TP N°01TP N°01TP N°01TP N°01 Dosage de la créatinine

plasmatique.

République algérienne démocratique et populaire. Université Djillali Liabes

Faculté de Médecine Département de Pharmacie

Année universitaire : 2008 / 2009

Réalisée par:

• GHERMI Mohamed. • CHAREF KHODJA Meriem. • TAHRI Mahmoud. • BETTAYEB Mohamed Amine.

4 ème année pharmacie G05.

TP N 01 DOSAGE DE LA CREATININE PLASMATIQUE

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I- Définition :

Créa vient du grec kreas qui veut dire chair. Une mesure de la créatinine donne des

informations sur deux points : la fonction rénale et la masse musculaire. La

créatinine est une molécule chimique générée par le métabolisme musculaire. La

créatinine est produite à partir de la créatine, une molécule de première

importance pour la production d'énergie dans les muscles. Environ 2 % de la

créatine du corps sont convertis chaque jour en créatinine. La créatinine est

transportée par le sang vers les reins.

Pour un sujet donné, le taux plasmatique et la quantité de créatinine éliminée

quotidiennement dans les urines constituent des paramètres biologiques

remarquablement fixes.

Pour ces raisons, la valeur de la clairance de la créatinine revêt une signification

séméiologique fondamentale lors de l'étude d'une insuffisance rénale. La clairance

de la créatinine est indépendante de la diurèse, elle mesure directement la filtration glomérulaire.

Le taux plasmatique est indépendant de l'apport protéique alimentaire ; il reflète la

masse musculaire du sujet et son métabolisme propre.

L'élimination est exclusivement urinaire, et donc toute variation de la clairance

renseigne directement sur l'état fonctionnel du rein.

II- Métabolisme :

1- Rappel physiologique : a- Origine métabolique :

La créatinine provient de la déshydratation de la créatine, elle même

présente dans le muscle strié où elle permet le stockage d'ATP sous forme

de créatine phosphate ou phosphagène par une réaction catalysée par la

créatine kinase (CK).

b- Comportement de la créatinine au niveau du néphron

La créatinine subit la filtration glomérulaire ; elle n'est par la suite ni

réabsorbée ni excrétée au niveau du tubule. Sa clairance mesure le volume

du filtrat glomérulaire formé par seconde.

Clairance = 2 ml/seconde pour 1,73 m2 de surface corporelle (voir tables

des Dubois).

2- Formation de la créatine phosphate: - Le phosphate de créatine est synthétisé dans les cellules à partir des

acides aminés. - Dans sa structure on retrouve la molécule du glycocolle, dont l’Azote est

substitué par le noyau guanidinium de l’arginine et un méthyl provenant de la méthionine.

- Le phosphate et la liaison riche en énergie provienne de l’ATP.

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3- Formation de la créatinine :

Le métabolisme de la créatine et donc celui de la créatinine peuvent être

résumés dans ce schéma explicatif.

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III- Méthodes d’explorations : 1- Détermination de la créatinine sanguine

Le sang total renferme de la créatine et de la créatinine. La créatine se trouve

surtout dans les globules rouges à des taux faibles, alors que la créatinine est

également répartie entre les globules et le plasma. La concentration en

créatinine totale du sang est remarquablement constante chez un sujet

donné, en fonction de sa masse musculaire. Elle ne dépend ni du régime, ni de

l'exercice physique, ni même d'autres influences biologiques. C'est le

constituant sanguin dont le taux est le plus fixe. La créatinine sanguine ne

varie pratiquement que dans les lésions rénales.

Son taux varie, chez l'adulte, de 50 à 105 pmol/l.

2- Clairance Elle établit le rapport entre la quantité de cette substance apportée par le

plasma au niveau du rein et la quantité de cette substance éliminée par le

rein.

C'est le coefficient d'épuration plasmatique ou nombre de ml de plasma totalement épurés par le rein dans l'unité de temps. Ce volume théorique

s'exprime dans le cadre des unités SI en ml/seconde. Il est utile, pour

manipuler simplement les clairances, de retenir que 24 h correspondent à 1

440 minutes et 86 400 secondes.

C = U.V/P

C = clairance = volume de plasma totalement épuré.

U = concentration urinaire par litre.

P = concentration plasmatique par litre.

V = volume d'urines émises en une seconde (ou une minute).

Il suffit donc de doser la créatinine dans le plasma et dans l'urine, d'exprimer

les résultats dans la même unité, de connaître la diurèse (débit urinaire) par

seconde, pour calculer sa clairance. Il est essentiel au cours de l'épreuve (3 h

ou mieux 24 h) de mesurer exactement la diurèse et de faire boire

abondamment le sujet, afin d'avoir une diurèse supérieure à 1,5 1/24 h. La

valeur normale est de 2 ml/s.

De plus la formule C = U.V/P est valable pour le sujet adulte normal dont la

surface corporelle est voisine de 1,73 m2. Chez l'enfant et le nourrisson il faut

tenir compte de la surface corrigée Se :

Ce = C x 1,73/Se

La Se est obtenue grâce aux tables de Dubois qui permettent, en joignant par

une droite la taille et le poids, d'obtenir la surface corporelle recherchée à

l'intersection avec la ligne des surface corporelles.

Cette clairance correspond au débit de filtration glomérulaire DFG qui est un

des éléments essentiels dans l’étude de la fonction rénale.

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Sinon cette même DFG peut être calculé par la Formule de Cockcrott et Gault (1976).

� Clairance de la créatinine = K x Poids (kg) x [140-âge(ans)] /

Créatinine(µmol/l)

K = 1,05 chez la femme

K = 1,25 chez l'homme

� Clairance créatinine (homme) = Poids (kg) x [140-âge (ans)] / Créatinine

(mg/l) x 7,2

� Clairance créatinine (femme) = 0,85 x Poids (kg) x [140-âge (ans)] /

Créatinine (mg/l) x 7,2.

� Conditions de l'utilisation de cette formule :

Age : entre 18 et 110 ans

Poids entre 35 et 120 kg

Sérum créatinine : 6 et 70 mg/l

IV- Méthodes de dosages :

Le sérum ou le plasma sanguin peuvent être utilisés indifféremment. Les

échantillons de sérum ou de plasma ou d'urines peuvent être conservés plusieurs

jours à l'abri de l'évaporation.

• Prélèvements : - Sang veineux :

Matériel nécessaire :

Garrot, seringue et aiguille, désinfectant, coton, sparadrap, tubes avec ou

sans anticoagulant, gants.

Mode opératoire :

Le prélèvement se fait habituellement au pli du coude, on peut aussi le

réaliser en cas de problèmes sur la face dorsale de la main.

Prévoir tout d'abord les tubes nécessaires, mettre éventuellement

l'anticoagulant.

Se munir d'une seringue au volume correspondant aux analyses totales, en

comptant 5 ml par tube.

Garrotter le bras du patient, désinfecter la zone cutanée, décoincer une

première fois le piston de la seringue puis le remettre dans sa position

initiale.

Aboucher la seringue à l'aiguille et piquer la veine.

Tirer le piston, retirer tout d'abord l'aiguille, la jeter dans un récipient

destiné aux consommables jetables puis remplir les tubes en commençant

toujours par le tube sec, boucher immédiatement tous les tubes et remuer

soigneusement ceux contenant l'anticoagulant.

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Ne jamais remplir de tubes avec une seringue sur laquelle on a pas enlevé

l'aiguille (risque d'aérosols, d'éclaboussures et d'expulsion brutale de

l'aiguille).

- Urine : Matériel nécessaire:

Un flacon pour analyse d'urine ou à défaut un récipient fermé propre et sec.

Mode opératoire :

Pour mesurer la clairance de la créatinine ou exprimer la protéinurie en

mg/jour, on pratique un prélèvement d'urine de 24 heures. Il est donc

préférable que le malade reste une journée et deux nuits à proximité du

laboratoire, ou qu'il effectue ce prélèvement chez lui, si on lui a bien

expliqué.

Le matin, faire uriner le malades dans les latrines. Il doit boire normalement

pendant l'épreuve.

Recueillir ensuite dans une grande jarre (minimum 3 litres) toutes les

urines de la journée, de la nuit et enfin celles du petit matin au réveil.

Boucher la jarre, puis l'agiter. Mesurer précisément le volume en ml grâce à

une éprouvette graduée en plastique de 2000 ml.

Procéder ensuite à un dosage de la créatinine urinaire.

Pour doser la créatinine, plusieurs méthodes ont été mises au point, parmi celles-

ci :

1- Méthodes enzymatiques : a- Méthode enzymatique à lecture UV :

Créatinine ��é��������

���é����> Créatine + ATP

�

> Créatine(P) + ADP

Phospho-énol-pyruvate + ADP ������� �����

> Pyruvate + ATP

Pyruvate + NADH.H+ ���

> Lactate + NAD+.

La cinétique décroissante de disparition du NADH.H+ suivie à 340nm est

proportionnelle à la quantité de créatinine initiale présente.

b- Action d'une oxydase spécifique

Créatinine �������

��� ! !��� > Sarcosine + H2O2

H2O2 + chromogène incolore

> H2O + chromogène coloré

Rmrq: � Chromogène incolore : 4-aminophénazone + acide 3-5 dichloro 2

hydroxybenzène sulfonique.

� Chromogène coloré : complexe quinone-imine rouge (absorbe à 520

nm).

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2- Méthode par réflectométrie :

C’est le cas des appareillages de chimie sur support solide.

Exemple : plaque « VITRAS » de dosage enzymatique de la créatinine sur une

plaque.

La plaque contient une série de couches afin de réaliser une cascade de

réactions enzymatiques. La créatinine est tout d’abord hydrolysée en

créatine :

Créatinine + H20 ��é��������

> créatine.

Créatine + H20 ��é����

�"�#��$%�#�$&��> sarcosine + Urée.

Sarcosine + 02 + H20 ����$���

$'�#��> glycine + formaldéhyde + H202

H202 + leucodérivé ��$'�#��

> coloration proportionnelle à la

concentration en créatinine.

La créatine est alors hydrolysée en sarcosine, elle-même oxydée pour

produire du peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée). L'eau oxygénée, en

présence de peroxydase, oxyde un leucodérivé qui se colore, et la vitesse de

coloration est alors mesurée en cinétique par réflectométrie. La vitesse de

réaction est proportionnelle à la concentration de créatinine présente dans le

sérum.

Rmrq :

Ces précédentes méthodes bien que très spécifique sont énormément

couteuses ce qui limite probablement leurs application générale dans le

laboratoire de biochimie.

3- Méthode colorimétrique cinétique de Jaffe : Décrite pour la première fois en 1886, dans une solution alcaline, la

créatinine réagit avec le picrate pour former un produit jaune-rouge.

Créatinine + acide picrique (� �)��) !

> complexe jaune-rouge

La vitesse de formation de colorant (intensité de la couleur) est directement

proportionnelle à la concentration de créatinine de l’échantillon. Elle est

déterminée par l’augmentation de l’absorbance à 512 nm.

Cette méthode a été minutieusement décrite pour ses avantages : simplicité

de détermination et faible coût des réactifs.

Le principal inconvénient de la méthode de Jaffé est son manque de

spécificité. Jusqu'à 20 % de la couleur générée lors des évaluations de sérum

ou de plasma peut provenir de substances endogènes autres que la

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créatinine, appelées chromogènes non créatinine. Les protéines, le glucose,

l'acide ascorbique, les céphalosporines et les α-céto-acides comme

l'acétoacétate et le pyruvate font partie de ces chromogènes non spécifiques

réagissant à la méthode de Jaffé. Selon leur concentration, ces composés

peuvent provoquer une surestimation de 18 à 20 µmol/L (0,2-0,4 mg/dL) de

la concentration de créatinine.

En même temps, l'augmentation de la concentration de bilirubine masque le

développement de la couleur, donnant des résultats de créatinine

erronément bas. Plusieurs médicaments couramment employés peuvent

également affecter les résultats de l'évaluation. Depuis sa première

application, de nombreuses modifications de la réaction de Jaffé ont été

décrites, concernant la composition du réactif ainsi que la procédure de

mesure.

Rmrq :

Plusieurs personnes ont affirmé que, ni la méthode de Jaffé, ni la méthode

enzymatique ne procure de résultats acceptables dans le contexte clinique.

Selon Thomas Hostetter, MD, MPH au National Kidney Disease Education

Program du National Institute of Health (USA) : “le rendu de résultats de

créatinine sérique peut varier de 30 % pour des laboratoires certifiés de

qualité”.

La connaissance de la méthodologie utilisée pour la mesure de la créatinine

est donc essentielle du fait que les interférences méthodologiques peuvent

altérer significativement les résultats et influencer ainsi les décisions

thérapeutiques.

V- Valeurs normales : 1- Créatininurie : ♂ : 1 à 1,8 g/24H. (9 - 16 mmoles/24H);

♀ : 0,8 à 1,2 g/24H. (7 – 10,5 mmoles/24H).

2- Créatininémie : ♂ : 6,8 à 13 mg/l. (60 – 115 µmoles/l); ♀ : 5,65 à 11,3 mg/l. (50 – 100 µmoles/l). Enfant : 3,5 à 7,5 mg/l. (31 – 66 µmoles/l). Nouveau née / Nourrisson : 2,3 à 5,6 mg/l. (20 – 50 µmoles/l).

3- Clairance de la créatinine : ≈ 120 ml /min / 1,73 m2.

Le sang des adultes et des jeunes particulièrement musclés peut contenir

davantage de créatinine que celui de la population moyenne. A l'opposé, le

sang des personnes âgées peut contenir moins de créatinine que la normale.

Une personne ne disposant que d'un rein peut présenter une créatinine

normale d'environ 160 µmol/L (1,8 mg/dL).

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VI- Application (TP) « Echantillon 92 » : La méthode utilisée est celle de la coloration de Jaffe.

1- Préparation des réactifs : • Acide picrique (17,5 mmol/l) :

MM= 229,1 g/mol.

V= 100 ml.

M= X.

X= 17,5 * 10-3 * 229,1 / 10.

X= 0,400925 g.

• NaOH (0,29 mol/l) :

MM= 40 g/mol.

V=100 ml.

M=Y.

Y= 0,29 * 40 /10.

Y=1,16 g.

2- Manipulation :

Solution de travail Echantillon Etalon

A 2ml 200µl

B 2ml 200µl

Pour chaque fois on mesure l’absorbance à 512nm à 30’’ puis à 90’’, la

concentration en créatinine est obtenue par l’équation suivante :

C (échantillon) = �*+ ,�-.�/+ ,�-

�*+ ,��)0!.�/+ ,��)0! [Etalon]

DO à 30’’ DO à 90’’

A 0,506 0,536

B 0,524 0,582

C (échantillon) = 0,582.0,524

0,536.0,524 [20]

C=38,66 mg/l

3- Interprétation des résultats :

La concentration obtenue (38,66 mg/l) est de loin supérieur des normes

usuelles comprises entre : 6,8 à 13 mg/l chez l’homme et 5,65 à 11,3 mg/l chez la femme, cette hypercréatininémie peut être expliquée par plusieurs processus pathologique dont essentiellement l’atteinte de la fonction rénale.

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4- Conduite à tenir devant une hypercréatininémie : Dans ce chapitre nous nous limiterons à la découverte d’une insuffisance

rénale débutante.

a- Circonstance de découverte : En-dehors de quelques complications bruyantes souvent trompeuses

(syndrome œdémateux ou élévation tensionnelle aigue orientant

souvent le malade vers le cardiologue) ou tardives (anémie, troubles

phosphocalciques), l’insuffisance rénale chronique se manifeste par

peu de symptômes cliniques. Ceci est particulièrement vrai pour

l’insuffisance rénale débutante dont le caractère asymptomatique,

indolent, sont volontiers considérés comme synonyme de « peu

grave », à la fois par les malades et les praticiens. C’est pourtant à ce

stade débutant que les possibilités thérapeutiques sont les plus

nombreuses et les plus efficaces pour influer sur le cours évolutif de la

néphropathie.

b- Diagnostique (+) de l’insuffisance rénale : L’interprétation de la créatinine plasmatique reste un point important

du dépistage et du diagnostic de l’insuffisance rénale.

L’augmentation de la créatinine plasmatique n’est qu’un signe peu

sensible et tardif pour dépister une altération débutante de la fonction

rénale. En pratique, les valeurs “normales” de la créatinine

plasmatique ne définissent que la distribution gaussienne de la

créatinine plasmatique mesurée dans la population (moyenne ± 2 SD)

mais n’indiquent pas les seuils de valeurs définissant l’insuffisance

rénale. Pour sensibiliser l’évaluation de la fonction rénale a partir de la

créatinine plasmatique, il est recommande de recourir

systématiquement à la clairance estimée par la formule de Cockcroft

et Gault (COcr).

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Un autre avantage lié à la créatinine corrigée selon Cockcroft est que

les variations de la clairance estimée vont dans le même sens et sont

grossièrement corrélées aux variations de la filtration glomérulaire

(intérêt évolutif +++ pour le suivi de la fonction rénale chez une même

personne en l’absence de variation de la masse musculaire).

L’interprétation de la COcr est la suivante :

� Une COcr > 90 ml/min. correspond à une fonction rénale normale

� Une COcr < 60 ml/min. traduit une insuffisance rénale modérée.

L’interprétation d’une COcr comprise entre 90 et 60 ml/min. doit

prendre en compte les signes rénaux associés et l’âge :

Une COcr comprise entre 90 et 60 ml/min. associée à des signes

biologiques (protéinurie, hématurie), radiologiques ou histologiques

de néphropathie correspond à une insuffisance rénale débutante.

Une COcr comprise entre 90 et 60 ml/min. sans aucun autre signe de

néphropathie peut correspondre à une fonction rénale normale basse

ou à une néphropathie débutante. C’est l’évolution sous surveillance

qui tranchera entre les deux situations. Cette situation est

particulièrement fréquente chez les sujets âgés (influence ++ de l’âge

dans la formule de Cockcroft) et l’on parle volontiers de vieillissement

“physiologique” de la fonction rénale. Cette notion est cependant

erronée car la diminution de la filtration glomérulaire et de la

clairance selon Cockcroft n’est pas systématique avec l’âge (1/3 des

individus restent stables) et elle est habituellement associée à une

HTA et/ou un terrain athéromateux (néphropathie vasculaire a

minima probable).

c- Diagnostic différentiel IR chronique vs. Aiguë

Pour affirmer le caractère chronique d’une insuffisance rénale, il

existe 3 critères :

� Critère anamnéstique : antécédent de maladie rénale, dosages

élevés anciens de créatininémie

� Critère échographique : la taille des reins est diminuée au cours de

l’IRC : <10 cm à l’échographie (ou < 3 vertèbres sur un cliché

d’ASP).

� enfin critères biologiques : deux anomalies orientent vers une IRC:

Anémie normochrome normocytaire arégénérative (secondaire au

défaut de production d’érythropoïétine)

Hypocalcémie (carence en vitamine D active (calcitriol) par défaut

d’hydroxylation rénale).