This article was downloaded by: [Nipissing University]On: 16 October 2014, At: 12:44Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

Acta Botanica Gallica: BotanyLettersPublication details, including instructions forauthors and subscription information:http://www.tandfonline.com/loi/tabg20

Etude de l'origine et de larépartition des granulesvacuolaires dans les hyphesd'une endomycorhize àvésicules et arbusculesJean Dexheimer a , Joëlle Gérard a , Hassan Ayatti b

& Jaafar Ghanbaja ca Laboratoire de Biologie forestière , associé àl'INRA , équipe “Cytophysiologie des Symbiosesmycorhiziennes”b Service commun d'Etudes biologiques enMicroscopie électroniquec Service commun de Microscopie électronique àTransmission, Université Henri Poincaré , B.P. 239,F-54506 , Vandœuvre CedexPublished online: 27 Apr 2013.

To cite this article: Jean Dexheimer , Joëlle Gérard , Hassan Ayatti & JaafarGhanbaja (1996) Etude de l'origine et de la répartition des granules vacuolaires dansles hyphes d'une endomycorhize à vésicules et arbuscules, Acta Botanica Gallica:Botany Letters, 143:2-3, 167-180, DOI: 10.1080/12538078.1996.10515337

To link to this article: http://dx.doi.org/10.1080/12538078.1996.10515337

PLEASE SCROLL DOWN FOR ARTICLE

Taylor & Francis makes every effort to ensure the accuracy of all theinformation (the “Content”) contained in the publications on our platform.However, Taylor & Francis, our agents, and our licensors make norepresentations or warranties whatsoever as to the accuracy, completeness,or suitability for any purpose of the Content. Any opinions and views

expressed in this publication are the opinions and views of the authors, andare not the views of or endorsed by Taylor & Francis. The accuracy of theContent should not be relied upon and should be independently verified withprimary sources of information. Taylor and Francis shall not be liable for anylosses, actions, claims, proceedings, demands, costs, expenses, damages,and other liabilities whatsoever or howsoever caused arising directly orindirectly in connection with, in relation to or arising out of the use of theContent.

This article may be used for research, teaching, and private study purposes.Any substantial or systematic reproduction, redistribution, reselling, loan,sub-licensing, systematic supply, or distribution in any form to anyone isexpressly forbidden. Terms & Conditions of access and use can be found athttp://www.tandfonline.com/page/terms-and-conditions

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

Acta bot. Gallica, 1996, 143 (213), 167-180.

Etude de l'origine et de Ia repartition des granules vacuolaires dans les hyphes d 'one endomycorhize a vesicules et arbuscules

par Jean Dexheimer C), Joelle Gerard C), Hassan Ayatti () et Jaafar Ghanbaja C)

( 1) Laboratoire de Biologiej(Jrestiere. associti c/ /'1NRA. equipe "Cytophysiologie des Symbioses mycorhiziennes", ('Service commun d'Etudes biologiques en Microscopie e/ectronique, (''Service C0/11/11Wl de Microscopie e/ectronique c) Transmission, Universite Henri Poincare, B.P. 239, F-54506 Vand(ruvre Cedex

( Manuscrit rep1 en amlt 1995: accepte en janvier 1996)

Resume.- Les auteurs ont observe trois types d'inclusions dans les hyphes de I' endophyte : des granules vacuolaires arrondis et denses, des granules vacuo­laires moins denses et plus diffus, des granules inclus dans de petites vesicu­las. Ces diverses inclusions son! etudiees a l'aide de techniques cytochimiques et de !'analyse par spectroscopie d'electrons en perle d'energie. Les granules cytoplasmiques denses correspondent aux granules de polyphosphates deja decrits par de nombreux auteurs. lis renferment du phosphore et du calcium, associes a une fraction proteique. Les granules cytoplasmiques et les granules vacuolaires peu denses et diffus son! uniquement proteiques. Les auteurs emet­tent !'hypothese que les granules intracytoplasmiques proteiques son! les pre­curseurs des granules vacuolaires de polyphosphates. Ces granules se tor­ment dans des vesiculas don! Ia nature n'a pas pu eire precisee. Les granules vacuolaires diffus son! les restes des granules de polyphosphates apres le trans­fer! du phosphore vers Ia plante-h6te. Les granules de polyphosphate son! com­muns dans les hyphes intercellulaires, mais plus rares et souvent absents dans les hyphes de l'arbuscules. Pour les auteurs, cette repartition est en relation avec Ia dynamique des echanges entre les partenaires.

Summary.- The authors have observed three different types of inclusions in hyphae of the endophyte : dense vacuolar granules, less dense and often dif­fuse vacuolar granules and granules included in small cytoplasmic vesicles. These inclusions were studied by cytochemical techniques and by energy elec­tron loss spectroscopy. Dense granules correspond to polyphosphate granules already described by many authors. They contain phosphorus and calcium as­sociated with a proteic fraction. Cytoplasmic granules and diffuse vacuolar granules are protein-rich inclusions without phosphorus and calcium. The au­thors suggest that the cytoplasmic inclusions are precursors of polyphos­phate granules. These inclusions are contained in unknown origin vesicles. The

©Societe botanique de France 1996. ISSN 1253-8078.

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

168 ACTA BOTANICA GALLICA

diffuse protein-rich vacuolar granules are the remaining of polyphosphate granules after the transfer of phosphorus to the host. The polyphosphate granules are common in intracellular hyphae, but more rare and often absent in the hyphae of the arbuscule. For the authors, this repartition is linked with the dynamic of exchanges between the partners of the symbiosis.

Ker ll'lmls : vesicular-arbuscular mycorrhiza- polyphosphate granules- cyto­chemistry - energy electron loss spectroscopy - phosphorus - protein.

INTRODUCTION

Les endomycorhizes a vesicules et arbus­cules (mycorhizes VA ou YAM) sont le type mycorhizien le plus repandu chez les vegetaux vasculaires herbacees et li­gneux. Comme toutes les mycorhizes, el­les ameliorent de maniere tres sensible Ia nutrition minerale de Ia plante-h6te, no­tamment Ia nutrition phosphatee (Harley, 1969 ; Sanders et Tinker, 1971 ; Bowen et a/., 1975 : Callow et a/., 1978 ; Walker et Powell, 1979 ; Cappacio et Callow, 1982 ; Strullu eta/., 1981a et b; Strullu eta/., 1982a et b).

Tous les auteurs, qui ont etudie Ia cyto­logie des endomycorhizes VA, ont decrit dans les vacuoles du champignon de peti­tes inclusions rondes, opaques aux elec­trons. Ces inclusions, observees en micros­copie photonique apres une coloration par le bleu de toluidine, sont colorees en rou­ge. II s'agit des granules metachromatiques signales dans les hyphes de diverses espe­ces de champignons (Chi Ivers et at., 1985 ; Simonet a!., 1984 ), y compris les champi­gnons formant des ectomycorhizes ou des endomycorhizes. Par des microanalyses en rayons X, il a ete montre que ces granules sont riches en phosphore sous forme de polyphosphates (Ashford et a/., 1975 ; Strullu et a!., 1981 a et b ; Strullu et a!., 1986) et, eventuellement, en d'autres ele­ments (calcium, aluminium). Pour Callow eta/. ( 1978), ces granules de polyphospha­tes renfennent 40 % du phosphore total pre­sent dans le champignon.

II est couramment admis qu'ils sont une forme de transport du phosphore par le champignon, entre le sol et Ia plante-h6te

(Cox eta/., 1980), et sont done directement impliques dans Ia nutrition phosphatee de Ia plante-h6te.

Toutefois, dans une etude recente, et pour un champignon ectomycorhizien (Pisoli­thus tinctorius), Orlovich et Ashford ( 1993) emettent !'hypothese que les granules de polyphosphate sont des artefacts induits par Ia deshydratation par I 'alcool. Dans les echantillons, traites par cryo-substitution, ces inclusions ne sont pas observees.

En utilisant une deshydratation par !'ace­tone, des techniques cytochimiques (mise en evidence des polysaccharides, coloration des proteines) et surtout !'analyse par spec­troscopie d'electron en perte d'energie, nous avons etudie les granules vacuolaires d'un champignon des endomycorhizes a vesicu­les et arbuscules de merisier. Nous nous sommes attaches a preciser Ia nature et l'ori­gine de ces granules.

MATERIEL ET METHODES

Techniques cytologiques Le materiel et les techniques cytologiques ont deja

ete presentes dans de precedentes publications (Dex­heimer et al., 1979; Kreutz-Jeanmaire eta/., 1988) et nous ne reprendrons ici que les points essentiels. En particulier, nous rappellerons que pour eviler des arte­facts dus ala deshydratation par l'alcool, les objets ont ete deshydrates par !'acetone.

Les coupes des objets inclus dans l'epon ont ete uti­li sees sans contraste (analyse en spectroscopie d'elec­trons), contrastees par Ia double coloration classique (acetate d'uranyle et citrate de plomb) ou ont ete soumi­ses a des reactions cytochimiques, pour mettre en evi­dence les polysaccharides (test PATAg), les proteines (coloration Gomori) ou identifier les membranes (colora­tion des membranes plasmalemmiques par l'acide phos­photungstique).

Elles ont ete observees avec differents microscopes electroniques . SIEMENS 102, ZEISS 902Aou PHILIPS CM20.

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

J. DEXHEIMER ET AL. 169

Etude spectroscopique par perte d'energie des elec­trons transmis

Ces etudes ont ete effectuees par le microscope elec­tronique Zeiss 902 A, equipe d'un double prisme per­mettant de realiser des images filtrees (ESI ou Electron Spectroscopy Imaging) et le microscope Phillips CM 20 equipe d'un spectrometre PEELS Gatan 66. Les techni­ques ESI et PEELS permettent respectivement de reali­ser des images filtrees et des analyses qualitatives et quantitatives des elements presents dans Ia zone ana­lysee. Ces techniques ont ete utilisees pour etudier des ectomycorhizes (Kottke, 1991, 1994), mais n'ont jamais ete appliquees a l'etude des endomycorhizes.

ESI et traitement des images Le flux d'electrons, correspondant a un niveau de

perte d'energie, ne represente qu'une tres Iaibie part du faisceau d'electrons incident. Les images qui sont pro­duites sont done tres peu lumineuses, et leur photogra­phie exige des temps de pose assez longs (2 ou 3 minu­tes). Nous avons mis au point une autre technique pour obtenir des documents exploitables.

Le microscope ZEISS 902 A est equipe d'une came­ra video type SIT 66 DAGE MTI. Les images obtenues par Ia camera sont, d'une part envoyees sur un moniteur de contr61e, d'autre part, enregistrees sur une bande vi­deo.

Les documents video ont ete ensuite numerises en reliant un magnetoscope a un micro-ordinateur de type 486 DX2 50 equipe d'une carte de capture video.

L'etude du phosphore a ete realisee en utilisant le seuil L2, 3, situe a 132 eV (Ahnet a/., 1983).

Pour ameliorer Ia detection, le bruit de fond peut etre eli mine en utilisant des techniques de traitement d'ima­ges. On peut considerer que le fond cy1oplasmique re­presente, avec une bonne approximation, ce bruit de fond etant donne qu'il ne contient pas ou Ires peu de phos­phore. II est done constitue par un masque ayant l'inten· site du fond cy1oplasmique, et ce masque est soustrait de l'image originale. Seules les zones presentant une intensite plus forte que le fond cy1oplasmique sont con­servees et correspondent aux zones riches en phospho­re. Cette image traitee peut ensuite etre additionnee a l'image originale, ce qui augmente Ia brillance des zo­nes riches en phosphore et les rend particulierement evidentes.

Une autre methode pour eliminer le bruit de fond consiste a trailer l'image originale par un filtre creant un faux relief. Les zones les plus claires, done les plus ri­ches en phosphore, apparaissent Ires saillantes sur un fond cy1oplasmique relativement uniforme.

Analyse par spectroscopie d'electrons (EELS) Cette etude est realisee sur une gamme de pertes

d'energie comprise entre 100 et 600 eV Les spectres obtenus ont ete traites a l'aide du programme EUP Ga­lan. Le fond continu est soustrait des spectres. Certai­nes parties des spectres ont ete amplifiees (16 ou 32 lois) pour rendre visibles les pies correspondant a I' azote eta I' oxygene.

RESULTATS

Repartition des granules vacuolaires Nous avons precedemment decrit )'orga­

nisation des endomycorhizes VA de meri­sier (Kreutz-Jeanmaire eta!., 1988) et nous rappellerons seulement les caracteristiques principales en nous interessant essentielle­ment a Ia repartition des granules vacuolai­res.

Comme toutes les endomycorhizes VA, les mycorhizes de merisier sont caracteri­sees par un reseau d'hyphes intercellulaires (Kreutz-Jeanmaire eta!., 1988) et des for­mations intracellulaires, les arbuscules et les pelotons. Dans le materiel que nous avons utilise pour notre etude, le reseau d'hyphes intercellulaires est parfois impor­tant, les arbuscules sont nombreux, mais les vesicules sont rares.

Les pelotons sont surtout presents dans les cellules corticales superficielles, alors que les arbuscules occupent toujours une position plus profonde et sont communs dans les cellules corticales au contact de l'endoderme.

Les hyphes, qui forment le reseau inter­cellulaire, sont surtout localisees dans les meats entre les cellules corticales. Ces hy­phes ont un diametre important (50 a I 00 J..l.m) et sont etroitement appliquees sur Ia surface externe des parois cellulaires. Leur section peut occuper toute Ia cavite du meat.

Les cellules, qui sont colonisees par le champignon, renferment un grand nombre de sections d'hyphes intracellulaires, depuis les grosses branches de l'arbuscule jus­qu'aux fines branches.

Le cytoplasme de !'endophyte, dense et riche en ribosomes, renferme un systeme vacuolaire constitue de petites vacuoles (Pl. I, figs. I, 2, 3, 4 ). Elles conservent leur individualite meme dans les hyphes agees ou elles ne sont plus separees les unes des autres que par les tonoplastes affrontes (Pl. I, fig. 4 ).

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

170 ACTA BOTANICA GALLICA

Planche I

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

J. DEXHEIMER ET AL. 171

La plupart des vacuoles presentent une lumiere claire, transparente aux electrons, mais nous avons aussi observe des vacuo­les dont le contenu presente un aspect flo­culeux plus ou moins dense.

Les vacuoles contiennent souvent des granules arrondis, de contour bien defini, et denses aux electrons (Pl. I, fig. I). Ces granules sont observes aussi bien dans des vacuoles a contenu clair qu'a contenu flo­culeux.

Dans les sections des grosses branches, les inclusions vacuolaires sont moins cou­rantes, et elles ont un diametre plus faible que celui des granules des hyphes intercel­lulaires (Pl. I, fig. 2).

Dans les petites branches de l'arbuscule, leur repartition varie suivant l'echantillon ou, dans un meme objet, suivant les cellu­les. Dans Ia plupart des arbuscules, les va­cuoles des petites branches ne renferment pas de granules denses (Pl. I, fig. 4) ou, lors­qu'ils sont presents, ils sont toujours de pe­tite taille.

Nous avons aussi observe des inclusions vacuolaires moins denses. Certaines sont rondes, mais d'autres ont un contour plus diffus. Ces inclusions, presentes dans tou­tes les parties de Ia mycorhize, sont parti­culierement abondantes dans les vacuoles des hyphes de l'arbuscule (Pl. I, fig. 4 ).

Enfin, le cytoplasme du champignon ren­ferme aussi des inclusions sombres sou vent moins denses que les granules vacuo! aires. Elles presentent une section arrondie a le­gerement ovale et un diametre comparable ou legerement superieur a celui des granu­les vacuolaires (Pl. I, fig. 3) des hyphes·in­tercellulaires.

Ces inclusions, que nous appellerons granules cytoplasmiques, sont incluses dans des vesicules limitees par une membrane continue dont le contraste, apres un test PATAg, est beaucoup plus marque que ce­lui des autres membranes cytoplasmiques, et notamment que le tonoplaste (Pl. II, fig. 2). Seulle plasmalemme et surtout les membranes des formations plasmalemmi­ques sont contrates aussi nettement par le test de polysaccharides (Pl. II, fig. I). A pres une coloration par l'acide phosphotungstique, specifique des membranes plasmalemmiques, cette membrane n'est pas co Ioree (Pl. II, fig. 6 ), contrairement a celles des formations plasma­lemmiques (Pl. II, fig. 5). A cote de ces vesi­cules contenant une inclusion bien definie, nous avons aussi observe des vesicules limi­tees par une membrane de meme nature mais dont le contenu est a l'etat diffus. Elles pour­raient correspondre a l'etat initial de Ia forma­tion de ces granules (Pl. II, fig. 2) avant Ia con­densation de leur contenu.

Planche I Fig. 1.- Hyphe intercellulaire. La vacuole (v) renferme un granule sombre arrondi (fleche). La lumiere de Ia vacuole

presente un contenu legerement floculeux. (x 45000). Fig. 2.- Hyphe intracellulaire. Grosse branche de l'arbuscule. Quelques vacuoles contiennent de petits granules

sombres (fleches). mais Ia plupart d'entre elles paraissent vides. (x 15000). Fig. 3.- Hyphe intracellulaire. Grosse branche de l'arbuscule. Les granules cytoplasmiques ant une section plus ou

mains ovale et son! inclus dans de petites vesicules doni Ia membrane limitante est particulierement nette. En bas a droite, Ia vesicule qui contient le granule est etroitement appliquee contre une vacuole (v) doni elle delor­me le contour. (x 40000).

Fig. 4.- Hyphe intracellulaire. Petite branche de l'arbuscule. Certaines vacuoles contiennent des inclusions mains denses et d'aspect plus diffus (fleches) que les granules des vacuoles des hyphes intercellulaires. (x 30000).

Plate I Fig. 1.- Intercellular hypha. The vacuole contains a dense rounded granule (arrow) and a diffuse fibrillar content.

(x 45000). Fig. 2.- Intracellular hypha. Large branch. Some vacuoles contain small dense granules (arrows). but most of them

seem empty (x 15000). Fig. 3.- Intracellular hypha. Large branch. The cy1oplasmic granules have a section more or less oval and are

included in small vesicles. Notice an inclusion applied on a vacuole (arrow). (x 40000). Fig. 4.- Intracellular hypha. Small branch. The inclusions of some vacuoles are less dense and more diffuse than the

polyphosphate granules (compare with Fig. 1 ). (x 30000).

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

172 ACTA BOTANICA GALLICA

Planche II

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

J. DEXHEIMER ET AL. 173

Souvent, Ia vesicule qui les contient est en contact etroit avec une vacuole. Les Iumieres vacuolaires et vesiculaires ne sont plus sepa­rees que par Ie tonoplaste et Ia membrane li­mitante de Ia vesicule (Pl. I, fig. 3 ; Pl. II, fig. 2).

Analyse des granules vacuolaires et cy­toplasmiques

En combinant des techniques cytochimi­ques et Ia spectroscopie d'electrons en per­te d'energie, nous avons essaye de preciser Ia nature et, eventuellement, Ies relations entre les granules vacuolaires et les granu­les cytoplasmiques.

• Test PATAg Le test PATAg de mise en evidence des

polysaccharides contraste tres fortement les parois fongiques et les rosettes de glycoge­ne du cytoplasme. Au contraire, les granu­les vacuolaires ou cytoplasmiques ne sont pas reactifs, montrant ainsi )'absence de polysaccharides dans leur constitution. Nous rappelons que Ia membrane des vesi­cules cytoplasmiques est tres reactive (Pl. II, fig. 2).

• Coloration des proteines de Gomori Apres une coloration des proteines se-

Ion Ia methode de Gomori, les granules vacuolaires et les granules cytoplasmiques sont fortement contrastes. Ils renferment done une importante fraction proteique (Pl. II, fig. 3 et 4).

• Imagerie par spectroscopie d'electrons Avec une perte d'energie de 132 eV cor­

respondant au seuil L2,3 du phosphore, les granules vacuolaires des hyphes intercel­lulaires sont lumineux (Pl. III, fig. 2). L'elimination du bruit de fond (Pl. III, figs. 3 et 4) rend ces granules encore plus evidents. Ils renferment done une forte concentration de phosphore. Cependant, apres quelques minutes d'observation, Ia luminosite decroit, indiquant une vapori­sation du materiel irradie par le faisceau d'electrons.

Au contraire, les inclusions cytoplasmi­ques sont peu ou pas lumineuses a ce ni­veau de perte d'energie et elles sont noyees dans le bruit de fond. Elles contiennent done peu de phosphore.

Analyse par spectroscopie d't!lectrons en perte d'energie

Nous avons analyse les granules vacuo­laires denses et Ies granules cytoplasmi­ques.

Planche II Fig. 1.· Test PATAg mettant en evidence Ia reactivite des membranes d'un plasmalemmasome. (x 40000). Fig. 2.- Test PATAg. Les membranes des vesicules renfermant les inclusions cytoplasmiques son! nettement reacti·

ves contrairement aux autres membranes cytoplasmiques. Certaines vesicules, limitees par une membrane reactive, ant un contenu diffus (etoiles). Une des vesicules contenant une inclusion est appliquee contre une vacuole (fleche). (x 40000).

Fig. 3.· Mise en evidence des proteines par Ia reaction de Gomori. Les granules vacuolaires son! reactifs (fleche). (x 15000).

Fig. 4.- Mise en evidence des proteines par Ia reaction de Gomori. Le granule cytoplasmique est marque (fleche). (x 30000).

Fig. 5.- Coloration des membranes d'un plasmalemmasome par l'acide phosphotungstique. (x 30000). Fig. 6.- La membrane limitante de Ia vesicule avec une inclusion (flilche) n'est pas coloree par l'acide phosphotungs­

tique. (x 30000). Plate II

Fig. 1.- Reactivity of plasmalemmasoma membranes with PATAg test. (x 40000). Fig. 2.- Membranes of vesicles with inclusions are stained by PATAg test contrarily to the other cytoplasmic mem­

branes. Some vesicles, surrounded by a stained membrane, have a diffuse content (stars). Notice a vesicle applied on a vacuole (arrow). (x 40000).

Fig. 3.- Staining of proteins by the Gomori reaction. Polyphosphate granules are stained. (x 15000). Fig. 4.- Staining of proteins by the Gomori reaction. The cytoplasmic inclusion is marked (arrow). (x 30000). Fig. 5.- Staining of plasmalemmasoma membranes by phosphotungstic acid. (x 30000). Fig. 6.- Membranes of vesicles containing a proteinic inclusion (arrow) are not stained by phosphotungstic acid.

(x 30000).

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

174 ACTA BOTANICA GALLICA

Planche Ill

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

J. DEXHEIMER ET AL. 175

Les analyses montrent que les granu­les vacuolaires denses renferment du phosphore, du calcium, du carbone, de !'oxygene et de !'azote (Fig. I, a et b), tan­dis que les granules cytoplasmiques ne contiennent que du carbone, de !'oxyge­ne et de )'azote (Fig. 2, a et b). Les etudes cytochimiques ont montre que ces der­niers granules sont de nature proteique, ce qui est confirme par Ia mise en evi­dence d'oxygene et d'azote.

La presence de phosphore, de calcium, d'azote et d'oxygene dans les granules va­cuolaires indique probablement que le phos­phore est sous Ia forme de polyphosphates de calcium associes a une fraction protei­que.

Dans tous les objets analyses, le pic du carbone amorphe (280 eV) est constam­ment present mais il est peu significatif puisqu'il s'agit d'un materiel biologique, ri­che en carbone et inclus dans une resine renfermant aussi de grandes quantites de carbone.

Nous avons aussi analyse le deuxieme type de granule vacuolaire, moins dense et plus diffus que les granules de poly­phosphates. Dans ces granules, nous n'avons pas detecte de phosphore, mais seulement, comme dans les granules cy­toplasmiques, du carbone, de !'azote et de !'oxygene. lis sont done de meme nature que ces derniers.

DISCUSSION ET CONCLUSION

Dans le cytoplasme de !'endophyte, nous avons observe trois types d'inclusions gra­nulaires : des granules inclus dans de peti­tes vesicules cytoplasmiques, des granules vacuolaires denses et arrondis et des gra­nules vacuolaires moins denses et plus ou moins diffus.

Les techniques de cytochimie ultrastruc­turale, couplees a !'analyse par spectrosco­pie d'electrons en perte d'energie, nous ont permis de montrer sans ambigu'ite que les granules vacuolaires denses sont riches en phosphore et en calcium. Les analyses ef­fectuees par Ia spectroscopie d'electrons en perte d'energie confirment done les resul­tats de Strullu et at. ( 1981) obtenus par ana­lyse en rayons X dans les mycorhizes ave­sicules et arbuscules de Taxus baccata. lis cmTespondent done bien aux granules de polyphosphate analyses avec d'autres me­thodes dans diverses mycorhizes et mi­croorganismes (Ashford eta!., 1986 ; Chi I­vers eta!., 1978 ; Chi Ivers et Harley, 1980 ; Chi Ivers eta!., 1985 ; Grellier eta!., 1989 ; Martin et a!., 1985 ; Moore et a!., 1991 ; Orlovich eta!., 1989, 1990; Simonet al., 1984 ; Strullu eta!., 1981 a et b ; Strullu et a!., 1982a et b ; Yare, 1990). Ces granules renferment des proteines qui servent pro­bablement de trame pour fixer les polyphos­phates.

Planche Ill Fig. 1.· Image obtenue sans coloration de contraste avec une perte d'energie nulle (0 eV). Les vacuoles (v) et les

granules vacuolaires sont bien visibles. (x 30000). Fig. 2.- Image du meme objet obtenue avec une perte d'energie de 132 eV, correspondant au phosphore. Les

granules vacuolaires sont brillants. (x 25000). Fig. 3.- Meme cliche que l'image precedente. L'utilisation d'un filtre creant un faux relief met bien en evidence les

parties les plus lumineuses, correspondant a une accumulation de phosphore. Le fond est tres attenue. (x 25000). Fig. 4.- Meme cliche que Ia figure 2, mais apres elimination du bruit de fond. Les granules sont toujours visibles,

confirmant bien Ia presence de phosphore. (x 25000). Plate Ill

Fig. 1.- Image obtained without staining at 0 eV energy loss. Vacuoles (v) and dense granules are evident. (x 30000). Fig. 2.- Image of the same object but at 132 eV energy loss (phosphorus). Vacuolar granules are very luminous.

(x 25000). Fig. 3.- Previous image, but processed with an emboss filter. The background is reduced and the phosphorus-rich

granules appear clearly. (x 25000). Fig. 4.- Same image than figure 2, but after subtraction of background noise. As image processed by a relief filter, the

phosphorus-rich granules appear very clearly. (x 25000).

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

176 ACTA BOTANICA GALLICA

0 0 0

><

0 0 0

><

10

2

0

50

C-K

200 300

• 32

Ca-1.2.3

400 500

Energy Loss ( e V)

Ca-1.2.3

a

0-K

Fig. 1.- a :spectre d'un granule vacuolaire nivelant Ia pre­sence de phosphore (P), de carbone (C), de calcium (Ca) et d'oxygeme (0). Les indications (L2,3; K ... ) cor­respondent aux couches electroniques utilisees pour Ia detection. b : spectre d'ensemble d'une inclusion vacuolaire. L'amplification 32 lois de Ia zone comprise entre 320 eV et 600 eV re­vele Ia presence d'azote. Les pies du calcium et de !'oxygene son! aussi bien visibles.

Fig. 1.- a : spectrum of a vacu­olar granule revealing the presence of phosphorus (P), carbon (C), calcium (Ca) and oxygen (0). L2,3, K ... indicate edges used for detection. b : spectrum of a vacuolar inclusion. The am­plification 32 time of the zone between 320 and 600 eV reveals the pres­ence of nitrogen. Notice the edges of calcium and oxy­gen.

ol_~--2~oo~~~3~oo~~~400~==~~s;oo~~~6oo~~_j Energy Loss ( e V)

No us remarquerons que Kottke ( 1991 ), en utilisant Ia meme methode pour analy­ser des granules de polyphosphates dans une ectomycorhize, a aussi montre Ia pre­sence de phosphore, de calcium, d'azote et d'oxygene_ Mais contrairement a cet auteur, nous n'avons pas detecte d'aluminium.

Dans un recent travail effectue sur le champignon ectomycorhizien Pisolithus tinctorius, Orlovich et Ashford ( 1993) con­siderent que les granules de polyphosphate

b

sont des artefacts puisqu'ils ne sont pas ob­serves apres utilisation de techniques de cryosubstitution_ Pour ces auteurs, les po­lyphosphates seraient presents sous forme soluble dans Ia vacuole des hyphes vivan­tes et seraient precipites par !'ethanol utili­se dans Ia deshydratation des objets_

Dans le present travail, nous n'avons pas utilise d'ethanol pour deshydrater nos ob­jets, mais de !'acetone et, neanmoins, nous avons observe des granules riches en phos-

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

J. DEXHEIMER ET AL 177

14

12

10

C-K

0 ' 8

8

>< 6

N-K

4 '

0 ~~1~00~~--2~00~~--~3~00~~--~~~--~~5~~~~--~~~

Energy Loss (eV)

Fig. 2.· a : spectre d'ensemble d'une inclusion cytoplasmi· que. Absence de pic a 132 eV (marque par P) cor­respondant au phosphore et 3350 eV, correspondant au calcium (comparer avec le spectre precedent, courbe non amplifiee). b : Ia zone comprise entre 350 et 700 eV a ete amplifiee 16 lois. Les pies de I' azote et de !'oxygene sont bien visibles.

20

18

0

8

4

2

a

Fig. 2.· a : spectrum of a cyto­plasmic inclusion. Absence of edge at 132 eV (phosphorus = P) and at 350 eV (calcium) (compare with the previous spectrum). b : the zone between 350 and 650 eV has been am­plified 16 time. Notice the edges of nitrogen and oxy­gen.

0~~~--~~~--~--~~~--~~~--~~~---='~ 200 700

phore dans les vacuoles. De plus. s'il s'agis­sait d'un artefact. il n'y a aucune raison pour qu'il n'apparaisse pas dans toutes les vacuo­les. Or. meme dans les hyphes intercellu­laires. ou ces granules sont communs. un nombre important de vacuoles ne renfer­ment pas d'inclusion de ce type. Enfin. il convient d'insister sur Ia grande labilite de ces structures qui peuvent etre tres facile­ment dispersees par une fixation inadequa­te ou vaporisees au cours de l'observation.

b

II n'est pas certain que les techniques de cryosubstitution soient adaptees a leur con­servation.

Les granules cytoplasmiques sont com­muns dans tous les champignons des mycorhizes VA. mais les auteurs ne les dis­tinguent pas des granules de polyphospha­te vacuolaires. lis sont inclus dans des ve­sicules dont Ia membrane limitante presen­te des proprietes cytochimiques differentes de toutes les autres membranes cytoplas-

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

178 ACTA BOTANICA GALLICA

miques, et nous n'avons pu preciser sa na­ture. Elle est reactive au test PATAg, com­me les membranes plasmalemmiques, mais elle n'est pas coloree par l'acide phospho­tungstique, reactif caracteristique de ces membranes. Comme les granules vacuolai­res, ils ne contiennent pas de polysacchari­des, mais renferment une fraction protei­que importante. Cependant, ils different de ces demiers par !'absence de phosphore. Les contacts tres nombreux entre Ies vacuoles et Ies vesicules contenant les granules pro­teiques suggerent Ia possibilite de coales­cence entre les vesicules et les vacuoles et done !'existence d'une filiation entre les gra­nules vacuolaires et les granules cytoplas­miques. lis pourraient representer les pre­curseurs des granules denses, riches en po­lyphosphates fixes sur Ia trame proteique.

Ces formations ne sont certainement pas des artefacts ; en effet, compte tenu du fai­ble volume des vesicules cytoplasmiques, il est impensable que les granules, qui oc­cupent Ia quasi totalite de Ia Iumiere de Ia vesicule, resultent d'une precipitation pro­voquee par Ia fixation. Nous rappelons aussi que certaines de ces vesicules, probable­ment moins evoluees, ont un contenu dif­fus. II est evident que si Ia formation des granules etait due a Ia fixation ou a Ia des­hydratation, il n'y aurait aucune raison pour que Ie contenu de ces vesicules ne soit pas aussi condense.

Une partie importante du phosphore n'est pas associee aces granules puisque Callow eta/. (I 978) ont montre que, puisque seu­lement 40 % du phosphore est present dans les granules de polyphosphate, Ia plus gran­de part du phosphore doit done se trouver sous forme soluble comme le suggerent Orlovich et Ashford ( 1993). Les granules de polyphosphate ne represente done pas Ia seule forme de transport du phosphore dans ces mycorhizes.

Si les granules de polyphosphate ont sou­vent ete signales dans les endomycorhizes VA, peu d'etudes sont consacrees a leur re­partition dans les diverses parties de Ia

mycorhize. Dans le present travail, nous avons mis en evidence un gradient de re­partition. Les granules sont relativement volumineux et bien representes dans les vacuoles des hyphes intercellulaires. Dans les grosses branches de l'arbuscule, ils sont moins abondants et leur taille est plus re­duite. Enfin, dans Ia plupart des arbuscu­les, les vacuoles des branches Ies plus fi­nes, ne montrent pas de granules. Strullu et a/., (1981 a), dans les mycorhizes VA de Taxus baccata, observent des granules va­cuolaires dans toutes les parties de Ia my­corhize, y compris Ies hyphes des jeunes arbuscules. Les granules disparaissent lors­que l'arbuscule est degenerescent.

Contrairement a ces observations, nous avons observe un gradient de repartition qui nous semble traduire Ia dynamique de fonctionnement de I'endomycorhize. En effet, Ies granules sont absents ou tres re­duits dans Ies branches de I'arbuscule, for­mations directement impliquees dans les echanges actifs entre les partenaires. II est d'autre part bien connu que Ie champignon symbiote transfere de grandes quantites de phosphore a Ia plante-h6te (Harley, I 969 ; Sanders et Tinker, 1971 ; Bowen et al., 1975 ; Callow et al., 1978 ; Walker et Powell, 1979). En fait, dans une endomy­corhize active, les granules de polyphospha­te, resultant de Ia polymerisation de phos­phore preleve dans le sol, sont transportes jusqu'aux arbuscules par les hyphes inter­cellulaires (Strullu et al., 1981 ). Pour le phosphore, ces demieres jouent done essen­tiellement le role de transport et leurs va­cuoles renferment des granules abondants et de taille importante. Au niveau des ar­buscules, Ie phosphore est Iibere par Ia lyse des polyphosphates et done, lorsque Ia mycorhize est active, il est normal que cet­te lyse se traduise par une reduction de taille des granules puis par leur disparition. Tou­tefois, Ia fraction proteique peut, dans cer­tains cas, persister apres Ia liberation du phosphore et correspondrait aux granules proteiques moins denses et plus diffus que

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

J. DEXHEIMER ET AL. 179

nous avons signales dans les vacuoles des branches de l'arbuscule.

Dans quelques cas, nous avons obser­ve des arbuscules dont les branches les plus fines montrent quelques granules de polyphosphates. Cela traduit probable­ment un etat metabolique moins actif de Ia cellule infectee et une reduction des echanges.

Cette etude confirme done l'existence de granules vacuolaires riches en phosphore et calcium associes a une fraction protei­que. Nos observations suggerent qu'ils evo-

luent a partir d'inclusions cytoplasmiques riches en proteines contenus dans des vesi­cules dont nous n'avons pu preciser l'origi­ne. Enfin Ia repartition des granules de po­lyphospahtes dans Ia mycorhize n'est pas homogene et traduit fidelement Ia dynami­que du fonctionnement de Ia mycorhize : les hyphes intercellulaires et les grosses branches de l'arbuscule sont essentiellement impliques dans le transport du phosphore, les petites branches sont les sites de trans­fert du phosphore entre le champignon et Ia plante-h6te.

BIBLIOGRAPHIE

Ahn C.C., O.L. Krivanek, R.P. Burgner, M.M. Disko & P.R. Swann, 1983.- EELS Atlas. Gatan Inc., Warren­dale, USA.

Ashford A. E., M. Ling Lee & G.A. Chilvers. 1975.- Poly­phosphate in Eucalypt mycorrhizas : a cytochemical demonstration. New Phytol., 74, 447-453.

Ashford A. E., R.L. Peterson, D. Dwarte & G.A. Chilvers, 1986.- Polyphosphate granules in eucalypt mycor­rhizas : determination by energy dispersive X-ray microanalysis. Can. J. Bot., 64, 677-687.

Bowen G.D., D.l. Bevege & B. Mosse, 1975.- Phospha­te physiology of vesicular arbuscular mycorrhizas. In : Endomycorrhizas. Sanders F. E., B. Mosse & P.B. Tin­ker (Eds), 241-260.

Callow J.A., L.C.M. Capaccio, G. Parish & P.B. Tinker, 1978.- Detection and estimation of polyphosphates in vesicular-arbuscular mycorrhizas. New Phytol., 80, 125-134.

Cappacio L.C.M. & J.A. Callow, 1982.- The enzymes of polyphosphate metabolism in vesicular-arbuscular mycorrhizas. New Phytol., 91. 81-91.

Chilvers G.A., M. Ling Lee & A.E. Ashford, 1978.- Poly­phosphate granules in the fungi of two lichens. New Phytol., 81, 571-574.

Chi Ivers G.A. & J.L. Harley, 1980.- Visualization of phos­phate accumulation in beech mycorrhizas. New Phy­tol., 84 319-326.

Chilvers G.A., F.F. Lapeyrie & P.A. Douglass, 1985.- A contrast between oomycetes and other taxa of my­celial fungi in regard to metachromatic granule for­mation. New Phytol., 99, 203-210.

Cox G., K.J. Moran, F. Sanders, C. Nockolds & P.B. Tin­ker, 1980.- Translocation and transfer of nutrients in vesicular-arbuscular mycorrhizas. Ill. Polyphospha­te granules and phosphorus translocation. New Phy­tol., 84, 649-659.

Dexheimer J., S. Gianinazzi & V. Gianinazzi-Pearson, 1979.- Ultrastructural cytochemistry of the host-fun­gus interfaces in the endomycorrhizal association

Glomus mosseae/AI/ium cepa. Z. Pflt. Physiol., 92, 191-206.

Grellier B., D.G. Strullu, F. Martin & S. Renaudin, 1989.­Synthesis in vitro and microanalysis and .. (31 )P-NMR study of metachromatic granules in birch mycorrhizas. New Phytol., 112, 49-54.

Harley J.L., 1969.- The Biology of Mycorrhiza. 2nd Ed., Leonard Hill, London.

Kottke 1., 1991.- Electron energy loss spectroscopy and imaging techniques for subcellular localization of ele­ments in mycorrhiza. In: Methods in Microbiology. Norris J.R., D.J. Read & A.K. Varma (Eds), 23, Tech­niques for the study of mycorrhiza. Academic Press, London, New York, 369-382.

Kottke 1., 1994.- Localization and identification of ele­ments in mycorrhizas. Advantages and limits of elec­tron energy loss spectroscopy. Act. bot. Ga/lica, 141, 507-510.

Kreutz-Jeanmaire C., J. Dexheimer & J. Gerard, 1988.­Etude de !'organisation ultrastructurale des myco­rhizes a vesicules et arbuscules dans deux Rosa­cees ligneuses (Prunus avium L. et Pyrus malus L.). Phytomorphology, 38,205-217.

Martin F., J.P. Marchal, A. Timinska & D. Cadet, 1985.­The metabolism and physical state of polyphospha­tes in ectomycorrhizal fungi. A .. (31)P nuclear ma­gnetic resonance study. New Phytol., 101,275-290.

Moore A.E.P., A.E. Ashford & R.L. Peterson, 1991.- Re­serve substances in Paxi/lus involutus sclerotia : de­termination by histochemistry and X-ray microanaly­sis. Protoplasma, 163, 67-81.

Orlovich D.A., A.E. Ashford & C.G. Cox, 1989.- Areas­sessment of polyphosphate granules composition in the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius. Aust. J. PlantPhysiol., 16,107-115.

Orlovich D.A., A. E. Ashford, C.G. Cox & A.E.P. Moore, 1990.- Freeze-substitution and X-ray microanalysis of polyphosphate granules in the mycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius (Pers.) Cooker and Couch. In:

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014

180 ACTA BOTANICA GALLICA

Int. Coli. Endocytobiology and Symbiosis, 139-143. Orlovich D.A. & A.E. Ashford, 1993.- Polyphosphate gra­

nules are an artefact of specimen preparation in the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius. Proto­plasma, 173, 91-102.

Sanders F. E. & P.B. Tinker, 1971.- Mechanism of absorp­tion of phosphate from soil by Endogone mycorrhizas. Nature, 33, 278-279.

Simon L., J.P. Bossy & J.P. Garrec, 1984.- Ultrastructu­ral and X-ray microanalytical studies on the associa­tion of phosphorus and calcium in metachromatic granules of the hyphae in Aureobasidium pul/ulans. Physiol. veg., 22, 833-839.

Strullu D.G., J.P. Gourret, J.P. Garrec &A. Fourcy, 1981a.­Uitrastructure and electron-probe microanalysis of the metachromatic vacuolar granules occuring in Taxus mycorrhizas. New Phytol., 87, 537-545.

Strullu D.G., J.P. Gourret & J.P. Garrec, 1981 b.- Microa­nalyse des granules vacuolaires des ectomycorhizes, endomycorhizes et endomycothalles. Physiol. veg., 19, 367-378.

Strullu D.G., J.P. Gourret & J.P. Garrec, 1982a.- Analyse des mycorhizes de Taxus baccata (L.) par Ia micro­sonde electronique. Rev. forest. fr., 34, 392-397.

Strullu D.G., J.L. Harley, J.P. Gourret & J.P. Garrec, 1982b.- Ultrastructure and microanalysis of the poly­phosphate granules of the ectomycorrhizas of Fa­gus sylvatica. New Phytol., 92, 417-423.

Strullu D.G , B. Grellier, C. Romand & J.P. Garrec, 1986.­Sur le modele unifie de fonctionnement des myco­rhizes : synthese in vitro de granules metachromati­ques vacuolaires. Les Mycorhizes : physiologie et genetique, 1er SEM, Dijon, juillet 1985, INRA, 441-444.

Vare H., 1990.- Aluminium polyphosphate in the ecto­myccorhizal fungus Sui/Ius variegatus (Fr.) 0. Kunt­ze as revealed by energy dispersive spectrometry. New Phytol., 116, 663-668.

Walker G.D. & C.L. Powell, 1979.- Vesicular-arbuscular mycorrhizas in white clover : a scanning electron microscope and X-ray micro-analytical study. New Zeal. J. Bot., 17, 55-59.

Dow

nloa

ded

by [

Nip

issi

ng U

nive

rsity

] at

12:

44 1

6 O

ctob

er 2

014