Etude de la mobilité des éléments intégratifs conjugatifs (ICE) intégrés dans

un gène codant un ARNt Lysine chez Streptococcus agalactiae

Encadrée par : Sophie PAYOT-LACROIX Gérard GUEDON

LABORATOIRE DE GENETIQUE ET MICROBIOLOGIEUMR1128 INRA, Nancy-Université - IFR 110

Présenté par Aurore PUYMEGE

Transfert horizontalIntroduction

● Rôle clé dans l’évolution des génomes bactériens et dans l’adaptation aux changements environnementaux

● Transfert intercellulaire de l’ADN par :

- transduction- transformation- conjugaison

● Transfert inter ou intra cellulaire de l’ADN par les éléments génétiques mobiles

IntroductionEléments intégratifs conjugatifs ou ICE

attL attR

attL

attR

attB

attI

attB

attI

attL attLattR attR

Donatrice Réceptrice

Pavlovic et coll., Microbiology, 2004

Introduction

Bactérie appartenant au phylum des Firmicutes

Streptocoque de groupe B (GBS)

Aérobie-anaérobie facultatif

Streptococcus agalactiae

Environ 30% de la population est porteur asymptomatique

Bactérie pathogène chez : - les nouveaux-nés - les personnes âgées

- les personnes immunodéprimées

- les bovins mammites

méningitespneumoniessepticémies

Introduction

● Etude sur les 8 génomes totalement ou partiellement séquencées

● Mise en évidence in silico de :- 12 ICE putatifs

- 19 éléments en dérivant ● 15 sites d’intégration

ICE et éléments en dérivant chez Streptococcus agalactiae

Grande diversité de ces éléments chez S. agalactiae

Brochet et coll., J. Bacteriol., 2008

IntroductionLes éléments intégrés à l’extrémité 3’ de l’ARNtLys

● Grande diversité des éléments intégrés dans ce locus● Présence de nombreux gènes pouvant être impliqués dans la réponse aux stress et la virulence de S. agalactiae

ObjectifsObjectifs

Etude de la fonctionnalité des 4 ICE putatifs intégrés à l’ARNtLys chez S. agalactiae

- Est-ce que les quatre éléments sont capables de s’exciser ?

- Est-ce que les éléments sont capables de se transférer ?

RésultatsTest d’excision des ICE

ICE

attL attR ARNt Lys

Excision

attI+

attB ARNt Lys

400 pb

547 pb

100

pb la

dder

5152603 V/R

CO

H1

1 2 3 18R

S21

1,5 kb

1 kb

500 pb

200 pb300 pb

700 pb

100 pb

597 pb492 pb404 pb

Seul l’élément présent chez la souche 515 s’excise

Résultats

100

pb la

dder

515

2603 V/R

CO

H1

1 2 3 18R

S21

1,5 kb

1 kb

500 pb

200 pb300 pb

700 pb

100 pb

597 pb492 pb404 pb

ICE

attL attRattI ARNt Lys

attL

+

ARNt LysattR’

attI’’

2

492 pb

214 pb

Excision

attI’’’

+3

404 pb

attRattL’

ARNt Lys

547 pb

Excision

attB ARNt Lys

attI’

attI

+

1

597 pb

315 pb

Excision

● Deux formes circulaires d’ICE_2603_tRNALys

sont détectables

Test d’excision des ICE

Test de transfert conjugatifRésultats

● Souche donatrice : ● Souche réceptrice :

COH1 RifR StrR

A909 RifR StrR

Nem316 RifR StrR

● ICE_515_tRNALys se transfère à une fréquence maximale de 4x10-7 (+/-0,9 x10-8) transconjugants / cellule donatrice dans les conditions testées

attL attR

ARNt Lys

attI

attB

ARNt Lys

515 EryR

attI

Ces témoins excluent l’hypothèse d’un mécanisme de transformation

RésultatsTest de transfert conjugatif

● Blocage du contact entre cellules donatrices et réceptrices

Donatrice et réceptrice Réceptrice

Donatrice

Transconjugants Pas de transconjugant

Aucun transconjugant n’est observé

● Ajout de DNase I dans le milieu

Les fréquences de transfert sont identiques avec et sans DNase I

Fréquence de transfert

DiscussionConclusions

2603V/R

COH1

18RS21

DONATRICE

515

Nem316

A909

RECEPTRICE

Nem316

COH1

Discussion

● Pas d’excision d’ICE_COH1_tRNALys et ICE_18RS21_tRNALys (et donc de transfert) :

- fréquence d’excision trop faible pour être détectée ou perte de la forme circulaire

- régulation différente

Discussion

● Pas de transfert d’ICE_2603_tRNALys :- fréquence de conjugaison trop faible pour être détectée- interruption d’un gène du module de conjugaison (orfD)

● Fréquence de conjugaison différente selon la souche réceptrice utilisée

● Vérification de la spécificité d’intégration d’ ICE_515_tRNALys

● Caractérisation de la machinerie de conjugaison utilisée par ces éléments génétiques mobiles

Etude de la relaxase

- rôle de la relaxase dans la régulation des gènes de l’élément

- caractérisation du site reconnu par la relaxase, de sa spécificité et de ses partenaire(s) protéique(s) (relaxosome)

DiscussionPerspectives