Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides

Anne-Laure PRUNIERDirecteur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie

2

Hypermutabilité et adaptation bactériennes

3

Survie des bactéries dans l’environnement : Survie des bactéries dans l’environnement : transmission fidèle du matériel génétiquetransmission fidèle du matériel génétique

≠≠Adaptation des bactéries à un environnement Adaptation des bactéries à un environnement fluctuant : modification du matériel génétiquefluctuant : modification du matériel génétique

Existence d’une petite proportion de bactéries hypermutables au sein des

populations

4

Bactéries non mutatrices avec mutations favorables

Hypermutabilité et évolution

Bactéries non mutatrices avec mutations délétères

Bactéries mutatrices avec mutations délétères

Bactéries mutatrices avec mutations favorables

Chemin direct (lent)

Chemin indirect (rapide) :

Mutateur transitoire

Bactéries mutatrices Bactéries non mutatrices

Pression de sélectionPression de sélection

Taddei et al., Science, 1997

5

Deux mécanismes principaux de modification du matériel génétique :

Partiellement contrôlés par le système de réparation des mésappariements (SRM)

Acquisition de matériel génétique étranger (transfert horizontal puis recombinaison homéologue)

Acquisition de mutations et transmission à la descendance (transfert vertical)

6

Le SRM chez E. coli

Marti, T.M. et al., J. Cell. Physiol., 2002

7

Conservation de la protéine MutS

S.aureus 347 ISVKDGGLFKVGFNTQLDEYLEASKNGKTWLAELQAKERQRTGIKSLKISFNKVFGYFIEB.subtilis 350 LSVKEGNLIKDGYNQKLDEYRDASRNGKDWIARLEQQEREYTGIRSLKVGFNKVFGYYIEE.coli 357 VLVRDGGVIASGYNEELDEWRALADGATDYLERLEVRERERTGLDTLKVGFNAVHGYYIQP.aeruginosa 359 AVIRDGGVIKTGYDAELDELQALSENAGQFLMDLEAREKARTGLPNLKVGYNRIHGYFIE

S.aureus 407 ITRANLQNFEPSEFGYMRKQTLSNAERFITDELKEKEDIILGAEDKAIELEYQLFVQLREB.subtilis 410 VTKANLHLLE--EGRYERNETLTNAERYITPELKEKEALILEAENNICELEYELFTELREE.coli 417 ISRGQSHLAP---INYMRRQTLKNAERYIIPELKEYEDKVLTSKGKALALEKQLYEELFDP.aeruginosa 419 LPRVQAEQAP---ADYIRRQTLKGAERFITPELKAFEDKALSAQSRALAREKALYEELLE

S.aureus 467 EVKKYTERLQQQAKIISELDCLQSFAEIAQKYNYTRPSFSENKTLELVESRHPVVERVMDB.subtilis 468 KVKQYIPRLQQLAKQMSELDALQCFATISENRHYTKPEFSKD-EVEVIEGRHPVVEKVMDE.coli 474 LLLPHLEALQQSASALAELDVLVNLAERAYTLNYTCPTFIDKPGIRITEGRHPVVEQVLNP.aeruginosa 476 RLIGHLAPLQDSASALAELDVLANLAERALNLDLNRPRFVEHTCLHIEQGRHPVVEQVLE

S.aureus 527 YNDYVPNNCRLDNETFIYLITGPNMSGKSTYMRQVAIISIMAQMGAYVPCKEAVLPIFDQB.subtilis 527 SQEYVPNNCMMGDNRQMLLITGPNMSGKSTYMRQIALISIMAQIGCFVPAKKAVLPIFDQE.coli 534 EP-FIANPLNLSPQRRMLIITGPNMGGKSTYMRQTALIALMAYIGSYVPAQKVEIGPIDRP.aeruginosa 536 TP-FVANDLALDADTRMLVITGPNMGGKSTYMRQTALIVLLAHIGSFVPAARCELSLVDR

S.aureus 587 IFTRIGAADDLVSGKSTFMVEMLEAQKALTYATEDSLIIFDEIGRGTSTYDGLALAQAMIB.subtilis 587 IFTRIGAADDLISGQSTFMVEMLEAKNAIVNATKNSLILFDEIGRGTSTYDGMALAQAIIE.coli 593 IFTRVGAADDLASGRSTFMVEMTETANILHNATEYSLVLMDEIGRGTSTYDGLSLAWACAP.aeruginosa 595 IFTRIGSSDDLAGGRSTFMVEMSETANILHNATDKSLVLMDEVGRGTSTFDGLSLAWAAA

8

Conservation de la protéine MutL

S.aureus 58 VDNGSGIEAE DLGLVFHRHA TSKLDQDEDL FHIRTLGFRG EALASISSVA KVTLKTCTDN B.Subtilis 58 LDNGEGMENE DCKRAFRRHA TSKIKDENDL FRVRTLGFRG EALPSIASVS HLEITTSTGE E.coli 57 RDNGCGIKKD ELALALARHA TSKIASLDDL EAIISLGFRG EALASISSVS RLTLTSRTAE P.aerugin 61 RDDGRGIPAD DLPLALARHA TSKIRELEDL ERVMSLGFRG EALASISSVA RLTMTSRTAD

S.aureus 118 ANGNEIYVEN GEILNH--KP AKAKKGTDIL VESLFYNTPA RLKYIKSLYT ELGKITDIVN B.Subtilis 118 GAGTKLVLQG GNIISE--SR SSSRKGTEIV VSNLFFNTPA RLKYMKTVHT ELGNITDVVN E.coli 117 QQEAWQAYAE GRDMNVTVKP AAHPVGTTLE VLDLFYNTPA RRKFLRTEKT EFNHIDEIIR P.aerugin 121 AGEAWQVETE GRDMQPRVQP AAHPVGTSVE VRDLFFNTPA RRKFLRAEKT EFDHLQEVIK

S.aureus 176 RMAMSHPDIR IALISDGKTM LSTNG---SG RTNEVMAEIY GMKVARDLVH ISGDTSDYHI B.Subtilis 176 RIALAHPEVS IRLRHHGKNL LQTNG---NG DVRHVLAAIY GTAVAKKMLP LHVSSLDFEV E.coli 177 RIALARFDVT INLSHNGKIV RQYRAVPEGG QKERRLGAIC GTAFLEQALA IEWQHGDLTL P.aerugin 181 RLALARFDVA FHLRHNGKTI FALHEARDEL ARARRVGAVC GQAFLEQALP IEVERNGLHL

S.aureus 233 EGFVAKPEHS R-SNKHYISI FINGRYIKNF MLNKAILEGY HTLLTIGRFP ICYINIEMDP B.Subtilis 233 KGYIALPEIT R-ASRNYMSS VVNGRYIKNF PLVKAVHEGY HTLLPIGRHP ITFIEITMDP E.coli 237 RGWVADPNHT TPALAEIQYC YVNGRMMRDR LINHAIRQAC EDKLGADQQP AFVLYLEIDP P.aerugin 241 WGWVGLPTFS R-SQPDLQYF YVNGRMVRDK LVAHAVRQAY RDVLYNGRHP TFVLFFEVDP

S.aureus 292 ILVDVNVHPT KLEVRLSKEE QLYQLIVSKI QEAFKDRILI PKNNLDYVPK KNKVLYSFEQ B.Subtilis 292 ILVDVNVHPS KLEVRLSKET ELHDLIRDGI KDVFKQQQLI PSAQ---VPK KSAPAIKNEQ E.coli 297 HQVDVNVHPA KHEVRFHQSR LVHDFIYQGV LSVL-QQQLE TPLPLDDEPQ PAPRSIPENR P.aerugin 300 AVVDVNVHPT KHEVRFRDSR MVHDFLY--- -GTL-HRALG EVRPDDQLAP PGATSLTEPR

9

SRM et recombinaison

Inhibe la recombinaison entre fragments d’ADN homéologues : barrière à l’échange interspécifique (Matic et al., Trends Microbiol., 1996)

Important pour la notion de mutateur transitoire : réacquisition facilitée d’un SRM fonctionnel par recombinaison (de Visser, Microbiology, 2002)

Confirmé par la structure en mosaïque des gènes mutS et mutL (Denamur et al., Cell, 2000)

10

Hypermutabilité et pathogénicité

Données contradictoires sur cette relation

Avantage dans certaines pathologies, dans certaines conditions

Ex : forte pression antibiotique

environnement hostile et fluctuant

Altérations du SRM dans de nombreux cas

11

Hypermutabilité et résistance aux antibiotiques Mutateurs = facteurs de risque :

résistance par mutation mutations compensatoires du coût biologique de la résistance

Antibiotiques = sélecteurs de l’hypermutabilité (Blazquez, Clin. Infect. Dis, 2003)

Sélection de clones

résistants

Antibiotique A

Antibiotique B

Sélection de clones

résistants

12

Hypermutabilité et mucoviscidose

13

La mucoviscidose

Maladie génétique due à une mutation du gène cftr : atteintes pulmonaires et digestives (circulation difficile du chlore à travers la membrane cellulaire)

Atteinte pulmonaire : mucus épais contribuant à l’inflammation et à l’infection, principale cause de décès

14

Infections bactériennes chez les malades

Espèces bactériennes impliquées : H. influenzae (patients jeunes) S. aureus (patients jeunes) P. aeruginosa (patients plus âgés)

Adaptation pour combattre la réponse inflammatoire de l’hôte :

P. aeruginosa dits « mucoïdes » small colony variants de S. aureus

Administration prolongée de multiples antibiotiques

15

Hypermutabilité des souches isolées de mucoviscidose

P. aeruginosa : 19,5% de souches hypermutables, phénotype surtout dû à des altérations du SRM (Oliver et al., Science, 2000)

H. influenzae : 14,5% de souches hypermutables (Roman et al., J. Clin. Microbiol., 2004)

16

Les macrolides

17

Surtout actifs sur les bactéries à Gram positif

Inhibent la synthèse protéique : fixation à la sous unité 50S du ribosome (centre peptidyl transférase)

18

Résistance par mutation (1)

L4

L22

NISSEN et al., Science, 2000

19

Particulièrement aux positions A2058 et A2059

Mutations de l’ARNr 23S (gène rrl) : faible nombre de copies du gène

mycobactéries (1 copie) H. pylori (2 copies) S. pneumoniae (4 copies)

Jamais décrites chez S. aureus : 5/6 copies

Résistance par mutation (2)

20

S. aureus

Macrolide

RibosomeRibosome

Résistance aux macrolides chezS. aureus

Gènes de résistance acquis :

MéthylaseCH3

(1)erm

(2)

ABC transporteur

msr(A)

Modification enzymatique (3)

21

Résultats

22

Point de départ de l’étude

Observation au CHU de Caen : augmentation importante de la proportion de S. aureus résistants aux macrolides isolés de mucoviscidose (<30% en 1997, >50% en 1999)

Corrélation avec l’augmentation de l’utilisation de l’azithromycine pour son effet indirect putatif sur P. aeruginosa (anti-adhésion et réduisant l’inflammation) ?

23

Analyse des mécanismes de résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose

24

Mutations de la cible des macrolidesPatient

(Souches)Gènes de résistance

ARNr 23S

L4 L22Domaine V Domaine II

1A

1B

1C, 1D

-

-

-

A2058T

A2059G

A2058G

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2B

2C

erm

-

-

A2058G

-

-

-

-

-

-

3A

3C

3D

erm

erm

erm

4

16

-

8

-

-

6

-

-

-

-

-

4A, 4B msr(A) T2089C, C2207T - - -

5B

5C, 5D, 5E

erm

-

C2163T

A2058G, C2207T

7

-

14

-

1

-

6B

6C

-

-

A2058G + 3

A2058G

-

-

-

-

-

1

7 - - - 2 -

8 - A2059G - - -

9 - A2058G - - -

(4/5)

(4/5)

(4/5)

(4/5)

(3/5)

(4/6)

25

Mutation du gène rrl Mutation successivement dans chaque copie

X

1

X

2

X

3

X

4

X

5

X

6

X

1 3 5

X X X X X

2 4 6

Mutation d’une copie puis transmission aux autres par conversion génique

26

Analyse du gène rrl quand 2 mutations adjacentes sont détectéesSouche

MutationsCopie A Copie B Copie C Copie D Copie E Copie F

4A2089C, 2207T

2089C, 2207T wt 2089C, 2207T wt 2089C, 2207T wt

5C2058G, 2207T

2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T

5D2058G, 2207T

2058G, 2207T wt 2058G, 2207T wt 2058G, 2207T 2058G, 2207T

5E2058G, 2207T

2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T wt 2058G, 2207T 2058G, 2207T

Les mutations semblent s’être répandues par conversion génique entre les copies du gène rrl : recombinaison facilitée ?

27

Mutations des gènes domestiques

Détection d’altérations de gènes domestiques chez les souches accumulant de nombreuses mutations ribosomales :

sodA : résistance au stress oxydatif

spa : adhésion

28

Recherche de souches hypermutables parmi des isolats cliniques de S. aureus

29

Proportion de souches hypermutables chez les S. aureus isolés ou non de mucoviscidose

Test de Fisher (qualitatif): différence significative (p=0,0045)

Test de Mann-Whitney (quantitatif): différence significative (p=0,05)

Confirmé sur streptomycine

13 / 89: fréquence de mutation sur rifampicine >

10-7

1 / 74: fréquence de mutation sur rifampicine >

10-7Les souches résistantes aux macrolides isolées de

mucoviscidose accumulant de nombreuses mutations (ribosome + gènes domestiques) n’étaient pas

hypermutables

!

30

Analyse moléculaire de mutS et mutL chez les S. aureus cliniques

Gènes très conservés chez S. aureus

10 paires d’amorces définies

Séquençage intégral de la région mutSL chez les mutateurs et chez 4 souches contenant de nombreuses mutations ribosomales

31

Mutations de la cible des macrolidesPatient

(Souches)Gènes de résistance

ARNr 23S

L4 L22Domaine V Domaine II

1A

1B

1C, 1D

-

-

-

A2058T

A2059G

A2058G

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2B

2C

erm

-

-

A2058G

-

-

-

-

-

-

3A

3C

3D

erm

erm

erm

4

16

-

8

-

-

6

-

-

-

-

-

4A

4B

msr(A)

msr(A)

T2089C, C2207T

T2089C, C2207T

-

-

-

-

-

-

5B

5C, 5D, 5E

erm

-

C2163T

A2058G, C2207T

7

-

14

-

1

-

6B

6C

-

-

A2058G + 3

A2058G

-

-

-

-

-

1

7 - - - 2 -

8 - A2059G - - -

9 - A2058G - - -

32

Souches 3A et 5B Pas d’amplification avec les amorces mutSL Le gène mutS est indétectable en Southern blot :

A B C

S 3A 5B S 3A 5B S 3A 5B

S: souche de référence S. aureus RN4220

Électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN total restreint

Hybridation avec une sonde rrl (contrôle positif)

Hybridation avec une sonde mutS

Etape ultime de l’évolution des Etape ultime de l’évolution des S. aureusS. aureus isolés de mucoviscidose? isolés de mucoviscidose?

33

Altérations des protéines MutS et MutLSouche Hypermutabilité MutS MutL

1A + délétion F488 à R528, T192A aucune

UCN22 + délétion 5060 pb (1900 pb mutS et tout mutL)

UCN23 + aucune aucune

UCN24 + aucune aucune

UCN25 + aucune aucune

UCN26 + aucune aucune

UCN27 + aucune del L275 à R279

UCN28 + aucune Y314H

UCN29 +N181H, N373D, T415M, N588D, L811S,

S814CN364D, S377R, N418D

UCN30 + aucune aucune

UCN31 + aucune aucune

3A - délétion

3C -N181H, S201P, N373D, T415M, V773G,

G789D, L811SND

4A - aucune ND

5B - délétion

34

Analyse des gènes mutS et mutL chez S. aureus

35

Le SRM des bactéries à Gram positif

Surtout étudié chez B. subtilis, L. monocytogenes, S. pneumoniae

Corégulation des gènes mutS et mutL : opéron (B. subtilis, L. monocytogenes) séquences régulatrices similaires en amont (S. pneumoniae)

36

pBT1 (6.73kb)

Analyse in silico de la région mutSL chez S. aureus

U1S L4S

(1993 pb)

(8723 pb)

U5S L1L

(1211 pb)

U5L glpL

(717 pb)

U1L L4L

(1785 pb)

? ΔG=-17.3 kJ/mol ? ΔG=-22.4 kJ/mol

302 pb 12 pb 14 pb 36 pb 348 pb

glpFSA1136 mutS (2619 pb) mutL (2010 pb) glpP HP

37

Analyse par RT-PCR de la région mutSL

500 pb

1000 pb

1500 pb2000 pb

T 42 S 42 S 42 S 42 S

glpFSA1136 mutS (2619 pb) mutL (2010 pb) glpP HP

(1993 pb)

(+pBT1 = 8723 pb)

(1211 pb) (717 pb)

(1785 pb)

38

Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus

pORI23

pORI23mutS

pORI23mutS1A

pORI23mutS29

RN4220 + pORI23mutS

mutS + pORI23mutS

RN4220 + pORI23mutS1A

mutS + pORI23mutS1A

mutS + pORI23mutS29

RN4220 + pORI23mutS29

mutS + pORI23

RN4220 + pORI23

39

Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus

4

5

6

7

8

9Inv

erse

Lo

g o

f m

uta

tio

n f

req

uen

cie

s

4

4220 + pORI23422

0

4220 + pORI2

3 mutS2

9

mutS

mutS +

pORI23

mutS + pORI23 mutS

mutS + pORI23 mutS1

A

mutS + pORI23 mutS29

Log

in

vers

e d

es f

réq

uen

ces d

e

mu

tati

on

5

7

6

8

9

4220 + pORI23 mutS

4220 + pORI2

3 mutS1

A

40

3

4

5

6

7

8Inv

erse

Lo

g o

f m

uta

tio

n f

req

uen

cies

3

Log

in

vers

e d

es f

réq

uen

ces d

e

mu

tati

on

4

6

5

7

8

4220 + pAT mutL

4220 + pAT392

42204220 +

pAT mutL27

4220 + pAT

mutL29mutL

mutL + pAT392

mutL+ pAT mutL

mutL + pAT

mutL27

mutL + pAT

mutL29

Rôle de MutL dans l’hypermutabilité chez S. aureus

41

Rôle de MutS et MutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (1)

pBT1

(TS, CHLR)

pBT1sodA (100%)

pBT1sodA (97%)

pBT1sodA (94%)

pBT1sodA (87,5%)

pBT1sodA (74%)

pBT1sodA (82,3%)

RN4220

mutS

mutL

3 cultures successives à 42°C + CHL

42

S. aureus RN4220

707580859095100

DNA sequence identity

Su

rviv

al a

fter

3 s

ub

cult

ure

s at

42

°C (

rati

o o

f th

e in

itia

l in

ocu

lum

)1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

S. aureus RN4220

Pourcentage d’identité avec sodA

y=4.45x10-2X-3.3815

R²=0.9367

Su

rvie

ap

rès 3

cu

ltu

res

su

ccessiv

es à

42°C

(ra

tio d

e

l’in

ocu

lum

in

itia

l)

Rôle de mutS et mutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (2)

S. aureus mutL

707580859095100

DNA sequence identity

Su

rviv

al a

fter

3 s

ub

cult

ure

s at

42

°C (

rati

o o

f th

e in

itia

l in

culu

m)

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

S. aureus mutL

DNA sequence identity

y=4.72x10-2X-3.5188

R²=0.7393

Su

rvie

ap

rès 3

cu

ltu

res

su

ccessiv

es à

42°C

(r

ati

o d

e l’i

nocu

lum

in

itia

l)Pourcentage d’identité avec sodA

S. aureus mutS2

707580859095100

DNA sequence identity

Su

rviv

al a

fter

3 s

ub

cult

ure

s at

42

°C (

rati

o o

f th

e in

itia

l in

ocu

lum

)

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

DNA sequence identity

y=4.18x10-2X-3.0942R²=0.7726

S. aureus mutSS. aureus mutS

Su

rvie

ap

rès 3

cu

ltu

res

su

ccessiv

es à

42°C

(r

ati

o d

e l’i

nocu

lum

in

itia

l)

Pourcentage d’identité avec sodA

43

Relation entre hypermutabilité et résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose

44

77 % chez les S. aureus hypermutables

50 % chez les S. aureus non hypermutables

Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes (p<0,05 Test de Fisher)

Résistance à l’érythromycine

45

Sélection de clones résistants

Erythromycine Azithromycine Télithromycine

4

5

6

7

8

9

10

inve

rse

log

of

mu

tati

on

fre

qu

enci

es UCN23

UCN30

UCN22

GR87

RN4220

Souches

hypermutables

Souches témoins

Log

in

vers

e d

es f

réq

uen

ces d

e

mu

tati

on

4

5

6

7

8

9

10

46

Conclusions (1) Mucoviscidose : résistance aux macrolides des S. aureus

surtout due à des mutations de la cible ribosomale

Au moins trois copies du gène rrl étaient mutées chez chaque mutant de l’ARNr 23S étudié

La dissémination d’une mutation rrl entre les différentes copies du gène semble se faire par conversion génique

Relation avec l’administration prolongée d’azithromycine aux patients atteints de mucoviscidose (?)

47

Conclusions (2) Ces observations pourraient être liées à une forte

proportion de souches hypermutables chez les S. aureus dans la mucoviscidose:

Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes à l’érythromycine

Les souches hypermutables sensibles aux macrolides acquièrent plus facilement une résistance par rapport aux souches sauvages

L’utilisation de combinaisons d’antibiotiques semble nécessaire pour éviter l’apparition de souches hypermutables

48

Conclusions (3) Spécificité de l’hypermutabilité des souches

isolées de mucoviscidose ?

Non : forte proportion de mutateurs dans d’autres pathologies

(ex: ITU – Denamur et al., J. Bacteriol., 2002)

Effets conjugués des pressions (antibiotiques + réponse immunitaire de l’hôte) : sélection de mutateurs

49

Conclusions (4)

Rôle de MutS et MutL chez S. aureus : Hypermutabilité : confirmé chez 4 souches cliniques Recombinaison : effet limité ?

Perspectives : Autres gènes mutateurs chez S. aureus ? Relation entre hypermutabilité et évolution du génome

de S. aureus ?

Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides

Anne-Laure PRUNIERDirecteur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie