Génétique des Maladies Multifactorielles

Génétique des

Maladies Multifactorielles

Stéphanie DebetteMCU-PH Epidémiologie – Neurologie Lariboisière

[email protected]

Approche épidémiologique

Epidémiologie génétique = Branche de l’épidémiologie qui étudie le rôle de

facteurs génétiques et de leur interaction avec des facteurs environnementaux dans la survenue de maladies

Khoury et al., Fundamentals of Genetic Epidemiology, Oxford University Press 1993

Génétique des maladies multifactorielles

Physiopathologie: Meilleure compréhension des mécanismes moléculaires

conduisant à la maladie

Prédiction de risque: Identification de populations à risque de développer

maladie, en fonction de patrimoine génétique Prévention ciblée (ou « Médecine personnalisée »)

Pharmacogénétique: Identification de meilleurs répondeurs à traitement ou

d’individus à risque accru d’effets secondaires « Traitement personnalisé »

McCarthy, Nat Rev Med 2008

Génétique des maladies multifactorielles:pourquoi?

McCarthy, Nat Rev Genet 2008

Epidemiologie génétique Physiopathologie

Identification de facteurs de susceptibilité génétique

Meilleure compréhension de biologie sous-jacente

Nouvelles Cibles thérapeutiques

Biomarqueurs Prévention

ex: monitorer évolution maladie

ex: mise en évidenceFDR environnemental

Découverte gènes de susceptibilité maladie de Crohn a révélé rôle central autophagie et exposition à microbes intestinaux

Yano & Kurata, Nat Immunol 2009

Nouvelles voies pour approches thérapeutiques

Abraham, NEJM 2009; Feero, NEJM 2010

Exemple de la maladie de Crohn…

Gène NOD2: détecteur intracellulaire de peptidoglycanes bactériens Gène ATG16L1: dirige composants intracellulaires (microbes) vers lysosomes

Targeting the human microbiome with antibiotics, probiotics, and prebiotics: gastroenterology enters the metagenomics era. Preidis, Gastroenterology 2009

Tabac ↗ risque de polyarthrite rhumatoïde de 1.5 en population générale, mais d’un facteur > 20 si certains variants génétiques sur HLA et PTPN22 sont présents!

Identification de FDR environnementaux par la génétique…

Klareskog, Arthritis Rheum 2006

Amish porteurs de variant génétique sur gène FTO ↗ risque obésité sont protégés de obésité par activité physique

Rampersaud, Arch Intern Med 2008;Kilpeläinen, PLOS Med 2011

Cho & Gregersen, NEJM 2011Ripatti, Lancet 2010

Epidemiologie génétique Prédiction de risque?

Décevant jusqu’ici, car variants génétiques identifiés jusqu’ici = associés à augmentation modeste de risque (OR < 1.5)

Même quand risque relatif plus élevé, pour l’instant pas d’application clinique dans majorité des cas: Allèle Epsilon4 de l’Apolipoprotéine E pour maladie d’Alzheimer

Allèles HLA pour maladies autoimmunes

Combiner Différents variants génétiques (« scores de risque »)

Variants génétiques + autres biomarqueurs (circulants, imagerie…)

CYP2C19 = enzyme impliquée dans bioactivation du clopidogrel

Allele CYP2C19*2 du variant génétique rs4244285 = associé à risque ↑ d’évènements cardiovasculaires

Scott, Clin Pharmacol Ther 2011

Pharmacogénétique, Exemple

FDA / AHA: « boxed warning », évaluer au cas par cas

Utilisation du Clopidogrel en fonction de génotype rs4244285 CYP2C19 chez patients traités par angioplastie pour syndrome coronarien aigu

I. Maladies complexes/multifactorielles vs. mendéliennes

II. Etudes d’association génétique vs. analyses de liaison

III. Quelques rappelsI. Variation génétiqueII. Equilibre de Hardy-WeinbergIII. Déséquilibre de liaison

IV. Etudes d’association génétique (EAG)I. Etudes d’association sur « gènes candidats »II. Etudes d’association génétique pangénomiques

V. Analyse et interprétation des EAGI. Tests multiplesII. Hétérogénéité de populationIII. Réplication

VI. Caractérisation des signaux identifiés, perspectives


Maladies mendéliennes

Maladies mendéliennes (ou monogéniques) = causées par mutation dans un seul gène

Trois modes de transmission:– Autosomique dominant– Autosomique récessif– Récessif lié à l’X

Maladies complexes ou multifactorielles

Maladies ayant de multiples facteurs de susceptibilité génétiques et facteurs de risque environnementaux

Ne suit pas un mode de transmission mendélien

Différentes façon de mesurer contribution de facteurs génétiques:

• Héritabilité: proportion de variance phénotypique due à effets génétiques

• Risque de récurrence: compare proportion d’apparentés de cas qui sont atteints par maladie versus proportion d’individus atteints en population générale

• Analyses de liaison (familles):

Examiner la co-transmission d’une génération à l’autre du phénotype et des allèles de marqueurs génétiques

• Etudes d’association génétique (population générale, cas/témoins):

Comparer fréquence des variants génétiques, entre patients et témoins

Outils en épidémiologie génétique

Courtesy Dr. Dupuis

• Analyses de liaison (familles):

Examiner la co-transmission d’une génération à l’autre du phénotype et des allèles de marqueurs génétiques

plus puissant pour maladies complexes Risch, Science 1996

• Etudes d’association génétique (population générale, cas/témoins):

Comparer fréquence des variants génétiques, entre patients et témoins

Outils en épidémiologie génétique

A A/CT G T T CCopie 1

A A/CT G T T CCopie 2

1000 témoins:

CC: n= 10AC: n= 180AA: n= 810

1000 patients avec AVC:

CC: n= 50AC: n= 250AA: n= 700

Single nucleotide polymorphism (SNP)

Etudes d’association génétique

• Un allèle est associé à un phénotype si sa fréquence diffère plus entre cas et témoins que par le simple hasard. Cela n’implique PAS nécessairement un lien de causalité

chromosome

Phénotype

AVariant génotypé

BVariant causal non observé

Déséquilibre de liaisonAssociation directe(non observée)

Association indirecte(observée)


Quelques chiffres…

• ~3 milliards de paires de bases (nucléotides) dans séquence d’ADN humain

• 20,000 – 25,000 gènes:– 1.5% du génome (reste contient ADN non-codant,

dont introns et séquences régulatrices)– Taille variable, de x100 bases à > 2 millions de bases

• 99.9% de la séquence d’ADN est identique d’un individu à l’autre– Portion variable fait la différence…

Types de variation génétique

• Single Nucleotide Polymorphism (SNP) = polymorphisme mononucléotidique

– Variation individuelle dans séquence nucléotidique– Plusieurs millions de SNPs, fréq >1% (<1% = mutation ou SNV)

A A/CT G T T CCopie 1 Chr (brin+)

A A/CT G T T C

2 Allèles possibles:C ou A

3 Génotypes possibles:CC, CA, AA

Copie 2 Chr (brin+)


Single Nucleotide Polymorphism (SNP) = polymorphisme mononucléotidique

– Variation individuelle dans séquence nucléotidique

– Plusieurs millions de SNPs, fréq >1% (<1% = mutation ou SNV)

– Conséquences:

• Neutre:─ Séquence non codante, non régulatrice─ Séquence codante mais « synonyme »:

exemple: ACC ou ACA même acide aminé (thréonine)

• Modification taux d’expression de gène─ Séquence régulatrice (non codante)

• Modification composition protéine:─ Séquence codante «non-synonyme» ou «missense»─ Séquence codante «non-sense» (induit codon stop)─ Intron, site d’épissage (non codante)


« Copy number variants » = CNV: segment d’ADN ou gène présent en nombre variable de copies d’un individu à l’autre

– Perte ou gain– Taille variable (10,000 – 5,000,000 bases)– Découverte plus récente que SNPs– Intra- ou intergénique

Polymorphismes de répétition– Répétition de séquences en tandem, en nombre variable– Taille variable: Microsatellites, STR, VNTR– Intra- ou intergénique

Calcul de fréquences alléliques pour un SNP

Génotype N individus %

AA 200 20%

AG 500 50%

GG 300 30%

TOTAL 1000 100%

Quelle est la fréquence de l’allèle A?


Génotype N individus N allèles

AA 200 400 A

AG 500 500 A 500 G

GG 300 600 G

TOTAL 1000 2000


Freq (A) = (200x2 + 500) / 2000 = 0.45

Quelle est la fréquence de l’allèle G?


Génotype N individus N allèles

AA 200 400 A

AG 500 500 A 500 G

GG 300 600 G

TOTAL 1000 2000


Freq (A) = (200x2 + 500) / 2000 = 0.45

Quelle est la fréquence de l’allèle G?

Freq (G) = (300x2 + 500) / 2000 = 0.55

Equilibre de Hardy-Weinberg

Dans une population dont l'effectif est infini (très grand), panmictique (mariages au hasard), en l'absence de mutation et de sélection, les fréquences alléliques et génotypiques restent constantes d’une génération à l’autre:

Fréquence du génotype aa = p2

Fréquence du génotype aA = 2pq Fréquence du génotype AA = q2

où p = fréquence de l’allèle a

q = fréquence de l’allèle A

• Conditions de Hardy-Weinberg (HW) ne sont généralement pas strictement remplies dans la plupart des populations, mais généralement les génotypes suivent assez bien l’équilibre de HW

• En l’absence d’équilibre de HW on doit se poser la question des causes potentielles

Par exemple lors de génotypage sur plateformes à haut débit, l’absence d’équilibre de HW dans une population témoin est considéré un signe de génotypage de mauvaise qualité


• Comment tester si équilibre de Hardy-Weinberg est présent?


Test de « Goodness of Fit »

où Oi = effectif observé pour génotype i Ei = effectif attendu pour génotype i si équilibre

de HW X2 suit une loi de Chi-2 à 1 degré de liberté

En effet, normalement pour un test de chi-2 de 2 x 3 classes (observé/attendu, aa/aA/AA) il y a 2 degrés de liberté, mais ici on retire un degré de liberté supplémentaire, car on estime les fréquences alléliques à partir des génotypes observés

Si équilibre de HW, alors test de Chi-2 est non significatif

Déséquilibre de liaison

Soit 2 variants génétiques sur même chromosome -Variant 1: Alleles “a” et “A”, fréquences = p(a), p(A)-Variant 2: Alleles “b” et “B”, fréquences = p(b), p(B)

On a 4 combinaisons (ou haplotypes) possibles: AB Ab aB ab

Si les deux variants sont indépendants, i.e. en « équilibre de liaison », alors:p(AB)=p(A) x p(B)

A/a

B/b

Déséquilibre de liaison

Soit 2 variants génétiques sur même chromosome -Variant 1: Alleles “a” et “A”, fréquences = p(a), p(A)-Variant 2: Alleles “b” et “B”, fréquences = p(b), p(B)

On a 4 combinaisons (ou haplotypes) possibles: AB Ab aB ab

Si les deux variants ne sont pas indépendants, ils sont dits en déséquilibre de liaison, i.e. p(AB)≠p(A) x p(B)

Fréquence de AB dépend non seulement de p(A) et p(B) mais aussi du degré de déséquilibre de liaison (r2, D’)

A/a

B/b

A/a

B/b

Indépendants

Recombinaison

A/a

B/b

Dépendants

Recombinaison

• Un allèle est associé à un phénotype si sa fréquence diffère plus entre cas et témoins que par le simple hasard. Cela n’implique PAS nécessairement un lien de causalité

chromosome

Phénotype

AVariant génotypé

BVariant causal non observé

Déséquilibre de liaisonAssociation directe(non observée)

Association indirecte(observée)


• Etudes d’association sur “gènes candidats”:

– Tester association de phénotype avec polymorphismes génétiques candidatsBasé sur hypothèses a priori sur physiopathologie

– Centaines d’études d’association gène candidat publiées sur AVC, HSB, infarctus: peu de loci répliqués de façon convaincante

– Principaux problèmes méthodologiques Petits effectifs Absence de réplication pré-planifiée Mauvais candidat ...


• Exemples d’hypothèses a priori conduisant à la sélection d’un gène candidat:

– Expérimentation animale:

Etudes gène candidat

Inactivation gène LRP1 dans cell. Musculaires lisses souris

Anévrysmes

Variants génétiques

dans LRP1 =

associés aux

anévrysmes aorte

chez l’homme?

Boucher, Science 2003

http://cochin.inserm.fr/la_recherche/plates-formes-technologiques/recombinaison_homologue

• Exemples d’hypothèses a priori conduisant à la sélection d’un gène candidat:

– Association connue avec d’autres maladies qui sont corrélées avec la maladie d’intérêt


Alzheimer AVC

Variants génétiques associés:Gene SNP chr Fréq allèle OR (AD)ApoE epsilon 19 0.11 2.5CR1 rs3818361 1 0.17219 1.18BIN1 rs744373 2 0.27341 1.17CLU rs11136000 8 0.40328 0.85PICALM rs3851179 11 0.37258 0.87

Lambert, 2009; Seshadri, 2010; Naj, 2011; Hollingsworth, 2011

• Exemples d’hypothèses a priori conduisant à la sélection d’un gène candidat:– Fonction du gène laisse supposer que pourrait être impliqué dans

physiopathologie maladie


AVC

Debette & Seshadri, Circ Cardiovasc Genet 2009

Genes Polymorphisms OR (IC95%) PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor 1)Catto, 1997 rs1799768 (-668/4G>5G) NSJood, 2005 rs1799768 NSCPB2 (Carbopeptidase B2, plasma = Thrombin-activable fibrinolysis inhibitor) Leebeek, 2005 -438A>G, 505A>G,1040C>T NSLadenvall, 2007 rs3742264/rs7337140/rs9526136/rs1926447/rs940 OR=2.5(1.4-4.4) PLAT (Plasminogen activator, tissue)Jood, 2005 rs2020918 NSYamada, 2006 rs2020918 NSVKORC1 (vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1)Wang, 2006 rs2359612 (2255T>C) OR=1.8(1.3-2.3)Shen, 2007 rs2359612 OR=1.7(1.4-2.1)

Gène de coagulation,hémostase

Choix des SNPs:

• 1-100 par gènes, en fonction de coût et taille gène

• SNPs « indépendants » si possible, i.e. pas en déséquilibre de liaison

• SNPs potentiellement fonctionnels:

– Codant non-synonyme

– Dans région régulatrice (promoteur, 3’UTR, site de fixation facteur transcription)

– Dans intron, site épissage


• Etudes d’association génétique pangénomiques = GWAS (genome-wide association study)

– Génotyper un très grand nombre (500,000-5,000,000) de variants génétiques distribués sur l’ensemble des chromosomesPAS d’hypothèse a priori sur les loci d’intérêt

– Récemment possible grâce au projet HapMap et aux technologies de génotypage à haut débit HapMap = projet international décrivant les variations

génétiques fréquentes dans différents groupes ethniques Génotypage automatisé et rapide de milliers d’échantillons,

pour des x100,000 SNPs.

Zeggini, Nature Genet 2005


Feero, NEJM 2010

Création micropuce Hybridisation d’ADN

« marqué »

Détectionde fixation « séquence-spécifique »

Interpretation informatisée

GWAS visant à identifier FDR génétiques d’AVC (accident vasculaire cérébral)• Population: 19,602 individus d’origine européenne• Phénotype: AVC, 1,544 cas incidents• SNPs: 2.5 Millions, sur les 22 autosomes

GWAS – présentation résultats

« Manhattan plot »

GWAS visant à identifier FDR génétiques d’AVC (accident vasculaire cérébral)• Population: 19,602 individus d’origine européenne• Phénotype: AVC, 1,544 cas incidents• SNPs: 2.5 Millions, sur les 22 autosomes


« Manhattan plot »

p = 5 x10-8rs11833579rs12425791

NINJ2 (chr12p13)

Ikram et al., NEJM 2009


Représentation régionale des associations de SNPs avec AVC (chr 12p13)

Zondervan, Nature Protocols 2007

GWAS – contraintes logistiques

• Très grands effectifs nécessaires:– > 1,000, voire > 10,000

– Plus si variant rare

– Plus si risque relatif faible

Gènes candidat (18 ou 11 SNPs)

GWAS (500,000 ou 300,000 SNPs)


• Supercalculateurs pour analyser données

prestige des U.S.A et d’AMD

http://www.abysse-tech.com

Nœud de connexion, travail sur

Unix


• Coût encore élevés:

– ~ 500 Euros pour génotyper 1 SNP sur 2000 sujets

– ~ 400,000 Euros pour un GWAS sur 600,000 SNPs sur 2000 sujets

– ~ 800,000 Euros pour un GWAS sur 5,000,000 SNPs sur 2000 sujets

• Gènes candidatsLimite analyse à régions sélectionnées sur données ou hypothèses préalables

Avantages:–Coûte moins cher–Nécessite effectifs moindres

Inconvénients:–Ne permet pas de découvrir de nouveaux gènes, non suspectés–Résultats très décevants en moyenne

• Genome-wideAnalyse de variants répartis sur l’ensemble du génome, sans hypothèse préalable

Avantages:–Permet de découvrir de nouveaux gènes (approche agnostique)–Couvre mieux variation génétique–A permis découverte x100 gènes

Inconvénients:–Nécessite très grands effectifs (collaborations…)–Coût élevé–Infrastructure (supercalculateur)


• Tests multiples en étude d’association génétique

– Multiples SNPs

– Dans un ou plusieurs gènes candidats

– Genome-wide (500,000 à 5,000,000 SNPs)

– Multiples phénotypes

• Comment en tenir compte dans interprétation résultats?

Tests multiples

• H0: pas d’association entre SNP et M

Tests multiples

Réalité

Décision H0 faux H0 vrai

Rejeter H0 correct faux positif

Ne pas rejeter H0 faux négatif correct

α = probabilité d’erreur de type I = probabilité de rejeter H0, alors que H0 = vrai = probabilité de déclarer une association à tortα = seuil de significativité pour un seul test statistique (α = 0.05) ß = probabilité d’erreur de type II = probabilité de ne pas rejeter H0, alors que H0 = faux = probabilité de ne pas détecter une association qui existe1-ß = puissance du test

Correction de Bonferroni

• Si n tests:• seuil de significativité = 0.05/n

• ou garder seuil à 0.05 mais multiplier p par n

• Exemple

Test p

Test1 0.047

Test2 0.03

Test3 0.009

Test4 0.10

Test5 0.02

Correction de Bonferroni

• Si n tests:• seuil de significativité = 0.05/n

• ou garder seuil à 0.05 mais multiplier p par n

• Exemple

Test p

Test1 0.047

Test2 0.03

Test3 0.009

Test4 0.10

Test5 0.02

Surcorrige (conservateur) si tests ne sont pas indépendants, par exemple:SNPs en déséquilibre de liaison

• En pratique…

– Bonferroni

– Autres méthodes: False Discovery Rate, Permutations

– Dans GWAS, généralement seuil fixe à p=5x10-8

Correspond à ~ 1 Million de tests indépendants

Reflète à peu près la réalité, quelque soit la densité des puces

Pour populations européennes…

Tests multiples

• Il faut tenir compte de la structure de la population Faux positifs (associations faussement significatives) si « stratification »

de la population, i.e. si population contient plusieurs sous-populations différant par leur caractéristiques génétiques, notamment fréquences alléliques

Campbell, Nat Genet 2005

Hétérogénéité ethnique

0

50

100

150

200

250

cases controls

Population 1 Population 2

Allele 2 = 20% in cases and controls

Allele 2 = 60% in cases and controls

Population 1 + 2

Allele 2 = 33% in cases and 45% in controls!

0

50

100

150

200

250

cases controls

0

50

100

150

200

250

300

350

cases controls

cases

cases

casescontrols controls

controls

Il est donc essentiel de…– choisir des témoins de la même origine ethnique que les cas– autant que possible du même pays, voire de la même région

Si différentes origines géographiques dans population étudiée, on peut:– stratifier l’analyse par origine géographique (i.e. par pays)– effectuer une analyse groupée en corrigeant sur la

stratification par des méthodes statistiques (contrôle génomique, composantes principales)

Hétérogénéité ethnique

Analyse en composantes principales = appliquée aux donnéesGWAS (génotypes pangénomiques) pour inférer des axescontinus de variation génétique

Price, Nat Genet 2006

• Essentielle pour confirmer qu’une association est réelle• Importance d’utiliser des échantillons de réplication indépendants

Credibilité augmentée quand groupes d’investigateurs multiples

Réplication +++

Ikram, NEJM 2009

Réplication dans article initial• 652/3613 caucasiens• 2430 personnes avec 215 AVC

incidents afro-américains Réplication dans étude asiatique

• 3784/3102 asiatiques Matsushita, J Hum Genet 2010

• Essentielle pour confirmer qu’une association est réelle• Importance d’utiliser des échantillons de réplication indépendants

Crédibilité augmentée quand groupes d’investigateurs multiples

Réplication +++

Ikram, NEJM 2009

Réplication dans article initial• 652/3613 caucasiens• 2430 personnes avec 215 AVC

incidents afro-américains Réplication dans étude asiatique

• 3784/3102 asiatiques Matsushita, J Hum Genet 2010

Rosand, NEJM 2010

• Calcul d’effectif nécessaire doit tenir compte du “winner’s curse” L’étude initiale tend typiquement à surestimer la force de l’association

• Même groupe ethnique initialement Du fait de différences en fréquence allélique, déséquilibre de liaison,

force de l’association Extension à d’autres groupes ethniques dans un 2è temps:

Important pour la généralisabilité des résultats Permet d’affiner le signal du fait de différences de déséquilibre de liaison,

plus forte densité en SNPs...

Réplication +++

Nature 2011; 475:163-165

Refining the signalRefining the signal

Ioannidis, Nat Rev Genet 2009

Where is the causative variant?



Where is the causative variant?

Resequencing and fine mapping around confirmed signals



Where is the causative gene?



Where is the causative gene?

Genome annotationExpression quantitative trait lociExperiments…

• En ~5 ans, GWAS ont identifié des centaines de nouveaux loci associé avec diverses maladies, avec réplication solide

• La plupart dans gènes préalablement non suspectés

• Catalogue online (http://www.genome.gov/gwastudies)71 gènes pour maladie de Crohn Franke, Nat Genet 2010

38 gènes pour diabète de type 2 Voight, Nat Genet 2010

25 gènes pour maladie coronaire Shunkert, Nat Genet 2011

12 gènes pour Alzheimer Hollingworth, Nat Genet 2011

4 gènes pour AVC (problème hétérogénéité…)

Succès et limites des GWAS…

Published Genome-Wide Associations through 6/2010, 904 published GWA at p<5x10-8 for 165 traits

NHGRI GWA Catalogwww.genome.gov/GWAStudies

Prédisposition génétique aux AVC ischémiques

↑ Risque de et susceptibilité auxFacteurs de risque traditionnels

Influence méchanismes responsables des sous-types d’AVC ischémique

HTADiabète

HypercholObesité

Tabac

Athérome

Maladie petites artères

Fibrillation auriculaire

Dissection

Predispose to arterial thrombosis

Module tolérance à ischémie cérébrale

?

NINJ2

PITX2, ZFHX2

9p21, HDAC9

?Other

Gretarsdottir, Ann Neurol 2008Bellenguez, Nat Genet 2012Traylor, Lancet Neurol 2012

Ikram, NEJM 2009

• En ~5 ans, GWAS ont identifié des centaines de nouveaux loci associé avec diverses maladies, avec réplication solide

• La plupart dans gènes préalablement non suspectés

• Catalogue online (http://www.genome.gov/gwastudies)71 gènes pour maladie de Crohn 23% héritabilité 38 gènes pour diabète de type 2 10% héritabilité25 gènes pour maladie coronaire 10% heritabilité12 gènes pour Alzheimer4 gènes pour AVC (problème hétérogénéité…)

Succès et limites des GWAS…

• Variants rares ─ 1000 génome─ Séquençage exons / genome entier (ESP-GO, CHARGE-S…)─ Exome chip

• Copy number variants ─ Segments d’ADN présents en nombre variable de copies

• Modifications épigénétiques─ Modulent « emballage » ADN dans noyau et influencent

expression

• ADN mitochondrial

Perspectives

Au-delà du GWAS…

Merci pour votre attention!Merci pour votre attention!

Génétique des Maladies Multifactorielles

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