Diu Cytometriegrenoble2011

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Monoclonal antibody, Janossy, Workshops, CDs, Cluster of dfferenciation, Mononuclear cells, lymphocytes, Immunolohy, Membrane molecules

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  • 1. MC Bn Grenoble 19 Janvier 2010 GC Faure Grenoble 12/12/2011

2. O lon cherche identifier les leucocytes.

  • Identifier : techniques morphologiques
    • talement
    • Sparation (gradients de densit)
    • Cytocentrifugats
    • Colorations
    • Cytochimie
  • Compter
    • Hmocytomtres
    • Appareils de numration

3. Les limites de la technique

  • Identification des blastes
  • Sous populations lymphocytaires
  • Rosettes mouton et leurs drivs
  • Premiers anticorps polyclonaux : anti-immunoglobulines (von Behring) , TdT (90s)

4. Anticorps polyclonaux : Gros animaux

  • Mlange danticorps sriques
  • - contre plusieurs pitopes
  • certains sans ractivitpour lantigne
  • Titre de chaque anticorps diffrent dun animal lautre

ANTICORPS POLYCLONAUX Vaccination avec rappels Saignes rptes 5. 6. TdT+, cALL (CD10)+ lymphoid blast crisis of Ph+ chronic myeloid leukaemia (Lancet ii: 1058, 1976) 7. La rvolution de Csar Milstein et Georges Khler

  • Petite histoire.
  • 1976, Milstein travaille sur la diversit des immunoglobulines et va faire une confrence Ble
  • Gnrer une ligne cellulaire productrice danticorps dirigs contre des hmaties de mouton pour travailler sur les mutations somatiques des gnes dimmunoglobuline
  • A lpoque la question de la spcificit des anticorps tait encore dbattue et on se battait avec la purification des anticorps polyclonaux

8. Dream No.1 Flow cytometry can be used for clinical leukaemia diagnosis on the immunophenotyping platform anti-ALL (24 absorptions!) fetal development:BM is a lymphoid organ Melvyn Greaves, Geoff Brown and George Janossy 9. Dream No.2from G.Janossy Monoclonal antibodies can be used for visualizing cells in tissues, normal and pathological (monoclonal immunohistology platform) CD1 (NA1/34) onhuman thymus: The first ever tissuesection stained by the first anti-humanmonoclonal antibody CD1 (NA1-34) andCD45 (2D1) for T-ALLdiagnosis and thymic origin Ken Bradstock, Gianni Pizzolo Bradstock KF, Janossy G, Bollum FJ, Milstein C. Anomalous phenotype in thymic acute lymphoblastic leukaemia.Nature1980; 284(5755): 455-7. 10. Anticorpsmonoclonaux Ligne de mylome murin Dficiente en HGPRT Immunisation Rate Pas de fusion - - + Slection desclones ractifs Clones Fusion en milieu HAT HYPOXANTHINE AMINOPTERINE THYMIDINE 11. Une explosion internationale

  • Production danticorps monoclonaux dans tous les laboratoires : liquides dascite
  • Identification sur les cellules disponibles/connues dans le laboratoire producteur
  • Redondances+++
  • Organisation indispensable
    • Hritage du HLA
    • Culture de la workshop (atelier)
    • PremieratelierH umanL eukocyteD ifferentiationA ntigens, 1981/82, 55 quipes de 14 pays, 12 fournisseurs

12. Quest-ce quune workshop HLDA?

  • Sries danticorps proposs pour une spcificit donne
  • Aliquotage, anonymisation et dispatching dans labos volontaires (pipette elbow)
  • Tests sur des cellules donnes
    • En immunofluorescence
    • En Western Blot
    • Plus tard avec des techniques molculaires ou cellulaires plus sophistiques
  • Enregistrement de la ractivit observe
  • Gnration dune immense base de donnes
  • confie aux statisticiens!

13. La technique de Clustering Notion de distance 14. Et donc, les CLUSTERS de diffrenciation ou CD! 15. Notion de CD

  • Clusters de diffrenciation
    • Groupes de monoclonaux reconnaissant la mme molcule
    • Par extension, cette molcule
    • CD+ numro+lettre : exCD1a
    • pitopes intracytoplasmiques cCD ou cyCD
    • Antignes sialyls CDns (ex CD15s)

16. Premire workshop HLDA

  • Ractivit teste sur
    • T-PBL Thymus
    • PHA Non T-PBL
    • Tonsils Spleen
    • Monocytes Polymorphs
    • Bone marrow
  • Anticorps classs en 3 groupes
    • Groupe I : T cells, 70 anticorps (79*)
    • Groupe II : B cells and CALLA, 24 anticorps (36*)
    • Group III : monocytes and myeloid, 45 anticorps (56*)
  • *avec duplicates et contrles

17. Evolution des Workshops HLDA

  • 1982 Paris, 11CD + 4 provisoires
  • 1984 Boston, 11 CD
  • 1987 Oxford, 19 CD
  • 1989 Vienne, 33 CD
  • 1993 Boston, 31 CD
  • 1996 Kobe, 55 CD
  • 2000 Harrogate, 81 CD
  • 2004 Adelaide, 93 CD
  • 2010 Barcelone CD307, 351-363

18. Adelaide 2004 8th HLDA : 339/350 CD Barcelone 2008 363 19. Critres HLDA

  • NouveauxCD
    • Initialement, au moins deux anticorps issus de deux laboratoires diffrents
    • Evolution vers une pridentification par le laboratoire proposant lanticorps, sur la base dtudes molculaires pralables
    • Slection danticorps de bonne qualit pourles distributions
  • Blind panel
    • Anticorps soumis aux workshops sans spcificit identifie
    • 101 Harrogate: 31 dcrypts
    • Souvent des spcificits dj connues
    • Bon outil de vrification des corrlations intercentres
    • Beaucoup tests sur des lignes

20. Jusquo?

  • Peut tre 4 5000 molcules?
    • Sur la base des spots des gels 2D
    • Sur la base des analyses de mRNA
    • Sur la base des analyses en SAGE(serial analysis of gene expression)
  • Quelle est la part des antignes intracellulaires dans ces estimations? Est-ce un rel problme?
  • On estime que 20% des gnes codent pour des protines membranaires
  • Des HLDA lHCDM :
  • Human Cell Differentiation Molecules
  • Daprs Heddy Zola,Cell Research2005

21. Les CD-anticorps

  • Le plus souvent dorigine murine-souris
    • Reconnaissance universelle par des anticorps polyclonaux fluorescents anti-souris (lapin, chvre, ne, cochon)
    • Isotypes et sous-classes des immunoglobulines de souris
      • IgM, IgG1, IgG2a,IgG2b.
    • Production actuelle en racteurs
  • Il existe des monoclonaux de rat, notamment pour les CD murins-souris
  • Il existe des monoclonaux de lapin
  • On peut faire des monoclonaux humains

22. Les CD-antignes

  • Surtout des protines/peptides
  • Les pitopes reconnus peuvent tre conformationnels
  • Les carbohydrates sont les plus souvent reconnus par des monoclonaux IgM
  • Essentiellement des molcules de surface

B A B 23. Les CD-antignes : dcouverte des familles molculaires

  • Immunoglobulines et superfamille des Ig
  • Rcepteurs aux cytokines
    • TNF/TNFR
    • Rcepteurs aux cytokines
    • Rcepteurs aux chemokines
  • Molcules d'adhsion
    • Slectines
    • Intgrines
    • Ttraspanines
  • Immunit inne: TLRs
  • CD45
  • Molcules costimulation
  • SigLec

24. La superfamille des immunoglobulines

  • Une structure de base, le domaine
  • Une centaine dacides amins et deux cystines
  • Un disque de feuillets bta plisss antiparallles
  • Des boucles de jonction
  • Quel CD avec 1 seul domaine?

25. ORGANISATION DES FEUILLETS BETA-PLISSES Les feuillets clairs sont sur le dessus (cercle clair), les feuillets foncs en-dessous (cercle fonc) Ils sont relis entre eux par des boucles dont certaines peuvent porter des CDR PONT DISULFURE Reprsentation schmatiquede face Reprsentation schmatiquede profil 26. 27. 28. 29. Superfamilles du TNF et des rcepteurs au TNF(TNFSF et TNFRSF)

  • Un grande famille de trimres transmembranaires gnralement homotrimriques
  • Clivage de la portion extracellulaire par les mtalloprotinases pour gnrer des formes solubles
  • Implication dans lapoptose,lactivation cellulaire, la prolifration, lorganognse