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Université Paris 12 Val De Marne Faculté de médecine de Créteil

Ecole Doctorale :

Sciences de la vie et de la santé

Thèse pour l'obtention du grade de

Docteur de l'Université Paris 12

Présentée et soutenue publiquement Par

Anis KLOUZ A Créteil, le 20 juin 2007

Mise en évidence des récepteurs

mitochondriaux de type sigma 1

et

rôle dans la prévention des lésions

cellulaires de l'ischémie-

reperfusion

Jury : Président : Pr. Alain BERDEAUX

Directeur de thèse : Pr. Jean Paul TILLEMENT

Rapporteur : Pr. Gérard MAUCO

Rapporteur : Pr. Thierry HAUET

Examinateur : Pr. Chalbi BELKAHIA

Examinateur : Dr. Didier MORIN

Année Universitaire 2006/2007

A mon Epouse LOBNA

À mes Enfants Ramy, Sami et Sarra

A mes Parents Abdelouaheb et Nour el Houda

À mon Frère Hazem

A mes Sœurs Sameh et Kaouther

A mon Beau-père Rafik

A mes Beaux-frères Rym et Yassine

Je dédie affectueusement ma thèse

Remerciements

Je tiens tout d’abord à exprimer mes profonds remerciements à monsieur Jean-Paul

Tillement, mon directeur de thèse, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire. Merci

pour les précieux conseils scientifiques, pour m’avoir appris de nombreuses

expériences, son aide sans limite, sa générosité et sa disponibilité, et surtout sa

patience pendant la rédaction de ce travail.

Je remercie Monsieur le Professeur Alain Berdeaux de me faire l’honneur de présider

ce jury et de m'avoir également accueilli dans son équipe

Je remercie Monsieur le Professeur Gérard Mauco et Monsieur le Professeur Thierry

Houet d’avoir bien voulu me faire l’honneur d’accepter d’être rapporteurs de ma

thèse.

Je remercie Monsieur le Professeur Chalbi Belkahia qui malgré ces multiples

responsabilités a accepté de ce déplacer en France et de faire partie du jury de la

thèse.

Je tiens à exprimer mes profonds remerciements et ma grande estime au Docteur

Didier Morin non seulement parce qu'il a accepté de faire partie du jury de la thèse

mais aussi pour ses conseils scientifiques, son aide précieuse et sa générosité. Merci

Didier.

Je remercie aussi tous les membres du laboratoire pour leurs conseils, leur soutien et

la chaleur familiale avec laquelle ils m’ont entouré, en particulier Roland Zini,

Catherine Plin et Rosa Sapéna.

Je voudrais ensuite remercier le Professeur Vassilios Papadopoulos et le Professeur

Brigitte Onténiente et toute leurs équipes.

J’aimerais également remercier toute l'équipe tunisienne qui a contribué à ce que ce

travail puisse être réaliser et en particuliers les Professeurs Belkahia, Lakhal,

Loueslati et Daghfous, mes amis le Docteur Kourda et Docteur Kadri et tous les

jeunes chercheurs qui travaillent avec moi : Issam, Nadia, Ridha, Dorra, Henda ben

Abda, Ischraf, Henda Ferchichi, Salma et Raoudha.

Je remercie chaleureusement, mon épouse, mes enfants pour tous les support et la

patience. Mille fois merci Lobna, merci les enfants.

Enfin, j’adresse mes remerciements à tous mes amis et en particulier à Hamdi

Dhaouadi.

RRééssuumméé

Le syndrome d’ischémie survient lorsque le débit sanguin d’un organe est fortement diminué, voire interrompu. D'où d’un défaut d’oxygène (hypoxie) entraînant une diminution de la respiration cellulaire puis de la synthèse d’ATP, une accumulation matricielle de Ca2+ puis une acidose métabolique. Lorsque l’ischémie peut être levée, le flux sanguin est rétabli mais les fonctions cellulaires initiales, physiologiques, ne le sont pas complètement. La chaîne respiratoire mitochondriale n’est plus immédiatement opérationnelle et l’apport brutal d’oxygène dans une cellule préalablement ischémiée provoque la génération souvent explosive d’espèces réactives de l’oxygène. Ainsi, la séquence de reperfusion lorsqu’elle survient entraîne d’autres désordres métaboliques qui s’ajoutent à ceux de l’ischémie. Cette succession de dommages entraîne rapidement la mort cellulaire. Elle explique la gravité du syndrome d’ischémie suivie de reperfusion (I/R). Le traitement du syndrome d’I/R est difficile car il faut traiter à la fois les conséquences de l’ischémie et de la reperfusion. L'objectif de cette étude est de limiter les effets délétères de l’I/R du foie dans les conditions d’une ischémie normothermique (ischémie chaude) suivie d’une reperfusion ou d’une ischémie hypothermique (ischémie froide) dans le cadre de la conservation des organes. La molécule cytoprotectrice potentielle que nous avons utilisée est le N-benzyl-N’(2-hydroxy-3,4-diméthoxybenzyl)pipérazine ou BHDP. Nous avons montré que le BHDP est un ligand spécifique des ligands sigma-1 et qu'il existe des récepteurs de type sigma 1 au niveau de la membrane externe des mitochondries des cellules hépatiques. En effet, le BHDP reconnaît un seul site de liaison mitochondriale de type sigma 1 dont le Kd est de 3,18 ± 0,055 nM et le Bmax de 2,17 ± 0,17 pmol/mg de protéine. Les effets pharmacologiques du BHDP dans deux modèles, l’un d’induction de l’expression de c-fos chez le Rat, l’autre de potentialisation de la toxicité de la cocaïne chez la Souris, sont comparables à ceux obtenus avec un agoniste sigma 1. L'évaluation de l’effet de cette molécule dans divers situations d’ischémie a montré que : - Sur un modèle de cultures d’astrocytes soumises à une hypoxie qui induit un épuisement

important en ATP, le BHDP maintient la disponibilité de l’ATP au niveau de la cellule de façon concentration-dépendante.

- Sur deux modèles d’ischémie hépatique normothermique et hypothermique, le prétraitement des rats avec du BHDP pendant trois jours avant l’épisode ischémique réduit les lésions tissulaires et les perturbations métaboliques hépatiques de façon dose-dépendante.

En conclusion, la protection cellulaire par le BHDP contre les processus d’ischémie reperfusion nous a permis de montrer un effet antiischémique intéressant de cette molécule. Bien que partielle, la protection obtenue est bien corrélée au maintien des fonctions mitochondriales. Ceci indique que les mitochondries seraient les principales cibles pharmacologiques du BHDP et que sa liaison aux récepteurs sigma 1 pourrait constituer le mécanisme d’action de cette molécule dans la prévention des lésions cellulaires de l’ischémie-reperfusion.

MMoottss--ccllééss :: Récepteurs sigma, Ligand sigma-1, Mitochondrie, Ischémie, Reperfusion, Antiischémique, Foie

Table des matières

Glossaire ………………………………………………………………………………... 1

Introduction ……………………………………………………………………………. 3

Première partie : Mécanismes physiopathologiques et bases pharmacologiques du

traitement de l'ischemie-reperfusion …………………………………………………

7

I. Mécanismes physiopathologiques de l'ischémie-reperfusion …………………… 7

1. Les effets métaboliques de l'ischémie …………………………………………... 7

2. Les effets métaboliques de la reperfusion, rôle des mitochondries ……………... 9

3. Les conséquences histopathologiques de l’ischémie-reperfusion ……………….

16

II. Les traitements actuels …………………………………………………………….. 19

1. Régulation du métabolisme mitochondrial ……………………………………… 19

2. Régulation de l’activité de la chaîne respiratoire ……………………………….. 21

• Maintien de l’activité des complexes de la CR …………………………. 23

• Inhibition de la libération du cytochrome C …………………………….. 24

• Inhibition de la F1-F0 ATPase ou complexe V …………………………. 25

3. Antioxydants …………………………………………………………………….. 25

III. Les nouvelles pistes thérapeutiques ………………………………………………

30

1- Le préconditionnement ………………………………………………………………. 30

2- Action sur les canaux potassiques mitochondriaux ………………………………….. 31

Deuxième partie : Etude expérimentale du BHDP …………………………………

34

1- La caractérisation des récepteurs sigma sur les membranes mitochondriales

des hépatocytes de rat ……………………………………………………………….

34

2- Le BHDP est un ligand sélectif de forte affinité des récepteurs sigma 1 des mitochondries des hépatocytes .……………………………………………………

36

3- Mise en évidence de l’effet anti-ischémique ……………………………………… 42

A- Méthodologie expérimentale ………………………………………………….. 42

• Exploration biochimique : dosage plasmatique des transaminases …….. 42

• Exploration fonctionnelle : le test du MEGX …………………………... 42

• Exploration histologique ………………………………………………... 47

• Exploration mitochondriale ……………………………………………... 48

B- Interprétation des résultats …………………………………………………… 48

Troisième partie : Discussion générale……………………… ………………………..

50

1- Les récepteurs sigma, leurs rôles physiologiques possibles ……………………... 51

2- Le BHDP : ligand sigma et cytoprotecteur ………………………………………. 59

3- L’effet antiischémique du BHDP est-il médié par les récepteurs sigma

mitochondriaux ? …………………………………………………………………..

60

Références ……………………………………………………………………………… 63

1

Glossaire

ADP : adénosine diphosphate

AIF : apoptosis inducing factor

ALAT : alanine aminotransférase

ANT : transporteur des nucléotides adényliques

ASAT : aspartate aminotransférase

ATP : adénosine triphosphate

BHDP : N-benzyl-N’(2-hydroxy-3,4-diméthoxybenzyl)pipérazine

Canaux K+

ATP : canaux potassiques ATP dépendants

Canaux Kv : canaux potassiques voltage-dépendants

Canaux mK+

ATP : canaux potassiques mitochondriaux ATP dépendants

CK : créatine kinase

CR : chaîne respiratoire

CyP-D : cyclophyline D

Cyt C : cytochrome C

DCA : dichloroacétate

DTG : 1,3-di(2-tolyl)guanidine

ERO : espèces réactives de l’oxygène

GIK : association glucose-insuline-potassium

HE : Hémateine-éosine

HK : hexokinase

I/R : ischémie suivie de reperfusion

IC50 : concentration qui inhibe 50 % de la fixation spécifique

MAO : monoamine oxidase

MEGX : monoethylglycinexylydide

2

NAD : nicotinamide adénine dinucléotide

nH : nombre de Hill

OH-LIDO : hydroxyl- lidocaïne

OH-MEGX : hydroxyl-monoethylglycinexylydide

Pi : phosphate inorganique

PPT : pore de perméabilité transitoire

QC : ubiquinone

RBZD : récepteur aux benzodiazépines

SNC : système nerveux central

TMZ : trimétazidine

VDAC : canaux anioniques voltage-dépendants ou porine

3

INTRODUCTION

Le syndrome d’ischémie survient lorsque le débit sanguin d’un organe est fortement diminué,

voire interrompu. Il peut être immédiat ou progressif, total ou partiel. Dans tous les cas, les

lésions cellulaires qu’il provoque ne sont réversibles que pendant un temps limité, elles

deviennent rapidement définitives. Elles résultent principalement d’un défaut d’oxygène

(hypoxie) entraînant une diminution de la respiration cellulaire puis de la synthèse d’ATP,

une accumulation matricielle de Ca2+ puis une acidose métabolique (revue par Vercesi et al.,

2006).

Lorsque l’ischémie peut être levée par exemple pour la lyse d’un caillot obstructeur, le flux

sanguin est rétabli mais les fonctions cellulaires initiales, physiologiques, ne le sont pas

complètement. La chaîne respiratoire mitochondriale n’est plus immédiatement opérationnelle

(Spees et al., 2006) et l’apport brutal d’oxygène dans une cellule préalablement ischémiée

provoque la génération souvent explosive d’espèces réactives de l’oxygène (ERO). Ce sont

des dérivés de l’oxygène partiellement réduits : ils indiquent que la cellule ischémiée et plus

particulièrement les mitochondries ont perdu au moins transitoirement, la capacité de réduire

complètement l’oxygène reçu.

Ces ERO sont très réactifs, toxiques car avides d’hydrogène et d’électrons. Certains sont

instables, d’autre stables (Zorov et al., 2006).

La séquence de reperfusion lorsqu’elle survient entraîne donc d’autres désordres métaboliques

qui s’ajoutent à ceux de l’ischémie. Cette succession de dommages entraîne rapidement la

mort cellulaire. Elle explique la gravité du syndrome d’ischémie suivie de reperfusion (I/R).

Ce syndrome peut frapper tous les organes mais plus particulièrement ceux dont les débits

sanguins sont les plus élevés : cœur, cerveau, foie, poumons, reins. Les désordres

métaboliques sont d’autant plus graves que la période d’ischémie a été plus longue.

Le traitement du syndrome d’ischémie suivie d’une reperfusion provoquée (thrombolytique

ou revasculation d’un greffon) ou non (suppléances collatérales) est difficile. En effet, il n’est

pas possible de compenser l’hypoxie par un apport supplémentaire d’oxygène qui aggraverait

les lésions de reperfusion, c’est à dire la génération d’ERO. De plus dans un même organe,

après thrombolyse par exemple, certaines structures cellulaires sont encore ischémiées alors

que d’autres sont déjà reperfusées. Il faut donc pouvoir traiter à la fois les conséquences de

l’ischémie et de la reperfusion, l’intervention pharmacologique ne peut être qu’indirecte.

4

Deux grandes stratégies semblent se dégager actuellement. Il est possible d’induire

expérimentalement une cytoprotection en stabilisant les fonctions mitochondriales, les rendant

moins sensibles aux variations du débit d’oxygène. On peut également « préparer » l’organe

cible à l’I/R par les techniques du préconditionnement. On y provoque une ischémie limitée,

subtoxique, suffisante pour déclencher les mécanismes de protection cellulaire qui

s’opposeront aux conséquences du syndrome d’I/R (Opie et al., 2003).

Ces deux stratégies sont intéressantes. Elles n’ont actuellement qu’un intérêt limité pour deux

raisons principales. Elles ne sont véritablement efficaces qu’expérimentalement en prévention

de l’I/R. Elles n’ont pas jusqu’à présent donné de résultats cliniques convaincants.

Une conférence de consensus a conclu récemment en ce sens et proposé des actions

spécifiques (Bolli et al., 2004). Il semble toutefois qu’un progrès sensible puisse être apporté

par l’utilisation simultanée de plusieurs médicaments ayant des effets cellulaires différents

mais complémentaires s’ils réalisent une stabilisation des principales fonctions cellulaires

vitales, une limitation de la génération d’ERO et une homéostasie calcique (Morin et al.,

2001).

Le travail présenté a pour objectif de limiter les effets délétères de l’I/R du foie dans deux

situations particulières, le clampage du pédicule hépatique lors d’une intervention sur cet

organe et la transplantation d’un greffon hépatique. Deux types de situations sont analysés,

suivant les conditions d’une ischémie normothermique (ischémie chaude) suivie d’une

reperfusion ou d’une ischémie hypothermique (ischémie froide) dans le cadre de la

conservation des organes.

La molécule cytoprotectrice potentielle que nous avons utilisée est le N-benzyl-N’(2-hydroxy-

3,4-diméthoxybenzyl)pipérazine ou BHDP (figure 1).

Elle a été sélectionnée sur les arguments suivants : sa structure chimique est proche de celle

de la trimétazidine (TMZ) qui développe expérimentalement et cliniquement, des effets

cytoprotecteurs dans les syndromes d’I/R (Elimadi et al.,1998, Hauet et al., 2000, Morin et al.,

1998 et 2001) et des travaux antérieurs ont décrit des substances actives sur des modèles

d’ischémie cérébrale, dont les structures chimiques sont proches de celle du BHDP (largent et

al., 1987) (figure 1). Selon leurs auteurs, cet effet anti-ischémique est rapporté à l’activation

des récepteurs sigma des membranes cellulaires cérébrales et, plus précisément, des

récepteurs de la sous-classe sigma 1 (Katnik et al., 2006). Des travaux antérieurs du

laboratoire de pharmacologie ont montré que la TMZ et plusieurs de ses dérivés développent

une cytoprotection vis-à-vis de l’I/R en préservant les fonctions mitochondriales et en

particulier la phosphorylation oxydative (Albengres et al., 1998, Moens et al., 2005).

5

Considérant que les mitochondries étaient une cible majeure de ces substances et qu’un effet

agoniste sigma-1 était décrit pour plusieurs molécules, structuralement apparentés au BHDP

et développant aussi des effets protecteurs dans l’I/R, l’hypothèse d’un effet des récepteurs

sigma sur les fonctions mitochondriale a été proposée. Elle se heurtait au fait que ces

récepteurs n’avaient pas été mis en évidence sur des mitochondries.

A partir de ces observations, l’objectif de notre travail a été de rechercher une éventuelle

interaction du BHDP avec des récepteurs sigma, de rechercher si ceux-ci pouvaient être

présents et fonctionnels sur les mitochondries des hépatocytes et d’évaluer les effets

protecteurs du BHDP sur des modèles hépatiques d’I/R normothermique et d’ischémie

hypothermique chez le rat.

La thèse est divisée en trois parties :

• la première, bibliographique, décrit les mécanismes et les approches thérapeutiques

connues actuellement.

• la seconde, expérimentale, présente les résultats que nous avons obtenus, la mise en

évidence des récepteurs sigma-1 mitochondriaux hépatiques (article publié), les

liaisons spécifiques du BHDP à ces récepteurs (article publié) et la mise en évidence

des effets antiischémiques (dans l’ischémie hypothermique) et dans l’ischémie

normothermique suivi de reperfusion du BHDP (article soumis).

• la troisième partie analyse les résultats obtenus à la lumière des données de la

littérature. Elle discute le rôle de l’activation des récepteurs sigma-1 mitochondriaux

dans la protection de l’organe (foie) soumis à l’I/R, tente de préciser les particularités

et les mécanismes d’action de cette protection

6

CH2

N

N

OH

H3CO

H3CO CH2

BHDP C20H26N2O3

N-benzyl-N'-(2-hydroxy-3,4-diméthoxybenzyl)-pipérazine

CH2

N

NH

OCH3

H3CO

H3CO

TMZ C14H21N2O3

2,3,4-triméthoxybenzyl pipérazine

OCH3

OCH3 (CH2)2

N

N

(CH2)3

SA4503 C23H32N2O3

3,4-diméthoxyphénéthyl)-4-(3-phénylpropyl)pipérazine

Cl

Cl (CH2)2

N

CH2

CH3

CH2

N

BD1008 C15H26N2Cl2

N-[2-(3,4-dichlorophényl)éthyl]-N-méthyl-2-(1-pyrrolidinyl) éthylamine) (CH2)2Cl

Cl

N

CH2

CH3

CH2

N

H3CCH3

BD1047 C13H22N2Cl2

[2-(3,4-dichlorophényl)éthyl]-N-méthyl-2-(diamino)éthylamine)

Cl

Cl (CH2)2

N

CH2

CH3

CH2

N

LR172 C16H24N2Cl2

N-[2-(3,4-dichlorophényl)éthyl]-N-méthyl-2-(1-homopipéridinyl) éthylamine

(CH2)2

O

CH2 CH2

N

(CH2)2 CH3

(CH2)2 CH3

NE100 C22H31N1O1

N,N-dipropyl-2-[4-méthoxy-3-(2-phényléthoxy)phényl]-éthylamine monohydrochloride

Figure 1 : similitudes structurales entre le BHDP, la TMZ et différents ligands sigma

7

PREMIERE PARTIE

Mécanismes physiopathologiques et bases pharmacologiques

du traitement de l'ischemie-reperfusion

I. Mécanismes physiopathologiques de l'ischémie-reperfusion

3. Les effets métaboliques de l'ischémie :

L'hypoxie provoque une diminution rapide de la phosphorylation oxydative. La concentration

d'ATP cellulaire n'est toutefois que modérément diminuée aux premiers stades de l'ischémie

car elle est compensée par la formation d'ATP par la glycolyse anaérobie. Celle-ci a un

rendement moindre. Son rendement énergétique est 19 fois plus faible que celui de la

glycolyse aérobie. En effet en anaérobie, la cellule n'utilise que le glucose, les protéines et les

lipides ne participent plus à la synthèse d'ATP. La glycolyse anaérobie utilise le seul

glycogène cellulaire. Elle dure d'autant plus longtemps que le stock de glycogène est plus

élevé, ce qui est le cas du foie. Elle entraîne la formation d'acide lactique qui provoque une

acidification cellulaire (figure 2).

La diminution de concentration cellulaire d'ATP s'accompagne d’une augmentation de celle

d'ADP qui à son tour est hydrolysé libérant une quantité importante de phosphates (Pi).

La sévérité de l'ischémie peut être jugée sur la diminution du glycogène, l'augmentation

d'acide lactique et celle des Pi.

Lorsque l'ischémie persiste, la déplétion en ATP entraîne une diminution de l’activité des

Na+-K+ ATPases provoquant une augmentation progressive de Na+ cytosolique et de K+

extracellulaire.

L'excès de Na+ cytosolique active les échanges Na+-H+ et Na+-Ca2+ (des pompes ATP

dépendantes). Il en résulte un flux intracellulaire de Ca2+ et de protons. L’augmentation de

Na+ intracellulaire provoque une dépolarisation de la membrane cellulaire qui entraîne

l’ouverture transitoire des canaux Ca2+ voltage dépendants et l’entrée de Ca2+ dans la cellule.

Cependant l’entrée de Ca2+ dans la matrice mitochondriale reste limitée car la membrane

mitochondriale est en partie deénergisée (son potentiel est diminué).

8

Figure 2 : Les rendements énergétiques de la glycolyse aérobie et anaérobie

La glycolyse anaérobie est une glycolyse limitée au cytoplasme et aboutissant au lactate.

C'est donc une voie de fermentation. Le rendement énergétique de la glycolyse anaérobie est

19 fois plus faible que celui de la glycolyse aérobie. La régulation de la glycolyse anaérobie

dépend des substrats : glucose, phosphate et ADP.

9

Au total, la glycolyse anaérobie, la libération de protons et l’hydrolyse des nucléotides

adényliques provoquent une acidose. Celle-ci, associée à la faible augmentation de Ca2+

mitochondrial, protège cet organite et donc ses fonctions.

Cependant lorsque l’ischémie est trop prolongée, les dommages cellulaires deviennent

irréversibles, c’est « le point de non retour » prélude à la mort cellulaire. L’apport d’oxygène

véhiculé par la reperfusion devient alors toxique car il n’est plus que partiellement utilisé

donc il devient source d’ERO. Ils entraînent la mort cellulaire par nécrose.

2. Les effets métaboliques de la reperfusion, rôle des mitochondries :

La restauration de l’apport d’oxygène réamorce l’activité de la chaîne respiratoire et restaure

le potentiel de membrane mitochondrial. Celui-ci permet à nouveau l’entrée de Ca2+ dans la

mitochondrie par l’uniporteur, le stockage matriciel de Ca2+ se faisant au détriment de la

synthèse d’ATP (figure 3).

L’accumulation de Ca2+ matriciel n’est pas en soi délétère s’il existe suffisamment d’ATP et

d’ADP (ayant été épargnés par l’hydrolyse) et si les nucléotides sont à l’état réduit. Le plus

souvent, ils ne le sont que partiellement car l’excès relatif d’oxygène est utilisé pour former

des ERO qui génèrent un stress oxydant et épuisent le stock de substances réductrices en

particulier le glutathion.

Ces dysfonctions entraînent une augmentation de la perméabilité de la membrane

mitochondriale causée par la formation d’un canal non spécifique, de large diamètre

dénommé pore de perméabilité transitoire (PPT). Il est transitoire dans la mesure où dans

certaines circonstances il peut se refermer (ouverture transitoire) principalement en début de

l’ischémie. Dans d’autres, son ouverture est irréversible entraînant la mort cellulaire. Il

correspond à une rupture de l’étanchéité de la membrane interne. Le PPT est un canal de

« haute conductance » formé par la jonction transmembranaire de protéines des membranes

internes et externes de la mitochondrie (Crompton, 2000 ; Bernardi et al., 2006 ; Mott et al.,

2006). Ce pore est de nature protéique, il semble principalement formé par l'association du

transporteur de nucléotides adényliques (ANT), des canaux anioniques voltage-dépendants

(VDAC) et de la cyclophiline D, une protéine de la matrice (Figure 4). L'ouverture du pore

peut être induite par différents effecteurs physiologiques comme le Ca2+, la diminution de la

concentration des nucléotides adényliques, l’augmentation de phosphate inorganique ou

l’alcalinisation (Crompton, 1999) ainsi que par la présence de la protéine Bax.

10

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆ΨPTP fermé

PTP ouvert

ISCHEMIE REPERFUSION

Cytosol Cytosol

MITOCHONDRIE

Ca2+Ca2+ Ca2+

[Na+]

[Na+]

[ATP][Pi]

[lactate]

pH

[ATP]

Gradient cellulaire

du pH

Hydrolyse d’ATP

Synthèse d’ATP

Activité de la CR

Activité de la CR

O2 O2

ERO ERO[Pi]

+ ++

+

+

Figure 3 : Conséquences de l’ischémie et de la reperfusion sur le rendement énergétique

et la production de radicaux libres au niveau de la cellule (d’après Morin et al., 2001)

La privation de l’O2 pendant la phase d’ischémie entraîne une réduction de la

synthèse d’ATP et un épuisement des réserves énergétiques mitochondriales aboutissant à

l’altération du potentiel de membrane. La reperfusion aggrave les conséquences de

l’ischémie en provoquant l’hydrolyse de l’ATP et la formation de radicaux libres.

11

Figure 4 : représentation schématique du pore de perméabilité transitoire mitochondrial

et de ses modulateurs

Le pore de perméabilité transitoire (PPT) dont la structure exacte est inconnue est un

assemblage multiprotéique connu sous deux configurations : l’une fermée ou la membrane

mitochondriale interne est imperméable, l’autre ouverte induite par le Ca2+ faisant communiquer

librement la matrice et le cytosol.

Plusieurs protéines sont probablement impliquées dans la structure du PPT, parmi elles, la

cyclophyline D (CyP-D), le transporteur des nucléotides adényliques (ANT), les canaux anioniques

voltage-dépendants (VDAC) ou porine, la créatine kinase (CK), l’hexokinase (HK), le récepteur aux

benzodiazépines (RBZD) et les protéines cytosoliques de la famille Bcl-2, telles que Bax, capables de

se transloquer dans la membrane mitochondriale afin de perméabiliser la membrane interne.

ANT ANT

12

L'ouverture du pore provoque une augmentation de la perméabilité de la membrane interne

mitochondriale qui laisse alors diffuser des molécules de poids moléculaire atteignant 1,5

Kda, une dissipation du potentiel membranaire mitochondrial (proton-dépendant), un

déséquilibre ionique entre le cytoplasme et la matrice mitochondriale, ainsi qu'un découplage

de la phosphorylation oxydative. La pression osmotique étant plus élevée dans la matrice que

dans le cytosol, l’ouverture du pore induit un flux liquidien du cytoplasme dans la matrice

provoquant son gonflement (swelling). Il est suivi d’un reflux qui entraîne le passage dans le

cytosol d’une grande partie du contenu matriciel. Ceci résulte de la rupture de la membrane

externe qui provoque la libération d’agents proapoptotiques tels que l’« apoptosis inducing

factor » (AIF), la procaspase 9 ou le cytochrome C. La mort cellulaire par apoptose ou par

nécrose devient alors inéluctable. (Zoratti et al., 1995 ; Kroemer et al., 1998) (Figure 5).

Le rôle des mitochondries dans l'I/R est donc déterminant pour la survie cellulaire. En effet,

elle peut orienter la cellule vers la mort par apoptose. Le phénomène de transition de

perméabilité mitochondrial est une étape clé de la signalisation de la mort cellulaire

caractérisée par la perte de l’imperméabilité constitutionnelle de la membrane interne

(Crompton, 2000). Il provoque un gonflement caractéristique de la matrice et un effondrement

du potential de membrane. Cela s’accompagne non seulement d’un arrêt de la synthèse

d’ATP, mais d’une hydrolyse de l’ATP. Le gonflement matriciel conduit également à une

rupture de la membrane externe, plus fragile, à l’origine d’une fuite dans le cytoplasme de

petites molécules, dont le cytochrome c. Ce dernier, protéine partenaire de la chaîne

respiratoire, est doué de propriétés proapoptotiques activatrices des caspases, enzymes

chargées d’exécuter la voie finale commune de l’apoptose (Argaud et al., 2006).

Ce phénomène est la conséquence de l’ouverture irreversible d’un « mégacanal » non sélectif

appelé pore de transition de perméabilité (PTP). La nature moléculaire du PTP est à ce jour

inconnu. Le seul élément de certitude, récemment mis en evidence concerne la participation

d’une protéine matricielle la cyclophiline D (Basso et al., 2005). D’autres protéines sont

probablement impliquées telles que l’ANT (transporteur des nucléotides adényliques), la

porine (ou VDAC : Voltage-Dependent Anion Channel), le complexe I, la créatine kinase

(CK), l’hexokinase, le récepteur des benzodiazépines, ainsi que des protéines proapoptotiques

de la famille Bcl-2 telles que Bax [19]. Ce PTP existerait donc dans la mitochondrie sous

deux configurations : l’une fermée et l’autre ouverte faisant largement communiquer la

matrice avec le cytosol.

Dans les conditions physiologiques, l’ion Ca2+ est l’inducteur principal de la transition de

perméabilité (Halestrap et al., 2004). Elle est également modulée par d’autres facteurs

13

matriciels : l’alcalose, l’accumulation de phosphates inorganiques (Pi), les radicaux libres de

l’oxygène, des taux faibles d’ATP et d’ADP sont autant d’éléments activateurs capables de

diminuer la tolérance du PTP à une surcharge calcique.

À l’inverse, les protons, l’ion Mg2+, des taux élevés de nucleotides adényliques ont plutôt

tendance à diminuer la probabilité d’ouverture du PTP.

Il est intéressant de noter que la transition de perméabilité est inhibée pharmacologiquement

par la cyclosporine A (CsA), via sa fixation sur la cyclophyline D de la matrice

mitochondriale [19].

En se fixant sur la cyclophyline D, la CsA empêche l’ouverture du PTP. Cet effet est

indépendant de son action immunosuppressive liée à sa fixation sur une cyclophyline A

cytosolique.

Si les mitochondries retrouvent leurs fonctions, synthèse d’ATP, homéostasie calcique et

limitation de la formation d’ERO, la survie est possible. En revanche, lorsque les fonctions

mitochondriales sont altérées, les mitochondries peuvent déclencher un processus de mort

cellulaire dont la forme apoptotique ou nécrotique semble dépendre de la sévérité de

l’altération (figure 6) et de la présence d’ATP résiduel dans la mitochondrie.

L’apoptose est en effet un processus actif, mort cellulaire programmée (suicide cellulaire) qui

utilise de l’ATP mais évite la destruction des constituants cellulaires qui sont réutilisables. Il

semble que les processus apoptotiques soient partiellement réversibles au début de leur

initiation par différentes interventions pharmacologiques. Expérimentalement, on peut aussi

les éviter.

Les processus nécrotiques en revanche sont irréversibles, les constituants cellulaires sont alors

définitivement dégradés.

14

ATP et pH

[Ca 2+]cyt et [Na+]cyt

[Ca 2+]cyt

ERO

Atteinte mitochondriale

ATP, [Ca2+]

Mitochondrie intacte

Ouverture des pores

Gonflement mitochondrial

Mort cellulaire

ISCHEMIE

Survie cellulaire

MITOCHONDRIE

Ischémie prolongée

REPERFUSION

APOPTOSE NECROSE

Atteinte modéréeFermeture des pores

Production d’ATP maintenue

Atteinte modéréePores restent ouverte

Déplétion en ATP

Figure 5 : Rôle central des mitochondries dans l’apparition des dommages

d'Ischémie-Reperfusion La mitochondrie participe à l’orientation de la cellule soumise au processus d’ischémie reperfusion vers la nécrose ou l’apoptose. L’importance des dégâts engendrés par cette agression dépend de la durée de l’ischémie et des systèmes protecteurs de la cellule. En effet, l’ischémie prolongée et/ou la production de quantité importante de radicaux libres de l’oxygène et d’autres métabolites toxiques peut dépasser les capacités d’adaptation de la mitochondrie aboutissant rapidement à la perte de l’homéostasie cellulaire et ainsi la mort par nécrose. Par contre, si ces processus restent limités la cellule peut dépasser ce cap et rester en vie si non elle déclenche le processus de mort par apoptose.

15

apoptose

ETC

K+

-- ---l

cytochrome c

Ca2+Ca2+

H+

H+

PB

R

AD

CV

DA

C

ROS ADPATP

ETC

Bcl-2

K+Ca2+Ca2+

UCP

H+

H+

Bax

PB

R

AD

C

CyPD

VD

AC

ROS

ATPs

ADPATP

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ+ + ++ + ++ + ++ + +

---- ---- ----

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ

Ischemie-reperfusion

Normoxie

ATP

σσσσ1

?

BaxBax

Bcl-2

ATPsCyPD

UCP

ATP

σσσσ1

?

Figure 6 : Les modifications structurelles et fonctionnelles des mitochondries

aboutissant à l’apoptose suite à un épisode d’ischémie-reperfusion

Au cours de l’ischémie reperfusion plusieurs phénomènes se produisent au niveau de la mitochondrie aboutissant à la survenue de l’apoptose :

• Une surcharge en Ca2+ de la mitochondrie entraînant une chute du potentiel de membranes mitochondriales

• Une inversion de l'activité de l’ATP synthase aboutissant à l’hydrolydse de l’ATP • Une production importante de ROS contribuant à la dégradation des structures de la mitochondrie • Ouverture du PPT « pore géant » • Libération de Cyt c déclanchant la cascade d’activation des caspases

16

3. Les conséquences histopathologiques de l’ischémie-reperfusion :

Les cellules soumises à l’I/R peuvent donc évoluer de deux façons différentes soit vers

l’apoptose, soit vers la nécrose. Par ailleurs, des phénomènes inflammatoires s’installent

rapidement aboutissant à un état inflammatoire chronique.

Au cours de la reperfusion, l’apport sanguin aggrave les lésions ischémiques existantes, en

provoquant une activation et/ou une libération de différents médiateurs de l’inflammation,

c’est « le paradoxe du reflux ». Il en résulte la mobilisation et l’adhésion des lymphocytes et

des polynucléaires neutrophiles à l’endothélium vasculaire. Les polynucléaires neutrophiles

ayant adhérés à l’endothélium vont, à leur tour, libérer d’autres médiateurs (ERO, cytokines,

Platelet-Activating-Factor et protéases) et un cercle vicieux s’installe. Cela aboutit à une

dégradation de l’endothélium vasculaire, au développement d’un environnement pro-

coagulant et à un éventuel phénomène de non reperfusion. La libération des agents vasoactifs

de l’endothélium, endothéline et NO, est perturbée. On observe enfin une infiltration de

l’endothélium par des lymphocytes et des neutrophiles. Les cellules parenchymateuses seront

ensuite atteintes (Figure 7).

En effet, sur le plan moléculaire les phénomènes de stress oxydatif et d’apoptose secondaires

à la réaction d’ischémie-reperfusion entraînent la sécrétion de TNF-α et d’IL-1 par les

cellules endothéliales parenchymateuses. Ces cytokines pro-inflammatoires favorisent la

production de chimiokines CXCL8, CXCL2 et CXCL1 qui attirent les neutrophiles. Le TNF-α

et l’IL-1 induisent également une augmentation de l’expression de molécules d’adhésion

(ICAM, intégrines) par les cellules endothéliales. Les neutrophiles actives libèrent des

chimiokines ligands (CCL3 et CCL4, CCL20 et CCL5) qui exercent une attraction chimique sur

les cellules dendritiques immatures. En outre, les neutrophiles sécrètent des facteurs qui

induisent une augmentation de l’expression de CD40 et de CD86 sur les cellules dendritiques.

Ils produisent également de l’IL-12 et du TNF-α et induisent la synthèse d’IL-12 par les

cellules dendritiques. Les neutrophiles tissulaires sont par conséquent stimulés par l’IFN-γ.

Les lymphocytes T CD8+ à mémoire, qui reconnaissent les alloantigènes de classe I exprimés

par les cellules endothéliales, représentent une source potentielle d’IFN-γ. Les neutrophiles

activés produisent du CXCL9, du CXCL10 et du CXCL11, des molécules chémoattractives

responsables de l’infiltration du greffon par les lymphocytes Th1 allospécifiques. Les

neutrophiles activés peuvent aussi participer aux lésions tissulaires via la libération de

17

radicaux libres oxygénés, d’enzymes protéolytiques, et via la cytotoxicité médiée par le

CD95L (FasL) (Surquin et al., 2005)

Tous ces phénomènes contribuent à l'aggravation des lésions tissulaires induites par

l'ischémie-reperfusion.

18

ER

O

Com

posa

nts

dér

ivés

de

la m

emb

ran

e ce

llu

lair

e

Cy

tok

ines

et

mo

lécu

les

d’a

dh

ésio

ns

Infiltration des polynucléaires

neutrophiles

Figure 7. Evènements successifs de la cascade inflammatoire après la reperfusion

(d’après Le Moine et al., 1998)

A la reperfusion il y a d’abord production de ERO, ensuite une dégradation des membranes

cellulaires avec formation de cytokines et l’activation des molécules d’adhésion d’où afflux

de cellules immunocompétentes (lymphocytes T et polynucléaire neutrophiles)

19

II. Les traitements actuels :

Le traitement pharmacologique actuel de l'insuffisance coronarienne chronique (la maladie

ischémique la plus fréquente) se compose des nitrates, des bêta-bloqueurs et des antagonistes

des canaux calciques. Ils ont été introduits en clinique respectivement en 1867 pour les

nitrates en Angleterre, en 1973 pour les bêta-bloqueurs aux Etats-Unis et en 1982 pour les

antagonistes des canaux calciques aux Etats-Unis également (Chaitman et al., 2005).

Cependant, ces médicaments n’ont qu’un intérêt limité aussi bien en traitement curatif que

préventif des maladies ischémiques mais durant les dernières années des travaux ont permis

d’identifier de nouvelles cibles pharmacologiques, dont certaines sont déjà accessibles en

clinique humaine.

1. Régulation du métabolisme mitochondrial :

La mitochondrie représente un lieu de transformation métabolique important aussi bien pour

le fonctionnement de cet organite que pour celui de la cellule (figure 8a). La viabilité de la

cellule au cours de l’ischémie peut être due à la persistance de son métabolisme anaérobie.

Certains médicaments comme la ranolazine, la trimétazidine, le dichloroacétate (DCA),

l’association glucose-insuline-potassium (GIK), la L-carnitine et les opioïdes, tout en ayant

des mécanismes d’action distincts, provoquent une focalisation du métabolisme énergétique

cellulaire et plus particulièrement mitochondrial, sur l’utilisation du glucose aux dépens des

acides gras. Comme le métabolisme anaérobie des acides gras utilise plus d’oxygène que celui

du glucose par molécule d’ATP formée, ces médicaments augmentent le rendement

énergétique en situation ischémique. Par ailleurs, ils limitent la glycolyse anaérobie qui

conduit à la formation de grandes quantités de lactate et ainsi à l’accumulation de protons.

Ces derniers doivent obligatoirement être expulsés sous peine d’entraîner une acidose

cellulaire qui peut mettre en jeu le pronostic vital de la cellule (Schofield et al., 2001).

Puisque ces médicaments sont bien tolérés et n'affectent pas la fréquence cardiaque ou la

tension artérielle, ils sont souvent associés (sauf les opioïdes) au traitement conventionnel des

maladies ischémiques.

20

Figure 8a : Localisation des processus métaboliques Dans le cytosol, le glucose entre dans la voie métabolique de la glycolyse qui consiste en une série de réactions convertissant une molécule de glucose en deux molécules de pyruvate avec production associée de 2 ATP et 2NADH + H+. Le pyruvate est transporté à l'intérieur de la mitochondrie où il est ensuite transformé en acétyl-CoA par la pyruvate déshydrogénase. Les acides gras sont importés dans la mitochondrie et y sont aussi convertis en acétyl-CoA. L'acétyl-CoA entre ensuite dans une troisième voie métabolique, le cycle de l'acide citrique dans lequel il est déshydrogéné en fournissant du FADH2 et NADH + H+ et du CO2. Cette figure est extraite du module universitaire de « Biologie cellulaire », écrit par le GUIP Biologie de l'Université Bordeaux 1 et mis en oeuvre sur le serveur multimédia de formations Ulysse. © 2003 Ulysse, Université Bordeaux 1 (http://www.ulysse.u-bordeaux.fr/atelie r/ ikramer/ biocell_diffusion)

21

2. Régulation de l’activité de la chaîne respiratoire

La chaîne respiratoire (CR) catalyse l'oxydation du chaînon acétate et produit un gradient

électrochimique entre la matrice et la membrane interne mitochondriale. La CR se compose

de quatre complexes protéiques comprenant différentes sous-unités de polypeptides. Ces

complexes sont contenus dans la membrane interne de la mitochondrie, surtout dans les

crêtes. Il s’agit de :

- la NADH-quinone oxydoréductase (complexe I),

- la succinate-quinone oxydoréductase (complexe II),

- la quinol-cytochrome C oxydoréductase (complexe III ou complexe bc1)

- et la cytochrome C oxydase (complexe IV).

Elle contient également :

1) l'ubiquinone, qui est mobile dans l'épaisseur de la membrane interne (molécule

lipophile) et qui transporte les électrons (et protons) des complexes I et II au

complexe III, et

2) le cytochrome C, qui se trouve dans l'espace intermembranaire et qui établit une

navette d'électrons entre complexes III et IV (figure 8b)

22

Figure 8b : structure et fonctionnement de la chaîne respiratoire

L’ubiquinone et le cytochrome C interviennent dans le transport d’électrons des différents complexes de la chaîne respiratoire

Le fonctionnement de la chaîne respiratoire aboutit à la production de chaleur et à la synthèse d’ATP

Cette figure est extraite avec modification du module universitaire de « Biologie cellulaire », écrit par le GUIP Biologie de l'Université Bordeaux 1 et mis en oeuvre sur le serveur multimédia de formations Ulysse. © 2003 Ulysse, Université Bordeaux 1(http://www.ulysse.u-bordeaux.fr/atelier/ikramer/biocell_diffusion)

23

L'ischémie est caractérisée par une réduction importante de l'oxygène disponible dans la

cellule. La conséquence immédiate est une diminution de la respiration basale puis de la

phosphorylation oxydative. L’intensité des effets sur la CR dépend de la durée de l'ischémie.

Pour de courtes périodes d’ischémie complète (10-20 minutes), la plupart des changements

mitochondriaux sont réversibles et disparaissent pendant la période de reperfusion. Si

l’ischémie est plus longue, les lésions de la CR deviennent irréversibles et sont même

aggravées par la reperfusion qui s’accompagne d’une production importante de ERO.

L’implication de différents constituants de la CR dans la physiopathologie de l’I/R fait que la

modulation de leurs activités constitue une alternative thérapeutique dans cette pathologie

(Morin et al., 2004).

- Maintien de l’activité des complexes de la CR :

L'objectif de cette approche est de protéger l’activité des complexes mitochondriaux afin de

conserver l'efficacité de la respiration mitochondriale, pour retarder la diminution du contenu

cellulaire en ATP et ainsi éviter l’installation de lésions irréversibles. Peu de substances ont

montré une efficacité significative dans cet objectif thérapeutique. Parmi eux, le bilobalide qui

est un extrait des feuilles de Ginkgo biloba (EGB 761). Cette molécule a montré une efficacité

dans l’I/R cardiaque et cérébrale. Elle agit en stabilisant l’activité respiratoire pendant

l’ischémie et donc la teneur de la cellule en ATP. Son mécanisme d'action semble impliquer

une augmentation de l'activité du complexe I et une protection des complexes I et III (Eckert

et al., 2003). Pour améliorer ou maintenir l'activité des complexes de la CR altérés pendant

l'ischémie, l’utilisation de molécules qui peuvent accepter transitoirement les électrons pour

les transférer au complexe en aval est un concept théorique intéressant. Il a été proposé pour

expliquer, au moins en partie, l'effet antiischémique du tanshinone IIA sulfonate de sodium.

Paradoxalement, quelques molécules qui inhibent l'activité de la CR se sont avérées aussi

protectrices des fonctions mitochondriales pendant l'I/R car elles limitent aussi la production

d’ERO. Pendant la reperfusion le trans-resvératrol, une phytoalexine trouvée dans divers vins

rouges, a montré une protection dans l’I/R cardiaque et cérébrale. Il agit en inhibant le

complexe III de la CR (Zini et al., 1999). Le mécanisme de cette inhibition est une

compétition entre le resvératrol et la décylubiquinone au niveau du cycle de la

decylubiquinone (Buryanovskyy et al., 2004). Cet effet empêche la formation de O2•- dans les

mitochondries. Il faut souligner que l’inhibition du complexe III n’est que partielle (- 20 % à

0,1 µM) et ne supprime pas la respiration mitochondriale comme le ferait l’antimycine A. Le

24

resvératrol montre également des propriétés antioxydantes s’opposant à la peroxydation des

lipides.

Une autre manière d'améliorer ou de maintenir l'activité de la CR est de reconstituer la

composition des complexes de la chaîne respiratoire restaurant le transfert normal des

électrons et ainsi le rendement de la phosphorylation oxydative. Le coenzyme Q10 est un

constituant de la chaîne respiratoire qui est situé au carrefour de plusieurs complexes. Il agit

en tant que navette d'électrons entre le complexe I (oxydation du NADH), le complexe II

(oxydation du succinate) et le système de cytochrome du complexe III. Le coenzyme Q10

améliore les fonctions myocardiques chez les rats soumis à une I/R cardiaque. Les effets

cardioprotecteurs du coenzyme Q10 sont liés à la conservation de la fonction mitochondriale

pendant la reperfusion en améliorant l'oxydation FADH-dépendante. Le coenzyme Q10

montre également des propriétés d'antioxydant et de piégeur de ERO qui peuvent expliquer

également son effet cytoprotecteur.

- Inhibition de la libération du cytochrome C :

L’I/R provoque la fuite du cytochrome C dans le cytosol à partir de l'espace intermembranaire

des mitochondries. Après sa libération, le cytochrome C active des caspases par la voie de

l’ « apoptotic protease-activating factor/caspase 9 » et provoque l’apoptose. Ainsi, la

libération du cytochrome C est doublement nuisible à la cellule puisqu’elle provoque

l'induction de l'apoptose et l'interruption de la CR mitochondriale. Par conséquent, une

approche pharmacologique visant à limiter la libération du cytochrome C peut être efficace

dans l’I/R. Le mécanisme moléculaire précis qui est à la base de la libération du cytochrome

C est actuellement mal connu. Plusieurs mécanismes ont été décrits. Le premier implique la

formation d'un canal dans la membrane externe mitochondriale favorisée par la translocation

dans les mitochondries et l'oligomérisation de Bax, une molécule de la famille Bcl-2. Ce

mécanisme semble se produire pendant la reperfusion et peut représenter une cible de futurs

agents antiapoptotiques. En effet, des travaux récents ont démontré que des médicaments

comme le propranolol et la dibucaïne qui sont des stabilisants de membrane, bloquent la

perméabilisation de celle-ci et la libération de cytochrome C des mitochondries de cerveau.

De la même manière, le resvératrol provoque une réduction de la libération du cytochrome C

par modification de la conformation des membranes mitochondriales (Plin et al., 2005). La

libération du cytochrome C entraîne aussi la formation du PPT. Son inhibition est donc une

stratégie pharmacologique appropriée.

25

- Inhibition de la F1-F0 ATPase ou complexe V :

Au début de l'ischémie, la concentration de l'oxygène diminue et le potentiel membranaire

mitochondrial chute. Dans ces conditions, afin d'essayer de rétablir le gradient

électrochimique, la F1-F0 ATPase qui est habituellement le principal fournisseur d’ATP

inverse son activité et hydrolyse l’ATP en ADP et Pi, ce qui aggrave l’appauvrissement en

ATP et provoque l’accumulation de Ca2+, deux effets délétères pour les mitochondries. Par

conséquent, l'inhibition pharmacologique de F1F0-ATPase représente un objectif approprié

pour protéger les fonctions mitochondriales. D'un point de vue expérimental, la plupart des

études in vitro ont employé des oligomycines en tant qu'inhibiteurs de la F1-F0 ATPase mais

ces substances sont hautement toxiques et ne peuvent pas représenter une approche

thérapeutique. D'autres molécules comme la quercétine et différents polyphénols, présentent

un profil intéressant. Ces agents antioxydants inhibent la F1-F0 ATPase aux concentrations

micromolaires et cet effet pourrait être associé à leurs effets antiischémiques (Morin et al.,

2004).

3. Antioxydants

Un antioxydant peut être défini comme une substance qui retarde de façon significative ou

inhibe l'oxydation d'un substrat et ce, à des concentrations bien inférieures à celles de ce

dernier (Gutteridge et al., 1989 ; Dunne et al., 2006). Les antioxydants biologiques sont des

substances qui protègent les systèmes biologiques contre les effets délétères possibles des

processus ou des réactions engendrant une oxydation excessive (Krinsky, 1992).

Les antioxydants sont donc des molécules qui peuvent limiter la formation d'ERO, ou qui

peuvent réagir avec ces derniers pour les neutraliser. Les termes antioxydants et piégeurs de

radicaux libres sont interchangeables pour décrire les différents systèmes de protection (Pré,

1992).

La figure 9 présente la structure des principaux antioxydants regroupés en fonction de leur

caractère hydrophile ou lipophile.

Pour se défendre contre les ERO, l'organisme possède deux grands systèmes de protection :

soit des systèmes enzymatiques, soit des antioxydants nonenzymatiques intra- et

extracellulaires qui interviennent selon un ordre hiérarchique (Sahnoun et al., 1997 ;

Nishiyama et al., 1998)

26

Antioxydants liposolubles Antioxydants hydrosolubles

HO

H3C

CH3

CH3

O

CH3

CH3H

CH3H

CH3

O

H

HCOH

CH2OH

HO OH

O

αααα- Tocophérol Acide Ascorbique

ββββ-Carotène

N

NHO

OH

N

N

OH

Acide Urique OH

H3OC

OH

H3OC

CH3

CH3

n

Ubiquinol

HOOC CH CH2 CH2 C NH CH

CH2

SH

C NH CH2 COOH

OONH2

Glutathion HO

HO

CH3

2-Hydroxy Estrone

N N

NH2+

O

CH3

Créatinine

Bilirubine

HO

HO

CH3

NH2 CH

CH2

SH

COOH

2-Hydroxy Estradiol Cystéine

Figure 9 : Structure moléculaire des principaux antioxydants physiologiques

(Krinsky, 1992)

27

Les enzymes antioxydantes, telles la superoxyde dismutase, la catalase et la glutathion

peroxydase, sont préventives parce qu'elles agissent sur les espèces impliquées dans

l'initiation de la chaîne de formation des ERO tandis que les molécules antioxydantes plus

petites, telles que l'ascorbate, le tocophérol, l'ubiquinone, l'urée et le GSH, sont capables de

piéger directement les radicaux oxydants et sont ainsi des antioxydants «briseurs» de la chaîne

radicalaire (Sies et al., 1997). De façon générale, les actions respectives des diverses enzymes

antioxydantes ne sont pas du même ordre d'importance (Harris, 1992) et les sites d’action sont

variables d’une molécule à une autre (figure 10).

L'ischémie-reperfusion est une situation qui s’accompagne d'une réduction des niveaux

d'antioxydants endogènes qui rend les tissus plus vulnérables à l'apport massif d’ERO

engendré par la reperfusion. D’où l'hypothèse suivante : l'administration d’antioxydants

comme thérapie adjuvante dans ces situations cliniques pourrait être bénéfique (Folkers et al.,

1969). Les effets des antioxydants ont été plus particulièrement étudiés dans les maladies

liées à l'ischémie du myocarde, à la chirurgie cardiaque ou lors de transplantations d’organes

(Chello et al., 1996 ; Bolcal et al., 2007).

Cependant, malgré ce substratum physiopathologique assez solide, les résultats cliniques sont

décevants :

- L’étude SUVIMAX (Bertrais et al., 2004) : au cours de cette étude une combinaison de

produits connus pour leurs activités anti-oxydantes a été utilisée bêta-carotène 6 mg, vitamine

C 120 mg, vitamine E 30 mg, sélénium 100 µg, zinc 20 mg. Les résultats montrent nettement

que l'apport de ces vitamines et de minéraux antioxydants à doses nutritionnelles réduit le

risque de cancers ainsi que la mortalité globale. Mais, le risque cardiovasculaire n'est pas

diminué.

- L’étude HOPE : En prévention primaire un essai qui a inclus 29113 participants n'a pas

montré d'effet statistiquement significatif de la vitamine E sur la mortalité globale des

infarctus du myocarde, accidents vasculaires cérébraux et des décès de cause cardiovasculaire.

En prévention secondaire les résultats ont été identiques (Sleight, 2000).

- D’autres études cliniques, décevantes elles aussi, ont été réalisées avec :

• La vitamine A, son précurseur le béta-carotène ou pro-vitamine A, protecteur des

noyaux cellulaires.

28

• Le zinc, constituant, entre autre, de la super oxyde dysmutase

• Le sélénium, constituant de la glutathion péroxydase cytosolique.

• Certaines vitamines B, B1, B5,B6

• Certains acides aminés, méthionine et cystine.

• Les flavonoïdes

• L’ubiquinone

Différentes hypothèses peuvent être évoquées pour expliquer les résultats modestes ou

négatifs de ces différentes études par rapport au espoirs portés par les études expérimentales :

- les doses utilisées : en effet au cours des études expérimentales les doses utilisées sont

très élevées et dépassent largement les doses nutritionnelles.

- la disponibilité de ces substances au niveau de leur site d’action n’est pas suffisante

- le choix des patients inclus dans ces différentes études. Il s’agit de patients soit ayant

plusieurs facteurs de risques cardiovasculaires donc l’action antioxydante seule n’est

pas suffisante pour avoir des résultats satisfaisants, soit il s’agit de patients n’ayant pas

de facteurs de risque cardiovasculaire. Un éventuel effet protecteur ne peut donc être

révélé car les groupes témoins ne présentent que peu de complications

cardiovasculaires, les différences entre ces groupes et les groupes traités par les

antioxydants restent non significatives.

29

Figure 10 : Antioxydants intracellulaires (d'après Bankson et al., 1993)

1 = noyau, 2 = peroxisomes, 3 = lysosomes, 4 = mitochondrie,

5 = réticulum endoplasmique, 6 = cytoplasme, 7 = membrane cytoplasmique

La répartition subcellulaire des antioxydants est différente d’un antioxydant à un autre.

Toutes les structures subcellulaires contiennent un ou plusieurs systèmes antioxydants

Ubiquinone

Catalases

Vitamine E

Caroténoïdes

Vitamine C

Superoxyde dismutase

Glutathion peroxydase

Glutathion

30

III. Les nouvelles pistes thérapeutiques :

1- Le préconditionnement

Le concept de préconditionnement « preconditioning » est né en 1985 dans le laboratoire

nord-américain dirigé par R.B. Jennings (Murry et al., 1986). Les chercheurs ont montré que

des occlusions coronariennes brèves (trop courtes pour provoquer une nécrose

cardiomyocytaire) réalisées avant une occlusion prolongée (de durée suffisante pour

provoquer un infarctus myocardique) peuvent réduire de façon très importante (50 % à 75 %)

la taille finale de l’infarctus. Le fait de rendre le myocarde brièvement ischémique induit une

protection endogène qui s’exprime lors d’une ischémie prolongée consécutive.

Tout se passe comme si le myocarde, « prévenu » par une première agression (ici de nature

ischémique), mettait en jeu des mécanismes endogènes de défense le rendant capable de

mieux tolérer une nouvelle agression à venir : il s’agit là d’un phénomène d’adaptation au

stress.

Le préconditionnement constitue donc un traitement préventif de la lésion myocardique,

l’intervention protectrice (épisode bref d’ischémie-reperfusion) précédant le développement

de la lésion. La cardioprotection est nettement plus importante que celle obtenue avec les

traitements connus à ce jour. Par ailleurs, elle s’étend au-delà de la limitation de la nécrose

tissulaire : le préconditionnement limite également l’apoptose myocardique induite par

l’épisode d’ischémie-reperfusion (Piot et al., 1997 ; Argaud et al., 2004). Il améliore aussi la

récupération contractile postischémique en raison de la limitation de la taille de la nécrose, et

non pas du fait d’un effet protecteur propre sur l’appareil contractile (Ovize et al., 1992 et

1994, Aouam et al., 2005).

L’ischémie n’est pas le seul stimulus capable d’induire cette cardioprotection. L’hypoxie, le

stress thermique, la stimulation par pacing, l’étirement myocardique sont susceptibles

d’activer ces mécanismes de défense (Lucats et al, 2005). De nombreux agonistes (ou

substances cardioactives) peuvent mimer ce phénomène dans certains modèles expérimentaux

: agonistes A1/A3 de l’adénosine, bradykinine, opioïdes, angiotensine II, noradrénaline ou

endothéline (Liu et al., 1991, Schultz et al., 1995).

31

Il est bien évident que ces résultats expérimentaux laissent entrevoir la possibilité d’une

manipulation pharmacologique de ce phénomène et, par conséquent, le développement de

nouveaux agents anti-ischémiques.

Leesar et al. (2003) ont montré que la perfusion intracoronaire d’adénosine a un effet

protecteur de type préconditionnement lorsque le critère de jugement est le sus-décalage du

segment ST au cours d’inflations itératives du ballon d’angioplastie. Cette même équipe a

obtenu des résultats similaires avec une perfusion de bradykinine, dont l’effet

préconditionnant avait été démontré chez l’animal.

Tomai et al. ont quant à eux rapporté dès 1994 que le glibenclamide, un antagoniste des

canaux K+ATP, bloque le préconditionnement dans le même modèle d’angioplastie coronaire

chez l’Homme. La portée pratique de ces travaux reste cependant limitée, ces agents

pharmacologiques étant difficiles à manier et la situation clinique testée étant très particulière

car elle a nécessité des perfusions de sérum glucosé et une surveillance stricte de la glycémie.

Une application plus intéressante du concept de préconditionnement a été donnée par l’étude

IONA (IONA Study group, 2002). L’idée générale était de déterminer si la prescription au

long cours de nicorandil, un agent capable d’induire le préconditionnement chez l’animal par

activation des canaux mitochondriaux K+ATP (mK+

ATP) (figure 11), avait un effet favorable

sur la morbi-mortalité de patients coronariens angineux stables ayant un risque

cardiovasculaire élevé. Les résultats montrent que le nicorandil limite significativement la

survenue de syndromes coronariens.

S’il est clair que l’étude IONA n’applique pas strictement le schéma du préconditionnement

expérimental, elle a le mérite d’appliquer les connaissances expérimentales sur le sujet à une

situation clinique rencontrée quotidiennement : elle représente à ce jour la seule application

pratique issue du concept de préconditionnement. Elle pose en outre une question essentielle,

toujours non résolue : les antagonistes des canaux K+ATP que sont les sulfonylurées

hypoglycémiantes, utilisés en clinique dans le traitement du diabète de type 2, ont-ils des

effets délétères chez le diabétique coronarien ?

2- Action sur les canaux potassiques mitochondriaux

Le rôle physiologique des canaux mK+ATP, de même que leur place exacte dans la

cardioprotection, sont encore mal connus. Deux effets sont susceptibles de favoriser la survie

32

cellulaire au cours de l’ischémie-reperfusion : d’une part, la dépolarisation de la membrane

mitochondriale interne, consécutive à l’entrée de K+ par ces canaux, limiterait la surcharge

matricielle en Ca2+ et préserverait la mitochondrie (O’Rourke, 2000) ; d’autre part, la

régulation du volume matriciel par l’ouverture des canaux mK+ATP pourrait influencer la

respiration mitochondriale et la production d’ATP. Il semble par ailleurs que ces canaux

modulent l’ouverture du PPT. Expérimentalement, on observe une ouverture du PPT après

ischémie-reperfusion chez le Rat, ainsi que l’atténuation des lésions cellulaires après

administration de ciclosporine A, un bloqueur spécifique de ce pore (Duchen et al., 1993 ;

Griffiths et al., 1993 ; Wu et al., 2006)

Piriou et al., (2004) ont montré que l’activation des canaux mK+ATP par le desflurane retarde

l’ouverture du PPT, et que cet effet est bloqué par le 5-hydroxydécanoate, un inhibiteur des

canaux mK+ATP . Le mécanisme sous-tendant ces effets reste mal connu, mais certains auteurs

suggèrent que l’activation des canaux mK+ATP limiterait la surcharge calcique mitochondriale,

induite par l’ischémie, par une réduction de la capture de Ca2+ (Wang et al., 2001).

33

Figure 11 : Rôle des canaux potassiques mitochondriaux dans

le préconditionnement ischémique

(schéma adapté selon Wang et al., 1999)

Les canaux potassiques mitochondriaux interviennent dans le préconditionnement ischémique

en jouant le rôle d’un effecteur mitochondrial de différentes substances agissant

sur des récepteurs membranaires

34

Deuxième partie :

Etude expérimentale du BHDP

Cette étude consiste à tester les trois hypothèses que nous avons proposées, la présence des

récepteurs sigma sur les mitochondries, la caractérisation des liaisons spécifiques du BHDP

sur les mitochondries et leurs relations avec les récepteurs sigma et la mise en évidence

d’effets antiischémiques du BHDP.

1- La caractérisation des récepteurs sigma sur les membranes mitochondriales des hépatocytes

de rat.

Klouz A, Sapena R, Liu J, Maurice T, Tillement JP, Papadopoulos V, Morin D. Evidence

for sigma-1-like receptors in isolated rat liver mitochondrial membranes. Br J Pharmacol.

2002; 135: 1607-15

Deux méthodes de caractérisation des récepteurs sont utilisées, la mise en évidence de liaisons

spécifiques à l’aide de ligands de forte affinité et l’immunocytochimie pour localiser la liaison

avec précision.

La difficulté expérimentale réside dans la nécessaire purification des membranes

mitochondriales. Des récepteurs sigma sont décrits dans les membranes cellulaires, nucléaires

et dans les microsomes. Le degré d’enrichissement de la préparation mitochondriale a été

mesuré par l’activité de trois enzymes, la cytochrome C oxydase pour la membrane interne, la

monoamine oxydase (MAO) pour la membrane externe et comparée à celle de la cytochrome

c réductase témoin de la présence des microsomes. La comparaison de ces trois activités

enzymatiques indique que la préparation est suffisamment purifiée.

L’étude des liaisons spécifiques utilise des ligands de forte affinité, les benzomorphanes pour

les récepteurs sigma 1 et leurs isomères (+). Le dérivé radioactif utilisé est la

[3H](+)pentazocine. Le 1,3-di(2-tolyl)guanidine (DTG) marque dans les mêmes proportions

les deux sous-types, sigma 1 et 2. La stéréosélectivité de la liaison de la pentazocine est

inversée pour le sigma 2 : L’isomère (-) est le plus fixé, l’isomère (+) a une affinité moindre.

35

Cette étude a été complétée par la mise en évidence de l’inhibition de la liaison de la

[3H](+)pentazocine par la progestérone considérée comme le ligand endogène des récepteurs

sigma 1.

Les résultats obtenus montrent que la [3H](+)pentazocine et de nombreux ligands sigma 1 se

lient à la membrane externe mitochondriale d’hépatocytes de rat et permettent de conclure que

des récepteurs de type sigma 1 existent sur cette membrane.

L’étude d’immunohistochimie montre la co-localisation des récepteurs sigma 1 avec un

marqueur mitochondrial Ab-1 par microscopie confocale.

Il est donc possible de conclure à la présence de récepteurs mitochondriaux de type sigma 1

sur la membrane externe. Pour affirmer qu’il s’agit bien de récepteur sigma 1, il faut

l’extraire, le cloner puis l’exprimer ce qui reste à faire.

Parallèlement, le même sous-type de récepteurs, sigma 1, a été caractérisé dans les

mitochondries de cerveau (synaptosomes) toutefois avec une affinité plus basse pour la

pentazocine. Ce résultat était attendu puisque ces récepteurs ont un profil de liaison proche de

ceux des opioïdes et ont longtemps été considérés comme l’un de leurs sous groupes avant

qu’on établisse qu’ils sont distincts.

La densité de ces récepteurs de type sigma 1 mitochondriaux est moindre comparée à celle

des membranes cellulaires et des microsomes. On observe aussi que devant la grande variété

structurale des ligands sigma 1 actuellement connus, la spécificité de reconnaissance stérique

de ce récepteur est relative.

36

2- Le BHDP est un ligand sélectif de forte affinité des récepteurs sigma 1 des mitochondries

des hépatocytes.

Klouz A, Tillement JP, Boussard MF, Wierzbicki M, Berezowski V, Cecchelli R,

Labidalle S, Onteniente B, Morin D. [3H]BHDP as a novel and selective ligand for sigma1

receptors in liver mitochondria and brain synaptosomes of the rat. FEBS Lett. 2003; 553: 157-

62.

La N-benzyl-N’-(2-hydroxy-3,4 diméthoxybenzyl) pipérazine ou BHDP fait partie du groupe

des 4-benzylpipéridines substituées sur l’azote. Elle est structuralement apparentée à

l’ifenprodil, à l’éliprodil et au SA4503, (figure 1), ces trois substances étant des ligands des

récepteurs sigma 1 (Lever et al., 2006).

Le SA4503 est un agoniste de ces récepteurs (Matsuno et al., 1996).

Le BHDP est également structurellement proche de la trimétazidine (TMZ) qui, si elle n’a pas

d’affinité significative pour les récepteurs sigma 1, présente des propriétés antiischémiques

mises en évidence sur différents modèles expérimentaux et en particulier sur l’ischémie-

reperfusion hépatique provoquée chez le rat (revue par Albengres et al., 1998).

Il y a donc un faisceau d’arguments pour émettre l’hypothèse que le BHDP est à la fois un

ligand sigma 1 et un antiischémique.

Dans ce travail, il est montré que le BHDP est un ligand des récepteurs sigma 1

mitochondriaux. Les techniques classiques de mesure de liaisons spécifiques sont utilisées. En

présence de ligands connus des récepteurs sigma 1, l’halopéridol, la (±)pentazocine, le NE-

100, le DTG, le carbétapentane, le (±)3-PPP, le rimcazole, le dextrométorphan, la

progestérone, la déhydroépiandrostérone, les liaison spécifiques du BHDP sont inhibées de

façon compétitive.

Le nombre de Hill est dans tous les cas (sauf pour la (±)pentazocine) voisin de l’unité ce qui

indique que l’inhibition n’inclut pas d’effet allostérique. On peut en conclure que le BHDP est

un ligand des récepteurs sigma 1 mitochondriaux hépatiques.

Les mêmes liaisons compétitives sont observées dans un autre organe, sur les synaptosomes

de cerveau de rat, ce qui permet de supposer qu’il s’agit d’un phénomène général.

L’inhibition compétitive, sans effet allostérique, est la règle avec toutefois deux exceptions,

(±)pentazocine et la progestérone, cette dernière étant un médiateur supposé de ces récepteurs

au niveau du SNC (Monnet et al., 2006).

37

La sélectivité de cette liaison est clairement prouvée par le fait que l’étude systématique des

liaisons du BHDP sur les principaux autres récepteurs connus ne montre pas d’affinité

significative.

Au total, le BHDP reconnaît un seul site de liaison mitochondriale dont le Kd est de 3,18 ±

0,055 nM et le Bmax de 2,17 ± 0,17 pmol/mg de protéine. Ce site est localisé sur la

membrane externe et présente toutes les caractéristiques de liaison du récepteur sigma 1.

L’affinité du BHDP est très élevée et cette substance peut donc être considérée comme un

ligand de référence du récepteur sigma 1.

La deuxième question posée est de savoir ce que provoque la liaison du BHDP au récepteur

sigma 1.

Provoque-elle un effet ? Et si oui, s’agit-il d’une stimulation, le BHDP est-il agoniste ? Ou

s’agit-il d’une inhibition, d’un antagonisme ?

Il est difficile de répondre à cette question car on ne connaît pas les rôles physiologiques de ce

récepteur (voir plus loin). Bien plus, des agonistes (supposés) et des antagonistes semblent

expérimentalement protéger différents organes, cerveau, foie … des effets délétères d’une

ischémie-reperfusion programmée. Nous avons donc cherché à caractériser les effets

pharmacologiques du BHDP en les comparant à ceux induits par différents ligands sigma.

- Le premier modèle utilisé est celui d’astrocytes en culture soumis à une hypoxie sévère

provoquant en 24 h une diminution significative de la concentration d’ATP, d’environ

50%. On constate que le BHDP prévient la diminution de la synthèse d’ATP de façon

concentration dépendante et qu’à dose suffisante, il maintient les concentrations observées

en normoxie.

- Le deuxième modèle utilisé est celui de l’induction de l’expression de c-fos par le BHDP.

Sans être formellement établies, les relations entre récepteurs sigma centraux et

antipsychotiques ont été évoquées (Maurice et al., 1999). L’activation du protooncogéne

c-fos peut être induite par les antipsychotiques. Cette expression est variable aussi bien

dans sa topographie que dans son intensité en fonction de l'antipsychotique utilisé

(Dragunow, 1990 ; Miller, 1990 ; Robertson et al., 1992). Il a été récemment rapporté que

des molécules antipsychotiques dites atypiques ayant une forte affinité sigma induisent

l'expression de c-fos d'une façon spécifique différente de l'expression des antipsychotiques

classiques (Guitart et al., 1998 ; Guzman et al., 2006).

38

Nous avons donc évalué l'expression de c-fos chez des rats après administration de BHDP

et nous l’avons comparé à celles de la clozapine et de l’halopéridol. Nous avons ainsi pu

mettre en évidence un profil sigma d’expression de c-fos suite à l’administration de

BHDP. Alors que les expressions de c-fos induites par la clozapine et l’halopéridol sont

comparables à celles décrites dans la littérature, le BHDP entraîne l’expression de c-fos au

niveau du cortex cérébral mais est sans effet au niveau du striatum et du noyau accumbens

(Figure 12).

- Le troisième modèle est la potentialisation de la toxicité de la cocaïne chez la Souris.

La cocaïne, benzoate de triméthylecgonine, est un anesthésique local de contact. Son site

d’action principal est la membrane des fibres sensitives dont elle bloque la conduction, c’est à

dire la transmission douloureuse. C’est aussi un sympathomimétique indirect. Elle s’oppose à

la recapture des amines biogènes et en particulier de la noradrénaline présente dans la fente

synaptique, par l’extrémité de la fibre. Là encore, il s’agit d’un effet d’imperméabilisation

membranaire par blocage des canaux Na+ et accessoirement K+ à doses plus élevées.

Dans le SNC, la cocaïne provoque aussi l’accumulation de la noradrénaline comme les

antidépresseurs (désipramine). A doses élevées, elle provoque des convulsions et la mort des

animaux. Cet effet observé aussi avec les antidépresseurs à doses toxiques est considéré

comme résultant de la stimulation des récepteurs sigma centraux. La cocaïne est considérée

comme un agoniste de ces récepteurs : ses effets toxiques sont dose-dépendants et

proportionnels au nombre de récepteurs occupés (Lason, 2001). La méthode utilisée consiste à

observer les modifications des effets de doses toxiques de cocaïne : les agonistes agissent en

synergie alors que les antagonistes protègent les animaux. Il a été rapporté que la cocaïne se

lie aux récepteurs sigma et ses effets toxiques sont proportionnels à cette liaison (Sharkey et

al., 1988).

Par ailleurs, certaines molécules se liant spécifiquement aux récepteurs sigma possèdent une

activité anti-cocaïne permettant de réduire significativement l'activité locomotrice, les

convulsions et la mortalité engendrées par la cocaïne. Il s'agit de molécules ayant une activité

antagoniste sigma (Matsumoto et al., 2001). En revanche, le DTG, un agoniste sigma aggrave

toutes ces manifestations (Ritz et al., 1993 ; McCracken et al., 1999).

Afin d'étudier le comportement du BHDP dans ce modèle (agoniste ou antagoniste), nous

avons injecté à des souris préalablement traitées par 10 mg/kg de BHDP, des quantités

croissantes de cocaïne 70, 85, 100 et 125 mg/kg par voie intra-péritonéale et évalué (tableau

1) :

39

- Les convulsions caractérisées par :

• le nombre de souris qui convulsent

• le délai de survenue des convulsions

• la durée des convulsions

• l’intensité des convulsions (faibles, moyennes et intenses)

- La mortalité :

• nombre de souris qui meurent

• le délai de survenue de la mort

Les résultats de cette étude sont indiqués sur le tableau 1. Ils montrent que le BHDP provoque

une aggravation des convulsions sans augmenter la mortalité.

En ce qui concerne la survenue des convulsions, il n'y a pas de différence significative entre le

groupe traité par le BHDP et le groupe témoin. Le BHDP n’a donc pas d’effet convulsivant

propre.

En outre, le BHDP augmente l’intensité des convulsions et réduit significativement le temps

de survenue des convulsions induites par la cocaïne. Le temps de latence est en moyenne

divisé par 2 (2 minutes et demi au lieu de 5 minutes).

Au total, les résultats obtenus permettent de conclure que :

- Le BHDP est un ligand sélectif des récepteurs sigma 1.

- Il développe des effets semblables à ceux des agonistes sigma 1 connus.

- Sa liaison aux mitochondries des hépatocytes est de forte affinité et en fait un marqueur

spécifique du récepteur mitochondrial.

40

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Cortex préfrontal Noyau accumbens striatum dorsolatéral

c-f

os

en

un

ité

re

lati

ve

Témoin BHDP 10 mg/Kg Clozapine 30 mg/Kg Halopéridol 1 mg/Kg

Figure 12 : Expression de c-fos induite par le BHDP, la clozapine et l’halopéridol dans

différentes régions du cerveau. (* p < 0,05)

* *

*

*

41

BHDP en mg / kg

Cocaïne en mg / kg

Délai de survenue

des convulsions en min

Durée des convulsions en min

Délai de survenue

de la mort en min

10 125 2,25 ± 0,58* - 7,208 ± 3,394

10 100 2,04 ± 1,01** 9,75 ± 2,217* 3,438 ± 1,782*

10 85 2,25 ± 0,58** 10,69 ± 3,23** 6,125 ± 2,358*

10 70 2,81 ± 0,83** 8,11 ± 2,38** -

- 125 4,54 ± 2,29 - 8,042 ± 3,602

- 100 4,64 ± 1,87 6,33 ± 0,29 5,955 ± 2,207

- 85 5,33 ± 3,35 3,31 ± 1,69 7,667 ± 3,312

- 70 6,11 ± 1,53 3,1 ± 2,38 -

Tableau 1 : Effet du BHDP sur la toxicité de la cocaïne.

Chez la souris Swiss, Le BHDP potentialise la toxicité de la cocaïne. En effet, des doses

croissantes de BHDP réduisent le délai de survenue des convulsions, allongent leurs durées et

accélèrent la survenue de la mort.(*p < 0,05 ; **p < 0,01)

42

3- Mise en évidence de l’effet anti-ischémique du BHDP

Après avoir montré que le BHDP est un ligand spécifique des récepteurs sigma et que ces

derniers sont bien présents sur la membrane externe de la mitochondrie, nous avons évalué le

potentiel protecteur de cette molécule vis à vis des processus d’ischémie-reperfusion.

Anis Klouz, Dorra Ben Saïd, Henda Ferchichi, Mohamed Lakhal, Nadia Kourda, Jean -

Paul Tillement and Didier Morin. Ischaemia-reperfusion injury: protection of cellular and

mitochondrial functions by BHDP, a sigma 1 ligand. (Article soumis à publication)

B- Méthodologie expérimentale

• Exploration biochimique : dosage plasmatique des transaminases

Pour évaluer l’intégrité des cellules hépatiques on a eu recours aux dosages des

transaminases (l’aspartate aminotransférase ou ASAT et l’alanine aminotransférase ou ALAT).

Il s’agit d’enzymes intracellulaires normalement présentes dans le plasma à des faibles

concentrations. En cas de lyse cellulaire leurs concentrations plasmatiques augmentent. En

effet, L’ASAT est retrouvée à des concentrations élevées dans les cellules du foie. Elle existe

sous forme de deux iso-enzymes différentes dont les proportions sont variables : 80 % de

l’activité hépatocytaire de l’ASAT est mitochondriale, alors que 90 % de l’activité plasmatique

est d’origine cytosolique. L’ALAT est localisée uniquement dans le cytosol, sa concentration

dans les tissus non hépatiques est très faible, elle est dans ces cas confinée au cytoplasme. La

demi-vie de l’ASAT est plus courte que la demi-vie de l’ALAT, ce qui explique la possibilité

du croisement des deux courbes retraçant l’évolution des taux enzymatiques en fonction du

temps en cas de cytolyse prédominant initialement sur l’ASAT. Cela explique aussi le retour

plus rapide à la normale de l’ASAT que de l’ALAT dans les situations aiguës. Il n’y a pas

d’élimination biliaire ni urinaire significative. Les transaminases sont probablement

catabolisées par les cellules du système des phagocytes mononucléés et notamment les

macrophages du foie.

• Exploration fonctionnelle : le test du MEGX :

Le métabolisme de la lidocaïne est essentiellement hépatique, catalysé par les enzymes P450

NADPH dépendants. Le monoéthylglycinexylydide (MEGX) est le métabolite majeur alors

que ses dérivés hydroxylés, OH-LIDO et OH-MEGX sont des métabolites mineurs (figure

12).

43

Figure 13 : Transformation de la lidocaïne en MEGX au niveau hépatique

44

Cette réaction de biotransformation a été utilisée en clinique en tant que test métabolique

permettant d’évaluer le fonctionnement hépatique. Le test du MEGX consiste à injecter 1

mg/kg de lidocaïne par voie intraveineuse et à effectuer 15 et 30 minutes plus tard des

prélèvements recherchant son métabolite, le MEGX. La concentration de MEGX formé est

inversement corrélée au degré de sévérité de l’atteinte hépatique (Tanaka et al., 2000 ;

Wojcicki et al., 2002 ; Orlando et al., 2004) : plus l’atteinte est sévère, moins il se forme de

MEGX

S’inspirant de ce test, nous avons développé le test de transformation de la lidocaïne en

MEGX ex-vivo.

Après avoir réalisé un prélèvement du foie d’un rat Wistar mâle anesthésié, le protocole

consiste à prendre 2,5 g de foie, le laver au sérum physiologique, le broyer manuellement à

l’aide d’un potter en verre pendant une minute. Puis 1 ml d’une solution de lidocaïne à 500

µg/ml est ajouté à l’homogénat obtenu et celui-ci est incubé à 37°C sous agitation rotative

pendant 2 h (durées variables lors de la mise au point). A la fin de l’incubation, l’homogénat

est centrifugé à 3000 tours/min pendant 5 min à 4°C et les quantités de MEGX formé et de

lidocaïne retrouvée sont déterminées par HPLC sur le surnageant obtenu.

L’analyse des résultats obtenus en fonction du temps d’incubation montre que le MEGX est

rapidement formé avec un maximum au bout des deux premières heures. En fait, la vitesse de

métabolisation de la lidocaïne augmente au cours du premier quart d’heure d’incubation, puis

continue avec une vitesse constante. Au bout de deux heures d’incubation, 57 % de la quantité

initiale de lidocaïne introduite est métabolisée. La détermination du pourcentage de

transformation de la lidocaïne en MEGX permet d’observer un palier de transformation entre

une et deux heures d’incubation. Le MEGX constitue environ 70 % de la lidocaïne

transformée, ce qui prouve bien que le MEGX est le métabolite principal de la lidocaïne.

Dans la littérature, il a été également montré que le MEGX représente le métabolite majeur de

la lidocaïne. D’ailleurs, Oda et al. (1989) ont montré que le MEGX représente 80 % des

métabolites formés après une heure d’incubation avec des microsomes hépatiques isolés.

45

Figure 14 : Chromatogrammes montrant la lidocaïne, le MEGX et l’étalon interne.

Incubation de la lidocaïne avec un homogenat de foie de rat Wistar à 37°C

pendant 30 min (figure 14a) et 2 h (figure 14b).

46

0

50

100

150

200

0 0,25 0,5 1 2 4 6 12

Temps d'incubation en heures

Con

cen

trati

on

ME

GX

en µ

g/m

l

0

100

200

300

400

500

600

Con

cen

trati

on

lid

oca

ïne

en µ

g/m

l

Concentration MEGX en µg/ml Concentration lidocaïne en µg/ml

Figure 15 : Cinétique de la transformation de la lidocaïne et de la formation

du MEGX en fonction du temps

La transformation de la lidocaïne en MEGX passe

47

• Exploration histologique

A la suite du prélèvement de l’organe, les tissus doivent être immergés dans au moins 10 fois

leur volume de liquide fixateur (le formol à 10 % 6 à 12 heures à température ambiante). Les

prélèvements sont ensuite inclus dans de la paraffine et coupés pour réaliser des coupe fines,

ces dernières seront colorées pour pouvoir visualiser les différentes structures tissulaires et

cellulaire en microscopie. Les colorations les plus fréquemment utilisées associent 2 ou 3

colorants différents.

Dans notre étude, nous avons utilisée deux techniques : coloration à Hématéine-éosine (HE)

et coloration au rouge sirus.

La coloration au rouge sirus nous a permis de valider les observations obtenues grâce à la

coloration à l’HE et surtout de compter les cellules apoptotiques.

Du point de vue microscopique, le foie consiste en une myriade d’unités fonctionnelles

individuelles, traditionnellement appelés lobules. Chacun est limité par quatre ou cinq espaces

portes (irrigués par la veine porte et l’artère hépatique) et possède une veinule hépatique

terminale centrale appelés veine centrolobulaire.

La zone 1, la plus proche de l’espace porte, est celle qui est la mieux vascularisée et où les

échanges entre le sang et les hépatocytes sont les plus intenses. La zone 3 est la plus

défavorisée des trois régions car le sang qui lui est destiné doit traverser les deux précédentes.

Afin d’attribuer un score histologique (Kobayashi et al., 2001), plusieurs lésions élémentaires

ont été évaluées :

- La dégénérescence ballonisante discrète qui est une étape précoce de la nécrose

(vacuolisation du cytoplasme et ballonisation des organites).

- L’apoptose : soit en quantifiant le nombre absolu de cellules apoptotiques sur 10 champs

soit sous forme de rapport exprimé en pourcentage correspondant au nombre de cellules

apoptotiques X 100 / nombre de cellules totales et ceci dans 10 champ consécutifs. (Le

nombre de cellules totales par champ est en moyenne 250)

- La nécrose, présence ou absence

- L’infiltrat inflammatoire, intensité et type des cellules inflammatoires

48

• Exploration mitochondriale

Pour évaluer le fonctionnement mitochondrial, nous avons mesuré le contrôle respiratoire et

le rendement énergétique mitochondrial.

Le contrôle respiratoire est déterminé par l’évaluation des vitesses de consommation de

l’oxygène dans le milieu en présence et en absence d’ADP.

Le rendement énergétique est défini par P/O, c’est à dire le rapport de la quantité d’ADP

utilisée sur la quantité d’oxygène consommée pendant la synthèse d’ATP.

B- Interprétation des résultats :

Ce travail montre que le BHDP protège les cellules hépatiques des effets délétères de

l’ischémie dans deux modèles. Un modèle d’ischémie-reperfusion normothermique in vivo

dans lequel une ischémie est induite par clampage du hile hépatique chez le rat et suivie d’une

reperfusion de 30 ou de 120 min. Un modèle dans lequel des foies de rats isolés sont soumis à

une ischémie hypothermique (4°C, 24 h). Dans les deux protocoles, les concentrations de

transaminases plasmatiques ou dans liquide de conservation, la formation du métabolite de la

lidocaïne, les modifications histologiques et dans le premier protocole la synthèse

mitochondriale d’ATP mesurée après l’extraction des mitochondries, à la fin de la reperfusion

ont été mesurées.

Le BHDP administré in vivo préventivement ou au moment de l’incubation in vitro, limite

significativement les effets de l’ischémie-reperfusion normothermique et de l’ischémie

hypothermique.

Au cours de l’ischémie-reperfusion normothermique, le BHDP est très efficace lorsque le

temps de reperfusion est limité à 30 minutes : ses effets sont dose-dépendants, maximaux à 10

mg/kg pendant 3 jours.

Après 120 minutes de reperfusion, on observe que le BHDP est toujours efficace mais qu’il ne

l’est plus que partiellement ce qui indique que les hépatocytes subissent une dégradation

prolongée au cours de la reperfusion. Les dommages cellulaires se sont aggravés entre 30 et

120 minutes de reperfusion. Cette observation est conforme à celle d’autres auteurs lors de

l’ischémie-reperfusion rénale chez le Porc (Hauet, 1997). Les paramètres qui restent altérés ne

sont pas directement liés aux fonctions mitochondriales, ce sont les concentrations de

transaminases, témoins de l’intégrité des membranes hépatocytaires, la dégénérescence

cellulaire mesurée par la vacuolisation, le nombre de cellules apoptotiques et le métabolisme

de lidocaïne qui met en jeu les fonctions du réticulum endoplasmique. En revanche, on

49

observe que les fonctions mitochondriales, contrôle respiratoire et rendement de

phosphorylation (P/O) sont conservées dès l’administration d’une dose de 2,5 mg/kg/jour. On

peut en conclure que le BHDP protège intégralement les fonctions mitochondriales en

particulier la phosphorylation oxydative mais seulement partiellement les structures

cellulaires et leurs membranes. Ceci justifierait l’ajout au BHDP d’autres substances

d’impacts différents, membranaire, agents antiapoptotiques.…. pour obtenir une meilleure

protection (Morin, 2004).

L’étude des effets du BHDP dans l’ischémie hypothermique confirme globalement son rôle

protecteur. Il est dose-dépendant mais cependant moins intense qu’en normothermie, in vivo.

Il semble que l’on puisse rapporter cette différence quantitative d’activité à celles déjà

décrites des mécanismes physiopathologiques de l’ischémie lorsqu’elle survient en hypo ou

en normothermie.

En conclusion, ces résultats montrent que le BHDP développe :

- des effets antiischémiques à la fois in vivo et in vitro.

- que ceux-ci sont dus à des effets préférentiellement mitochondriaux,

- que la cytoprotection partielle qu’ils provoquent est essentiellement due à la

conservation de la synthèse d’ATP mitochondriale.

50

TROISIEME PARTIE

Discussion Générale

Nos travaux ont permis de montrer qu’il existe des récepteurs de type sigma, de sous type

sigma-1, sur les membranes externes mitochondriales de foie et de cerveau de Rat. Le BHDP

s’y fixe avec une grande affinité, l’une des plus grandes connues actuellement, de façon

sélective puisqu’il ne présente pas d’autres liaisons réceptorielles spécifiques significatives.

Le BHDP présente aussi des effets protecteurs vis à vis des lésions d’ischémie-reperfusion

hépatique dans différentes conditions expérimentales :

• En ischémie normothermique, il permet de réduire l’élévation des concentrations

plasmatiques des transaminases, de limiter les lésions histologiques aussi bien de type

apoptotique que nécrotique et enfin, de restaurer les capacités métaboliques du foie.

• En ischémie hypothermique, le BHDP maintient la qualité du foie 24 h après son

prélèvement, aussi bien sur les plans biochimique, histologique que fonctionnel.

• Sur les mitochondries de foie isolées d’un animal prétraité pendant 3 jours par le BHDP,

on observe une protection vis à vis des effets de l’ischémie-reperfusion. Il permet ainsi de

maintenir le contrôle respiratoire mitochondrial et le rendement de synthèse de l’ATP.

Tous ces effets sont dose-dépendants. En ischémie normothermique, l’effet sur les

mitochondries de foie prélevées sur des rats traités débute à la dose de 2,5 mg/kg/j en IP alors

que la protection globale hépatique n’est optimale qu’à 10 mg/kg/j en IP. En ischémie froide,

une concentration de 10 µg/ml dans le liquide de conservation donne la meilleure protection.

Les questions qui nous sont posées sont les suivantes :

Les récepteurs sigma interviennent-ils dans la protection cellulaire induite par le BHDP au

décours des états d’ischémie-reperfusion ?

Les récepteurs sigma sont présents dans de nombreux organes et plusieurs fonctions leur sont

attribuées notamment cytoprotectrice, mais sans que l'on puisse affirmer qu'il s'agisse d'un

effet propre à ces récepteurs. En effet, toutes les molécules antérieurement connues pour

interagir avec ces récepteurs possèdent également, à la différence du BHDP, des affinités

importantes pour d'autres récepteurs. Récemment, les récepteurs sigma-1 ont été impliqués

dans les processus de protection cellulaire, plusieurs de leurs ligands ayant démontré un effet

neuroprotecteur dans des modèles d'ischémie cérébrale. Mais des questions subsistent :

51

- Y a-t-il une relation directe entre la liaison du BHDP au récepteur sigma et le pouvoir

antiischémique ?

- Dans l’affirmative, l’effet protecteur des ligands sigma est-il du à une stimulation de ces

récepteurs (agoniste) ou au contraire à une inhibition (antagoniste) sachant que les

travaux antérieurs apportent des résultats opposés ? la protection étant observée soit avec

des molécules décrites comme étant agonistes ou antagonistes (Azzariti et al., 2006 ;

Vagnerova et al., 2006 ; Skuza et al., 2004 ; Colabufo et al., 2004).

- L’effet protecteur est-il lié à un sous type de récepteurs, sigma-1 ou sigma-2 ?

1- Les récepteurs sigma, leurs rôles physiologiques possibles.

En 1976, Martin et al., rapportent que les récepteurs sigma peuvent expliquer les actions du

(+/-)SKF 10.047 (N-allylnormétazocine) et des benzomorphanes racémiques apparentés.

Ces composés produisent chez le Chien des réactions comportementales diverses désignées

sous le nom de démence canine et provoquent également des effets psycholeptiques chez

l'Homme.

Des travaux complémentaires ont permis ensuite de conclure que (Quirion et al. 1987) :

• Le (+/-)SKF 10.047 se fixe sur des sites distincts : les récepteurs opiacés mu et kappa et

un site de fixation appelé récepteur sigma

• Le (-)SKF 10.047 se fixe principalement aux récepteurs opiacés mu et kappa

• Le (+)SKF 10.047 se fixe aux récepteurs de la phencyclidine et au récepteur sigma.

En fonction des ligands testés, les récepteurs sigma ont été successivement appelés récepteurs

sigma halopéridol-sensibles, récepteurs sigma étorphine-insensible, et récepteurs sigma

naloxone-insensible (Walker et al., 1988). Ainsi, les récepteurs sigma ont été considérés, à

l'origine, comme un sous-type de récepteur opiacé, mais les trois résultats suivants ont d'une

façon convaincante démontré que cette hypothèse était incorrecte :

(a) tandis que les récepteurs opiacés sont énantiosélectifs pour les isomères(-) des opiacés

et de leurs dérivés, les récepteurs sigma ont une énantiosélectivité inversée pour les

isomères(+).

(b) la naloxone se s’oppose pas aux effets des ligands sigma aussi bien in vitro qu’in vivo,

alors que c’est l’antagoniste de référence des opiacés.

52

(c) Différents opiacés et opioïdes ne se lient pas aux récepteurs sigma.

Par conséquent, le récepteur de sigma n'est pas un sous-type de récepteur opiacé.

Les récepteurs de sigma sont-ils identiques aux récepteurs de la phencyclidine ?

Le déplacement de la [3H]phencyclidine de ses sites de fixation par le ligand sigma (+)SKF

10.047 a laissé penser qu’ils se lient à un même récepteur. Pour cette raison, les récepteurs

sigma ont été parfois appelés « récepteurs sigma opiacé/phencyclidine ».

Cependant, les molécules qui inhibent la liaison du [3H](+)SKF 10.047 diffèrent de celles qui

déplacent la [3H]phencyclidine, prouvant que ces deux substances se lient à des récepteurs

différents :

Par exemple, des médicaments antipsychotiques (tel que l'halopéridol) déplacent [3H](+) SKF

10.047, mais n’ont aucun effet sur les liaisons de la [3H]phencyclidine. Réciproquement, la

phencyclidine n’est que faiblement antagoniste de la fixation de l'[3H]halopéridol.

Les récepteurs sigma et les récepteurs de la phencyclidine peuvent également être différenciés

par leurs distributions anatomiques distinctes. En effet, les liaisons du [3H](+)SKF 10.047 et

de la [3H] phencyclidine sont observées dans des régions différentes du cerveau.

D’autres différences ont été apportées par les travaux de Tam (1985).

- La liaison de la [3H]phencyclidine est sensible à la concentration de Na+, alors que la

fixation du [3H](+)SKF 10.047 l’est beaucoup moins

- Les récepteurs de la phencyclidine ont une faible affinité et pas de stéréoselectivité de

liaison pour le (+)SKF 10.047 (N-allylnormétazocine) et l’(+)éthylcétocyclazocine,

deux ligands sigma de la famille des cyclazocines.

Pris dans leur ensemble, ces résultats prouvent que le [3H](+)SKF 10.047 se fixe à deux sites

distincts : un site halopéridol-sensible, reconnu définitivement comme le récepteur sigma et

un site phencyclidine-sensible, désigné actuellement comme le récepteur de la phencyclidine.

En outre, bien qu’il ait été montré que les récepteurs sigma et les récepteurs kappa lient

certains opiacés, ils différent par la nature des stéréoisomères qu’ils fixent. En effet, les

récepteurs opiacés kappa lient préférentiellement les (-)benzomorphanes, alors que les

récepteurs sigma lient les (+)benzomorphanes comme le (+)SKF 10.047, la (+)pentazocine, la

(+)cyclazocine, et l’(+)éthylcétocyclazocine.

53

Par ailleurs, l'halopéridol possède une forte affinité pour les récepteurs sigma et se fixe à des

sites distincts de ceux classiquement décrits pour les opiacés et la phencyclidine. (Bartoszyk

et al., 1996 ; Ovalle et al., 2002). Dans notre travail, l’halopéridol déplace le [3H]BHDP au

niveau des synaptosomes avec une forte affinité (IC50 = 8,96 nM) avec un seul site de fixation

(nH = 0.95)

On distingue deux sous-types principaux de récepteurs sigma, sigma-1 et sigma-2 (Coccini et

al., 1999, revue récente par Azzariti et al., 2006). Les premiers ont une grande affinité pour

les isomères (+) des benzomorphanes et sont marqués par la (+)pentazocine. Les seconds ont

une stéréosélectivité moindre et sont marqués par la 1,3-di(2-tolyl)guanidine (DTG). La DTG

n’est que partiellement sélective puisqu’elle se fixe avec la même affinité sur les deux sous-

types (Bouchard et al., 1997, Skuza et al., 2006). Le BHDP est considéré comme un ligand

sigma-1 puisqu’il a une IC50 de 6,62 nM pour la [3H] (+)pentazocine alors qu’elle n’est que de

713 nM pour la [3H]DTG.

Les récepteurs sigma n’ont pas de réelles spécificités de reconnaissance structurale puisqu’ils

peuvent lier des molécules de structures très différentes comme la cocaïne, des inhibiteurs des

cytochromes P450, des antagonistes des canaux calciques, des antipsychotiques, des anti-

convulsivants et des stéroïdes. Parmi ces stéroïdes, la progestérone est considérée comme le

ligand endogène de ces récepteurs (Schwarz et al., 1989 ; McCann et al., 1994 ; Bergeron et

al., 1999 ; Silvers et al., 2006)

Il faut noter que la différenciation des deux sous-types est basée uniquement sur des

différences de liaison et qu’il ne semble pas qu’ils aient des effets pharmacologiques distincts.

Classiquement, les récepteurs sigma sont décrits dans de nombreux organes, principalement

dans le cerveau (observation initiale avec les opioïdes) mais aussi dans les principaux organes

périphériques comme le foie, le cœur, les reins, la rate, les intestins, les testicules et les

ovaires.

Ces récepteurs ont été décrits sur différentes membranes, cellulaires et microsomales

(DeHaven-Hudkins et al., 1994). D’autres auteurs suggèrent d’autres localisations sans

toutefois bien les préciser. D’ailleurs, la présence de récepteurs sigma au niveau de fractions

subcellulaires contenant des mitochondries a déjà été décrite (McCann et al., 1994 ; Ross,

1991). Il s’agissait de fractions enrichies en cet d’organite. Il n’a jamais été décrit, à notre

connaissance, d’étude sur des fractions purifiées. Notre travail permet de le faire en prouvant

la localisation de récepteurs sigma sur les membranes mitochondriales externes.

54

Figure 16 : Représentation schématique du récepteur sigma

(d’après Aydar et al., 2002)

Ce modèle contient deux segments transmembranaires. Les régions N et C-terminales sont

intracellulaires. Les deux lysines dans le récepteur sigma de cobaye sont indiquées par les

diamants fermés en noir. Chez le rat, le résidu 60 est une arginine, ainsi les seuls groupes

aminés primaires sont la lysine 142 et les acides aminés terminaux.

55

Un modèle théorique de la structure du récepteur sigma est montré sur la figure 16 (Aydar et

al., 2002). C’est un récepteur transmembranaire sans protéine G, à trois domaines

intracellulaires, le 3ème présentant le COOH terminal.

Le codage du gène du récepteur sigma-1 a montré qu’il est différent de toute autre classe de

récepteur connu (Hanner et al., 1996 ; Seth et al., 1997 ; Dunne et al., 2006). Ce gène code

une protéine de 25300 kDa. Le gène sigma-1 a été codé chez le Cobaye, la Souris, le Rat et

l’Homme (Kekuda et al., 1996). Ce gène contient quatre exons et trois introns. L’exon 3 est le

plus court (93 bp), et l'exon 4 est le plus long (1132 pb). Parmi les introns, l'intron 3 est le

plus long (1250 pb). Chez l'Homme, le gène du récepteur sigma-1 est situé sur le chromosome

9p13 (Prasard et al., 1998)

Afin de mieux étudier son rôle in vivo, des souris « knock-out » pour le récepteur sigma-1 ont

été produites (Langa et al., 2003). Il s’avère que ces souris sont viables et fertiles, et ne

montrent aucune différence phénotypique manifeste. Toutefois, elles présentent une

diminution significative de la réponse à un test d’hypermotricité qui se corrige lorsqu’elles

sont traitées par le SKF 10047. Ceci montre qu’il s’agit bien de souris dont le gène sigma-1 a

été délété. Récemment, il a été montré que ces souris présente une moindre sensibilité à la

douleur induite par la formaline (Cendan et al., 2005).

On décrit aux récepteurs sigma deux interactions cellulaires :

• La première avec différents canaux ioniques intracellulaires voltage dépendants.

Il a été bien démontré que les récepteurs sigma provoquent la transduction d’un signal

extracellulaire à l’intérieur de la cellule de façon particulière. Cette transduction ne

nécessite ni protéine G, ni ATP (Lupardus et al., 2000). Les récepteurs sigma sont

directement associés aux canaux K+ auxiliaires voltage-dépendants. Au niveau cardiaque,

l’activation des récepteurs sigma provoque l’inactivation de différents canaux, en

particulier les Kv 1.4 mais aussi Ca2+ et K+ dépendants (McKay et al., 2002 ; Aydar et al.,

2002 ; Claydon et al., 2004) et l’inhibition des récepteurs muscariniques. Les récepteurs

sigma interagissent aussi avec les canaux Kv 4.2 qui sont sensibles aux variations de l’O2

intracellulaire (Perez-Garcia, 1999) ce qui suggère leur intervention dans l’ischémie. Une

particularité de ces récepteurs est que leurs effets différent en présence ou en absence de

ligand (figure 17).

56

Le canal potassique Kv 1.4 permet le transfert

du K+ vers le milieu extracellulaire

La présence d’un récepteur sigma à coté du

Kv 1.4 augmente sa vitesse d’inactivation et

réduit ainsi le flux potassique

La fixation d’un ligand sigma (�) comme le

SKF 10047, la pentazocine ou la DTG

renforce la vitesse d’inactivation de Kv 1.4 et

réduit ainsi le flux potassique de 70 %

Figure 17 : Interaction entre le récepteur sigma et le canal potassique Kv 1.4

(figures propres à l'auteur)

57

Bien que ce système de transduction ne soit pas complètement validé, on admet

actuellement qu’il permet la diminution de l’activité des canaux ioniques voltage-

dépendants, que leurs effets sont localisés en des points précis de la cellule et que les

récepteurs sigma sont directement associés à ces canaux ioniques voltages-dépendants

avec des effets opposés en fonction des différents ligands sigma sans que l’on puisse

actuellement distinguer un agoniste d’un antagoniste.

• La seconde interaction est leurs liaisons au cholestérol.

Il a été démontré que les récepteurs sigma sont capables de lier le cholestérol par leur

extrémité COOH-terminale (Hayashi et al., 2003 ; Labit-Le Bouteiller et al., 1998). Il faut

rapprocher cette liaison du fait que ce récepteur n’a pas d’homologie structurale connue avec

d’autres protéines physiologiques sauf avec les ∆ stérol 8,7 isomérases qui curieusement dans

les levures (saccharomyces cerevisiae) interviennent dans la synthèse de l’ergostérol

(Moebius et al., 1997). Le traitement de cellules de levures avec le SR 31747, un ligand

sigma (Paul et al., 1998), conduit à l'accumulation de 8-stérols, par un blocage des 8,7-stérol

isomérases. La surexpression du gène ERG2 correspondant (codant pour la 8,7-stérol

isomérase) augmente la formation de 8-stérols. La délétion de ce gène ERG2 conduit à une

souche non viable en aérobiose. Lorsque des gènes correspondants sont exprimés dans une

souche de levure délétée à l'aide d'un plasmide centromérique et sous le contrôle du

promoteur du gène ERG2, la levure transformée retrouve la capacité de proliférer en

aérobiose et de synthétiser l'ergostérol, ce qui prouve que ces sites peuvent correspondre à une

8,7-stérol isomérase. L'analyse de la séquence de ce gène a révélé qu'elle est identique à 78%

à celle des sites de fixation sigma humains (Silve et al., 1996). La fonction 8,7 isomérase est

comparable à celle du cholestérol chez les mammifères. Récemment chez l'Homme, des

mutations des 8,7-stérol isomérases se sont avérées être associées au syndrome de Conradi-

Hünermann.

Le rôle des ligands sigma comme agents neuroprotecteurs a été largement étudié; au vu des

résultats sus-cités, Silve et al. (1997) supposent que le blocage de la synthèse du cholestérol

pourrait faciliter la neuroprotection contre la toxicité du glutamate.

58

Un effet cytoprotecteur est attribué aux récepteurs sigma :

Plusieurs molécules sélectives des récepteurs sigma ont montré un effet de neuroprotection

dans des modèles d’ischémie cérébrale chez le Rat et la Souris.

Bien que le mécanisme de cette protection soit encore discuté deux orientations mécanistiques

se distinguent :

• un effet cytoprotecteur direct des récepteurs sigma : Plusieurs hypothèses sont émises.

Il a été rapporté que les agonistes des récepteurs sigma agissent en réduisant la

production de NO par l'inhibition de l'oxyde nitrique synthétase inductible (Vagnerova

et al., 2006). D’autre auteurs ont rapporté que l'agoniste sélectif des récepteurs sigma-

1 et sigma-2, la DTG, peut augmenter la survie neuronale même lorsqu’il a été

administré 24 heures après un épisode ischémique (Ajmo et al., 2006).

• un effet cytoprotecteur indirect : cette hypothèse met l’accent sur le fait que l’action

neuroprotectrice n’est qu’un effet indirect des ligands sigma et que cette protection

passe par une action sur d’autres structures ou systèmes connus.

- le système hormonal cérébral :

Des récepteurs sigma sont trouvés dans beaucoup de structures cérébrales liées à des

fonctions endocrines. Par exemple la fixation importante des ligands sigma au

niveau des noyaux supra-optique et paraventriculaires dans l'hypothalamus suggère

que les récepteurs sigma participent à la régulation de la sécrétion de vasopressine

(et/ou la dynorphine). Une fixation importante a été également retrouvée au niveau

de l'adéno-hypophyse, suggérant l’intervention de ces récepteurs dans la régulation

de la secrétions des hormones pituitaires antérieures. Utilisant la [3H](+)- 3-PPP,

Jansen et al. (1990) ont montré des niveaux élevés de fixation aux récepteurs sigma

dans la glande pinéale de rat, ce qui lie encore plus les récepteurs sigma à la fonction

endocrinienne. La relation des récepteurs sigma à la fonction d'endocrine est encore

soutenue par leur présence dans les tissus périphériques endocriniens. Plusieurs

stéroïdes comprenant la progestérone, la prégnénolone, le prégnénolone sulfate, la

testostérone, le déhydroépiandrostérane sulfate, et l’estradiol-17 déplacent in vitro

des radioligands du récepteur sigma comme le [3H]SKF-10,047, le

[3H]dextromethorphan, le [3H]3-PPP, et l’[3H]halopéridol au niveau du cerveau de

rat, des splénocytes, et des microsomes hépatiques (Klein et Musacchio 1994 ; Mc-

Cann et Su 1991 ; Ross 1991 ; Schwarz et al. 1989 ; Su et al. 1988 ; Yamada et al.

59

1994). Maurice et al. (2004) considèrent que la progestérone est le ligand endogène

des récepteurs sigma.

- Le système dopaminergique :

Une autre hypothèse place les récepteurs sigma comme modulateur des autres

récepteurs et en particulier des récepteurs dopaminergiques. L'existence des

récepteurs sigma-1 sur les neurones dopaminergiques a été démontrée (Gundlach

et al. 1986) et des études électrophysiologiques ont prouvé que ces récepteurs sont

impliqués dans le régulation de l'activité neuronale des neurones dopaminergiques

du cerveau moyen (Bunney et al., 1984 ; Steinfels et Tam 1989). De plus, la

technique de microdialyse in vivo dans le cerveau a démontré que des ligands

sigma comme le (+)SKF 10.047 (Volonte et al., 1995) et la (+) pentazocine

(Patrick et al., 1993) augmentent la synthèse endogène de dopamine cérébrale chez

le Rat.

Toutes ces données pharmacologiques indiquent que très probablement, les récepteurs sigma

sont impliqués dans la résistance cellulaire à l’ischémie suivie ou non de reperfusion. Une

participation des récepteurs sigma-1 est logique puisque la plupart des molécules étudiées

sont leurs ligands comme l’est le BHDP.

2- Le BHDP : ligand sigma et cytoprotecteur :

Les récepteurs sigma ayant été impliqués dans des processus de protection cellulaire et nos

études expérimentales ayant montré que le BHDP présente une affinité élevée et une forte

sélectivité pour les récepteurs sigma-1, une importante composante de notre travail a consisté

à évaluer l’effet de cette molécule dans divers situations d’ischémie.

Un premier modèle de cultures d’astrocytes soumises à une hypoxie qui induit un épuisement

important en ATP, nous a permis de montrer que BHDP maintient la disponibilité de l’ATP

au niveau de la cellule de façon concentration-dépendante, un effet optimal étant obtenu à la

concentration de 10 µM.

Ce test a été choisi d'abord parce que le niveau d’ATP est un bon index de la capacité d'une

cellule de récupérer et deuxièmement parce que nous avions précédemment démontré la

présence du récepteur de sigma au niveau de la mitochondrie qui est le principal fournisseur

d’ATP dans la cellule. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus avec d’autres ligands

sigma-1 comme la (+)pentazocine et le SA4503 qui suppriment la neurotoxicité induite par

60

une hypoxie et une hypoglycémie dans des cultures neuronales primaires de rat (Nakazawa et

al., 1998). Bien que le mécanisme d'action du BHDP ne puisse pas être déduit de cette

expérience particulière, ces données renforcent l'hypothèse que les ligands sigma peuvent

avoir des effets cytoprotecteurs par une action directe au niveau des récepteurs sigma.

Deux modèles d’ischémie hépatique normothermique et hypothermique ont été réalisés. Dans

ces modèles, la privation en oxygène suivi ou non par une reperfusion est à l’origine de

l’élévation des transaminases, de l’apparition de nécrose et d’apoptose sur des coupes

histologiques et de l’altération des fonctions métaboliques hépatiques. Le prétraitement des

rats avec du BHDP pendant trois jours avant l’épisode ischémique réduit les lésions tissulaires

et les perturbations métaboliques hépatiques de façon dose-dépendante. Bien que la littérature

ne rapporte pas d’évaluation d’un ligand sigma dans un modèle d’ischémie-reperfusion

hépatique, les résultats de Lihmanov et al. (2000) sur un modèle proche d’ischémie

reperfusion cardiaque confortent nos résultats. En effet, ces auteurs rapportent que le

prétraitement des rats par un ligand sigma, le DuP 734 permet d’améliorer la tolérance du

cœur (in vivo et/ou après isolement) aux troubles de rythme occasionnés par un épisode d’I/R

La protection cellulaire que nous observons n’est que partielle mais elle est bien corrélée à la

protection des fonctions mitochondriales. Ceci indique que les mitochondries sont

probablement les principales cibles pharmacologiques du BHDP.

À la lumière de ces résultats, aussi bien in vivo, in vitro que sur des cultures cellulaires, il est

raisonnable de présumer que le BHDP protége la cellule en agissant sur les mitochondries.

Ayant auparavant montré la présence de récepteurs sigma au niveau de la mitochondrie, il est

légitime de poser la question suivante : l’effet antiischémique du BHDP est-t-il lié à sa

fixation au niveau des récepteurs sigma-1 mitochondriaux ?

3- L’effet antiischémique du BHDP est-il médié par les récepteurs sigma

mitochondriaux ?

Nos résultats ne permettent pas de répondre définitivement à cette question. Il existe des

arguments pour et contre la médiation sigma de l’effet antiischémique du BHDP.

Le BHDP protège de façon préférentielle les fonctions mitochondriales lors de l’ischémie-

reperfusion provoquée. Les résultats obtenus en ischémie normothermique montrent que les

61

parois cellulaires sont moins bien protégées (augmentation des transaminases), que les

mitochondries. Quantitativement, on observe que les mitochondries après isolement sont

protégées à des doses plus faibles, 2,5 mg/kg/j que celles nécessaires à une protection

cellulaire globale efficace, 10 mg/kg/j. Le fait qu’il existe aussi des récepteurs sigma sur les

membranes cellulaires suggère que le point d’impact principal du BHDP est mitochondrial

avant d’être la membrane cellulaire. D’autre part, il semble raisonnable de supposer que si la

synthèse d’ATP est conservée, il s’agit alors d’un facteur déterminant de la survie cellulaire

qui utilise des mécanismes ATP dépendants.

Si l’on admet le rôle des récepteurs sigma dans la prévention des lésions cellulaires de

l’ischémie-reperfusion, il apparaît que la seule liaison pharmacologiquement pertinente du

BHDP est celle aux récepteurs sigma-1. D’autre part, le BHDP n’a pas d’autres propriétés

pharmacologiques qui pourraient expliquer son action protectrice et notamment, il n’a aucune

action antioxydante (Zini et al., résultats non publiés). En d’autres termes, il n’existe pas

d’autre explication simple.

Ainsi, on peut avancer que l’action du BHDP au niveau des récepteurs sigma notamment

mitochondriaux peut constituer le mécanisme d’action de cette molécule dans la prévention

des lésions cellulaires de l’ischémie-reperfusion

Les arguments contre l’hypothèse de la médiation sigma-1 de l’effet antiischémique du BHDP

sont les suivants :

- La trimétazidine, dont la structure chimique est proche de celle du BHDP, ne se lie pas

aux récepteurs sigma mitochondriaux. Son action antiischémique s’exerce au niveau du

métabolisme cellulaire en favorisant l’utilisation du glucose au dépens des acides gras en

inhibant la β-oxydation, ce qui augmente le rendement énergétique de la cellule en

situation d’ischémie. On ne peut pas écarter un mécanisme de ce type pour le BHDP.

- Il n’est pas possible de définir si les effets antiischémiques des ligands sigma résultent

d’une activation ou d’une inhibition de ces récepteurs

- Ces récepteurs n’ont pas la classique spécificité de reconnaissance structurale décrite

habituellement. Leurs ligands sont nombreux et de structures variées c’est à dire non

spécifiques.

62

- On n’a pas jusqu’à présent la contre épreuve pharmacologique qui consisterait à inhiber

l’effet du BHDP par un antagoniste des récepteurs sigma-1, le NE-100 par exemple ou le

BD 1008.

En conclusion, bien qu’imparfaite la protection du foie par le BHDP contre les processus

d’ischémie reperfusion nous a permis de montrer un effet antiischémique intéressant de cette

molécule. Cette efficacité est retrouvée aussi bien en ischémie normothermique

qu’hypothermique. Elle est essentiellement mitochondriale.

Notre travail nous a également permis de montrer que le BHDP est un ligand très sélectif des

récepteurs sigma et que ces récepteurs sont présents sur la membrane externe de

mitochondries. Cependant, nos résultats ne nous permettent pas d’établir de façon certaine un

lien entre l’effet antiischémique observé et la fixation du BHDP sur ces récepteurs

mitochondriaux. De ce constat découle les principales perspectives à venir de ce travail. Il

s’agirait d’une part de déterminer le rôle exact de ces récepteurs sur les fonctions

mitochondriales et, d’autre part, de démontrer une relation entre l’effet protecteur de cette

substance et sa fixation au niveau de la mitochondrie.

Une première stratégie expérimentale consisterait à essayer de réverser l’effet protecteur du

BHDP en utilisant d’autres ligands sigma capables d’inhiber l’effet protecteur du BHDP. La

réalisation de ces expériences est pour le moment difficile car la notion d’agoniste et

d’antagoniste des récepteurs sigma est encore mal définie. Une seconde stratégie serait de

vérifier la persistance ou non de l’effet protecteur du BHDP lorsque les récepteurs sigma sont

absents. Ceci est possible soit en utilisant des protéines antisens des récepteurs sigma ou des

animaux dont le gène du récepteur sigma a été délété (souris « knock-out » pour le récepteur

sigma).

Ce travail laisse aussi entrevoir d’autres perspectives plus lointaines utilisant le BHDP comme

outil pharmacologique. Notamment il serait intéressant d’évaluer les propriétés

antiischémiques et la fixation aux récepteurs sigma de molécules structurellement proches du

BHDP afin de réaliser une réelle étude de structure-activité qui puisse permettre de mettre en

évidence un pharmacophore pour cette classe de molécules. Ceci pourrait servir de modèle

pour la conception de nouveaux médicaments antiischémiques.

63

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Le syndrome d’ischémie survient lorsque le débit sanguin d’un organe est fortement diminué, voire interrompu. D'où d’un défaut d’oxygène (hypoxie) entraînant une diminution de la respiration cellulaire puis de la synthèse d’ATP, une accumulation matricielle de Ca2+ puis une acidose métabolique. Lorsque l’ischémie peut être levée, le flux sanguin est rétabli mais les fonctions cellulaires initiales, physiologiques, ne le sont pas complètement. La chaîne respiratoire mitochondriale n’est plus immédiatement opérationnelle et l’apport brutal d’oxygène dans une cellule préalablement ischémiée provoque la génération souvent explosive d’espèces réactives de l’oxygène. Ainsi, la séquence de reperfusion lorsqu’elle survient entraîne d’autres désordres métaboliques qui s’ajoutent à ceux de l’ischémie. Cette succession de dommages entraîne rapidement la mort cellulaire. Elle explique la gravité du syndrome d’ischémie suivie de reperfusion (I/R). Le traitement du syndrome d’I/R est difficile car il faut traiter à la fois les conséquences de l’ischémie et de la reperfusion. L'objectif de cette étude est de limiter les effets délétères de l’I/R du foie dans les conditions d’une ischémie normothermique (ischémie chaude) suivie d’une reperfusion ou d’une ischémie hypothermique (ischémie froide) dans le cadre de la conservation des organes. La molécule cytoprotectrice potentielle que nous avons utilisée est le N-benzyl-N’(2-hydroxy-3,4-diméthoxybenzyl)pipérazine ou BHDP. Nous avons montré que le BHDP est un ligand spécifique des ligands sigma-1 et qu'il existe des récepteurs de type sigma 1 au niveau de la membrane externe des mitochondries des cellules hépatiques. En effet, le BHDP reconnaît un seul site de liaison mitochondriale de type sigma 1 dont le Kd est de 3,18 ± 0,055 nM et le Bmax de 2,17 ± 0,17 pmol/mg de protéine. Les effets pharmacologiques du BHDP dans deux modèles, l’un d’induction de l’expression de c-fos chez le Rat, l’autre de potentialisation de la toxicité de la cocaïne chez la Souris, sont comparables à ceux obtenus avec un agoniste sigma 1. L'évaluation de l’effet de cette molécule dans divers situations d’ischémie a montré que : - Sur un modèle de cultures d’astrocytes soumises à une hypoxie qui induit un épuisement

important en ATP, le BHDP maintient la disponibilité de l’ATP au niveau de la cellule de façon concentration-dépendante.

- Sur deux modèles d’ischémie hépatique normothermique et hypothermique, le prétraitement des rats avec du BHDP pendant trois jours avant l’épisode ischémique réduit les lésions tissulaires et les perturbations métaboliques hépatiques de façon dose-dépendante.

En conclusion, la protection cellulaire par le BHDP contre les processus d’ischémie reperfusion nous a permis de montrer un effet antiischémique intéressant de cette molécule. Bien que partielle, la protection obtenue est bien corrélée au maintien des fonctions mitochondriales. Ceci indique que les mitochondries seraient les principales cibles pharmacologiques du BHDP et que sa liaison aux récepteurs sigma 1 pourrait constituer le mécanisme d’action de cette molécule dans la prévention des lésions cellulaires de l’ischémie-reperfusion.

MMoottss--ccllééss :: Récepteurs sigma, Ligand sigma-1, Mitochondrie, Ischémie, Reperfusion, Antiischémique, Foie

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