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16/12/2005

IMMUNOLOGIE EN TS :

Utiliser les données numériques et les logicielslors des activités pratiques Monique DUPUIS, IA-IPR de SVT, Académie de Nantes

Extraction de travaux de différentes équipes INRP et de Jean-François MADRE (Académie d'Amiens).

SommaireObjectifsQuantifier un electrophorégramme avec Mesurim_proEtudier un anticorps avec RastopEtudier la formation des complexes immuns avec RastopComparer différents anticorps avec Rastop et AnagèneMesurer les différentes populations cellulaires avec WinMDI

Objectifs

Le chapitre d'immunologie du programme de terminale S ne présente pas beaucoup d'occasions d'effectuer desactivités pratiques "de paillasse". Les produits sont chers, les manipulations longues et parfois délicates, voireinterdites comme la réalisation de frottis sanguins. L'électrophorèse de plasma, le test Elisa ou celui d'Ouchterlonysont les rares manipulations qui viennent émailler les quatre semaines consacrées à ce chapitre. Heureusementl'utilisation de substituts du réel et les dispositifs d'acquisition numérique augmentent les occasions de rendre lesélèves actifs. Les quelques manipulations qui suivent sont insérées dans une progression qui comporte aussi desactivités de paillasse et l'utilisation de documents.

Quantifier un électrophorégramme avec Mesurim_pro

Le logiciel Mesurim Pro de Jean-François Madre est téléchargeablegratuitement sur le site del'académie d'Amiens.

Après l'installation une icônepermet d'ouvrir le logiciel.

http://www.ac-amiens.fr/pedagogie/svt/info/logiciels/Mesurim2/Index.htm

Voir également les travaux de Jean François MADRE sur le site de l'académied'Amiens

L'électrophorégramme est unetechnique élémentaire permettantde mettre en évidencel'augmentation de la quantitéd'anticorps plasmatiques.

Le logiciel mesurim_pro comportedans son stock d'images uneimage numérisée d'une banded'électrophorèse. Le fichiers'appelle plasma.jpg

Les commandes "Fichier" puis"Ouvrir" permettent d'afficherl'image.

On voit clairement que le dépôts'est effectué à droite et que lamigration a eu lieu de droite àgauche. Cela correspond à laplupart des diagrammes présentésdans les manuels et nous allonsgarder cette disposition. Un travailsur la signification des différentestaches peut déjà être fait par lesélèves.

Choisir l'outil "mesure" et tracer untrait selon la direction choisie sur lecliché.

Dans la liste déroulante des typesde mesure, choisir "Lumière surune bande". Dans la boîte deparamétrage qui s'ouvre alors,changer la largeur de la bande etchoisir "Mesure en absorption".

Le diagramme d'absorption de lalumière par l'électrophorégrammemontre plusieurs picscaractéristiques. De gauche àdroite les albumines puis lesglobulines alpha1, alpha2, beta etgamma.

En utilisant desélectrophorégrammespathologiques, on peut montrer quela présence d'un antigène (ici lescellules cancéreuses d'unmyélome) provoque uneaugmentation globale de laproduction des IgG.

Ici, il s'agit d'une cirrhose du foie.

Il serait très intéressant serait deposséder une banded'électrophorèse relative à unépisode grippal ou à une hépatitepour montrer quel type de réactionprovoque l'introduction d'un virusdans l'organisme.

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Etudier un anticorps avec Rastop

Rastop 2.03vf est la dernière version miseà la disposition des enseignantsgratuitement par l'INRP.

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/rastop/accueil.htm

Voir également les travaux sur Rastop sur le site de l'INRPLa seule condition est de s'enregistrerauprès du serveur et d'avoir une connexionassez rapide. Décompactez le fichierdirectement sur l'unité disque C, parexemple. Un répertoire rastopvf est crééautomatiquement mais il n'y a pas deprocédure d'installation proprement dite. Ilsuffit donc de créer un raccourci sur lebureau pour le programme "Rastop.exe"Rastop utilise des fichiers au format .pdb(protein data bank).

Pour les données de base, le plus simpleest d'utiliser les données de Rasmol mais ilest aussi possible d'utiliser les fichiers misà disposition par l'INRP ou les serveurs dedonnées .pdb.

Dans ce cas, le plus simple est de faire larequête <nom de la molécule> + .pdb dansle moteur de recherche de votre choix.

http://www.inrp.fr/Acces/Biogeo/model3d/data3d.htm

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/rastop/html/3D-DB.htm

Le fichier de molécule IGG-TOTAL.pdbcorrespondant à un d'anticorps circulantanti-lysozyme fait partie des fichiers de labanque de données initiale de Rasmol.

Il suffit de choisir le fichier IGGTOTAL.pdbpour voir apparaître la forme globale de lamolécule.

Le mode d'affichage par défaut montreuniquement les liaisons. Pour serapprocher des représentation usuelles enchimie, il est préférable d'afficher ensphères de Van der Waals avec le bouton :

Le résultat montre que chaque couleurcorrespond à un élément.

Le Carbone est en gris, l'Oxygène enrouge, l'Azote en bleu et le Souffre enjaune. On notera que l'Hydrogène n'est pasreprésenté.

La première approche de la molécule sefera par la mise en évidence des chaîneslourdes et légères.

Les chaines légères sont ici en jaune et envert tandis que les chaînes colorées enbleu correspondent aux chaînes lourdes.La partie en rouge correspond à un glucidequi n'entre pas dans le cadre de l'étude desanticorps en Terminale S.

Pour répondre à la question des liaisons quiassurent la cohésion des chaînes, il estnécessaire d'adopter un autre mode dereprésentation en utilisant lesconnaissances de première sur la structuredes protéines.

On fera donc successivement afficher lesquelette carboné,

puis effacer les atomes :

On remarquera que le glucide est effacé mais que la nature des liaisonsentre les chaînes reste mystérieuse.

L'affichage des ponts disulfures répond auproblème posé mais la notion de pontdisulfure est difficile à expliquer.

Le logiciel affiche les ponts disulfure avec beaucoup trop de discrétion.

Pour les mettre en évidence il est possiblede les colorer spécifiquement. L'utilisation

du bouton permet d'afficher unepalette de coloration.

Choisir "Ponts disulfures" dans la listedéroulante puis une couleur. Ils sont un peuplus visibles.

La sélection des seuls atomes de souffrese fait dans la liste déroulante la plus àgauche.

Une fois l'élément choisi, la sélection n'est

effective qu'en actionnant le bouton situé à droite.

Les atomes de souffre seront alors affichésen utilisant l'icône "Boules et Bâtonnets"

la sélection d'une couleur pour les atomesdans la palette termine la mise en évidencedes ponts disulfures.

A partir de cet affichage, il est possible deproduire un schéma de la moléculed'anticorps avant de passer à l'étude del'interaction avec les antigènes.

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Etudier la formation des complexes immuns avec Rastop

Le fichier IGG-LYS.PDB contient la représentation desextrémités des chaînes lourdes et légères (Le fragmentFAB) associées à l'antigène constitué par une moléculede lysozyme.

En utilisant l'affichage en sphère VDW

puis la coloration par chaîne

il est possible de distinguer l'antigène en rouge, l'extrémitéde la chaîne lourde en bleu et celle de la chaîne légère envert.

A ce stade, l'hypothèse d'une complémentarité géométrique peut être émise. Pour la vérifier nous allons utiliser lesfonctions de zoom et de coupe virtuelle.

En sélectionnant Trans/Zoom, les actions sur les curseurssont interprétées comme des translations selon l'un destrois axes. Cela permet de centrer l'observation sur lazone de contact entre anticoprs et antigène.

La fonction de coupe est commandée par un petit tableausitué en centre de la barre inférieure.

L'action sur le bouton de droite déplace un plan de coupevirtuel vers l'arrière de l'écran.

Cela permet de constater qu'il existe une complémentaritégéométrique en trois dimensions entre antigène etanticorps.

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Comparer différents anticorps avec Rastop et Anagène

L'étude des western blot commemoyens de dépistage de la séropositivitépose le problème de la diversité desanticorps fabriqués par l'organismeinfecté par le VIH. Les anticorps se lientspécifiquement à l'une des protéines dela bande.

Une hypothèse basée sur l'analogieavec l'interaction enzyme substrat vueen Première S peut être formulée parles élèves. Il s'agirait de différencesdans les séquences peptidiques desanticorps. Il est possible de poser leproblème en affichant aussi deux vuesde fragments FAB de complexesimmuns formés avec différentesprotéines du VIH.

Ces ressources sont disponibles sur le site de l'INRP à l'adresse :

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/immuno/html/telechar.htm

Il faut ensuite télécharger le fichier IGG-SIDA-3D.zip pour rastop et igg-vih-8seq.edi pour les données "Anagène" correspondantes.

Le fichier Zip sera décompressé dans le dossier adéquat. 8 fichiers auformat pdb présentent des fragments FAB soit seuls soit associés à unantigène du VIH.

Ouvrir une nouvelle fenêtre dans rastop.

Ouvrir dans cette fenêtre le fichierACY_gp120.pdb

En utilisant le bouton afficherl'ensemble de la molécule en sphère deVan der Waals. Il est souhaitableensuite de colorer les atomes parchaînes.

On voit ici que le fragement FABcorrespond à un anticorps associé à laGP120

Pour avoir des informations sur lamolécule utiliser la commande :

Faire à nouveau les commandes pourune nouvelle fenêtre et l'ouverture d'unnouveau fichier.

1E6J correspond à un anticorps contrela P24.

Le bouton permet d'afficher lesdeux fenêtres côte à côte.

En cliquant sur chaque partie de lamolécule, il est possible d'afficher lenom de la chaîne pointée

Il s'agit ici de la chaîne H qui colorée enbleu alors que la chaîne légère (L) esten vert et que l'antigène est en rouge(P)

Le logiciel anagène distribué par l'INRPva servir à vérifier la validité del'hypothèse formulée au début del'activité. Il permet de comparer lesséquences de différentes protéines.

Les séquences sont dans le fichier igg-vih-8seq.edi

Toutes les chaînes sont affichées sansconsidération d'alignement.

Pour que les bases de la comparaisonsoient valides il convient de ne comparerque des chaînes de même type. A l'aidede la souris il faut mettre les quatrechaînes H en surbrillance puis utiliser

l'outil de comparaison en faisant lechoix de la comparaison avecdiscontinuité.

La première ligne de la fenêtre de comparaison indique par des étoiles les identités totales et par des points lesidentités partielles. Cliquer sur la règle pour afficher les numéros des acides aminés. On remarque qu'au début desséquences ces identités sont très rares. Les identités deviennent trèsimportantes à partir de l'acide aminé 118pour la chaîne lourde.

Les élèves noteront que la partievariable des fragments FAB se trouvententre 1 et 118 pour la chaîne lourde.

Il est possible à ce stade de faire mettreen évidence des parties hypervariablesoù les identités sont inexistantes. Onnotera les numéros de la même façon.

On fera ce travail aussi sur les chaîneslégères.Pour localiser les zones variables desfragments FAB dans rastop nous allonschanger le mode de représentation desprotéines de l'anticorps. Poursélectionner la chaîne lourde, utiliser le

bouton et taper *H dans la ligne desélection.

La fenêtre inférieure indique le nombred'atomes sélectionnés. Pour afficher lapartie sélectionnée en ruban, utiliser lacommande spécifique. Cela ne suffitpas car il faut aussi faire disparaîtrel'affichage des atomes.

La chaîne lourde apparaît en squelettecarboné. Faire de même pour la chaînelégère et utilisant cette fois *L.

Pour sélectionner la zone variable,l'expression change. Il faut faireattention à laisser des espaces entre lesdifférentes parties de l'expression.

Il s'agit ici de sélectionner les acidesaminés 1 à 112 de la chaîne légère.

Une fois la sélection réalisée, onutilisera la représentation en sphère

pour mettre en évidence lesatomes sélectionnés.

Ici les 112 premiers acides aminés de lachaîne légère sont effectivement ceuxqui sont les plus proches de l'antigène.

Le même travail sera réalisé sur lachaîne lourde.

Si le travail porte sur les parties hypervariables, la proximité entre cesatomes et ceux de l'antigène est évidente.

Le problème de l'origine de la variabilité des anticoprs pourra alors êtreposé.

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Mesurer les différentes populations cellulaires avec WinMDI

Il est classique de faire utiliser une courbemontrant l'évolution des populations delymphocytes au cours de l'infection par le VIH.La question de techniques qui permettent lescomptages est souvent posée par les élèves.Les manipulations proposées ci-dessousutilisent WinMDI, un logiciel pemettant detraiter les résultats de comptages réalisés parcytométrie de flux.

Les cellules extraites d'une prise de sang sontmarquées par des substances fluorescentesliées à des anticorps dirigés contre lesmolécules CD. A chaque molécule anti-CD estliée une substance fluorescente de couleurdifférente. Les cellules sont alors amenées àcirculer dans un tube très fin qui n'en laissepasser qu'une seule à la fois. Elles passentdevant des stimulateurs et des détecteurs defluorescence spécifiques des longeurs d'ondesémises. Chaque passage de cellule estdétecté par la fluorescence émise, incrémenteun compteur et enregistre le niveau defluorescence correspondant à la cellule.

Le logiciel WinMDI est téléchargeable sur le site :

Scripps Research Institute

Les données cytométriques correspondent au fichierhiv-cyto.zip, disponible sur la page :

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/immuno/html/telechar.htm

Des informations supplémentaires sur les fichiers sont disponiblessur la page :

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/immuno/html/ressourc.htm

Voir aussi les pages spécifiques sur le serveur de l''INRP

L'installation du logiciel et des données se faitde façon classique .

Un clic sur l'icône provoque l'ouverture dulogiciel.

Une fenêtre propose le type de représentationà utiliser. Il faut choisir dotplot pour pouvoircaractériser les lymphocytes T4 ou T8 pardeux paramètres cytométriques.

Le fichier C05220.570 correspond à unepersonne non infectée.

Les fichiers L05220.341 à un maladeasymptomatique et H05220.629 à un SIDAdéclaré.

Le paramétrage du diagramme est la phase laplus délicate. Il repose sur quelquesconnaissances essentielles concernant lesmarqueurs membranaires des lymphocytes :

Tous les lymphocytes possèdent le marqueurCD3,-les marqueurs CD4 sont spécifiques deslymphocytes T4.

Il faut donc choisir comme variable X les CD3et comme Y les CD4.

Il faut aussi cocher les cases selon le modèleci-contre.

En cliquant sur OK, on voit apparaître undiagramme où chaque point représente unecellule. On voit nettement que plusieurspopulations cellulaires sont présentes dansl'échantillon.

Les mesures de fluorescences sont telles quetoute fluorescence inférieure à 10² estconsidérée comme non significative.Autrement dit, seules les cellules présentantune fluorescence supérieure à 10² pour lesCD3 et CD4 pourront être considérées commedes lymphocytes T4.

Nous voyons effectivement une populationprésentant ces caractéristiques.

Une approche semi quantitative estmaintenant possible.

Pour ouvrir une seconde fenêtre il faut utiliser la commande .Cela permet d'ouvrir un second fichier avec les mêmes caractéristiques de représentation que la première. Ilfaudra faire de même pour le troisième fichier.

On voit ici successivement les diagrammes des sujets sain, infecté asymptomatique et malade. La population deslymphocytes T4 a fortement diminué chez ce dernier.

Il s'agit maintenant de dénombrer leslymphocytes T4. En cliquant avec le boutongauche de la souris sur le graphique, onaffiche un menu contextuel dans lequel il fautchoisir "Regions".

La boîte de dialogue permet de créer unepremière région.

Le pointeur adopte la forme d'une croix etpermet de définir un polygone par des clicssuccessifs.

Il est important de délimiter au plus près legroupe de cellules à mesurer.

Un petit panneau de contrôle permet de validerla sélection.

Pour afficher la sélection, revenir au menucontextuel et choisir "Stats"

En consultant les valeurs numériques onconstate que les lymphocytes T4 représentent928 cellules dans l'échantillon de sang.

Il est préférable de ne pas utiliser lespourcentages car le nombre total deLymphocytes T n'est pas stable dans le tempsdans une infection par le VIH.

Le même travail devra être entrepris sur lesdeux autres diagrammes.

Le paramètre utilisé par les médecins n'estpas le nombre de T4 mais le rapport T4/T8. Ilfaut donc modifier la variable affichée en Ypour pouvoir mettre en évidence les cellulesporteuses de CD8. Cela se fait par le menucontextuel en activant "Format".

Il faut alors simplement modifier la variable Y.

En utilisant le protocole ci-dessus, il sera ainsi possible dedénombrer les T8.

On fera les mêmes manipulations pour les deux autresdiagrammes. L'évolution du rapport T4/T8 pourra ainsi êtreétudiée.

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Travail mis en page pour son utilisation dans une session de préparation à l'agrégation interne de SVT parFrançois CORDELLIER, Professeur de SVT au lycée Jean Perrin de Rezé

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