M. ArchambaudLaboratoire Bactériologie-Hygiène

CHU Rangueil Toulouse

Méthodes d ’évaluation de l ’activité des antibiotiques in vitro

17 Mars-2009

"Toute substance chimique, élaborée par un microorganisme ou produit par synthèse, à coefficient chimothérapeutique élevé dont

l'activité se manifeste à très faible dose d'une manière spécifique, par l'inhibition de

certains processus vitaux, à l'égard des microorganismes."

Définition d'un antibiotique

Plus de 60 ans d’histoire 1897 : E. Duchesne « Concurrence vitale » Antagonisme entre

les moisissures et les microbes

1928 : Flemming découverte de la pénicilline G

1935 : découverte des sulfamides

1942 : utilisation de la pénicilline G en cliniqueaprès purification de la Pénicilline G par Florey et Chain

CMI : concentration minimale inhibitrice : plus petite concentration d’antibiotique qui inhibe toute culture visible d’une souche bactérienne après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l’effet bactériostatique d’un antibiotique.

.CMB : plus petite concentration d’antibiotique ne laissant subsister 0,01% ou moins de survivants de l’inoculum initial après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l’effet bactéricide d’un antibiotique

Méthodes d ’évaluation de l ’activité des antibiotiquesin vitro : CMI et CMB

CMI : détermination

CMI = 2 mg/l

Concentration d’antibiotiquesmg/l

Même inoculum bactérien10 6 bactéries/ml

Nombre de bactéries/ml

Temps en heures

témoin

2mg/l

4mg/l

8 mg/l

16 mg/l

32 mg/l

64 mg/l

bactériostase

bactéricidie

10 6 bact/mlInoculum initial

10 2 bact/ml< ou = 0,01% de survivants

CMI

CMB

Courbe de croissance en présence d’antibiotiques

Antibiotiques bactériostatiques - Antibiotiques bactéricidesSelon leur activité, les antibiotiques sont classés :

Antibiotiques bactériostatiquesCMB éloignée des CMI : CMB > 32 x CMI

les macrolides, tétracyclines, rifamycines, sulfamidesAntibiotiques bactéricides

CMB proches des CMI : CMB < 32 x CMIaminosides - β-lactamines - quinolones - glycopeptides

Tolérance :Certaines souches pourront être tolérantesvis à vis d'antibiotiques normalement bactéricides,si les CMB de ces antibiotiques s'éloignent des CMI

(>32 fois)

Antibiotique concentration ou temps dépendant

Antibiotiques concentration dépendantsl'activité bactéricide augmente avec la concentration d'antibiotique: et ont généralement une vitesse de bactéricidie rapide (les aminosides, les fluoroquinolones)L'obtention in vivo de concentration élevée semble déterminanteCette observation est à la base du mode d'administration proposé

dose journalière pour les ATB concentration dépendants

Antibiotiques temps dépendantsl'intensité de la bactéricidie est corrélée avec la duréependant laquelle la concentration dépasse la CMI :

ces antibiotiques sont les β-lactamines, les glycopeptides

Cette observation est à la base du mode d'administration proposédoses fractionnées, en continu pour les ATB temps dépendants

Mise en route d ’une antibiothérapieInfection documentée

Détermination du profil de sensibilité à différents antibiotiques de la ou des bactéries responsables de l ’infection

Antibiogramme

* détermine le profil de sensibilité d’une bactérie à un panel d’antibiotiques

* étudie ll’’activitactivitéé bactbactéériostatiqueriostatique des antibiotiques

* établit un lien avec les concentrations critiques qui déterminent les classes S, I, Rles classes S, I, R , prédictives du succès ou de l’échec thérapeutique.

Test prédictif et non descriptif : valeur relativeSon résultat est confronté aux résultats thérapeutiques

Antibiogramme : Test prédictif

Antibiogrammeen milieu solide par diffusion en milieu gélosé

Antibiotique : disque papier imprégné charge d’antibiotiqueformation d’un gradient de concentration autour du disque

Bactérie : inoculum bactérien calibré déposé à la surface d’une gélose (milieu standardisé Muller Hinton)

Incubation 37°C pendant 18 heures

Lecture : Images d’inhibition de la culture autour du disque

Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé

CMI

Gradient de concentration

Diamètre d’inhibition

Lecture d ’un antibiogramme par diffusion en milieu géloséMesure du diamètre d ’inhibitionRelation entre diamètre et CMI :courbe de concordance établie sur un grand nombre de souches

2

1,75

1,50

1,25

1

0,75

0,5

0,20,01 0,02 0,04 0,1 0,2 0,4 1 2 4 8 16

Lecture d ’un antibiogramme par diffusion en milieu gélosé

Détermination des concentrations critiques (et les diamètres critiques) : qui découlent de données pharmacologiques (concentrations sériques obtenues avec des posologies habituelles) et définissent les classes S, I, R, raisonnablement prédictives du succès ou de l ’échec thérapeutique

Valeurs données par des groupes experts nationaux , européens

Pour être efficace la concentration sérique d’un antibiotique doit être supérieure à la CMI

Lecture interprétative de l’antibiogramme en milieu gélosé

1disque d’antibiotique, une bactérie, un diamètre d’inhibition = S, I, R

La lecture doit être interprétative :mécanisme de résistance faiblement exprimé

Basée sur la reconnaissance des phénotypes de résistance naturelle ou acquise :

- lecture comparative pour plusieurs antibiotiques de la même famille

- règles d ’interprétation CASFM- systèmes expert : lecture couplée à la lecture des

diamètres par caméra

Antibiogramme en milieu liquideAutomatisation possibleLecture informatisée

Mesure de l ’activité bactériostatique en milieu liquide, -2 concentrations correspondantes aux concentrations critiques -plusieurs concentrations Lecture automatique de la croissance bactérienneCouplée à une informatique pour déterminer les classes S, I, R

Systèmes experts pour la reconnaissance des mécanismes de résistance:

-intégration des règles d ’interprétation dans la base de données-intégration de zones de CMI pour chaque phénotype de résistance

connu

Antibiogramme : réponse au clinicien

Liste des antibiotiques : DCI et noms commerciauxRéponse interprétée en S, I ou RMéthodologieCMI si possibleCommentaires :

phénotypes de résistance aux antibiotiques (Posologie moyenneCoût du traitement par molécule)

Signalement d’une BMR (bactérie multirésistante)Signalement CLIN résistance inhabituelle

(décret 2001-671)

en milieu gélosé :-méthode de référence, différentes dilutions incorporées dans boîte de gélose, plusieurs souches-à l ’unité : E Test, de réalisation facile,

en milieu liquide : systèmes automatisés

Intérêts :repérer les sensibilités diminuées :

ex Pneumocoque et ββββ-lactaminesStaphylocoques et teicoplanine

adapter les posologiescomparaison CMI - dosage sériquesituations où les données pharmacologiques (volume de distribution) sont perturbées

Détermination des CMI

E Test

CMI

Elle se base sur :- le site infectieux et les principales espèces bactériennes pouvant êtreresponsables

- les antécédents infectieux du patient - l'écologie du service si le patient est hospitalisé- le spectre des antibiotiques ( AMM, Vidal)

* Espèces habituellement sensibles :* Espèces modérément sensibles :* Espèces résistantes

- mise à jour régulière du spectre : évolution de la résistance-Des règles de consensus sont établies pour certaines infections : * site SPILF

Mise en route d ’une antibiothérapieInfection non documentée - Antibiothérapie probabiliste

Site SPILF : Conférences de consensus téléchargeable

Déterminé sur un grand nombre de souches,Histogramme des valeurs de CMI, Détermination des CMI50 et CMI90,

CMI 50 : la plus petite concentration d'la plus petite concentration d'ATBATB permettant permettant d'inhiber la d'inhiber la croissance de 50% des souchescroissance de 50% des souches d'une espd'une espèèce bactce bactéérienneriennemarqueur de la marqueur de la sensibilitsensibilitéé naturellenaturelle d'une espd'une espèèce ce àà un ATBun ATB

CMI90 : La plus petite concentration d'La plus petite concentration d'ATBATB permettant permettant d'inhiber la d'inhiber la croissance de 90% des souchescroissance de 90% des souches d'une espd'une espèèce bactce bactéérienneriennemarqueur de la rmarqueur de la réésistance acquisesistance acquise àà un ATB par une espun ATB par une espèèce bactce bactéériennerienne

Spectre des antibiotiques

3 Classes : dans le Vidal pharmacodynamie* Espèces habituellement sensibles :plus de 90% des souches sont sensibles * Espèces modérément sensibles :plus de 90% des souches se situent dans la zone intermédiaire* Espèces résistantesau moins 50% des souches sont résistantes

* Espèces inconstamment sensibles : la fréquence de résistance s’échelonne entre 10 et 50% et est mentionnée dans le vidal

Spectre des antibiotiquesListing de bactéries /3 classes

Espèces modéremment sensibles

Espèces habituellement sensibles

Espèces résistantes

Appréciation de l ’activité bactéricide des antibiotiquesseuls ou associés

Techniques sont basées sur des dénombrements des bactériessur inoculum de départ et après mise en contact avec une solution d ’antibiotique

ou une association d ’antibiotiques

au bout de 18 heures, en temps fixeCMB

en cinétique, en temps variableCourbes de bactéricidie

pour les associations :Courbes de bactéricidie

Techniques réservées à des laboratoires de recherche

Appréciation de l ’activité bactéricide des antibiotiquesseuls ou associés

Etablir des courbes de bactéricidie

Dosage des antibiotiquesAdaptation des posologies

contrôle de la toxicité : aminosides, glycopeptidescontrôle de l ’efficacité en comparaison aux CMI

Prélèvement :sur tube secmoment du prélèvement

au pic : 15 minutes si voie IV1 heure si voie IM3 heures si per os

à la vallée

Prescription fréquente pour glycopeptides et aminosides