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IMAGEN™ Respiratory Syncytial Virus (RSV)

K6102

50

A direct immunofluorescence test for the detection of Respiratory Syncytial Virus (RSV).

For all enquiries please contact your local DakoCytomation subsidiary or distributor. Pour toute information, veuillez contacter votre filiale ou votre distributeur local(e) DakoCytomation. Anfragen jeder Art richten Sie bitte an die für Sie zuständige DakoCytomation-Niederlassung oder an Ihren Händler.

Test pour la détection du Virus Respiratoire Syncytial par immunofluorescence directe. Direkter Immunfluoreszenztest zum Nachweis des Respiratory Syncytial Virus.

Manufactured by/Fabriqué par/Hersteller: DakoCytomation Ltd Denmark House Angel Drove Ely Cambridgeshire, CB7 4ET United Kingdom/Royaume Uni/Großbritannien Telephone: +44 1353 669911 Fax: +44 1353 668989 IM

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1 INTENDED USE The IMAGEN™ Respiratory Syncytial Virus (RSV) test is a qualitative immunofluorescence test for the direct detection of RSV in clinical specimens. 2 SUMMARY Respiratory Syncytial Virus is an enveloped, spherical, RNA virus of the family Paramyxoviridae and is classified in the genus Pneumovirus. This genus has four members: human RSV, bovine RSV, pneumonia virus of mice and turkey rhinotracheitis virus1,2. RSV is the major cause of lower respiratory tract disease in infants and young children causing seasonal epidemics of respiratory illness each year3,4. RSV is spread by virus-laden droplets of respiratory secretions from infected individuals. Infection may manifest as a variety of symptoms, ranging from rhinitis to pneumonia, which are influenced by factors such as the age, sex and socio-economic background of infected individuals5. Approximately 50% of infants infected during the first year of life may develop lower respiratory tract illness involving bronchitis, bronchiolitis, bronchopneumonia and croup which may require hospitalisation6. Infants with underlying complications such as congenital heart disease, bronchopulmonary dysplasia and congenital or other immunodeficiencies may be susceptible to severe, sometimes life threatening, infection with RSV7,8. Recurrent less severe infections occur in all age groups, occasionally resulting in pneumonia in children and the elderly9,10. Co-infections of RSV with other micro-organisms may result in increased severity of respiratory disease9,11,12. Outbreaks in geriatric wards have been associated with considerable morbidity and occasional mortality. Nosocomial transmission of RSV occurs in paediatric wards and nursery units resulting in prolonged hospitalisation and treatment of infected children13,14,15,16,17,18. The laboratory diagnosis of RSV plays an important role in patient management and assists in the control of outbreaks15,16,17,19. Methods commonly employed for laboratory diagnosis of RSV infection include direct detection of virus or viral proteins in clinical samples such as nasopharyngeal aspirates and isolation of viable virus in cell culture monolayers inoculated with respiratory secretions20,21. Isolation of RSV from clinical specimens can be accomplished in continuous cell lines such as HeLa and Hep2 cells in which a characteristic cytopathic effect (CPE), formation of syncytia, may develop. Successful diagnosis by virus isolation is time consuming and may require from 5 to 20 days for characteristic CPE to develop. Isolation of RSV is complicated by the lability of the virus and the insensitivity of some cell cultures22. Cell culture techniques are costly, laborious and inappropriate for the rapid diagnosis of RSV infections. A direct immunofluorescence test utilising specific monoclonal antibodies offers a rapid, sensitive and specific method for direct detection of RSV in clinical samples such as nasopharyngeal aspirates. IMAGEN™ RSV is a direct immunofluorescence test for the rapid detection and identification of RSV in human clinical specimens. The test utilises three monoclonal antibodies in order to detect specific structural proteins expressed in all strains of human Respiratory Syncytial Virus.

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3 PRINCIPLE OF THE TEST The IMAGEN™ RSV test contains monoclonal antibodies conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC). The conjugated antibodies bind specifically to viral antigens present in all strains of human RSV. The reagent is used in a one-step direct immunofluorescence technique. Specimens are incubated with the reagent containing FITC conjugated antibodies for 15 minutes, then excess reagent is washed off with phosphate buffered saline (PBS). The stained area is mounted and viewed microscopically using epi-fluorescent illumination. If RSV antigen is present, characteristic bright granular apple-green fluorescence is seen within infected cells, which contrasts with the red background staining of uninfected cells. Acknowledgement The monoclonal antibodies used in this test were produced in The Institute for Research on Animal Diseases, Compton, Berkshire, United Kingdom. 4 DEFINITIONS The following symbols and definitions are in accordance with ISO 15223 and EN 980 and have been used in the product information.

Product code and catalogue number. Consult the instructions for use. N Contains sufficient for <N> tests.

Manufactured by. In vitro diagnostic medical device.

Use by.

Batch Code.

Storage temperature limitations. 5 REAGENTS PROVIDED

50 - Each kit contains sufficient materials for 50 direct specimens or cell culture preparations. - The shelf life of the kit is as indicated on the outer box label. 5.1 IMAGEN™ RSV REAGENT

One Instructions for Use Booklet.

2 x 1 well positive control slide containing acetone-fixed human epithelial cells (Hep2) infected with RSV.

One bottle of each of the following:

3mL of mounting fluid. The mounting fluid contains a photobleaching inhibitor in a glycerol solution (pH 10.0)

1.4mL of IMAGEN™ RSV reagent. The reagent consists of a mixture of purified murine monoclonal antibodies specific to RSV and conjugated to FITC. The monoclonal antibodies are directed against the Fusion protein and Nucleoprotein of RSV.

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5.2 PREPARATION, STORAGE AND RE-USE OF KIT COMPONENTS In order to ensure optimal kit performance it is important that unused kit components are stored according to the following instructions: 5.3 POSITIVE CONTROL SLIDES - The slides are provided individually in sealed foil pouches with nitrogen. Store unused slides at 2-8 °C. The slide should be left for 5 minutes at room temperature (15-30 °C) before opening. Stain the slide immediately after opening. 5.4 MOUNTING FLUID - Ready to use. Store unused mounting fluid at 2-8 °C. The mounting fluid should be left at room temperature (15-30 °C) for 5 minutes before use. 5.5 REAGENT - Ready to use. Store unused reagent in the dark at 2-8 °C. Reagent should be left at room temperature (15-30 °C) for 5 minutes before use. 6 ADDITIONAL REAGENTS 6.1 REAGENTS Fresh acetone (for fixation). Phosphated buffered saline (PBS) pH 7.5 for washing stained specimens and for specimen preparation. 6.2 ACCESSORIES The following products are intended for use in conjunction with IMAGEN™ RSV. Contact your local DakoCytomation subsidiary or distributor for further information. Teflon coated glass microscope slides with single 6mm diameter well (100 slides per box) available from your local DakoCytomation subsidiary or distributor, (Code No. S6114). Positive Control Slide (Code No. S6108). 7 EQUIPMENT The following equipment is required: Precision pipette and disposable tips to deliver 25µL. Wash bath. Coverslips suitable to cover 6mm diameter well. Non-fluorescing immersion oil.

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Epifluorescence microscope with filter system for FITC (maximum excitation wavelength 490nm, mean emission wavelength 520nm) and x200-x400 magnification. Incubator at 37 oC. Low speed centrifuge. For Direct Specimens Mucus extractor (nasopharyngeal specimens only). 8 PRECAUTIONS

- For in vitro diagnostic use. Anyone performing an assay with this product must be trained in its use and must be experienced in laboratory procedures. 8.1 SAFETY PRECAUTIONS 8.1.1 The IMAGEN™ RSV reagent contains 15mmol/L sodium azide, which is a poison. Sodium azide may react with copper and lead plumbing systems to form explosive metal azides. Always dispose of materials containing azide by flushing with large quantities of water. 8.1.2 RSV on the positive control slide has been shown to be non-infectious in cell culture, however, the slide should be handled and disposed of as though potentially infectious. 8.1.3 Evans blue dye is present in the reagent. This may be carcinogenic and contact with the skin should be avoided. 8.1.4 Care should be taken when using the mounting fluid as it may cause skin irritation. Skin should be flushed with water if contact occurs. 8.1.5 Do not eat, drink, smoke, store or prepare foods or apply cosmetics within the designated work area. 8.1.6 Do not pipette materials by mouth. 8.1.7 Wear disposable gloves while handling clinical specimens and infected cells and always wash hands after working with infectious materials. 8.1.8 Dispose of all clinical samples in accordance with local legislation. 8.1.9 Safety data sheet available for professional user on request. 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS 8.2.1 Components must not be used after the expiry date printed on the labels. Do not mix different batch lots of reagents. 8.2.2 The reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance will be adversely affected if the reagents are stored under conditions as detailed in Section 5. 8.2.3 Prepare fresh Phosphate Buffered Saline (PBS) as required on the day of use. 8.2.4 Avoid microbial contamination of reagents. 8.2.5 The reagents must not be frozen.

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9 COLLECTION AND PREPARATION OF SPECIMENS22 The collection and preparation of specimens is of fundamental importance in the diagnosis of RSV by direct immunofluorescence and cell culture methods. Specimens must be collected from the site of infection during peak time of viral shredding and be prepared in such a way as to preserve intact cells which are free from adherent mucus. The recommended respiratory sample is nasopharyngeal aspirate which, when correctly collected, should provide large numbers of respiratory epithelial cells. 9.1 NASOPHYARYNGEAL ASPIRATES/SECRETIONS Collection Collect secretions from the nasopharyngeal region into a mucus extractor through a size 8 feeding tube. The mucus extractor and tubing should be sent to the laboratory as soon as possible for processing. Cell separation techniques are necessary for direct immunofluorescence staining. Specimen or supernatant material from cell separation techniques may be used for virus culture inoculation. Cell Separation If necessary add 2mL phosphate buffered saline (PBS) to the specimen prior to centrifugation to reduce the viscosity and dilute the mucus. Centrifuge the mucus extractor at room temperature (15-30 °C) for 10 minutes at 380g. Remove the supernatant which can be used for cell culture. Suspend the cell deposit in 2mL PBS and gently pipette the cells up and down with a wide bore pipette, or vortex gently, until the mucus is broken up and cellular material released. Avoid vigorous pipetting/vortexing to prevent damage to the cells. When a smooth suspension has been obtained add further PBS as required, pipetting or vortexing after addition of the extra volume to wash the cells further. Remove and discard any visible flecks of mucus remaining at this point. Excess mucus must be removed as it will prevent adequate penetration of the reagent and may result in non-specific fluorescence. If all secretions remain in the feeding tube and none reach the mucus extractor, wash all secretions out of the tube into PBS. This is best achieved by inserting a pasteur pipette into the end of the tube which was attached to the mucus extractor. Suck up the appropriate fluid into the tube and expel it repeatedly until the secretions adhering to the wall of the tube have been dislodged. Pipette the suspension up and down until the mucus has been adequately broken up. Preparation of Slides After completing the cell separation process, centrifuge the resultant cell suspension at room temperature (15-30 °C) for 10 minutes at 380g and discard the supernatant. Resuspend the cell deposit in sufficient PBS to dilute any remaining mucus while at the same time maintaining a high cell density. Place 25µL of the resuspended cell deposit into the well area on the slide. Allow the specimen to air dry thoroughly at room temperature (15-30 °C) and fix in fresh acetone at room temperature (15-30 °C) for 10 minutes. If the specimen is not stained immediately store at 4 °C overnight or freeze at -20 °C for longer storage periods. 10 TEST PROCEDURE PLEASE REFER TO SECTION 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS BEFORE PERFORMING TEST PROCEDURE. 10.1 ADDITION OF REAGENT Add 25µL of IMAGEN™ RSV reagent to the fixed cell preparation on the slide (see Section 9) or to a positive control slide. Ensure that the reagent covers the entire well area.

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10.2 FIRST INCUBATION Incubate the slides with reagent in a moist chamber for 15 minutes at 37 °C. Do not allow the reagent to dry on the specimen, as this will cause the appearance of non-specific staining. 10.2 WASHING THE SLIDE Wash off excess reagent with phosphate buffered saline (PBS) then gently wash the slide in an agitating bath containing PBS for 5 minutes. Drain off PBS and allow the slide to air dry at room temperature (15-30 °C). 10.3 ADDITION OF MOUNTING FLUID Add one drop of IMAGEN™ RSV mounting fluid to the centre of each well and place a coverslip over the mounting fluid and specimen ensuring that no air bubbles are trapped. 10.4 READING THE SLIDE Examine the entire well containing the stained specimen using an epifluorescence microscope. Fluorescence (see Section 11) should be visible at x200-x500 magnification. (For best results specimens should be read immediately after staining, but specimens may be stored at 2-8 °C in the dark for up to 72 hours). 11 INTERPRETATION OF TEST RESULTS 11.1 CONTROLS 11.1.1 Positive Control Slides When stained and viewed (see Section 10) the control slide should show cells with apple-green fluorescent intracellular cytoplasmic granules contrasting against a red background of counterstained specimen. These cells are slightly larger than respiratory epithelial cells but show similar cytoplasmic fluorescence when infected with RSV. Positive control slides should be used to check that the staining procedure has been satisfactorily performed. 11.1.2 Negative Control If a negative control is required, uninfected intact cells of the type used for the culture and isolation of RSV are recommended. The cells should be prepared, fixed and stained (see Section 10). 11.2 CLINICAL SPECIMENS 11.2.1 Appearance of RSV Infected cells Apple-green fluorescent intracellular cytoplasmic granules are seen in respiratory epithelial cells infected with RSV. In Iater stages of infection, RSV antigen may be restricted to isolated areas in the cytoplasm appearing as small ill-defined granules singly or in clusters. Uninfected cells stain red with the evans blue counterstain.

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11.2.2 Interpretation A positive diagnosis is made when one or more cells show typical fluorescence in the fixed, stained specimen. A negative diagnosis is made when fixed stained specimens do not exhibit fluorescence after staining with the reagent. For directly stained nasopharyngeal aspirate specimens at least 20 uninfected respiratory epithelial cells must be visible within the slide well before a negative result is reported (see Section 11.2.3 if insufficient cells are present). 11.2.3 Insufficient cells If insufficient cells are present in the slide well preparation, the remainder of the clincial specimen should be centrifuged at 380g for 10 minutes at room temperature (15-30 °C). Resuspend the cells in a smaller volume of PBS before redistribution (25µL) on the slide. Alternatively, a repeat specimen should be requested. 12 PERFORMANCE LIMITATIONS 12.1 The FITC reagent may non-specifically stain Staphylococcus aureus strains containing large amounts of protein A. This is due to non-immune interaction of protein A with the Fc region of the monoclonal antibody, an observation reported for other monoclonal and polyclonal based fluorescent assays23. However, this staining does not give the typical intracellular fluorescence pattern seen in cells infected with RSV (see Section 11.2.1) and should be interpreted as non-specific staining. 12.2 Use only the mounting fluid provided. 12.3 The visual appearance of the fluorescence image obtained may vary due to the type of microscope and light source used. 12.4 It is recommended that 25µL of reagent is used to cover a 6mm well area. A reduction in this volume may lead to difficulties in covering the specimen area and may reduce sensitivity. 12.5 All reagents are provided at fixed working concentrations. Test performance may be affected if the reagents are modified in any way or not stored under the recommended conditions as outlined in Section 5. 12.6 Failure to detect RSV may be a result of factors such as collection of specimen at an inappropriate time of the disease, improper sampling and/or handling of specimen, failure of cell culture etc. A negative result does not exclude the possibility of RSV infection. 12.7 The presence of RSV in nasopharyngeal secretions does not necessarily exclude the possibility of concomitant infection with other pathogens9,12. Test results should be interpreted in conjunction with information available from epidemiological studies, clinical diagnosis of the patient and other diagnostic procedures. 12.8 Test results should be interpreted in conjunction with information available from epidemiological studies, clinical assessment of the patient and other diagnostic procedures.

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13 EXPECTED VALUES The detection rate for RSV is influenced by the time of specimen collection and the handling, storage and transportation of specimens. It is also dependent on age, general health, geographical location and socio-economic status of the population tested. Respiratory syncytial viruses are prevalent throughout the world and are associated with significant seasonal respiratory tract infections in temperate and tropical regions. In temperate climates annual outbreaks of RSV infection occur predominantly during winter months. Lower respiratory tract infections are generally higher during these periods and RSV accounts for 20% of respiratory tract infections. Therefore, during seasonal outbreaks, a significant number of nasopharyngeal aspirates can be expected to be positive for RSV. RSV infections occur in all age groups but the symptoms are most severe in infants. 50% of all infants experience RSV infection during the first year of life. RSV has been implicated in outbreaks of respiratory tract infection in hospitals, particularly paediatric wards and in geriatric institutions where it has been associated with increased morbidity and mortality. 14 SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS 14.1 CLINICAL TRIALS The IMAGEN™ RSV test was evaluated in two clinical trial centres on nasopharyngeal secretions from hospitalised infants showing symptoms of respiratory infection. Trial centre 1 tested 305 specimens collected during the 1982-83 and the 1983-84 winter epidemics by IMAGEN™ RSV test and the centre's standard RSV diagnostic test (virus isolation in HeLa cell culture monolayers and indirect bovine polyclonal immunofluorescence). A result was considered positive if either indirect bovine polyclonal fluorescence or cell culture culture was positive. In 8 specimens, in which indirect fluorescence gave non-specific binding, a diagnosis was made solely on the cell culture result. Trial centre 2 tested 200 specimens collected during the 1983/84 winter epidemic and 50 known positive specimens collected during epidemics occuring in the previous 5 years by IMAGEN™ RSV test and indirect polyclonal immunofluorescence. Culture for virus isolation was also inoculated at the time of specimen collection on all specimens but culture was discontinued on specimens subsequently found positive by immunofluorescence. Specimens negative by immunofluorescence for RSV and those from patients where infection with a second virus in addition to RSV was considered possible were also cultured. A result was considered positive if either the indirect immunofluorescence or cell culture was positive. 8 specimens showed antigen deterioration with slide storage (as measured by a change in the indirect immunofluorescence result after storage and observation of poor fluorescence with both reagents). The IMAGEN™ RSV test diagnosed RSV infection in known positive specimens collected over 5 consecutive epidemics, indicating that the monoclonal antibodies used are directed against stable RSV antigens.Therefore, the diagnostic capacity of the reagent is unlikely to be affected by the minor antigenic changes known to occur.2,24 The results of the two trials are shown in Table 14.1. Of the 547 specimens tested, the IMAGEN™ RSV test correlated with the standard RSV diagnostic test in 525 cases (a correlation of 96%). The overall sensitivity and specificity of the IMAGEN™ RSV test was 93% and 98% respectively, assuming that the standard methods were 100% specific and sensitive. The predictive values for positive and negative tests were 98% and 94% respectively. Sensitivity, specificity and predictive values were calculated as described previously25.

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Table 14.1 Comparison of test results by the IMAGEN™ RSV test and the standard RSV Diagnostic test used at two trial centres TEST RESULT Standard test IMAGEN™ RSV test

Neg Neg

Pos Pos

Pos Neg

Neg Pos

Trial Centre 1 Trial Centre 2

220 64

74 167

6 11

5 0

TOTAL No. of Specimens 284 241 17 5 14.2 CROSS REACTIVITY The IMAGEN™ RSV test was performed against preparations of other viruses and micro-organisms likely to be present in respiratory secretions. All organisms tested (Table 14.2) were negative with the IMAGEN™ RSV test reagent. Table 14.2 Organisms tested in the IMAGEN™ RSV test and found to be non-reactive Adenovirus 1-4, 7, 21 Neisseria gonorrhoeae Branhamella catarrhalis Neisseria lactamica Chlamydia trachomatis Neisseria meningitidis Coxsackie Virus types A9, B1, B3 Neisseria perflava Cytomegalovirus Parainfluenza virus types 1, 2 and 3 Echovirus types 3, 6, 9 Picornavirus Herpes Simplex virus types 1 and 2 Polio virus types 1 and 2 Influenza virus types A and B Rhinovirus Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Neisseria cinerea Varicella zoster virus

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1 INTERET Le test IMAGEN™ de détection du Virus Respiratoire Syncytial (VRS) est un test qualitatif d'immunofluorescence pour la détection du VRS dans des échantillons cliniques. 2 RESUME Le Virus Respiratoire Syncytial est un virus à ARN, sphérique, encapsulé, de la famille des Paramyxoviridae et appartenant au groupe des Pneumovirus. Ce groupe comporte quatre types: VRS humain, VRS bovin, virus de la pneumonie de la souris et virus de la rhinotrachéite du dindon1,2. Le VRS est la cause principale des affections des voies respiratoires inférieures chez les nourrissons et les jeunes enfants, qui provoquent chaque année des épidémies saisonnières de maladies respiratoires3,4. Le VRS se transmet par des gouttelettes de secrétions respiratoires chargées du virus et provenant d'individus contaminés. L'infection peut se manifester par différents symptômes, allant de la rhinite à la pneumonie, sur lesquels des facteurs tels que l'âge, le sexe et le contexte socio-économique des individus contaminés ont une influence5. Près de 50 % des nourrissons contaminés au cours de la première année de leur vie risquent de développer des affections des voies respiratoires inférieures, parmi lesquelles bronchite, bronchiolite, bronchopneumonie et croup, qui peuvent nécessiter une hospitalisation6. Les nourrissons présentant des complications sous-jacentes telles que maladie cardiaque congénitale, dysplasie bronchopulmonaire et congénitale ou autres types d'immunodéficiences, risquent d'être sujets à des infections graves dues au VRS, mettant parfois leur vie en danger7,8. Des infections fréquentes, moins graves, se manifestent dans toutes les tranches d'âge, provoquant parfois des pneumonies chez les enfants et les personnes âgées9,10. Des infections à VRS simultanées à d'autres microorganismes peuvent accentuer la gravité des affections respiratoires9,11,12. Les épidémies survenant dans les services de gériatrie allaient généralement de pair avec une morbidité considérable et engendrait parfois la mort. La transmission nosocomiale du VRS a lieu dans les services de pédiatrie et les nurseries, entraînant une hospitalisation et un traitement prolongés des enfants contaminés13,14,15,16,17,18 . Le diagnostic en laboratoire du VRS joue un rôle important dans le traitement des patients et permet de contrôler les épidémies 15,16,17,19. Parmi les méthodes de diagnostic du VRS, on compte la détection directe du virus ou des protéines virales dans des échantillons cliniques tels que des aspirations nasopharyngiennes, et l'isolement du virus viable dans des monocouches de culture cellulaire inoculées au moyen de secrétions respiratoires20,21. L'isolement du VRS dans des échantillons cliniques peut se réaliser dans des lignées continues de cellules telles que les cellules HeLa et Hep2, dans lesquelles un effet cytopathologique caractéristique (CPE), formation de syncytia, peut apparaître. Il faut beaucoup de temps pour obtenir un diagnostic réussi par isolement du virus et 5 à 20 jours peuvent s'avérer nécessaires pour que le CPE caractéristique se développe. L'isolement du VRS n'est pas facilité par la labilité du virus et l'insensibilité de certaines cultures cellulaires22. En outre, les techniques de culture cellulaire sont coûteuses, laborieuses et inadaptées au diagnostic rapide des infections dues au VRS. Par contre, un test d'immunofluorescence directe utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques constitue une méthode rapide, sensible et spécifique de détection directe du VRS dans des échantillons cliniques tels que des aspirations nasopharyngiennes. Le test IMAGEN™ VRS est un test d'immunofluorescence directe pour la détection et l'identification rapide du VRS dans des échantillons cliniques. Il utilise trois anticorps monoclonaux afin de détecter les protéines structurelles spécifiques présentes dans toutes les souches de virus respiratoire syncytial humain.

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3 PRINCIPE DU TEST Le test IMAGEN™ VRS contient des anticorps monoclonaux conjugués à de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Les anticorps conjugués se lient spécifiquement aux antigènes viraux présents dans toutes les souches de VRS humain. Le réactif est utilisé dans le cadre d'une technique d'immunofluorescence directe en une seule étape. Les échantillons sont incubés avec le réactif contenant les anticorps conjugués au FITC pendant 15 minutes, puis l'excès de réactif est éliminé par lavage à l'aide d'une solution saline (PBS). L'observation de la zone colorée s'effectue après montage entre lame et lamelle, au microscope sous un éclairage épifluorescent. Si l'antigène du VRS est présent, on distingue une fluorescence caractéristique granuleuse vert- pomme vif, à l'intérieur des cellules infectées, qui contraste avec la coloration rouge des cellules non infectées. Déclaration Les anticorps monoclonaux utilisés dans le cadre de ce test ont été produits par l'Institute for Research on Animal Diseases, Compton, Berkshire, Royaume-Uni. 4 DEFINITIONS Les définitions et symboles suivants sont conformes aux normes ISO 15223 et EN 980 et sont utilisés dans la notice du produit.

Code du produit et référence du catalogue. Consulter les instructions d’utilisation. N Contenu suffisant pour <N> tests.

Fabricant. Dispositif médical de diagnostic in vitro.

Utiliser jusque.

Code du lot

Limite de température de stockage. 5 REACTIFS FOURNIS

50 - Chaque kit comprend suffisamment de réactifs pour tester 50 échantillons respiratoires ou

préparations de cultures cellulaires. - La date de péremption du kit est indiquée sur l'étiquette extérieure de la boîte. 5.1 REACTIFS IMAGEN™ RSV

Un fascicule d’ Instructions.

2 lames de contrôle positif à 1 puits contenant des cellules épithéliales humaines fixées à l'acétone (Hep2) et contaminées par le VRS.

Un flacon de :

3mL de liquide de montage. Ce liquide de montage contient un agent inhibant photodécolorant dans une solution de glycérol (pH 10,0).

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1,4mL de réactif IMAGEN™ VRS. Le réactif se compose d'un mélange d'anticorps murins monoclonaux purifiés, spécifiques du VRS et conjugués au FITC. Les anticorps monoclonaux sont dirigés contre la protéine de fusion et la nucléoprotéine du RSV.

5.2 PREPARATION, STOCKAGE ET REUTILISATION DES COMPOSANTS DU KIT Pour assurer des performances optimales du kit, il est important de stocker les composants non utilisés conformément aux instructions suivantes : 5.3 LAMES DE CONTROLE POSITIF - Les lames sont fournies séparément enveloppées dans des pochettes aluminium scellées et remplies d’azote. Les lames non utilisées doivent être stockées entre 2 et 8 °C.. La pochette contenant la lame à utiliser doit rester à température ambiante (15 à 30 °C) pendant 5 minutes avant de l’ouvrir. Colorez la lame immédiatement après ouverture. 5.4 LIQUIDE DE MONTAGE - Prêt à l’usage. Conserver le liquide de montage non utilisé entre 2 et 8 °C. Le flacon de liquide de montage doit rester à température ambiante (15-30 °C) pendant 5 minutes avant de l’ouvrir. 5.5 REACITF - Prêt à l’usage. Conserver le réactif non utilisé à l’abri de la lumière entre 2 et 8 °C. Le flacon de réactif doit rester à température ambiante (15-30 °C) pendant 5 minutes avant utilisation. 6 REACTIFS NON FOURNIS 6.1 REACTIFS Acétone frais (pour la fixation). Solution saline tamponnée (PBS), pH 7,5, pour le lavage des échantillons marqués et pour la préparation des échantillons. 6.2 ACCESSOIRES Les produits suivants sont destinés à être utilisés conjointement au test IMAGEN™ RSV. Pour tous renseignements supplémentaires, veuillez vous adresser à votre filiale DakoCytomation ou distributeur locaux. Lames pour microscope en verre recouvertes de téflon avec un seul puits de 6mm (100 lames par boîte) disponibles auprès de votre filiale ou distributeur DakoCytomation, (Code S6114). Lames de contrôle positif (Code S6108). 7 MATERIEL Le matériel suivant est nécessaire :

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Pipette de précision et embouts jetables pour des quantités de 25µL.

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Bain de lavage. Lamelles adaptées à un puits de 6mm de diamètre. Huile d'immersion non fluorescente. Microscope épifluorescent avec filtre pour FITC (longueur d'onde d'excitation maximale 490 nm, longueur d'onde d'émission moyenne 520 nm) et amplification x200-x400. Incubateur à 37 °C. Centrifugeuse à vitesse réduite. Pour échantillons directs Extracteur de mucosités (échantillons nasopharyngiens uniquement). 8 PRECAUTIONS

- Pour diagnostic in vitro. L’utilisateur doit maîtriser les procédures générales de laboratoire et être spécifiquement formé à I’emploi de ce test. 8.1 MESURES DE SECURITE 8.1.1 Le réactif IMAGEN™ VRS contient 15mmol/L d'azide de sodium, un agent chimique extrêmement toxique susceptible de réagir avec les parties en cuivre ou en plomb des tuyauteries pour former des azides métalliques extrêmement explosifs. Au moment de jeter les solutions contenant de l'azide de sodium, rincer abondamment à l'eau. 8.1.2 Le VRS présent sur la lame de contrôle positif s'est révélé non infectieux lors de la culture cellulaire. Toutefois, la lame doit être manipulée et mise au rebut comme si elle était potentiellement infectieuse. 8.1.3 Le réactif contient du bleu d’Evans. Cette substance pouvant être cancérigène, éviter tout contact avec la peau. 8.1.4 Le liquide de montage doit être utilisé avec précautions, car il peut provoquer des irritations cutanées. En cas de contact avec la peau, rincer abondamment à l'eau. 8.1.5 Ne pas manger, boire, fumer, conserver ou préparer de la nourriture, ni se maquiller sur les lieux de travail. 8.1.6 Ne pas pipéter les solutions à la bouche. 8.1.7 Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons cliniques et les cellules infectées et toujours se laver les mains après avoir travaillé avec des substances infectieuses. 8.1.8 L'élimination de tous les échantillons cliniques doit avoir lieu conformément à la législation en vigueur. 8.1.9 Une fiche de sécurité destinée aux professionnels est disponible sur demande. 8.2 PRECAUTIONS TECHNIQUES 8.2.1 Ne pas utiliser les composants après la date de péremption indiquée sur les étiquettes. Ne pas mélanger ou échanger différents lots de réactifs.

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8.2.2 Les réactifs sont fournis prêts à l'emploi, à des concentrations prédéterminées. Les performances pourraient être affectées en cas de non respect des conditions de conservation décrites dans la Section 5. 8.2.3 Préparer le volume de PBS nécessaire le jour le l’utilisation. 8.2.4 Eviter la contamination microbienne des réactifs. 8.2.5 Les réactifs ne doivent pas être congelés. 9 PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS22 Le prélèvement et la préparation des échantillons sont prépondérants dans le cadre du diagnostic du VRS par immunofluorescence directe, ainsi que par les méthodes de culture cellulaire. Les échantillons doivent être collectés sur le site de l’infection, en période d’excrétion virale maximale, et être préparés de manière à garder intactes les cellules qui sont débarrassées de mucosités adhérentes. L'échantillon respiratoire idéal consiste en un prélèvement nasopharyngien par aspiration qui, s’il est prélevé correctement, doit présenter un grand nombre de cellules épithéliales respiratoires. 9.1 ASPIRATION/SECRETIONS NASOPHARYNGIENNES Prélèvement Prélever les secrétions dans la zone nasopharyngienne, dans un extracteur de mucosités, à l'aide d'un tube d'alimentation de dimension 8. L'extracteur de mucosités et le tube doivent être envoyés au laboratoire aussitôt que possible pour traitement. Il est nécessaire d’employer les techniques de séparation des cellules pour une coloration par immunofluorescence directe. L’échantillon ou le surnageant résultant de la séparation des cellules peut être inoculé pour la culture du virus. Séparation des cellules Le cas échéant, ajouter à l'échantillon 2mL de solution saline tamponnée (PBS) avant la centrifugation, de manière à réduire la viscosité et à diluer les mucosités. Centrifuger l'extracteur de mucus à température ambiante (15-30 °C) pendant 10 minutes à 380g. Eliminer le liquide surnageant qui peut servir pour la culture cellulaire. Mettre le dépôt cellulaire en suspension dans 2mL de PBS et pipeter doucement les cellules vers le haut et vers le bas à l'aide d'une pipette de large diamètre, ou agiter légèrement à l'aide du vortex, jusqu'à ce que le mucus se dissolve et libère la substance cellulaire. Eviter de pipeter/agiter au vortex vigoureusement afin de ne pas endommager les cellules. Dès qu’une suspension uniforme est obtenue, ajouter si nécessaire un peu de PBS, et pipeter ou agiter au vortex après addition éventuelle de ce PBS, afin de laver les cellules. Eliminer et jeter toutes les particules de mucus restantes à ce stade. L'excès de mucus doit être éliminé car il risque d'empêcher la pénétration adéquate du réactif, produisant ainsi une fluorescence non spécifique. Si toutes les secrétions restent dans le tube d'alimentation et n'atteignent pas l'extracteur de mucosités, évacuer les secrétions du tube par lavage et les verser dans du PBS. Pour ce faire, insérer une pipette Pasteur dans l'extrémité du tube attachée à l'extracteur de mucus. Aspirer le liquide adéquat dans le tube et l'expulser plusieurs fois jusqu'à ce que les secrétions adhérant aux parois du tube soient délogées. Pipeter la suspension qui en résulte de haut en bas jusqu'à dissolution adéquate du mucus. Préparation des lames Une fois le processus de séparation des cellules terminé, centrifuger la suspension cellulaire ainsi obtenue à température ambiante (15-30 °C) pendant 10 minutes à 380g et éliminer le liquide surnageant. Remettre le dépôt de cellules en suspension dans une quantité suffisante de PBS, afin de diluer le mucus restant tout en maintenant une importante densité cellulaire. Mettre 25µL de dépôt cellulaire remis en suspension dans le puits, sur une lame. Laisser sécher complètement l'échantillon à l'air libre et à température ambiante (15-30 °C) et le fixer à l'acétone frais, à température ambiante également (15-30 °C), pendant 10 minutes. S'il l'échantillon n’est pas marqué immédiatement, le conserver à 4 °C pendant la nuit ou le congeler à –20 °C pour des périodes plus longues.

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10 MODE OPERATOIRE VEUILLEZ CONSULTER LA SECTION 8.2, PRÉCAUTIONS TECHNIQUES, AVANT DE RÉALISER LE TEST. 10.1 ADDITION DE REACTIF Ajouter 25µL de réactif IMAGEN™ VRS à la préparation de cellules fixée sur la lame (voir Section 9) ou une lame de contrôle positif. Vérifier si le réactif couvre toute la surface du puits. 10.2 PREMIERE INCUBATION Incuber les lames contenant le réactif dans une chambre humide pendant 15 minutes à 37 °C. Ne pas laisser sécher le réactif sur l'échantillon, car cela provoquerait l'apparition d'un marquage non spécifique. 10.3 LAVAGE DE LA LAME Eliminer l'excès de réactif par lavage avec la solution saline (PBS), et laver la lame avec précaution dans un bain contenant du PBS, sous agitation, pendant 5 minutes. Laisser égoutter le PBS et laisser sécher la lame à l'air libre et à température ambiante (15-30 °C). 10.4 ADDITION DE LIQUIDE DE MONTAGE Ajouter une goutte de liquide de montage IMAGEN™ VRS au centre de chaque puits et placer une lamelle, en évitant la formation de bulles d'air sous le couvercle. 10.5 LECTURE DE LA LAME Examiner le puits contenant l'échantillon coloré dans son ensemble, en utilisant un microscope à épifluorescence. Comme indiqué à la Section 11, une amplification de x200-x500 permet de visualiser la fluorescence. (Pour obtenir des résultats optimaux, les échantillons doivent en principe être examinés immédiatement après le marquage, mais ils peuvent être conservés entre 2 et 8 °C, à l'abri de la lumière, jusqu'à 72 heures). 11 INTERPRETATION DES RESULTATS 11.1 CONTROLES 11.1.1 Lames de contrôle positif Une fois colorée et examinée conformément aux instructions de la Section 10, la lame de contrôle doit présenter des cellules avec des granules cytoplasmiques intracellulaires fluorescents vert pomme, contrastant avec la couleur rouge du contre-colorant. Ces cellules sont légèrement plus grandes que les cellules respiratoires épithéliales mais présentent une fluorescence cytoplasmique similaire lorsqu'elles sont contaminées par le VRS. Les lames de contrôle positif doivent servir à vérifier si la procédure de marquage a été réalisée correctement. 11.1.2 Contrôle négatif Si un contrôle négatif s'avère nécessaire, il est recommandé d'utiliser des cellules intactes non contaminées du même type que celles utilisées pour la culture et l'isolement du VRS. Les cellules doivent être préparées, fixées et colorées (voir Section 10)

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11.2 ECHANTILLONS CLINIQUES 11.2.1 Aspect de cellules contaminées par le VRS Des granules cytoplasmiques intracellulaires fluorescents vert-pomme apparaissent dans les cellules respiratoires épithéliales contaminées par le VRS. Aux stades plus avancés de l'infection, l'antigène du VRS peut se limiter à des zones isolées dans le cytoplasme, et apparaître alors sous forme de granules mal définis, séparément ou en groupes. Les cellules non contaminées se colorent en rouge au contact du bleu d’Evans, le contre-colorant. 11.2.2 Interprétation des résultats Le diagnostic est positif lorsqu'une ou plusieurs cellule(s) présente(nt) une fluorescence caractéristique dans l'échantillon fixé et coloré. Le diagnostic est négatif lorsque les échantillons fixés colorés ne présentent pas de fluorescence après marquage avec le réactif. En ce qui concerne les échantillons d'aspiration nasopharyngienne colorés directement, un minimum de 20 cellules épithéliales respiratoires non infectées doit être visible à l'intérieur du puits de la lame pour permettre de conclure à un résultat négatif (voir Section 11.2.3 s'il n'y a pas suffisamment de cellules). 11.2.3 Quantité de cellules insuffisante S'il n'y a pas suffisamment de cellules dans la préparation, centrifuger le reste de l'échantillon clinique à 380g, pendant 10 minutes, à température ambiante (15-30 °C). Remettre les cellules en suspension dans un plus petit volume de PBS avant répartition (25µL) sur la lame. Le cas échéant, il est conseillé de prélever un nouvel échantillon. 12 LIMITES DU TEST 12.1 Il arrive que le réactif FITC colore de manière non spécifique les souches de Staphylococcus aureus contenant d'importantes quantités de protéine A. Il ressort d'une constatation relative à d'autres tests fluorescents à base de réactifs monoclonaux ou polyclonaux que ce phénomène provient de l'interaction non immune entre la protéine A et la zone Fc de l'anticorps23. Toutefois, cette coloration ne présente pas la structure de fluorescence intracellulaire typique qui apparaît dans les cellules contaminées par le VRS (voir Section 11.2.1) et elle doit donc être considérée comme une coloration non spécifique. 12.2 Utiliser exclusivement le liquide de montage fourni. 12.3 L'apparence de l'image de fluorescence obtenue peut varier en fonction du type de microscope et de la source lumineuse utilisés. 12.4 Il est recommandé d'utiliser 25µL de réactif pour couvrir la surface d'un puits de 6mm de diamètre. Si ce volume est réduit, il peut de s'avérer difficile de couvrir la surface de l'échantillon, au risque de diminuer la sensibilité. 12.5 Tous les réactifs sont fournis prêts à l'emploi, à des concentrations prédéterminées. Les performances pourraient être affectées en cas de modification des réactifs par l'utilisateur ou de non respect des conditions de conservation décrites dans la Section 5.

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12.6 Le prélèvement d'échantillons à un moment inapproprié de la maladie, l'échantillonnage et/ou la manipulation incorrect(e/s) des échantillons, l’échec de la culture cellulaire, etc. sont autant de facteurs qui peuvent empêcher la détection du VRS. Un résultat négatif n'exclut pas pour autant la possibilité d'une contamination par le VRS. 12.7 La présence du VRS dans les secrétions nasopharyngiennes n'exclut pas nécessairement la possibilité d'une infection concomitante avec d'autres agents pathogènes9,12. Les résultats du test doivent être interprétés en tenant compte des informations fournies par les études épidémiologiques, l’évaluation clinique du patient et autres procédures de diagnostic. 12.8 Les résultats du test doivent être interprétés en tenant compte des informations fournies par les études épidémiologiques, l’évaluation clinique du patient et autres procédures de diagnostic. 13 VALEURS NORMALES Le taux de détection du VRS est influencé par le moment auquel a lieu le prélèvement des échantillons, ainsi que par la manipulation, la conservation et le transport des échantillons. Il dépend également de l'âge, de l'état de santé général, de lieu de résidence et du contexte socio-économique des individus testés. Les virus respiratoires syncytiaux sont répandus dans le monde entier et sont associés aux infections des voies respiratoires saisonnières importantes dans les régions tempérées et tropicales. Sous les climats tempérés, les accès annuels d'infection au VRS se produisent principalement au cours de l'hiver. Les affections des voies respiratoires inférieures sont généralement plus importantes durant cette période et le VRS est quant à lui responsable de 20 % des infections des voies respiratoires. C'est pourquoi, durant les épidémies saisonnières, un nombre considérable d'aspirations nasopharyngiennes risque de se révéler positif au VRS. Les infections dues au VRS touchent toutes les tranches d'âge, mais les symptômes sont plus graves chez les nourrissons. 50 % des nourrissons sont sujets à une infection au VRS au cours des cinq premières années de leur vie. Les VRS ont été responsables d'épidémies d'infections des voies respiratoires dans les hôpitaux, et plus particulièrement dans les services de pédiatrie et les établissements gériatriques, où il s'est avéré qu'ils allaient de pair avec une augmentation de la morbidité et de la mortalité. 14 PERFORMANCES SPECIFIQUES CARACTERISTIQUES 14.1 ETUDES CLINIQUES Le test IMAGEN™ VRS a été évalué dans deux centres d'études cliniques sur des secrétions nasopharyngiennes prélevées chez des nourrissons hospitalisés présentant des symptômes d'infection respiratoire. Le centre n° 1 a testé 305 échantillons, prélevés lors des épidémies des hivers 1982-83 et 1983-84, à l'aide du test IMAGEN™ VRS et du test standard de diagnostic du VRS utilisé par le centre (isolement du virus dans des monocouches de culture cellulaire HeLa et immunofluorescence polyclonale bovine indirecte). Le résultat était considéré comme positif si la fluorescence polyclonale bovine indirecte ou la culture de tissus s'avérait positive. Le diagnostic fut établi uniquement sur base de la culture tissulaire pour 8 échantillons dans lesquels la fluorescence indirecte présentait une liaison non spécifique.

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Le centre d'étude n° 2 a testé 200 échantillons, prélevés lors de l'épidémie de l'hiver 1983-84, et 50 échantillons reconnus comme positifs, prélevés lors des épidémies survenues au cours des 5 années précédentes, en utilisant le test IMAGEN™ VRS et l'immunofluorescence polyclonale indirecte. Les cellules en culture pour l’isolement du virus ont été inoculées dans tous les échantillons lors de leur prélèvement, mais la culture fut interrompue sur les échantillons qui se sont avérés positifs par la suite par immunofluorescence. Les échantillons négatifs par immunofluorescence, de même que ceux provenant de patients considérés comme susceptibles d'être sujets à une infection simultanée due à un second virus, en plus du RSV, ont également été cultivés. Le résultat était considéré comme positif si l'immunofluorescence indirecte ou la culture cellulaire était positive. Huit échantillons ont présenté une détérioration des antigènes suite à la conservation des lames (mesurée par une modification du résultat de l'immunofluorescence indirecte après conservation et constatation d'une faible fluorescence avec les deux réactifs). Le test IMAGEN™ VRS a décelé l'infection due au VRS dans les échantillons reconnus comme positifs prélevés au cours de 5 épidémies consécutives, montrant ainsi que les anticorps monoclonaux utilisés sont dirigés contre les antigènes de VRS stables. C'est la raison pour laquelle les possibilités de diagnostic du réactif ne sont pas susceptibles d'être affectées par les modifications mineures qui surviennent au niveau des antigènes2,24. Les résultats des deux études sont présentés dans le tableau 14.1. Sur les 547 échantillons testés, le test IMAGEN™ VRS corrèle avec le test standard de diagnostic du VRS dans 525 cas (soit une corrélation de 96 %). La sensibilité et la spécificité générales du test IMAGEN™ VRS atteignent respectivement 93 % et 98 %, à supposer que les méthodes standard soient spécifiques et sensibles à 100 %. Les valeurs prédictives des tests positifs et négatifs atteignent respectivement 98 % et 94 %. La sensibilité, la spécificité et les valeurs prospectives ont été calculées comme décrit précédemment25. Tableau 14.1 Comparaison des résultats obtenus avec le test IMAGEN™ VRS et le test standard de diagnostic du VRS utilisé par deux centres d'étude TEST RESULTATS Test standard Test IMAGEN™ VRS

Nég Nég

Pos Pos

Pos Nég

Nég Pos

Centre n° 1 Centre n° 2

220 64

74 167

6 11

5 0

N° TOTAL d'échantillons 284 241 17 5 14.2 REACTIONS CROISEES Le test IMAGEN™ VRS a été réalisé sur des préparations d'autres virus et microorganismes susceptibles d'apparaître dans les secrétions respiratoires. Tous les organismes testés (Tableau 14.2) se sont révélés négatifs avec le réactif du test IMAGEN™ VRS. Tableau 14.2 Organismes testés selon le test IMAGEN™ VRS et s'étant révélés non réactifs Adénovirus 1-4, 7, 21 Neisseria gonorrhoeae Branhamella catarrhalis Neisseria lactamica Chlamydia trachomatis Neisseria meningitidis Virus Coxsackie types A9, B1, B3 Neisseria perflava Cytomegalovirus Virus parainfluenza types 1, 2 et 3 Echovirus types 3, 6, 9 Picornavirus Virus de l’herpès simplex types 1 et d 2 Virus de la Polio types 1 et 2 Virus Influenza types A and B Rhinovirus Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae

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Neisseria cinerea Virus Varicella zona

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1 ZWECKBESTIMMUNG Der IMAGEN™ Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Test ist ein qualitativer Immunfluoreszenztest zum direkten Nachweis von RSV in klinischen Proben. 2 EINFÜHRUNG Das Respiratory Syncytial Virus ist ein mit Hülle („envelope“) versehes, kugelförmiges RNA-Virus aus der Familie der Paramyxoviridae und gehört zur Gattung der Pneumoviren. Diese Gattung umfaßt vier Spezies: humanes RSV, bovines RSV, Pneumovirus der Maus und Rhinotracheitisvirus des Truthahns1,2. RSV ist die wichtigste Ursache von Erkrankungen der unteren Luftwege bei Säuglingen und Kleinkindern und verursacht jedes Jahr saisonal bedingte epidemieartige Erkrankungen der Atemwege3,4. Die Übertragung des RSV erfolgt durch virushaltige Tröpfchen aus dem Nasen-/Rachensekret infizierter Personen. Die Infektion manifestiert sich durch eine Vielzahl von Symptomen, die von Rhinitis bis zur Pneumonie reichen können und von Faktoren wie Alter, Geschlecht und sozioökonomischem Umfeld der infizierten Personen beeinflusst werden5. Bei ca. 50 % der während des ersten Lebensjahres infizierten Säuglinge können Erkrankungen der unteren Luftwege, wie Bronchitis, Bronchiolitis, Bronchopneumonie und Pseudokrupp auftreten und einen Krankenhausaufenthalt erforderlich machen6. Säuglinge mit vorbestehenden Komplikationen wie einer kongenitalen Herzerkrankung, bronchopulmonärer Dysplasie und kongenitalen oder anderen Immundefekten können für schwere, teilweise lebensgefährliche Infektionen mit RSV anfällig sein7,8. Wiederholte, weniger schwere Infektionen kommen in allen Altersgruppen vor und führen bei Kindern und älteren Personen gelegentlich zu Pneumonien9,10. Koinfektionen von RSV mit anderen Mikroorganismen können zu einem verstärktem Schweregrad der Atemwegserkrankungen führen9,11,12. Ausbrüche in Altersheimen gehen mit einer erheblichen Erkrankungsrate und gelegentlicher Morbidität einher. Zu nosokomialer Übertragung von RSV, mit in der Folge längeren Krankenhausaufenthalten zwecks Behandlung der infizierten Kinder, kommt es in Kinderkliniken und Kindergärten13,14,15,16,17,18. Die Labordiagnose von RSV ist für die Behandlung der Patienten wichtig und hilft außerdem bei der Kontrolle von Ausbrüchen15,16,17,19. Zu den herkömmlichen Methoden, die zur Labordiagnose von RSV-Infektionen angewendet werden, gehört der direkte Nachweis des Virus oder von Virusproteinen in klinischen Proben wie nasopharyngealen Absaugsekreten und die Isolierung von lebensfähigem Virus aus mit Nasen-/Rachensekret beimpften einschichtigen Zellkulturen20,21. Die Isolierung von RSV aus klinischen Proben kann über kontinuierliche Zelllinien wie HeLa-Zellen und Hep2-Zellen erfolgen, auf denen sich ein charakteristischer zytopathischer Effekt (CPE) - die Synzytia-Bildung – einstellen kann. Eine erfolgreiche Diagnose durch Isolierung des Virus ist zeitaufwendig und es kann 5 bis 20 Tage dauern, ehe sich der charakteristische CPE entwickelt. Die Isolierung von RSV wird durch die Labilität des Virus und die Insensitivität einiger Zellkulturen zusätzlich kompliziert22. Zellkulturverfahren sind teuer, arbeitsaufwendig und für eine schnelle Diagnose von RSV-Infektionen ungeeignet. Ein direkter Immunfluoreszenztest, bei dem spezifische monoklonale Antikörper eingesetzt werden, bietet eine schnelle, empfindliche und spezifische Methode für den direkten Nachweis von RSV in klinischen Proben wie nasopharyngealen Absaugsekreten. IMAGEN™ RSV ist ein direkter Immunfluoreszenztest zum schnellen Nachweis und zur schnellen Identifikation von RSV in humanen klinischen Proben. Im Test werden drei monoklonale Antikörper

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eingesetzt, um die spezifischen Strukturproteine nachweisen zu können, die von allen Stämmen des humanen Respiratory Syncytial Virus exprimiert werden.

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3 TESTPRINZIP Der IMAGEN™ RSV-Test enthält Fluoresceinisothiocyanat-(FITC-)konjugierte monoklonale Antikörper. Die konjugierten Antikörper binden spezifisch an die in allen Stämmen des humanen RSV vorliegenden Virusantigene. Das Reagenz wird in einem direkten Einschritt-Immunfluoreszenzverfahren verwendet. Die Proben werden mit dem Reagenz, das FITC-konjugierte Antikörper enthält, 15 Minuten inkubiert und anschließend wird überflüssiges Reagenz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abgewaschen. Die gefärbte Fläche wird eingedeckt und mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop ausgewertet. Falls RSV-Antigen vorliegt, ist in infizierten Zellen eine charakteristische helle, granuläre, apfelgrüne Fluoreszenz zu beobachten, die im Kontrast zur roten Hintergrundfärbung nicht infizierter Zellen steht. Anerkennung Der in diesem Test verwendeten monoklonalen Antikörper stammt aus dem „Institute for Research on Animal Diseases“, Compton, Berkshire, Großbritannien. 4 DEFINITIONEN Die folgenden Symbole und Definitionen entsprechen ISO 15223 und EN 980 und wurden in den Produktinformationen verwendet.

Produktcode und Bestellnummer Gebrauchsanweisung beachten N Inhalt ausreichend für ‚n’ Ansätze

Hersteller In-Vitro-Diagnostikum

Verwendbar bis

Chargenbezeichnung

Zulässiger Temperaturbereich 5 GELIEFERTE REAGENZIEN

50 - Jeder Testkit enthält ausreichend Reagenzien für die Durchführung des Tests an 50

Patientenproben oder an 50 Zellkulturpräparationen. - Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem äußeren Verpackungsetikett vermerkt. 5.1 IMAGEN™ RSV-TESTKIT

Eine Gebrauchsanleitung.

2 x als Positivkontrolle vorgesehene Objektträger mit 1 Vertiefung und Azeton-fixierten humanen Epithelzellen (HEp-2), die mit RSV infiziert sind.

Jeweils ein Fläschchen der folgenden Reagenzien:

Ein Fläschchen mit 3 mL Eindeckmedium. Das Eindeckmedium enthält eine Hemmsubstanz gegen lichtbedingtes Ausbleichen in einer Glyzerinlösung (pH 10,0).

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Ein Fläschchen mit 1,4 mL IMAGEN™ RSV-Testreagenz. Das Reagenz besteht aus einer Mischung von gereinigten, murinen, monoklonalen Antikörpern, die RSV-spezifisch und FITC-konjugiert sind. Die monoklonalen Antikörper sind gegen das Fusionsprotein und das Nukleoprotein von RSV gerichtet.

5.2 ANSETZEN, LAGERUNG UND ERNEUTE VERWENDUNG DER KIT-KOMPONENTEN Um optimale Leistung der Kit-Komponenten sicherzustellen, müssen alle nicht genutzten Komponenten in Übereinstimmung mit den folgenden Anleitungen gelagert werden: 5.3 POSITIVE KONTROLLOBJEKTTRÄGER- Als Positivkontrolle dienende Objektträger werden einzeln in versiegelten und mit Stickstoff gefüllten Kunststoffbeuteln geliefert. Nicht verwendete Objektträger bei 2-8 °C lagern. Vor dem Öffnen den Objektträger 5 Minuten lang Raumtemperatur (15-30 °C) annehmen lassen. Die Objektträger müssen unmittelbar nach dem Öffnen der Folienhüllen angefärbt werden. 5.4 EINDECKMEDIUM - Gebrauchsfertig. Bei 2-8 °C aufzubewahren. Das Eindeckmedium wird vor Gebrauch 5 min auf Raumtemperatur (15-30 °C) gebracht. 5.5 REAGENZ - Gebrauchsfertig. Das Reagenz wird bei 2-8 °C im Dunkeln aufbewahrt und vor Gebrauch 5 min auf Raumtemperatur (15-30 °C) gebracht. 6 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND ERFORDERLICHES ZUBEHÖR 6.1 REAGENZIEN Frisches Azeton (zur Fixierung). Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, zum Waschen der gefärbten Proben und zur Probenvorbereitung. 6.2 ZUBEHÖR UND GERÄTE Die folgenden Produkte sind für die Anwendung zusammen mit IMAGEN™ RSV bestimmt. Weitere Informationen können von der zuständigen DakoCytomation-Niederlassung oder vom zuständigen Händler angefordert werden. Teflonbeschichtete Mikroskop-Objektträger mit jeweils einer Vertiefung von 6 mm Durchmesser (100 Objektträger pro Gebinde) sind bei der zuständigen DakoCytomation-Niederlassung oder dem Händler erhältlich (Code-Nr. S 6114). Positive Kontrollobjektträger (Code-Nr. S 6108). 7 AUSSTATTUNGEN Es werden folgende Ausstattungen benötigt:

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Präzisionspipette und Einmal-Pipettenspitzen, 25 µL.

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Waschtrog. Deckgläser zum Eindecken eines Testareals mit 6 mm Durchmesser. Nicht fluoreszierendes Immersionsöl. Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Filtersystem für FITC (maximale Anregungswellenlänge 490 nm, mittlere Emissionswellenlänge 520 nm) und für 200-400fache Vergrößerung. Inkubator für 37 °C. Niedertourige Zentrifuge. Für direkte Proben Schleim-Extraktor zur Gewinnung von nasopharyngealen Proben. 8 VORSICHTSMASSNAHMEN

- In-Vitro-Diagnostikum. Personen, die Tests mit desem Produkt durchführen, müssen in die Durchführung eingewiesen sein und über entsprechende Laborerfahrung verfügen. 8.1 SICHERHEITSMASSNAHMEN 8.1.1 Das IMAGEN™ RSV-Testreagenz enthält 15 mmol/L Natriumazid. Natriumazid ist ein Gift, das mit Blei- und Kupferleitungen reagieren und hochexplosive Metallazide bilden kann. Beim Entsorgen der azidhaltigen Materialien immer mit viel Wasser spülen. 8.1.2 RSV auf den positiven Kontrollobjektträgern hat sich in Zellkulturen nachweislich als nicht infektiös erwiesen; trotzdem sind sie als potentiell infektiös zu handhaben und zu entsorgen. 8.1.3 Das Reagenz enthält Evans-Blau. Evans-Blau ist möglicherweise karzinogen; Hautkontakt ist deshalb unbedingt zu vermeiden. 8.1.4 Bei Verwendung des Eindeckmediums muss vorsichtig vorgegangen werden, da es Hautirritationen verursachen kann. Falls es zu einem Kontakt kommt, muss die Haut mit Wasser abgewaschen werden. 8.1.5 Essen, Trinken, Rauchen, Aufbewahren und Zubereiten von Speisen sowie Schminken sind im für Arbeiten vorgesehenen Bereich (Labor) verboten. 8.1.6 Reagenzien dürfen nicht mit dem Mund pipettiert werden. 8.1.7 Beim Handhaben von klinischen Proben und infizierten Zellen immer Einweghandschuhe tragen und nach dem Umgang mit infektiösen Stoffen immer die Hände waschen. 8.1.8 Alle klinischen Proben entsprechend den geltenden gesetzlichen Vorschriften entsorgen. 8.1.9 Von fachlich qualifizierten Anwendern kann ein Sicherheitsdatenblatt angefordert werden. 8.2 TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN 8.2.1 Reagenzien dürfen nach Ablauf des auf den Etiketten vermerkten Verfalldatums (Verwendbar bis:) nicht mehr verwendet werden. Reagenzien aus verschiedenen Chargen dürfen nicht vermischt oder gegeneinander ausgetauscht werden.

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8.2.2 Die Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung wird beeinträchtigt, falls Reagenzien modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten Bedingungen gelagert werden.

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8.2.3 Die erforderliche Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ist am Tag der Anwendung frisch anzusetzen. 8.2.4 Mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss vermieden werden. 8.2.5 Die Reagenzien dürfen nicht tiefgekühlt werden. 9 GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER PROBEN22 Gewinnung und Vorbereitung der Proben sind für die Diagnose von RSV mittels direkter Immunfluoreszenz- oder Zellkultur-Methoden von grundlegender Bedeutung. Das zu testende Material muss vom Infektionsgebiet und während des Höhepunkts der Virenfreisetzung („viral shedding“) gewonnen und so vorbereitet werden, dass es intakte Zellen enthält, die frei von Schleimresten sind. Das am besten geeignete Probenmaterial ist nasopharyngeales Absaugsekret, in dem sich bei korrekter Gewinnung jeweils eine große Anzahl von Epithelzellen der Atemwege befindet. 9.1 NASOPHARYNGEALE ABSAUGSEKRETE Gewinnung Proben aus dem nasopharyngealen Bereich durch eine Sonde (Größe 8) in einen Mukusextraktor gewinnen. Mukusextraktor und Schlauchmaterial müssen so schnell als möglich zur Verarbeitung ans Labor weitergeleitet werden. Für die direkte Immunfluoreszenzanfärbung müssen Verfahren der Zellseparation genutzt werden. Anhand dieser Techniken gewonnenes Proben- oder Überstandsmaterial kann für das Inokulieren von Kulturen genutzt werden. Zellseparation Falls notwendig, der Probe vor Zentrifugation 2 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung zugeben, um die Viskosität zu vermindern und den Schleim zu verdünnen. Den Schleim-Extraktor bei Raumtemperatur (15-30 °C) 10 Minuten bei 380 g zentrifugieren. Den Überstand, der für Zellkulturen verwendet werden kann, entfernen. Das Zellsediment in 2 mL PBS suspendieren und die Zellen in einer Pipette größeren Durchmessers vorsichtig auf und ab pipettieren oder in einem Vortex-Gerät vorsichtig mischen bis der Schleim aufbricht und das Zellmaterial freigegeben wird. Heftiges Pipettieren/Mischen ist zu vermeiden, um eine Beschädigung der Zellen zu verhindern. Sobald sich eine gleichmäßige Suspension gebildet hat, je nach Bedarf weitere PBS zugeben und nach Zugabe der zusätzlichen PBS wieder Pipettieren oder Mischen, um die Zellen weiter zu waschen. Jegliche sichtbaren, bis zu diesem Stadium noch verbliebenen Mukusteilchen entfernen und entsorgen. Überschüssiger Schleim muss entfernt werden, weil sonst eine adäquate Penetration des Reagenzes verhindert wird, was zu einer unspezifischen Fluoreszenz führen kann. Falls das ganze Sekret in der Ernährungssonde verbleibt und nichts davon den Mukus-Extraktor erreicht, das gesamte Sekret aus der Sonde in PBS herauswaschen. Das wird am besten erreicht, indem eine Pasteur-Pipette in das Sondenende eingeführt wird, das sich am Schleim-Extraktor befand. Die entsprechende Flüssigkeit in die Sonde saugen und wiederholt hinausdrücken, bis sich das an der Sondenwand befindliche Sekret gelöst hat. Die so erhaltene Suspension wird solange auf und ab pipettiert, bis der Schleim aufgebrochen ist. Vorbereitung der Objektträger Nach der Zellseparation wird die Zellsuspension bei Raumtemperatur (15-30 °C) 10 Minuten bei 380 g zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Das Zellsediment in ausreichend PBS resuspendieren, um jeglichen verbliebenen Schleim zu verdünnen und gleichzeitig eine hohe Zelldichte beizubehalten. 25 µL des resuspendierten Zellsediments in die 6 mm große Vertiefung eines Mikroskopobjektträgers geben. Die Probe bei Raumtemperatur (15-30 °C) gründlich trocknen lassen und in frischem Azeton bei Raumtemperatur (15-30 °C) 10 Minuten fixieren. Wird die Probe nicht sofort angefärbt, ist sie über Nacht bei 4 °C aufzubewahren oder, falls eine längere Aufbewahrung vorgesehen ist, bei –20 °C einzufrieren.

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10 TESTVERFAHREN VOR DURCHFÜHRUNG DES TESTVERFAHRENS SIND DIE IN ABSCHNITT 8.2 AUFGEFÜHRTEN TECHNISCHEN VORSICHTSMASSNAHMEN ZU BEACHTEN. 10.1 ZUSETZEN DES REAGENZES 25µL IMAGEN™ RSV-Reagenz zu der fixierten Zellpräparation auf dem Objektträger (siehe Abschnitt 9) oder auf einen positiven Kontrollobjektträger geben. Sicherstellen, dass das Reagenz die gesamte Testfläche bedeckt. 10.2 ERSTE INKUBATION Die Objektträger 15 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren. Das Reagenz darf nicht auf der Probe eintrocknen, da es sonst zu einer unspezifischen Färbung kommt. 10.3 WASCHEN DES OBJEKTTRÄGERS Überschüssiges Reagenz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung abwaschen und den Objektträger anschließend in einem Schüttelbad, das PBS enthält, 5 Minuten vorsichtig waschen. PBS vom Objektträger abfließen lassen und bei Raumtemperatur (15-30 °C) trocknen. 10.4 ZUSETZEN VON EINDECKMEDIUM Einen Tropfen IMAGEN™ RSV-Eindeckmedium in die Mitte jeder Vertiefung geben und mit einem Deckglas eindecken; sicherstellen, dass dabei keine Luftblasen entstehen. 10.5 ABLESEN DES OBJEKTTRÄGERS Die gesamte Vertiefung, in der sich die gefärbte Probe befindet, mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop untersuchen. Wie in Abschnitt 11 beschrieben, sollte die Fluoreszenz bei 200-500facher Vergrößerung sichtbar sein. (Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Proben unmittelbar nach dem Anfärben abgelesen werden; Proben können aber auch bis zu 72 Stunden bei 2-8 °C im Dunkeln aufbewahrt werden). 11 INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE 11.1 KONTROLLEN 11.1.1 Positive Kontrollobjektträger Beim Kontrollobjektträger, der gemäß Abschnitt 10 angefärbt wurde, sollten Zellen mit intrazellulären zytoplasmatischen Granula sichtbar werden, die, im Gegensatz zum roten Hintergrund gegengefärbten Materials, eine apfelgrüne Fluoreszenz aufweisen. Diese Zellen sind etwas größer als Epithelzellen der Atemwege, weisen aber bei Infektion mit RSV ähnliche zytoplasmatische Fluoreszenz auf. Positive Kontrollobjektträger müssen verwendet werden, um überprüfen zu können, dass das Testverfahren ordnungsgemäß durchgeführt wurde. 11.1.2 Negative Kontrolle Falls eine negative Kontrolle erwünscht ist, empfiehlt sich die Verwendung von nicht infizierten, intakten Zellen des Typs, der zur Kultur und Isolierung von RSV verwendet wird. Die Zellen sind wie in Abschnitt 10 beschrieben zu präparieren, zu fixieren und anzufärben.

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11.2 KLINISCHE PROBEN 11.2.1 Erscheinungsbild RSV-infizierter Zellen RSV-infizierte Epithelzellen der Atemwege weisen apfelgrüne, fluoreszierende, intrazelluläre, zytoplasmatische Granula auf. In späteren Stadien der Infektion kann RSV-Antigen auf isolierte Bereiche des Zytoplasmas beschränkt sein, die als kleine, schlecht definierte Granula einzeln oder in Gruppen sichtbar werden. Nicht infizierte Zellen sind bei Gegenfärbung mit Evans-Blau rot gefärbt. 11.2.2 Interpretation Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn eine oder mehrere Zellen der fixierten, angefärbten Probe die typische Fluoreszenz aufweisen. Eine negative Diagnose wird gestellt, wenn die fixierten, angefärbten Proben nach Anfärbung mit dem Reagenz keine Fluoreszenz aufweisen. Bei direkt angefärbten nasopharyngealen Absaugsekretproben müssen mindestens 20 nicht infizierte Epithelzellen der Atemwege auf dem Objektträger sichtbar sein, um ein negatives Ergebnis zu rechtfertigen. (Siehe unter 11.2.3, wenn zu wenig Zellen vorliegen). 11.2.3 Zu wenig Zellen Falls die in der Vertiefung des Objektträgers befindliche Präparation zu wenig Zellen aufweist, wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten bei 380 g und Raumtemperatur (15-30 °C) noch einmal zentrifugiert. Die Zellen werden in einer kleineren Menge PBS resuspendiert (25 µL), bevor sie wieder auf die Testfläche des Objektträgers aufgebracht werden. Alternativ kann eine neue klinische Probe angefordert werden. 12 BEGRENZUNGEN DER METHODE 12.1 Das FITC-Reagenz kann Stämme von Staphylococcus aureus, die große Mengen Protein A enthalten, unspezifisch anfärben. Dies ist auf eine nicht immunbedingte Wechselwirkung zwischen Protein A und dem Fc-Teil des monokonalen Antikörpers zurückzuführen; derartige Beobachtungen wurden auch bei anderen Fluoreszenztests gemacht, die auf monoklonalen und polyklonalen Antikörpern basieren23. Bei diesen Färbungen erhält wird aber nicht das typische intrazelluläre Fluoreszenzmuster erhalten, das bei RSV-infizierten Zellen beobachtet wird (beschrieben in Abschnitt 11.2.1) und sie sind als unspezifisch zu interpretieren. 12.2 Es darf nur das mit dem Kit gelieferte Eindeckmedium verwendet werden. 12.3 Das Erscheinungsbild der erzielten Fluoreszenz kann abhängig vom Typ des Mikroskops und der benutzten Lichtquelle unterschiedlich sein. 12.4 Es empfiehlt sich, zum Abdecken der gesamten 6 mm großen Vertiefung 25 µL Reagenz zu verwenden. Eine Reduzierung dieses Volumens kann zu Schwierigkeiten beim Abdecken der von der Probe eingenommenen Fläche führen und die Empfindlichkeit herabsetzen. 12.5 Alle Reagenzien werden in festgelegten Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung kann beeinträchtigt werden, falls Reagenzien modifiziert oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten Bedingungen gelagert werden.

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12.6 Wird RSV nicht nachgewiesen, kann das die Folge verschiedener Faktoren sein: Probengewinnung zu einem ungeeigneten Zeitpunkt der Krankheit, unkorrekte Probengewinnung und/oder unkorrekte Handhabung der Proben usw. Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit einer RSV-Infektion nicht aus. 12.7 Das Vorliegen von RSV in nasopharyngealen Sekreten schließt nicht notwendigerweise die Möglichkeit einer begleitenden Infektion mit anderen Pathogenen aus9,12. Die Testergebnisse sind zusammen mit verfügbaren Informationen aus epidemiologischen Untersuchungen, der klinischen Diagnose des Patienten und anderen diagnostischen Verfahren zu interpretieren. 12.8 Die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit epidemiologischen Informationen, dem klinischen Erscheinungsbild und anderen diagnostischen Verfahren interpretiert werden. 13 ERWARTETE WERTE Die Nachweisrate für RSV wird vom Zeitpunkt der Probengewinnung und von Handhabung, Aufbewahrung und Transport der Proben beeinflußt. Sie hängt außerdem vom Alter, dem allgemeinen Gesundheitszustand, den geographischen Verhältnissen und dem sozioökonomischen Status der getesteten Personenkreise ab. Respiratory Syncytial Viren herrschen in der ganzen Welt vor und sind mit signifikanten saisonalen Atemwegsinfektionen in gemäßigten und tropischen Klimazonen assoziiert. In gemäßigten Klimazonen erfolgt der jährliche Ausbruch von RSV-Infektionen vorwiegend während der Wintermonate. Erkrankungen der unteren Luftwege sind während diesen Perioden häufiger und RSV ist für 20 % der Atemwegsinfektionen verantwortlich. Deshalb wird erwartungsgemäß während der saisonalen Ausbrüche eine signifikante Anzahl von nasopharyngealen Absaugsekreten RSV-positiv sein. RSV-Infektionen treten in allen Altersgruppen auf, die Symptome sind bei Säuglingen jedoch am ernsthaftesten. 50 % aller Säuglinge machen während ihres ersten Lebensjahres eine RSV-Infektion durch. RS-Viren sind für Ausbrüche von Atemwegsinfektionen in Krankenhäusern, insbesondere Kinderstationen und Altersheimen verantwortlich, wo sie mit erhöhten Krankheits- und Mortalitätsraten in Verbindung stehen. 14 SPEZIFISCHE LEISTUNGSKRITERIEN 14.1 KLINISCHE STUDIEN Der IMAGEN™ RSV-Test wurde in zwei klinischen Prüfzentren an nasopharyngealen Sekreten von stationär behandelten Säuglingen, die Symptome einer Atemwegsinfektion aufwiesen, ausgewertet. Im Prüfzentrum 1 wurden 305 während den Winterepidemien 1982-83 und 1983-84 gewonnene Proben mit dem IMAGEN™ RSV-Test und mit dem Standard-Test zur RSV-Diagnose (Virusisolierung auf einschichtigen HeLa-Zellkulturen und indirekter Immunfluoreszenztest mit polyklonalen Antikörpern vom Rind) des Zentrums getestet. Ein Ergebnis wurde als positiv betrachtet, wenn entweder der indirekte bovine polyklonale Immunfluoreszenztest oder die Gewebekultur positiv ausfielen. Bei 8 Proben, bei denen im indirekten Immunfluoreszenztest eine unspezifische Bindung auftrat, wurde die Diagnose allein auf dem Ergebnis der Zellkultur erstellt.

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Das Prüfzentrum 2 testete 200 während der Winterepidemie 1983/84 gewonnene Proben und 50 bekannt positive Proben aus Epidemien der vorangegangenen 5 Jahre mit dem IMAGEN™ RSV-Test und dem indirekten Immunfluoreszenztest unter Verwendung polyklonaler Antikörper. Zum Zeitpunkt der Probengewinnung wurde auch die Beimpfung einer Kultur zur Virusisolierung vorgenommen; diese wurde jedoch bei Proben, die im Immunfluoreszenztest positiv ausfielen, abgebrochen. Im Immunfluoreszenztest RSV-negative Proben und Proben von Patienten, bei denen eine Infektion mit einem zweiten Virus zusätzlich zur RSV-Infektion als möglich erachtet wurde, wurden auch in der Zellkultur getestet. Das Ergebnis wurde als positiv betrachtet, wenn entweder der indirekte Immunfluoreszenztest oder die Zellkultur positiv ausfielen. Bei 8 Proben erwies sich das Antigen nach der Objektträgeraufbewahrung als verdorben (was anhand einer Veränderung des indirekten Immunfluoreszenztestergebnisses nach Lagerung und Beobachtung einer schwachen Fluoreszenz mit beiden Reagenzien nachgewiesen wurde). Mit dem IMAGEN™ RSV-Test wurde für bekannt positive Proben, die im Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden Epidemien gewonnen wurden, eine RSV-Infektion diagnostiziert, ein Beweis dafür, dass die verwendeten monoklonalen Antikörper gegen stabile RSV-Antigene gerichtet sind. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die diagnostische Leistungsfähigkeit des Reagenzes durch bekanntermaßen auftretende geringfügige Antigenveränderungen beeinträchtigt wird2,24. Die Ergebnisse beider Studien sind in Tabelle 14.1 dargestellt. Von den 547 getesteten Proben korrelierte der IMAGEN™ RSV-Test mit dem Standard-Test zur RSV-Diagnose in 525 Fällen (Korrelation = 96 %). Empfindlichkeit und Spezifität des IMAGEN™ RSV-Tests betrugen insgesamt 93 % bzw. 98 %, wenn von einer 100%igen Spezifität und Empfindlichkeit der Standardmethoden ausgegangen wird. Die Vorhersagewerte für positive und negative Tests betrugen 98 % bzw. 94 %. Empfindlichkeit, Spezifität und Aussagewerte wurden berechnet wie oben beschrieben25. Tabelle 14.1 Vergleich der Testergebnisse zwischen dem IMAGEN™ RSV-Test und dem an zwei klinischen Prüfzentren angewendeten Standard-Test zur RSV-Diagnose TEST ERGEBNIS Standardtest IMAGEN™ RSV-Test

Neg Neg

Pos Pos

Pos Neg

Neg Pos

Prüfzentrum 1 Prüfzentrum 2

220 64

74 167

6 11

5 0

ANZAHL DER GETESTETEN PROBEN 284 241 17 5 14.2 KREUZREAKTIVITÄT Der IMAGEN™ RSV-Test wurde an Präparationen aus anderen Viren und Mikroorganismen durchgeführt, die mit hoher Wahrscheinlichkeit in Sekreten des Respirationstraktes vorhanden sind. Alle getesteten Organismen (Tabelle 14.2) fielen mit dem IMAGEN™ RSV-Testreagenz negativ aus.

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Tabelle 14.2 Im IMAGEN™ RSV-Test getestete und für nicht reaktiv befundene Organismen Adenovirus 1-4, 7, 21 Neisseria gonorrhoeae Branhamella catarrhalis Neisseria lactamica Chlamydia trachomatis Neisseria meningitidis Coxsackie-Virus, Typ A9, B1, B3 Neisseria perflava Cytomegalie-Virus Parainfluenza-Virus, Typ 1, 2 und 3 Echovirus, Typ 3, 6, 9 Picorna-Virus T-V Herpes-Simplex-Virus, Typ 1 und 2 Polio-Virus- Typ 1 und 2 Influenza-Virus, Typ A und B Rhinovirus Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Neisseria cinerea Varicella-Zoster-Virus

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