions provoquées par le traitement sontensuite éliminées par des croisementssuccessifs avec des vers de génotypesauvage. Les lignées ainsi stabiliséesavec un fond génétique nettoyé sontobtenues en 1 mois et peuvent êtresutilisées pour des applications à grandeéchelle.

C. elegans est un organisme multi-cellulaire au génome séquencé etannotéLe nématode étant rapidement de-venu un modèle reconnu et relevantpour la biologie, d’importants effortsont été fournis au sein de la commu-nauté des laboratoires utilisant le né-matode pour finaliser le séquençagede cet invertébré et fournir une anno-tation compréhensive de ses 6 chro-mosomes. Initiée par le biologiste an-glais J. Sulston en collaboration avecRobert Waterston, qui a dirigé le travailde séquençage à l'université de Wa-shington, la séquence complète dugénome de C. elegans fut publiée en1998 (T. C. S. C., 1998). Ce travailconstitue le premier décryptage del’ADN d’un métazoaire, les séquen-çages précédant ayant concerné labactérie Haemophilus influenzae en1995 et la levure Saccaromyces cere-visiae en 1997. En terme de chiffres, legénome du nématode est constituéde 100 Méga bases (3 Giga bases pourl’homme) avec environ 20 000 gènes(30 000 pour l’homme) annotés. Lescomparaisons entres les différentesséquences disponibles ont rapidementsoulignées la relevance du modèle né-matode pour la compréhension de labiologie des mammifères car 74% desprotéines humaines présentent deshomologues chez le ver (T. C. S. C.,1998). Certaines de ces ressem-blances sont telles qu’elles stimulent

des approches qui portent sur la ma-ladie d’Alzheimer ou de Parkinsonchez le ver (Driscoll and Gerstbrein,2003). Ces maladies humaines sonten partie liées à une accumulation deprotéines qui forment des agrégatstoxiques pour la cellule et de telssymptomes peuvent êtres induits chezle ver en surexprimant dans certainescellules le prototype de ces molécules.Ces protéines sont fusionnées à la GFPet la transparence du nématode per-met de visualiser directement la for-mation ou la dissolution de ces aggre-gats chez les animaux transgéniques.Il est ainsi possible d’effectuer describles génétiques pour identifier desfacteurs aggravants ou protecteursainsi que d’utiliser ces nématodescomme plateforme in vivo pour testerl’effet de certaines molécules oudrogues (Choe and Strange, 2008).

Inactivation direct d’un gène ou deson produit, oui ; KO ciblé, nonUne autre approche qui découle di-rectement de l’obtention de la sé-quence génomique de C. elegans estla génétique inverse. Les comparai-sons de gènes entres espèces et le re-coupement des travaux effectués chezdifférents organismes permettent d’at-tribuer une fonction putative à de trèsnombreux produits de gènes du né-matode. Pour tester la fonction d’ungène dans l’animal, il faut pouvoir sup-primer ce gène ou le produit de cegène. L’approche reine qui chez lasouris consiste a enlever tout ou par-tie d’un gène ciblé (Knock Out) n’estque très peu efficace chez le ver. Parcontre, des couples d’oligonucléotidespeuvent êtres définis pour tester laprésence et l’état du gène d’intérêtpar PCR (Polymerase Chain Reaction).Il est donc possible de contrôler la pré-

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sence de délétions dans une popula-tion traitée aux rayons ultraviolets. Cer-tains laboratoires (http://www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/index.jsp et http://celeganskoconsortium.omrf.org/) dé-dient une part de leur temps à la gé-nération de population de mutantsqu’ils testent pour la présence de dé-létions spécifiques selon demande.Ces mutants sont envoyés au labora-toire demandeur ainsi qu’au CGC (voirplus haut). Néanmoins, il n’y a aucunegarantie de délai concernant l’identifi-cation d’une délétion dans le gèned’intérêt. De plus, une banque de mu-tants composée d’animaux avec untransposon inséré dans le génome aété générée (Duverger et al., 2007). Laposition des transposons est identi-fiée et les nématodes congelés sontenvoyés sur demande (http://pbil.univ-lyon1.fr/segalat/data/mos.php). Ré-cemment, une technique de recombi-naison homologue a été développée àpartir de ces mutants dans le but d’in-sérer un fragment d’ADN à proximitédu site d’insertion du transposon (Ro-bert and Bessereau, 2007). En com-plément, il existe une méthode rapidepour supprimer spécifiquement destranscrits ; l’ARN interférence (ARNi).Ce mécanisme initialement identifiéchez les plantes (Ecker and Davis,1986) a été compris d’un point de vuemécanistique grâce aux travaux chezle nématode (Tabara et al., 1999). Sonutilisation pour inactiver spécifique-ment le produit de n’importe quel gènea révolutionné l’étude de la biologie deC. elegans ainsi que d’autres espèces.Il fallait initialement injecter dans lagonade des vers de l’ARN double brinsspécifique d’un gène pour observerune disparition des transcrits corres-pondants dans les animaux traitésainsi que leur descendance et ainsi

simuler une mutation perte de fonction(Timmons and Fire, 1998). Une autrealternative consistait à tremper les né-matodes dans une solution enrichieen ARN double brins. Finalement, unetroisième technique a été mise aupoint pour laquelle il suffit de nourrirles vers avec des bactéries qui pro-duisent l’ARN double brins pour ob-server une très forte diminution de laquantité de transcrits correspondants(Fraser et al., 2000). Sur ce principe eten utilisant les ressources associéesau séquençage, le laboratoire de JulieAhringer (Cambridge, Angleterre) aconstruit des banques de bactéries oùchaque clone permet de cibler spéci-fiquement un gène de C. elegans. Desbanques qui couvrent plus de 80 % dugénome du nématode sont disponibleset permettent de faire des criblages deperte de fonction « génome complet »(Kamath and Ahringer, 2003). Les tra-vaux récents de l’équipe de Todd La-mitina sur le stress osmotique illus-trent bien les outils décritsprécédemment. A partir d’animauxtransgéniques qui deviennent fluores-cents uniquement dans un contextede stress, ce groupe de recherche aeffectué l’ARNi de 16,000 gènes surces nématodes. Ils ont identifié desgènes dont la perte de fonction induitun stress chez l’animal (animal fluo-rescent) alors que l’environnementn’est pas stressant. Les gènes mis enévidence codent des protéines de sys-tèmes régulateurs impliqués dans lemaintient de l’homéostasie protéiquedu nématode (Lamitina et al., 2006).

De nombreuses ressources sur in-ternet pour partager découverteset matérielsToujours dans l’esprit de la diffusiondes ressources et des connaissances

au sein de la communauté des utili-sateurs de C. elegans et au-delà, denombreux sites sur internet sont dé-diés à la recherche sur le nématode.Le plus utilisé d’entre eux est certai-nement le site « wormbase »(http://www.wormbase.org) qui pré-sente la carte physique du génome deC. elegans ainsi que quantité d’infor-mations sur les mutants disponibles,les expériences effectuées ainsi que labibliographie correspondante. Ce siteest le point d’entrée vers d’autres res-sources telles que « wormbook »(http://www.wormbook.org/) ou «wormatlas » (http://www.wormat-las.org/). Le premier est un livre nu-mérique qui traite de nombreux as-pects de la biologie ou de l’utilisationde C. elegans tandis que le second estun atlas numérique de l’anatomie duver conçu à partir de coupes sériéesanalysées par microscopie électro-nique. Les patrons d’expression denombreux gènes sont aussi décrits etaident à l’identification cellulaire. Danscette thématique, il est intéressant denoter le site d’un consortium qui dé-termine systématiquement les pa-trons d’expressions des gènes deC. elegans et dont les images sontaccessibles au travers d’un moteurde recherche qui tri par tissu, stade dedéveloppement ou nom de gène(http://gfpweb.aecom.yu.edu/index).

Divers aspects de la biologie sontétudiables avec C. elegansDes possibilités rapidement dé-montréesLa simplicité de ce modèle à favoriséel’émergence d’incroyables décou-vertes biologiques et technologiquesqui ont bénéficié à des usages quis’étendent bien au-delà du nématode.A ce jour ce ne sont pas moins de


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3 prix Nobel qui ont récompensés6 scientifiques et leurs équipes pourleurs travaux directs sur C. elegans.Le prix Nobel de physiologie ou demédecine attribué en 2002 à S. Bren-ner, J. Sulston et R. Horvitz a soulignéles atouts du modèle nématode à tra-vers leurs découvertes qui concer-nent la régulation génétique du déve-loppement des organes et la mortcellulaire. Ce prix prend en compteles efforts ayant permis l’établisse-ment de l’animal comme modèle enbiologie, l’étendue des connaissancessur sa physiologie et les découvertesayant une relevance pour tous les ani-maux, résultats qui découlèrent engrande partie de cribles génétiques.En 2006, ce fut au tour d’Andrew Fireet C. Mello de se voir décerner ce prixpour leurs travaux sur l’interférencepar ARN. Bien qu’observée depuislongtemps chez les plantes, sous leterme de co-suppression, lors notam-ment de la surexpression de trans-gènes (Ecker and Davis, 1986), lacompréhension des bases molécu-laires de ce phénomène attendit l’uti-lisation du nématode. Partant du prin-cipe que l’ARNi est très efficace chezle nématode, C. Mello et A. Fire ontmis en place des cribles génétiquespour identifier des animaux résistantsà l’ARNi. Pour avoir un phénotype ro-buste, ils ont traité des populationsmutagénisées par l’EMS avec un ARNiqui entraine une létalité embryonnaire.Par conséquent, seuls les mutants ré-sistants à l’ARNi sont capables d’avoirune progéniture. Cette approche as-tucieuse et les études qui en ont dé-coulé ont posé les bases moléculairesde l’ARNi, processus qui s’est révéléhautement conservé chez les euca-ryotes (Tabara et al., 1999). Plus ré-cemment en 2008 Martin Chalfie,

Osamu Shimon et Roger Y. Tsien ontreçus le prix Nobel de chimie, pour ladécouverte et le développement de laGreen Fluorescent Protein (GFP)comme outils en biologie. Découvertedans les années 1970 par O. Shimurala GFP n’a été cloné et séquencéqu’en 1992. Le laboratoire de R.Y.Tsien n’a cessé d’améliorer et de mo-difier la GFP pour créer de très nom-breux fluorochromes actuellement uti-lisées par tous les laboratoires.M. Chalfie qui travaillait déjà surC. elegans a compris le potentiel de lacombinaison entre cette molécule etle nématode transparent. Il a alors ef-fectué les premières expériencesd’expression hétérologue de cetteprotéine chez l’animal et ouvert la voieaux études de patrons d’expression etaux approches par gène rapporteur(Chalfie et al., 1994). D’autres résultats obtenus grâce à cemodèle sont tout aussi remarquable telque l’identification des microARNs(miARN). Ils furent découverts en 1993par Victor Ambros, Rosalind Lee etRhonda Feibaum lors d’une étude surun mutant de C. elegans présentant undéfaut dans son lignage cellulaire. Cedéfaut était lié à une mutation dans lapartie non codante d’un gène (3’ UTRdu gène lin-14), séquence nécessaireà l’interaction avec un miARN (Lee etal., 1993). Le miARN correspondant(lin-4) fut le premier découvert mais ilfallut attendre l’année 2000 et l’iden-tification du miARN let-7 dont la sé-quence est conservée dans de nom-breuses espèces pour réaliser que lemécanisme de régulation par lesmiARN est aussi présent chez lesmammifères (Pasquinelli et al., 2000).Le monde des miARN est désormaisen pleine effervescence tant ces petitsacides nucléiques semblent impliqués

dans de nombreux mécanismes derégulations transcriptionnelles ou tra-ductionnelles (Bartel, 2009).

Vers une meilleure compréhensiondes infections grâce au nématodeComme décrit précédemment, C. ele-gans est un modèle de choix pour dé-crypter les mécanismes du dévelop-pement embryonnaire, de l’apoptoseou encore de la signalisation neuro-nale. Deux types d’approches vontétendre le spectre d’utilisation des in-vertébrés dont le nématode aux ma-ladies infectieuses ainsi qu’à la dis-section de l’immunité innée. Lepremier type de travaux est effectuéavec la drosophile et a pour cadre laréponse immunitaire innée. L’équipede Jules Hoffman à Strasbourg déter-mine en 1996 que le récepteur trans-membranaire TOLL identifié 10 ansauparavant pour son rôle dans l’orien-tation de l’axe dorso-ventrale de l’em-bryon de drosophile (Anderson et al.,1985) est crucial pour la synthèse depeptides antimicrobiens chez cettemouche suite à une infection fongique(Lemaitre et al., 1996). Cette décou-verte va trouver un écho retentissantauprès des immunologistes avec ladécouverte de récepteurs équivalentschez les mammifères, les TLR (TollLike Recepteurs) (Medzhitov et al.,1997). Chez la souris et l’homme no-tamment, ce sont ces récepteurs quiperçoivent les pathogènes, activentl’immunité innée et orchestrent la ré-ponse adaptative qui suivra à traversla régulation de la synthèse d’interfé-rons ou de cytokines (Palm and Medz-hitov, 2009). Les travaux qui ont suiviont démontré des similitudes inatten-dues entres les cascades de signali-sation qui aboutissent à la synthèsedes peptides antimicrobiens chez cet

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invertébré et les voies de signalisationen aval des TLRs des mammifères.Ces résultats obtenus avec un insecteet leur relevance pour les mammi-fères ont ouvert les yeux des biolo-gistes sur la conservation inter-es-pèces de processus autres que latranscription, la traduction ou la répli-cation. Dans le même temps, l’équipede Frederick Ausubel à Boston tra-vaille a l’identification de facteurs devirulence bactériens. Cette équipe partdu principe que des pathogènes avecun large spectre d’hôte allant desplantes aux mammifères utilisent cer-tainement un même lot de facteurs devirulence et ceci quel que soit l’hôte ;c’est le principe des facteurs de viru-lence universels. L’équipe de F. Ausu-bel par exemple détermine qu’il estpossible d’utiliser la plante commepremier modèle hôte pour identifierpar crible génétique des facteurs devirulence de la bactérie pathogènePseudomonas aeruginosa qui sontaussi requis pour l’infection chez lasouris (Rahme et al., 1995). Ce groupedécide ensuite d’utiliser le nématodecomme hôte pour l’identification defacteurs de virulence microbiens, tra-vaux qui s’avèrent relevant pour lesmammifères (Mahajan-Miklos et al.,1999). Ces découvertes, associées àl’existence d’une importante famillede pathogènes humains avec un largespectre d’hôte (P. aeruginosa, Serratiamarcescens, Burkholderia pseudo-mallei,…), ont ouvert la voie à denombreuses études (Kurz et al., 2003,Gan et al., 2002) dont les cribles demolécules potentiellement antimicro-biennes avec le ver comme modèlehôte pour l’infection (Breger et al.,2007). Finalement, les modèles d’in-fections caractérisés avec le néma-tode ont permis d’analyser la réponse

du ver et de mettre en évidence uneimmunité innée inductible dont leséléments des voies de signalisationsont conservés inter-espèces (Kim etal., 2002 , Mallo et al., 2002).

Cas pratique : étude de l’immunitéantifongique de C. elegansPour comprendre à quel point C. ele-gans est un modèle pratique et ro-buste, nous allons utiliser l’historiquedes expériences menées sur l’immu-nité antifongique de C. elegans dans lelaboratoire de Jonathan Ewbank(CIML, Marseille). Les étapes qui ontpermis les évolutions dans ce domaineseront illustrées par des détails surles protocoles types ainsi que parquelques exemples de résultats mar-quants. En effet, même si le question-nement change selon le sujet de re-cherche qui motive l’utilisation dumodèle C. elegans, les outils employésrestent sensiblement constants et sontle reflet du potentiel de ce modèle. L’exploitation qui peut être faite deC. elegans en tant que modèle pourl’étude de l’immunité innée nécessitetout d’abord que l’on définisse quelstypes de microorganismes peuvent in-fecter ce vers (Couillault and Ewbank,2002). Depuis bien longtemps deschampignons qui infectent des néma-todes (nématophages) sont connus etdécrits comme pathogènes naturelsdes nématodes (Barron, 1976, van denBoogert et al., 1992). Leur variété estgrande, leurs stratégies infectieusestout aussi variées et dans tous les casles nématodes sont pour eux unesource nutritive. Certains de ces cham-pignons sont capables de capturer lesnématodes grâce à de véritables lassosconstricteurs, d’autres via de petitesstructures adhésives qui piègent lesnématodes qui s’en approchent. Le

choix du laboratoire de J. Ewbank s’estporté en 1999 sur le champignonDrechmeria coniospora car quelquesétudes décrivaient déjà ce champignoncomme pathogène des nématodes telsque C. elegans (Coles et al., 1989).L’objectif était d’obtenir une infectionstandardisée pour effectuer des ap-proches de génétique et de transcrip-tomique sur l’hôte. D. coniospora estdéfinit comme un champignon néma-tophage strict qui infecte grâces à desspores d’environ 8μm de long. Cesspores ont une forme de massue etprésentent à leur extrémité apicale unestructure adhésive qui leur permetd’adhérer à la cuticule des nématodes(figure 5). Chez C. elegans, l’adhésionse produit préférentiellement autourde la bouche et de la vulve. Ainsi col-lées aux vers, les spores vont germerpour permettre la croissance deshyphes (système végétatif du champi-gnon) qui vont perforer sa cuticule puistraverser l’épiderme sous-jacent pourfinir par envahir le corps entier de l’ani-mal ce qui entraine sa mort. Après 24h,l’animal ne constitue plus une sourcenutritive suffisante pour le champignonqui entre alors dans un nouveau cyclede sporulation pour permettre sa dis-sémination. Pour mettre en évidenceles mécanismes de défense de C. ele-gans, l’utilisation de D. coniospora pré-sente plusieurs avantages. D’une part,ce système infectieux est non problé-

Figure 5 : Image en microscopie optique despores de Drechmeria coniospora. La flèchemontre l’extrémité adhésive de la spore


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matique pour le manipulateur puisquece champignon n’est pathogène quedes nématodes. D’autre part, l’infectionpar ce champignon implique que le ré-gime alimentaire du ver ne change pasà la différence des modèles infectieuxqui utilisent les bactéries. En effet, lesinfections bactériennes se produisentmajoritairement suite à une adminis-tration par ingestion ce qui peut rendredifficile la distinction entre mécanismesde défenses et ce qui peut être imputéà des problèmes nutritifs.

Méthodes pour évaluer la pathogé-nicité d’un microorganisme enversle nématodeUne méthode simple pour évaluer lavirulence d’un microbe potentielle-ment pathogène (bactérie, champi-gnon) est de mesurer le temps de sur-vie des vers en contact avec cettesouche. Cette survie suite à l’exposi-tion au microbe d’intérêt est comparéeavec celle obtenue en nourrissant lesvers avec la souche d’E. coli (OP50) deréférence utilisée dans les laboratoirespour la culture de C. elegans. CommeD. coniospora ne sert pas de nourritureau nématode, des spores sont mélan-gées à la nourriture du ver qui est in-fecté par simple contact avec celles-ci.Ces études de survie sont facilitéespar le grand nombre de nématode quel’on peut utiliser, par leur homogénéitéen termes de génotype ainsi que parleur synchronisation. Ces cinétiquesde survie nous ont permis de déter-miner que l’infection par D. coniosporatue tous les vers en moins de 3 joursalors que les nématodes non infectéspeuvent vivre 20 jours (Couillault etal., 2004). Au-delà de la survie qui estle résultat d’une combinaison de nom-breux facteurs, il est possible d’utiliserles connaissances sur la physiologie

du nématode pour détecter des per-turbations durant l’exposition à cer-tains microorganismes. Ces change-ments dans les cycles ou lescomportements sont autant de phé-notypes qui renseigneront sur la pa-thophysiologie.

Analyser le transcriptome pouravoir une vue globale de la réponsede l’hôteL’une des caractéristiques de la ré-ponse d’un organisme à un stress ouà une infection réside dans l’inductionde la transcription d’un certainsnombre de gènes dont le produit vaaider à l’adaptation à cette nouvellesituation. L’étude du transcriptomepar puces à ADN qui permet de défi-nir le niveau d’expression des gènesdans des conditions définies est pos-sible chez le nématode car l’usagede C. elegans permet la productiond’ARN par les techniques les plus cou-rantes telles que des extractions auphénol-Chloroforme. Ces techniquesd’analyses de transcriptome s’effec-tuent aujourd’hui en routine avec despuces à ADN désormais considéréescomme « génome complet ». Combi-nées avec la richesse des banquesde données qui concernent C. ele-gans, ces approches sont globales,efficaces et robustes. Nous avionsdéjà entrepris ce type d’approchepour mettre en évidence l’immunitéantibactérienne du nématode (Malloet al., 2002) et nous avons réutilisé lastratégie lors des infections par D. co-niospora (Couillault et al., 2004 , Wonget al., 2007). Plusieurs séries de pucesà ADN, répétées à différents tempsd’infection (12 et 24h post-infection)ont été réalisées et les résultats obte-nus ont permis de classer les gènesselon deux catégories principales : les

gènes qui sont surexprimés et ceuxqui sont sous-exprimés au cours del’infection. L’analyse des gènes sur-exprimés a mis au jour entre autredes gènes codant des peptides d’unecinquantaine d’acides aminés. Cespeptides ont des séquences relative-ment identiques et ils sont codés pardes gènes organisés sur deux loci dis-tincts, le locus NLP pour Neuropep-tides Like Peptides et le locus CNCpour CaeNaCin (nommé ainsi par lelaboratoire Ewbank) (Pujol et al.,2008b, Couillault et al., 2004).

Certains gènes induits durant l’in-fection codent des peptides anti-microbiensPour déterminer la fonction biologiquede ces peptides au cours de l’infection,l’un d’entre eux, NLP-31, a été syn-thétisé et la capacité de ce peptided’inhiber la croissance de certainschampignons et de bactéries a étémise en évidence par des tests in-vi-tro (Couillault et al., 2004). Un autretest a consisté à incuber des néma-todes infectés par D. coniospora avecce peptide de synthèse. Nous avonsainsi démontré que selon les concen-trations de peptide utilisées, ce dernierpouvait permettre de stopper la crois-sance du champignon dans le néma-tode mais aussi bloquer sa sporulation.Cet exemple montre qu’il est tout à faitpossible d’utiliser les modèles infec-tieux qui impliquent C. elegans commehôte pour le criblage de moléculesd’intérêts thérapeutiques telles quedes drogues aux capacités antimicro-biennes (Moy et al., 2006). Pour preuvein-vivo de l’effet protecteur de cespeptides, des copies supplémentairesdu locus codant la famille des NLPsont été injectées chez le nématode.Les animaux transgéniques ainsi gé-

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nérés sont capables de produire cespeptides en plus grande quantité. Nousavons ainsi mis en évidence in-vivoque cette surexpression augmente lasurvie des nématodes suite à une in-fection par le champignon D. conio-spora (Zugasti and Ewbank, 2009, Pu-jol et al., 2008b).

L’induction de ces peptides ren-seigne sur l’état d’activation del’immunitéNous l’avons dit, la transparence de cevers permet une visualisation précise

de marqueurs tels que la GFP ce quirend la stratégie d’utilisation desgènes rapporteurs particulièrementinstructive. Pour cela la GFP est clonéeen aval d’un promoteur d’intérêt puiscette construction est injectée chez lenématode pour créer des animauxtransgéniques chez lesquels la syn-thèse de la GFP dépend de l’utilisationde ce promoteur (Chalfie et al., 1994).Après vérification par RT-PCR des ré-sultats obtenus par puce à ADN, diffé-rentes lignées transgéniques furentgénérées que ce soit pour un peptide

de la famille NLP (gène de la GFP sousle contrôle du promoteur du gène nlp-29 : pnlp-29::GFP) ou pour la familleCNC (gène de la GFP sous le contrôledu promoteur du gène cnc-2 : pcnc-2::GFP). Dans les deux cas, nous avonsconstaté que la GFP est exprimée fai-blement et de manière constitutivechez les animaux transgéniques. Cetteexpression se fait dans l’épiderme duvers situé sous la cuticule, premièrescellules en contact avec le pathogène.Enfin, comme espéré, la fluorescencedes animaux transgéniques augmentefortement dans ce tissu suite à l’in-fection par le champignon (figure 6)(Couillault et al., 2004, Pujol et al.,2008a, Zugasti and Ewbank, 2009). Tout l’intérêt de posséder ce typed’animaux transgéniques réside dansle système rapporteur qui indique demanière robuste l’état d’activationd’une partie de l’immunité antifon-gique de l’animal. En effet, nous pou-vons supposer que les gènes qui co-dent les peptides antimicrobiens sontles éléments les plus en aval d’unecascade de signalisation activée suiteà une infection. Le champignon D. co-niospora est l’activateur et les pep-tides antimicrobiens les effecteurs.Basé sur le principe d’une quantifica-tion de la GFP produite, ces animauxtransgéniques sont donc des outilsprécieux pour la dissection des voiesde régulation de l’immunité car ilsprésentent un phénotype robuste etreproductible. L’inactivation d’un gène,situé dans cette cascade de signali-sation doit empêcher l’induction dutransgène promoteur::GFP suite à l’in-fection. En revanche, si ce gène est unrégulateur négatif de cette cascade,les animaux transgéniques serontfluorescents avant même leur infec-tion (figure 7).

Vers Infectés Vers Non Infectés

A B

Figure 6 : Rapporteur fluorescent de l’immunité antifongique de C. elegans.Image de vers transgéniques non infectés (A) et infectés (B) en fluorescence. Ces animaux produisentconstitutivement un fluorochrome rouge qui sert de marqueur de co-injection pour cette transgénèse.Les vers infectés expriment fortement la GFP qui est sous le contrôle d’un promoteur induit par l’in-fection.

A

B

C

A

B

C

A

B

C

Contrôle Infection Infection

A

D

C

Contrôle

Mutant nipi Mutant peni

Figure 7 : Principe de l’utilisation d’un rapporteur pour disséquer les voies de signalisation situéesen amont. Les animaux transgéniques non-infectés sont rouges et deviennent verts suite à l’infec-tion et à l’activation de leur immunité innée. Des cribles génétiques peuvent permettre à partir decet outil d’isoler des mutants qui ne répondent plus à l’infection (nipi) ainsi que des mutants ayantune immunité constitutivement active (peni).


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Commencer la dissection des voiesde signalisation avec une étude pargènes candidats Un génome séquencé et annoté, desbases de données en libre accès, desbanques de mutants disponibles et unebibliographie minutieuse du domained’intérêt sont plus que suffisant pourréaliser une étude par gènes candi-dats (génétique « reverse »). A ce stadedu projet, plusieurs groupes de re-cherche avaient déjà clairement iden-tifiés de nombreuses protéines commedes éléments clés de l’immunité innéedes invertébrés ou des vertébrés.L’analyse du génome de C. elegans arévélé quelques homologues de la voieTOLL présente chez la drosophile etconservée chez les mammifères pourson rôle dans l’immunité (voies de si-gnalisation des TLRs). Ces protéineset les gènes qui les codent ont donc étéde bons candidats pour tester leur rôledans la synthèse des NLPs et desCNCs au travers de mutants existantsou d’ARNi et des rapporteurs fluores-cents (Couillault et al., 2004). Une re-cherche bioinformatique en utilisantcomme sonde le domaine TIR qui estune caractéristique des récepteursTOLL a révélé deux protéines chez lenématode. La première est la protéineTOL-1 (Pujol et al., 2001), équivalenteau récepteur transmembranaire TOLLde la drosophile et aux TLRs de mam-mifères et la deuxième est la protéineadaptatrice TIR-1, équivalente chez ladrosophile à dSARM et chez les mam-mifères à la protéine SARM (Stérile Al-pha and aRmadillo Motifs) pour la-quelle l’implication dans une voie designalisation des TLRs n’avait pas étédémontrée. Par conséquent, un mu-tant homozygote de tol-1 a été croiséavec des nématodes transgéniquescontenant le rapporteur pnlp-29::GFP

et suite à l’infection de la souche ob-tenue nous avons montré que le niveaud’expression du rapporteur GFP estéquivalent à celui des vers transgé-niques infectés de fond génétique sau-vage. De plus, suite à une infectionpar D. coniospora, la cinétique de sur-vie des vers sauvage est comparable àcelle des vers mutants tol-1. Nousavons ainsi démontré que chez le né-matode et dans nos conditions expéri-mentales, le récepteur TOL-1 n’est pasimpliqué dans la synthèse des pep-tides antimicrobiens.Concernant TIR-1, aucun mutantn’existait et nous avons donc choisisune approche par ARNi. Le génome deC. elegans code plusieurs isoformesde cette protéine et la technologied’ARNi permet d’inactiver l’ensemblede ces isoformes à condition qu’ilsaient des régions codantes com-munes. Nous avons donc réalisé uneconstruction capable d’inactiver tousles isoformes de TIR-1 pour faire del’ARNi par ingestion (voir précédem-ment). L’ARNi de tir-1 sur des lignéescontenant la construction pnlp-29::GFP a montré que ce gène est re-quis pour l’activation du rapporteurGFP suite à l’infection. En revanche, cen’est pas le cas concernant les rap-porteurs du locus cnc. De plus desnématodes traités par une ARNi detir-1 survivent moins longtemps quedes nématodes contrôles (Couillaultet al., 2004, Zugasti and Ewbank,2009). Nous avons ainsi démontrépour la première fois l’implicationd’une protéine à domaine TIR dans lasignalisation de peptides antimicro-biens de C. elegans. Suite à ces tra-vaux publiés en 2004, une équipeaméricaine mit en évidence pour lapremière fois le rôle de la protéineSARM (équivalente à TIR de C. ele-

gans) en tant que régulateur négatifdans la signalisation des TLRs chezles mammifères (Carty et al., 2006).C’est principalement par ces ap-proches directes et ciblées que leséléments connus et impliqués dansl’immunité antibactérienne du ver telsque les voies de la p38 MAPkinase(Kim et al., 2002) et du TGF-beta(Mallo et al., 2002) furent démontréscomme nécessaires à la réponse an-tifongique chez le nématode(Couillault et al., 2004, Zugasti andEwbank, 2009).

Criblage ARNi « génome complet »et mutagénèse pour une vue glo-bale des voies de signalisationAfin d’avoir une approche moins biai-sée envers les éléments déjà identi-fiés chez d’autres espèces, le labora-toire de J. Ewbank a initié en 2004des cribles par mutagénèse EMS àpartir de la souche transgénique pos-sédant la construction pnlp-29::GFP.Les vers transgéniques mutagéniséspar l’EMS permettent de réaliser describlages basés sur la recherche dedeux phénotypes majeurs. D’une partdes animaux dits nipi (no induction ofpeptides after Drechmeria infection)qui ne produisent pas de GFP suite al’infection par D. coniospora et d’autrepart des animaux dits peni (peptideexpression no infection) qui sur-ex-priment la GFP sans qu’il y ait infec-tion par le champignon (figure 7). Lapremière catégorie représente enthéorie des régulateurs positifs desvoies de signalisation tandis que ladeuxième regroupe a priori des régu-lateurs négatifs des voies de trans-duction du signal.A ce jour ces différents criblages nousont permis d’obtenir une centained’allèles différents de vers nipi ou peni

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et seuls quelques uns ont été carac-térisés et mis en évidence en tantqu’acteurs essentiels dans la signali-sation des peptides antimicrobiens(Pujol et al., 2008a, Ziegler et al.,2009, Lee et al., 2010).L’identification du gène muté chez cesanimaux peut se faire par deux mé-thodes. La première implique les prin-cipes de Mendel et Morgan et lestechniques de cartographie génétiqueclassique qui utilisent soit des mar-queurs génétiques, soit des polymor-phismes génétiques, soit les deux(voir http://www.wormbook.org/toc_wormmethods.html). Le résultatest que le gène muté est générale-ment identifié au bout de 3 à 12 mois.L’autre possibilité pour caractériserune mutation obtenue par EMS est defaire du séquençage direct à haut dé-bit de tout le génome (Sarin et al.,2008). Cette technique récente né-cessite un important travail d’analysein-silico car même après avoir fait ceque l’on appelle un nettoyage du fondgénétique suite à la mutagénèse, plu-sieurs mutations qui sont restées si-lencieuses pour le phénotype recher-ché peuvent êtres détectées.Néanmoins, le positionnement de lamutation peut être confirmé par cetteméthode en 1 mois. En complément des techniques demutagénèse, la disponibilité debanque d’ARN interférant « génomecomplet » permet une approche quimême si elle ne cible que les gènesannotés reste néanmoins promet-teuse. En effet, l’ARNi et la mutagé-nèse sont deux approches complé-mentaires car une mutagénèse peutaffecter un gène essentiel à la crois-sance du vers et les animaux muta-génisés ne seront pas viables alorsque l’ARNi permet de travailler à dif-

férents stades de développement cequi permet de s’affranchir de ce typed’effets létaux. Par contre, une muta-génèse chimique va générer des mu-tants subtils par changement d’unacide aminé tandis que l’ARNi en-traine essentiellement des pertes defonction.Travailler à l’échelle du génome avecl’ARNi nécessite de pouvoir réaliserdes analyses à hauts débits. Pour cela,un outil très performant existe quin’est autre qu’un trieur automatiquede nématodes, machine développépar la société Union Biometrica (Etats-Unis). Ce trieur peut être comparé à unFACS car il permet d’analyser diffé-rents paramètres chez le ver tels quesa taille, son opacité ou sa fluores-cence (Vert, Jaune, Rouge) et ceci àun rythme de plusieurs milliers d’in-dividus à la minute. Cette machinepermet ainsi de trier des populations,d’analyser leur niveau de fluorescenceou encore de distribuer des individusdans des plaques 96 puits. Cet ins-trument permet de grandement faci-liter la sélection et le tri d’individusd’intérêt après une mutagenèse et vasurtout s’avérer crucial pour l’analyseautomatisée de nématodes exposéesaux différents clones d’une banqued’ARNi. L’intérêt majeur de cettesemi-automatisation réside dans lefait que toutes les données d’un ani-mal concernant sa taille, son opacitéou sa fluorescence sont stockées etpeuvent êtres analysées de diversesmanières en temps voulu. Une telleapproche par ARNi à grande échelleest actuellement en cours dans notrelaboratoire et devrait permettre detester avec notre rapporteur de l’im-munité antifongique les 18 000 gènesdu ver représentés par les clones ARNien moins de 4 mois.

Un bon modèle, un complément ouune alternative ?Cette revue qui peut paraitre commeun plaidoyer en la faveur du nématodene saurait être objective sans une pré-sentation des approches qui ne fonc-tionnent pas, ne sont pas envisa-geables ou sont fastidieuses avecC. elegans. Tout d’abord, l’anatomiedu ver limite les études aux fonctionsdes organes présents. Il faut en effetgarder à l’esprit qu’en dépit de soncaractère multicellulaire l’animal n’estpas composé de plus de 1000 cellulessomatiques avec une absence de sys-tème circulatoire, de reins, de cœur oude poumons. Il y a en revanche desmuscles, des neurones ainsi que desépidermes. Cette anatomie simplifiéeet compacte rend paradoxalementcertaines analyses des organes pré-sents plus difficiles car il est délicatd’extraire spécifiquement des cellulesd’un tissu. Certains protocoles per-mettent d’isoler l’intestin ou lesnoyaux d’embryon mais la dissectiond’autres tissus ou cellules reste ha-sardeuse. Cette lacune peut dans cer-tains cas tels que des purificationsd’ARN ou de protéines devenir pro-blématique si le gène d’intérêt ou sonproduit est exprimé dans plusieurstissus à la fois. Il peut alors y avoir uneimportante perte de résolution dansl’analyse. Cette difficulté pour extrairespécifiquement des cellules est ac-compagnée par une absence totalede lignées cellulaires. Certaines cul-tures primaires sont possibles maisaucune lignée immortalisée n’a étégénéré. Le seul modèle de proliféra-tion non-contrôlée est celui qui im-plique des cellules germinales ce quiaboutit à la rupture de la gonade et àla dissémination des gamètes dansl’organisme (Francis et al., 1995). Enrevanche, les voies de signalisation


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impliquées dans des processus can-céreux tel que la voie de l’EGF sontprésentes chez le ver et peuvent ser-vir de modèle pour une étude molé-culaire (Kirienko et al., 2010). En termes de protocoles et commedécrit précédemment, les recombi-naisons homologues sont difficilementutilisables chez le ver pour générerKnock Out ou Knock In. Récemment,une méthode a été développée pourpermettre l’insertion d’un fragmentd’ADN en un endroit précis mais ilfaut pour cela utiliser des animauxayant un transposon présent à proxi-mité du site visé (Robert et al., 2006).Finalement, malgré l’essor importantdes études portant sur les interac-tions nématode-pathogène, de nom-breuses limitations existent. La plusévidente concerne la température deculture des nématodes qui ne peutexcéder 25 °C alors que les patho-gènes de mammifères effectuentleurs cycles au sein d’un hôte dont latempérature est supérieure. Cette dif-

férence affecte tout le microbe, deson métabolisme général à son pou-voir pathogène. Ensuite se pose leproblème de la spécificité de certainspathogènes qui réduit fortement lespectre d’hôtes envisageables. Fina-lement, certaines stratégies micro-biennes visent à contrecarrer directe-ment les systèmes de défensesadaptatifs de l’hôte. Etant donné quele nématode ne possède qu’un sys-tème immunitaire inné, le ver est in-utilisable pour l’étude de ces proces-sus. Néanmoins, il faut noter que demanière remarquable des facteurs devirulence relevant pour les mammi-fères produits par des bactéries tellesque Yersinia pestis, Vibrio cholerae ouSalmonella typhimurium ont pu êtresétudiés ou identifiés à partir de tra-vaux qui utilisent le nématode commehôte (Styer et al., 2005, Vaitkevicius etal., 2006 , Tenor et al., 2004).

Pour conclure, C. elegans est devenuun modèle incontournable en biologieet a une place de choix dans le cadredu réseau français EFOR (réseaud'Etudes Fonctionnelles chez les OR-ganismes modèles) (http://www.efor.fr/). De plus, il est important derappeler qu’actuellement, une partiede la recherche en biologie ne peut sejustifier qu’au travers de son impact àmoyen ou long terme sur la sociétéhumaine. Dans ce contexte et mêmesi le nématode tire son épingle du jeugrâce à de nombreuses similitudesavec l’homme, cet invertébré n’estqu’un complément voir une alterna-tive aux mammifères mais en aucuncas un modèle de remplacement. Parcontre, d’un point de vue fondamen-tal, il faut garder à l’esprit que lesatouts de cet animal lui ont permis defaire partie des métazoaires les mieuxdécrit et les mieux compris et ceci enmoins de 50 ans, ce qui en soi est ex-trêmement enrichissant pour la biolo-gie en général.

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75

FORMATION ET COLLOQUE

L’Université Blaise Pascal de Cler-mont Ferrand organise du 1 au4 février 2011 une formation à la chi-rurgie des rongeurs, agréée par leministère de l’agriculture ( R-63Univ-PASCAL-Chir-09).Renseignements et inscriptions : PaulPRADIER Université Blaise PascalUFR Sciences et Technologies Phy-siologie Animale - Biologie BLes Cézeaux24 avenue des Landais BP 8002663171 AUBIERE Cedex. FranceTél: 04 73 40 74 80E-mail: [email protected]

Formation des membres des comi-tés d’éthique (GIRCOR)Dans la continuité des sessions orga-nisées depuis 2006, le programme deformation des membres des comitésd’éthique mené par le GRICE(www.gircor.net) se poursuivra en2011.Les écoles vétérinaires accueillerontchacune une session à des dates res-tant à définir.> 1er trimestre : ENV Alfort> 2ème trimestre : ENV Toulouse> 3ème trimestre : Oniris (Nantes)> 4ème trimestre : VetAgroSup (Lyon)Les informations pratiques (dates,contacts, coût) seront précisées ulté-rieurement via Anilab et Afstal news.

Formation à la chirurgie des ron-geursL’Université Blaise Pascal de Cler-mont Ferrand organise du 1 au

4 février 2011 une formation à la chi-rurgie des rongeurs.Cette formation est agréée par leministère de l’agriculture et est assu-rée par des personnels de l’UniversitéBlaise Pascal, de l’Université d’Au-vergne et de l’INRA deClermont-Theix.Pout tout renseignement concernantcette formation contacter : Mr [email protected]

ESLAV-LAVA-ComVet AFSTAL Mee-tingDu 26 au 28 septembre 2010, l'EcoleNationale Vétérinaire de Toulouse aaccueilli le 11ème congrès scientifiqueESLAV (European Society of Labora-tory Animal Veterinarians), organisécette année conjointement avec laComVet AFSTAL et LAVA (LaboratoryAnimals Veterinary Association) ayantcomme titre, "Vets for Life !".Environ 160 participants de 19 paysdifférents à travers le monde ontassisté à la réunion.Pendant deux jours, ils ont pu suivrepas moins de 24 conférences sur desthèmes très variées, tels que la spé-cialisation vétérinaire en médecinedes animaux de laboratoire, l’impactde la révision de la Directive euro-péenne sur l’expérimentation animaleet encore les nouvelles techniques etméthodes d’anesthésie et d’analgésieet la surveillance per-opératoire desanimaux.Le Congrès a permis aux participantsde se rencontrer et de nouer descontacts entre collègues de l'industrieet de la recherche publique pendant

les pauses, agrémentées d’une« Session Posters », avec 40 commu-nications scientifiques et techniquesaffichées.Ce fut un très beau succès grâce àl’engagement et à la rigueur descomités scientifiques et d’organisa-tion, grâce au professionnalisme desintervenants et des participants etaux nombreux services rendus parl’Ecole Vétérinaire, à commencer parson accueil chaleureux au sein de labelle ville de Toulouse.

Réseau EFORLe prochain colloque du réseau EFORse déroulera les 14 et 15 février àParis : les thématiques abordéesseront les modèles émergents, lesmodèles agronomiques et méthodo-logies RNAi et les OGM végétaux.Pour plus de renseignements :http://www.efor.fr

Fondation Guido BernardiniLa fondation Guido Bernardini orga-nise ses 2 prochains workshops àMilan intitulés: > “Cleansing and decontamination”:best practice in washing, disinfectionand sterilization in the laboratory ani-mal facility” du 25 au 27 janvier2011.> “The health monitoring of rodentsand the cage level environment in IVCequipped facilities” les 15 et 16 mars2011.Contact secrétariat: [email protected] ouhttp://www.fondazioneguidobernar-dini.org/en/home.aspx.

INFORMATIONS DIVERSES

En bref

INFORMATIONS DIVERSESSTAL Volume 36 / 4ème Trimestre 2010

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Symposium FELASA 2010, Helsinki,Finland Ce congrès a été un succès avec laparticipation de 1200 personnes. Le symposium 2013 se déroulera àBarcelone en Espagne.

ICLAS – LASA symposiumLe symposium est organisé par leLaboratory Animal Science Associa-tion- Turkey (LASA-Turkey) encollaboration avec l’InternationalCouncil for Laboratory AnimalScience (ICLAS) et se déroulera àIstanbul en Turquie du 13 au15 juin2011.Les thématiques abordées serontl’évaluation éthique, le protocoleexpérimental, les nouvelles technolo-gies en expérimentation animale, lesnouveaux modèles animaux, lesméthodes de réduction. Pour plusd’information, vous pouvez visiter lesite web suivant : http://www.iclas2011istanbul.org/default.asp

Society Of Toxicology (SOT) Son congrès se déroulera du 6 au10 mars 2011 à Washington.

Le Master Professionnel de Phy-siologie et Neurosciences2ème année spécialité « Bioexpéri-mentation animale » de l’universitéde Lyon 1 (M2P BEA) accueille tousles ans une quinzaine d'étudiants.Cette formation, sous la responsabi-lité de Dr Anne Morales, vise àpréparer les étudiants à des fonctionstelles que directeur d'étude junior,responsable d'unité expérimentale oud'élevage, ou encore assistant derecherche clinique dans le domainevétérinaire. La possibilité est notam-ment donnée aux étudiantsd'acquérir le Niveau 1 d'Expérimen-tation Biologique (accréditationCategory C FELASA).La formation repose également beau-coup sur le stage de longue duréeeffectué à partir du mois de Février(6 mois) ou dès la rentrée universi-taire dans le cadre d'un contrat deprofessionnalisation en alternance. Si vous pensez pouvoir accueillir enstage dès Février 2011 un étudiant,vous pouvez contacter C. Berthier :[email protected] d'informations sur le master sontdisponibles à l'adresse suivante : http://bioexperimentation.univ-lyon1.fr/

Site web ”Procedure with care”Ce site web a été réalisé pour formeret informer les chercheurs et techni-ciens aux administrations chez le ratet la souris. Vous pouvez visualiser lesvidéos sur le site suivant :http://www.procedureswithcare.org.uk/

PARUTION D’OUVRAGE

Anesthésie des ani-maux de laboratoire,troisième édition

AUTEUR : Paul Flecknell,

Academic Press | 2009 | ISBN:0123693764 | 304 pages |

Les ajouts et les modifications appor-tées à cette nouvelle édition reflètentl'évolution de la pratique de l'anes-thésie et les changements dans nosattitudes à l'égard du bien-être desanimaux de laboratoire.Cette édition fournit des informationsnouvelles sur l'anesthésie et l'anal-gésie, et une bibliographieentièrement revue et mise à jour.


77

1) Les manuscrits devront être écritsen français ; seuls les résumés peu-vent être en anglais.

2) Les manuscrits seront envoyés sousformat word à [email protected], endouble interligne et toutes les pagesseront numérotées.

3) Organisation du manuscrita) La première page comportera le

titre de l'article en français, le prénomsuivi du nom de(s) l'Auteur(s), le(s)nom(s) et l'adresse ou les adresses du(des) laboratoire(s) ou établissement(s)où a été effectué le travail (chaqueadresse sera numérotée et les numé-ros correspondants seront reportés enexposant sur le nom des auteurs) ainsiqu'une adresse électronique de cor-respondance avec l'auteur principal ;la liste des abréviations employées etleur signification, et si nécessaire, ladénomination, la date et le lieu de laréunion scientifique où a été présen-tée la communication.

b) La seconde page comportera unbref résumé (10 à 15 lignes) suivi de 3à 5 mots-clés, en français et enanglais.

A l'exception des revues générales,le manuscrit devra contenir les sec-tions suivantes :

c) Introduction : elle devra poser leproblème de façon claire et concise.

d) Matériels et méthodes : cettesection comprendra successivementl'identification des animaux de labora-toire en respectant les règlesinternationales (race, souche, etc.) eten utilisant pour les espèces les moinscourantes, le nom français suivi de la

dénomination zoologique Linnéenne(exemple : le poisson combattant"Betta splendens"), l'appareillage lors-qu'il est particulier, le protocole, lesméthodes particulières de dosage, lesméthodes statistiques et les produitsutilisés (en utilisant le nom générique,et si le produit est dans le commerce,le nom du fabricant ou du fournisseur,la ville et le pays). La forme du produit,base ou sel devra être précisée.

e) Résultats : l'utilisation des figureset des tableaux est encouragée, enévitant les redondances. L'utilisationdes tests statistiques devra permettrel'évaluation et l'interprétation desrésultats.

f) Discussion : Elle devra s'appuyeressentiellement sur les résultats pré-sentés et faire référence aux résultatsde même nature déjà publiés.

g) Conclusion h) Bibliographie

4) Tableaux et figuresa) Chaque tableau sera présenté

sous format word, en annexe, à lasuite du document texte. Chaquetableau sera numéroté (en chiffresromains) tel que cité dans le texte.Dans le tableau, les renvois serontréférencés par les lettres a, b, c, etc. etleur signification devra apparaîtresous le tableau. Chaque tableau seraaccompagné, sur une page séparée,d'une légende qui explicitera briève-ment son contenu et les abréviationsutilisées. La légende apparaîtra lors dela publication en haut du tableau.

b) Chaque figure devra être pré-sentée en annexe et sera numérotée(en chiffres arabes) tel que mentionné

dans le texte. Le haut de la figure seramentionné clairement. La clarté dudessin et l'épaisseur des traits et deslettres devront être suffisamment mar-quées pour permettre une réductionau 1/3. La légende de la figure appa-raîtra sur une page séparée etexplicitera brièvement le contenu de lafigure, et si nécessaire, l'essentiel desrésultats et les abréviations utilisées.Les photos et images devront êtreenvoyées en format TIFF, à une réso-lution minimum de 600 dpi.

5) Référencesa) Dans le texte, les références à

des travaux publiés devront être citéessuivant le système d'Harvard (noms etdate). S'il y a plus de 2 Auteurs dansune même référence, la citation dansle texte devra comprendre le nom dupremier Auteur suivi par "et al.". Lesréférences citées simultanémentdevront être classées chronologique-ment.

Exemple : (Langer 1981 ; Chamo-veet Anderson 1989 ; Gérard et al.1990).

Les citations se référant à des com-munications personnelles ou à desobservations non publiées devront êtrestrictement limitées et apparaître dansle texte entre parenthèses, mais nondans la liste des références.

b) La Bibliographie sera présentéesur une (des) feuille(s) séparée(s). Lesréférences seront classées par ordrealphabétique des Auteurs et pourchaque Auteur par ordre chronolo-gique. Tous les Auteurs d'une mêmeréférence devront être mentionnés.

Instructions aux auteurs


78

Plusieurs références d'un même Auteur,apparaissant une même année, devrontêtre différenciées en ajoutant un suffixe(a, b, c, etc.) à l'année.

Chaque référence devra comprendrela séquence suivante : le nom de(s)l'Auteur(s), l'initiale de leur prénom,l'année de publication entre paren-thèses, le titre complet de l'article, letitre du journal dans lequel l'article estparu (abrégé selon les normes), levolume de la revue et la pagination del'article (première et dernière page).

Exemple : Zerial A, Lemaître M (1990)Recherche de médicaments anti-SIDAet évaluation de leur efficacité dans desmodèles animaux. Sci Tech Anim Lab15, 115-122.

Les références aux articles parusdans les livres devront comprendre laséquence suivante : le nom de(s) l'Au-

teur(s), l'initiale de son prénom, l'annéede publication entre parenthèses, letitre complet de l'article, In : suivi dutitre complet du livre, le nom et l'initialedu prénom de(s) l'Auteur(s) du livreentre parenthèses, l'éditeur, la ville et lapagination de l'article (première et der-nière page).

Exemple : Chamove A, Anderson J(1989) Examining environmentalenrichment. In : Housing, care and psy-chological wellbeing of captive andlaboratory primates (Segal E, ed), Noyespublications, Park Ridge, 183-202.

Un article ne pourra être cité "souspresse" que s'il a été accepté pourpublication et si le nom du journal estdonné.

6) Remise des manuscritsLe manuscrit et les tableaux, au for-

mat électronique .doc, ainsi que lesimages et photos au format .TIFF seronttransmis à l'adresse [email protected] logiciels compatibles chez l’impri-meur sont : QuarkXpress (texte), Word6 (texte, format PC ou Mac), Illustrator6 (images), Photoshop (dessins).

L'auteur principal devra mentionnerson numéro de téléphone et sonadresse. Les Auteurs s'engagent à nepas proposer leur manuscrit à uneautre revue avant d'avoir reçu la déci-sion du Comité de Rédaction. Le Comitéde Rédaction soumettra le manuscrit àl'approbation du Comité de Lecture.

7) Corrections des épreuvesLes Auteurs devront retourner les

épreuves corrigées dans un délai de5 jours à l’adresse é[email protected].

AFSTAL 28 rue Saint-Dominique 75007 PARIS courriel : [email protected] - Web: http://www.afstal.com Association Déclarée : J.O. du 14 Avril 1972 ; N°SIRET 43120536800019

Nom et prénom..................................................................................................................... Fonction................................................................................................................................ Domaine d’activité............................................................................................................... Société et adresse complète................................................................................................... ............................................................................................................................................. E-mail :....................................................................Tel : ............................Fax :..............................

½ tarif : Etudiant, retraité, chômeur

sans adhésion AFSTAL

sans adhésion AFSTAL ____________________________

..................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

agrafez SVP votre à la ) Sébastien Paturance, Trésorier de l’AFSTAL, 28 rue Saint-Dominique, 75007 PARIS

...........................................................................................................................................

2011

et BCLAS 2011

2011

Règlement par BON DE COMMANDE :

ARTICLE PREMIERIl est fondé entre les adhérents auxprésents statuts une Association àbut non lucratif et à caractère pure-ment scientifique, régie par la loi duler juillet 1901 et le décret du 16 août1901, ayant pour titre "AssociationFrançaise des Sciences et Techniquesde l’Animal de Laboratoire"(A.F.S.T.A.L.).

ARTICLE 2Cette association a pour buts :> d'une manière générale, de ratio-naliser et d'améliorer l'usage desanimaux de laboratoire au service dela santé de l'homme et de l'animal ;> en particulier, de codifier l'éthiquede leur utilisation et d'en faire mieuxconnaître les principes;> d'encourager la recherche et depromouvoir les connaissancesconcernant la biologie et la patholo-gie des animaux de laboratoire ;> de mettre en oeuvre les moyensdestinés à permettre de limiter quan-titativement leur emploi ;> de développer les relations inter-disciplinaires centrées sur l'animal delaboratoire ;> d'échanger régulièrement aumoyen de colloques, de groupes detravail et de communication toutesles informations scientifiques et tech-niques relatives aux animaux delaboratoire ;> d'entreprendre toutes les activitésscientifiques qui s'y rapportent ;> d'entreprendre le cas échéant touteaction jugée utile à la défense desexpérimentateurs respectant les règlesd'éthique et la réglementation envigueur.

ARTICLE 3Le siège social est situé à l'adressesuivante :28 rue Saint Dominique75007 PARISTél et télécopie : 01 45 56 91 16 Le siège social pourra être transféréen cas de nécessité par simple déci-sion du Conseil d'Administration, entout autre lieu, dans les limites du ter-ritoire français, mais cette mesuredevra être entérinée lors de la pro-chaine Assemblée GénéraleStatutaire Annuelle.

ARTICLE 4L’association se compose demembres fondateurs, de membresbienfaiteurs, de membres adhérentset de membres d'honneur.

ARTICLE 5Pour devenir membre, il faut être pré-senté par deux membres del’Association et agréé par son Conseild'Administration.Le Conseil d'Administration proposeà l'approbation de l'Assemblée Géné-rale Annuelle Statutaire le montantdes cotisations des différentes caté-gories de membres pour la prochaineannée civile.Le titre de membre d'honneur peutêtre décerné par le Conseil d'Admi-nistration aux personnes qui rendentou ont rendu des services signalés àl’Association. Ce titre confère à ceuxqui l'ont obtenu, le droit de faire par-tie de l'Assemblée Générale sans êtretenus de payer une cotisationannuelle.

Sur la proposition de son Conseild'Administration, l'Assemblée Géné-rale pourra décerner le titre dePrésident d'Honneur à un ou plu-sieurs des anciens présidents del’Association ; la possession de cetitre exempte celui qui en est investi,du paiement de toute cotisation.

ARTICLE 6La qualité de membre de l’Associa-tion se perd :1° Par démission ;2° Par radiation prononcée par leConseil d'Administration pour non-paiement de la cotisation ;3° Par radiation prononcée par l'As-semblée Générale pour motif gravesur proposition du Conseil d'Adminis-tration

ARTICLE 7Les ressources de l’Association sontconstituées par le montant des coti-sations de ses membres et deséventuelles subventions de l'État, desCollectivités publiques ou des orga-nismes privés et des éventuels donset legs.

ARTICLE 8L’Association est administrée par unConseil composé d'au moins douzemembres élus au scrutin secret pourtrois ans par l'Assemblée Générale,choisis et renouvelables par tiers tousles ans, parmi les membres dont secompose cette Association. Cesmembres sortants ne sont pas immé-diatement rééligibles plus d'une fois.En cas de vacance, le Conseil d'Ad-ministration pourvoit provisoirement

Statuts de l’Association Française des Scienceset Techniques de l’Animal de Laboratoire(A.F.S.T.A.L.)


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au remplacement de ses membres.Il est procédé à leur remplacementdéfinitif par la plus prochaine Assem-blée Générale. Le mandat desmembres ainsi élus prend fin àl'échéance normale du mandat desmembres remplacés.Chaque année le Conseil d'Adminis-tration élit, au scrutin secret, unbureau constitué d'un Président, d'unVice-Président ou deux, d'un Secré-taire Général et d'un Trésorier. LePrésident n'est immédiatement rééli-gible que deux fois.

ARTICLE 9Le Conseil d'Administration se réunitau moins une fois par an, sur convo-cation, soit du Président, soit à sondéfaut, du Secrétaire Général et aussisouvent que l'intérêt de l'Associationl'exige ; sa convocation est de droitlorsque le tiers de ses membres ledemande.La présence physique d'au moinssept membres du Conseil d'Adminis-tration est nécessaire pour la validitédes délibérations.Tout membre du Conseil, qui, sansexcuse, n'aura pas assisté à deuxréunions consécutives, sera consi-déré comme démissionnaire.Le Conseil d'Administration peut invi-ter à siéger avec lui, de façontemporaire, toute (s) personne (s) qu'iljuge utile (Animateurs de groupesd'études, Conseillers, Experts, Repré-sentants d'autres Sociétés ouAssociation, etc....). Ces personnesparticipent aux discussions mais neprennent pas part aux votes duConseil d'Administration.

ARTICLE 10Les membres de l’Association nepeuvent recevoir aucune rétribution

eu égard aux fonctions qui leur sontconfiées.Les personnes rétribuées par l’Asso-ciation peuvent être invitées àassister avec voix consultative, auxséances de l'Assemblée Générale etdu Conseil d'Administration.

ARTICLE 11L'Assemblée Générale de l’Associa-tion comprend tous les membrescomposant celle-ci. Chacun desmembres de l’Association ne peutêtre représenté à l'Assemblée Géné-rale que par un délégué.L'Assemblée Générale se réunit aumoins une fois par an et chaque foisqu'elle est convoquée par le Conseild'Administration, ou selon les moda-lités définies à l'article 13.Le Conseil d'Administration se consti-tue en bureau et fixe l'ordre du jour.L'Assemblée Générale entend lesrapports sur la gestion du Conseild'Administration ainsi que sur lasituation financière et morale de l’As-sociation. Elle approuve les comptesde l'exercice clos, délibère sur lesquestions mises à l'ordre ou jour etpourvoit, s'il y a lieu, au renouvelle-ment des membres du Conseild'Administration.Le vote par correspondance ou pro-curation est admis.Chaque Sociétaire présent à l'Assem-blée Générale ne pourra pas disposerde plus de trois pouvoirs. Le rapportannuel et les comptes seront tenus àla disposition des membres de l’As-sociation, au siège social, pendant lemois qui précède l'Assemblée Géné-rale annuelle.

ARTICLE 12Les dépenses sont ordonnancées parle Président. Les comptes ouverts au

nom de l’Association fonctionnentsous la signature du Président ou duTrésorier. L’Association est représen-tée en justice et dans tous les actesde la vie civile par le Président ou partout autre membre du Conseil d'Ad-ministration choisi à cet effet parcelui-ci. Le représentant de l’Asso-ciation doit jouir du plein exercice deses droits civils.De même l’Association pourra êtrereprésentée auprès des autres Asso-ciations par un de ses membres.Les membres de l’Association nepeuvent recevoir aucune rétributioneu égard aux fonctions qui leur sontconfiées.Les personnes rétribuées par l’Asso-ciation peuvent être invitées àassister avec voix consultative, auxséances de l'Assemblée Générale etdu Conseil d'Administration.

ARTICLE 13Si besoin est, ou sur la demande dela moitié plus un des membres ins-crits, le Président convoque uneAssemblée Générale extraordinairepour l'étude du sujet ayant motivé laconvocation.

ARTICLE 14Les statuts ne peuvent être modifiésque sur la proposition du Conseild'Administration ou du dixième desmembres dont se compose l'Assem-blée Générale, soumise au Bureau aumoins un mois avant la séance.L'Assemblée doit se composer duquart, au moins, des membres enexercice. Si cette proportion n'est pasatteinte, l'assemblée est convoquéede nouveau, mais à quinze jours aumoins d'intervalle, et cette fois, ellepeut valablement délibérer, quel quesoit le nombre de membres présents. 81

Dans tous les cas, les statuts ne peu-vent être modifiés qu'à la majoritédes deux tiers des membres présents.

ARTICLE 15L'Assemblée Générale appelée à seprononcer sur la dissolution de l’As-sociation et convoquée spécialementà cet effet, doit comprendre, aumoins, la moitié plus un des membres

en exercice. Si cette proportion n'estpas atteinte, l'Assemblée est convo-quée à nouveau, mais à quinze joursau moins d'intervalle, et, cette fois,elle peut valablement délibérer, quelque soit le nombre des membres pré-sents. Dans tous les cas, la dissolutionne peut être votée qu'à la majorité desdeux tiers des membres présents.

ARTICLE 16

En cas de dissolution, l'Assemblée

Générale désigne un ou plusieurs

commissaires, chargés de la liquida-

tion des biens de l’Association. Elle

attribue l'actif net à un ou plusieurs

établissements analogues, publics ou

reconnus d'utilité publique.


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