Direction des Sciences du Vivant Institut de Biologie et de Technologies de Saclay Service de...

Direction des Sciences du VivantInstitut de Biologie et de Technologies de SaclayService de Bioénergétique, Biologie Structurale et MécanismesCEA Saclay

URA 2096Protéines MembranairesTransductrices d’Energie

ATPsynthase

année 2006-2007

Localisation et fonction des ATP synthases

Structure générale des ATP synthases et aperçu du mécanisme

Les hypothèses fondatrices sur le mécanismeL’hypothèse du proton substratLe mécanisme de changement d’affinité

Structure détaillée de la partie F1

Les sites nucléotidiquesL’axe central

Structure de la partie F0

Architecture du complexe F0F1

Structure de la sous-unité cStructure de la sous-unité aStructure de la sous-unité b

Mécanisme de la partie F1

Evidence biochimique de la rotationVisualisation de la rotationEtats catalytiques, occupation des sites et étapes du mouvement rotatif


Couplage entre F0 et F1

Stoechiométrie H+/ATPnombre de sous-unités cElasticité et problèmes connexes

Régulation de l’activité des ATP synthasesLe cas des chloroplastesLe cas de E.coli

Existe-t-il des cliquets moléculaires?Comparaison E.coli-chloroplaste

Le cas des mitochondries Le peptide inhibiteur IF1

Les V-ATPasesStructure générale des V-ATPasesLes sous-unités c des V-ATPasesFonctions des V-ATPasesStoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon

Les hélicases hexamériques

H2O

PS2complexe I

cyt b6fcyt bc

PCcyt c

PS1cyt oxydase

ATP synthase

NADH NADP+

O2

Q pool

H+

H+

H+H+

H+

H+

ADP + Pi ATP + H20

e-

e-

e-

e-

e-

e-e-

e-

e-

STROMAMATRICE

LUMENESPACE INTERMEMBRANAIRE

33

(E.coli, chloroplaste)

(mitochondrie)

(E.coli, chloroplaste)

b2 (E.coli)

b+b’ (chloroplaste)

b (mitochondrie)

a c10-15

H+

H+

F1

F0

(Mg)ADP + P

(Mg)ATP + H2O

OSCP (mitochondrie)

membrane

sous-unités des ATP-synthases

partie membranaire F0E.Coli Chloroplaste Mito animale Fonction position

a 30 (1) 27 (1) 25 (1) protons? statorb 17 (2) 19 (1) 25 (1) connexion F0F1 statorb’ (0) 16 (1) (0) connexion F0F1 statorc 8 (9-12) 8 (9-12) 8 (9-12) protons rotorOSCP (0) (0) 21 (1-2) connexion F0F1 statorA6L (0) (0) 8 ? statorF6 (0) (0) 9 ? statord (0) (0) 19 ? statore (0) (0) 8 ? statorf (0) (0) 10 ? statorg (0) (0) 11 ? statorh (0) (0) 10 ? stator

partie extrinsèque F1E.Coli Chloroplaste Mito animale Fonction position

55 (3) 55 (3) 55 (3) nucléotides stator 50 (3) 53 (3) 52 (3) nucléotides stator 32 (1) 35 (1) 30 (1) énergie rotor 19 (1) 20 (1) 15 (1) connexion F0F1 rotor

(mitochondrie)stator (E.coli,chloroplaste)

15 (1) 15 (1) 6-7 (1) inhibit ion(E.Coli,Chlor)connexion F0F1

rotor

IF1 (0) (0) 12 inhibit ion dissociable

codageprocaryotique

codagenucléaire

H+

H+

pHe=6

pHi=6

K+

K+

a) incubation acide

H+

H+

pHe=8

pHi=6

K+

K+

ADP + Pi

ATP

H+

b) transfert à pH élevésynthèse d'ATP

pHe=8

pHi=8

c) nouvel équilibre

Les expériences historiques de Jagendorf ont montré qu’une force protomotrice complètement artificielle

pouvait induire la synthèse de l’ATP[Jagendorf A.T. et Uribe E., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1966) 55, 170-177]

Hypothèse (abandonnée) du «proton substrat» (d’après P. Mitchell)[Mitchell P., FEBS Lett. (1974) 43, 189-194]

MgADP- O OO- P O P Ad O Mg O

OPO-O- OH

HPO42-

F0F1

O OO- P O P Ad O Mg O

OP+

OHOH

3 H+

H2O


O P+

OHOH


O-

POH

O-

2 H+

MgATP2-

Les ATP synthases peuvent être fragmentées en un « canal à protons » F0 et une ATPase soluble F1

F0

H+F1

ATP+H2O

ADP + Pi

énergieH2O

Coopérativité (modèle à 2 sites)Pi + ADP

ATP ATP

PiADP

ATP

Pi ADP

Hypothèse du changement d’affinité ( P. Boyer)

ADP P

ATP

ADP P

ATP

H2O

H+

H+

~

[Boyer P.D., Cross R.L. et Momsen W. PNAS (1973) 70, 2837-2839]

E E.ATP E: EADPPi

ADP

Pi

H20ATP

a) échanges isotopiques18O 32P

H+

O-

O-

O

OH

P1

2

3

H

HO

b) oxygènes échangeables du phosphate

[D’après Gresser M.J., Myers J.A. et Boyer, P.D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 12030-12038]

ATP

EF0F1

9 nm

11 nm

4.5 nm

MF1

2 nm

D’après Boekema E.J., Berden J.A. et Heel M. G., Biochim. Biophys. Acta (1986) 851, 353-360

D’après Gogol E.P., Lucken U. et Capaldi R.A., FEBS Lett. (1987) 219, 274-278

D’après Wilkens S. et Capaldi R.A., Nature (1998) 393, 29

NUCLEOTIDES ET ANALOGUES

Analogues photoactivables

-O

3 ’-arylazido-ATP

O O

O

H HH

OH

CO

CH2

NH

N3

N

N

CHC

C N CH

C N

NH2

H

CH2O P

O

O-

O P

O

O-

P

O

O-

NO2

N

C

NH2

O O

OH

H HH

OH

N

N

CHC

C

H

CH2O P

O

O-

O P

O

O-

-O P

O

O-

C

N

N3

2-azido-ATP

N

C

NH2

O O

OH

H HH

OH

N

N

CC

C

H

CH2O P

O

O-

O P

O

O-

-O P

O

O-

CH

NN3

8-azido-ATP

CH

-O O O

OH

H HH

OH

N

N

CHC

C N

C N

NH2

H

CH2O P

O

O-

NH P

O

O-

P

O

O-

analogue non hydrolysable AMP-PNP

-O O O

OH

H HH

OH

N

N

CHC

C N

C N

NH2

H

CH2O P

O

O-

O P

O

O-

P

O

O-

NH2C

analogue hydrolysable GTP

MARQUAGE DES RESIDUS CATALYTIQUES DE PAR 2-azido-ANP

origine du F1 résidu modifié Peptide marqué

Mitochondrie boeufChloroplaste épinardEscherichia coli

Tyr-345Tyr-362Tyr-331

A I A E L G I Y* P A V D P L D S T S R G I Y* P A V D P L D S T S T M L Q P RQ I A S L G I Y* P A V D P L D S T S R

I M P N I V G S E H Y* D V A R I V G E E H Y* E I A Q R Q L D P L V V G Q E H Y* D T A R

MARQUAGE DES RESIDUS NON CATALYTIQUES DE PAR 2-azido-ANP

origine du F1 résidu modifié Peptide marqué

Mitochondrie boeufChloroplaste épinardEscherichia coli

Tyr-368Tyr-385Tyr-354

D’après Wise J.G., Hicke B.J. et Boyer P.D., FEBS Lett. (1987) 223, 395-401

-R272

-Y368

F357

Mg

P363

R362 Q432

S177

Q172

D269

D270

E328

K273

Q208

Y203

P-loop (QTGKTS)

SITE NON CATALYTIQUE(par défaut, les résidus sont situés sur )

F424A121

F418

Y345

T425

E192

V164

R189

-R373

E188-S344

G159D256P-loop

(GVGLTV) Mg

SITE CATALYTIQUE(par défaut, les résidus sont situés sur )

D ’après Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370, 621-628

EDP

20 Å

DP

TP

E

DP

TP

E

DPTP

DP

TP

E

DP

TP

E

TPE

DP

TP

E

DP

TP

E

DP

TP

EDP

TP

E

Interfaces catalytiques

Interfaces non catalytiques

D’après Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370, 621-628

TPE

Le pontage de sous-unités proches permet de savoir si elles bougent l’une par rapport à l’autre durant le cycle catalytique.

Double mutation en

cystéine

PontageINACTIVATION

Quand la topologie n’est pas connue avec certitude, il permet aussi d’établir des proximités (étude du secteur membranaire F0).

(Aggeler R., Haughton M. A. & Capaldi R. A.(1995) J. Biol Chem. 270, 9185-9191)

Structure de la partie centrale du sous-complexe F1

dans le complexe F1 entier (mito)

de mitochondrie dans le complexe entier

éLa sous-unité (bactérie, chloroplaste) ou (mitochondrie) est formée essentiellement d’un tonneau et de 2 hélices . La sous-unité bactérienne isolée, solubilisée (RMN) ou cristallisée (RX) a la même configuration que son homologue dans l’ATPase mitochondriale, c’est-à-dire que les deux hélices forment une épingle à cheveux. En revanche, dans le complexe de E.coli cristallisé, la boucle entre les deux hélices s’ouvre largement et la deuxième hélice est plaquée contre la sous-unité .

complexe de E.coli

de E. coli en solution ou cristallisé

D’après Gibbons C., Montgomery M.G., Leslie A.G. et Walker J.E., Nat. Struct Biol. (2000)7,1055-1061

Rodgers A.J. et Wilce M. C., Nat. Struct. Biol. (2000) 7, 1051-1054.

Uhlin U., Cox G.B. and Guss J.M., Structure (1997) 5, 1219-1230

Désénergisé

Energisé

µH+~

S S199 205

S S

SH SH

S S

+DTT

+maléimide

SH89

SH322

SH SH

+monomaléimide +dimaléimide

S S SH SH

bloqué découplé 6 Å <d< 19 Å

Réactivité des thiols de la sous-unité de l ’ATPase des chloroplastes

(d’après Moroney J.V., Warncke K. et McCarty R.E, J. Bioenerg. Biomembr. (1982) 14, 347-359

cys322

cys89

70 Ådistance entre Cys89 et Cys322 en

se basant sur les domaines homologues dans la mitochondrie et

dans E. coli

LE PROBLEME DE LA SOUS-UNITE

CHLOROPLASTIQUE

Asp61

oligomèresous-unités c

RECONSTRUCTION PARTIELLE DU COMPLEXE F0F1 MITOCHONDRIAL

[d’après Stock D., Leslie A.G. et Walker J.E., Science (1999) 286, 1700-1705] et Dickson, K., Silvester, J. A., Fearnley, I. A., Leslie, A.G.W. et Walker, J.E. (2006)

EMBO J. 25, 2911-2918]

b

d

F6OSCP

[d’après Girvin M.E., Rastogi V.K., Abildgaard F., Markley J.L. et Fillingame R.H.,

Biochemistry (1998) 37, 8817-8824]

Asp61

Structure (RMN) de la sous-unité c de E.coli

La structure de la sous-unité a de E. coli à travers les âgesQuelques exemples

Auteurs Méthode RésultatSenior et al., 1983 prédiction de structure 7 hélices transmembranairesHermolin et al., 1983 prédiction de structure

digestion partielle trypsine6 hélices transmembranairesextrémités périplasmiques

Walker et al., 1984 prédiction de structure 6 hélices transmembranairesCox et al., 1986 prédiction de structure

règle empirique des résidusbasiques internes

5 hélices transmembranairesextrémité C-terminalecytoplasmique

BjØrbaek et al., 1990 Fusion de gènes 8 hélices transmembranairesextrémités cytoplasmiques

Lewis et al., 1990 Fusion de gènes 8 hélices transmembranairesextrémités cytoplasmiques

Vik et Dao, 1992 prédiction de structure 6 hélices transmembranairesYamada et al., 1996 réaction aux anticorps 6 hélices transmembranaires

extrémités cytoplasmiquesJäger et al., 1998 réaction aux anticorps après

insertion d'épitopes6 hélices transmembranairesextrémités cytoplasmiques

Valiyaveetil & Fillingame,1998

réaction aux anticorps aprèsinsertion d'épitopesFusion de gènes


Long et al., 1998 introduction et marquage decystéines


sous-unité a, hélice 4 sous-unité c, hélice 2

AD

IL

NM

IG

LI YL

I

202

229

52

79

structure vraisemblable de la sous-unite a [d’après Long J.C, DeLeon-Rangel, J. et Vik S.B., J. Biol. Chem. (2002) 277, 27288-27293;

Zhang, D.et Vik, S.B., J. Biol. Chem. (2003) 278, 12319-12324 ]

pontages XnC entre a et c [d’après Jiang W. et Fillingame R.H., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1998) 95, 6607-6612]

L

F

166100LIAP LAL TIFV WVF LMNL MDL LPI

DLLP

AVSR FLV LL

V

FGLV

SF MSD INIT WFT

FP

APPNQ

D V L S T R L D

GL

QL

NN

L

HH

I

YD Q P T M N E S A M

37

64

VIG

F V N

K

L

KATSG

VPGK

F Q TA

IE G

VK

D

S

YM

HG

KS

K

123

SE

E

ISYF LL I

IFVG LAM SLTV NV

DAS

P V VRL

SKPV SG L

LRLF GNM YAGE L IF IL IA GLL

K M K G

AFF

FI G G

T K EL T L QN H W

P IV

LEGV

NLISL

L

YV

ITL

M V F IF AQLT I IL IH

F I AWP VNL I

LS

MA

H H H H H H C

P W WS Q

W

AL PGY IA

E H

V L

147

202

229233

260

Pinteraction

avec cinteractionavec b

F17

F14

Q10

T6N4

W26 (cycle // mb)P27-28 (torsion 30°)

organisation dimérique de la sous-unité bhélice N-terminale transmembranaire(mutagenèse cystéines et pontage)

[d’après Dmitriev O., Jones P.C., Jiang W. et Fillingame R.H., J. Biol. Chem. (1999) 274,

15598-15604]

sous-unité b, ATPsynthase E.coli

81 KRRSQILDEA KAEAEQERTK IVAQAQAEIE AERKRAREEL

1 MNLNATILGQ AIAFVLFVLF CMKYVWPPLM AAIEKRQKEI

interface du dimère

clusteraromatique

Hélice transmembranaire

pas de pontage

cycle parallèleà la membrane

torsion rigide30°

début hélice soluble

Réf. 1

ADGLASAERA HKDLDLAKAS ATDQLKKAKA EAQVIIEQAN41

zone où des délétions importantespeuvent être faites sans dommages Réf.2

tronquer jusqu’ici n’empêche pas la

dimérisation

Réf.3

tronquer jusqu’ici empêche la

dimérisation

Réf.3

pontages XnC dimériquesRéf.3

XnC ne ponte pasRéf.4

RKQVAILAVA GAEKIIERSV DEAANSDIVD KLVAEL121

XnC pontages dimériques

Réf.4Réf.5

inteface dimère

Réfs.4-6XnC pontages dimériques

Réf.3E155C pontage avec Réf.7

Réf. 1 Dmitriev et al. (1999) JBC 274, 15598-15604; fragment N-terminal; RMN, mutagenèse, pontage et modélisation

Réf. 2 Sorgen et al. (1998) JBC 273, 27873-27878; complexe entier, délétion, tests fonctionnels

Réf. 3 McLachlin & Dunn (1997) JBC 272, 21233-21239; tronquage N-terminal, mutagenèse et pontage, chromatographie d’affinité, ultracentrifugation

Réf.4 Rodgers et al. (1997) JBC 272, 31058-31064; domaine soluble, mutagenèse et pontage, dichroïsme circulaire

Réf. 5 Rodgers & Capaldi (1998) JBC 273, 29406-29410; complexe entier, mutagenèse et pontage, tests fonctionnels

Réf. 6 Howitt et al. (1996) JBC 271, 7038-7042, domaine soluble, mutagenèse (sans pontage), ultracentrifugation

Réf. 7 McLachlin et al. (1998) JBC 273, 15162-15168; domaine soluble, mutagenèse et pontage

L156C pontage avec et découple

Réf.5

membrane

contact avec et

(sommet du complexe F0F1)

contact avec adimérisation

2, 6, 10

P 27-28

pontage 59, 60, 61, 65, 67heptades 53-79

54-60peut être raccourci (-2, -4, -7)

peut être rallongé (+7,+11,+14)peut être rendu boiteux (+7,-7)

dimère de sous-unité b (E.coli)(modèle largement spéculatif)

heptades 106-123

pontage 84, 104

pontage 124

pontage 128,131,132,140pontage 144, 146

le pédoncule latéral de l'ATP synthase de E.coli serait plutôt flexible

Sous-unité b

Sous-unité d

Sous-unité F6

Sous-unité bNter côté matriciel

Structure RX du com

plexe b-d-F6(m

itochondrie animale)

membrane

[d’après Dickson, K., Silvester, J. A., Fearnley, I. A., Leslie, A.G.W. et Walker, J.E. (2006) EMBO J. 25,

2911-2918]

le pédoncule latéral de l'ATP synthase mitochondriale serait plutôt rigide

SH SHSH

SH

S SHS

SH

oxydation

S

SDissociation des

sous-unités

S SHS

SH

*

*

Réassociation avec des sous-unités

radioactives

SS

SS

*

SS *

Dissociation des sous-unités

séparation

comptage radioactif

[d’après: Duncan T.M., Bulygin V.V., Zhou Y., Hutcheon M.L. et Cross R.L., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1995) 92, 10964-10968]

*

SS

*

SH

SH

* SH SH *

SH

SH

*

Réduction

turnover catalytique (+ATP)

oxydation

SS

SS *

Sens de rotation de l'ATP synthase

vide

.AMPPNP .ADP

synthèse d'ATP

vers membrane

a) Prédit par l'occupation des sites dans le cristal de MF1

b) Observé lors de l'hydrolyse d'ATP par le TF1 ou le EF0EF1

vers membrane

[D ’après Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita K., Nature (1997) 386, 299-302]

[D’après Sambongi Y., Iko Y., Tanabe M., Omote H., Iwamoto-Kihara A., Ueda I., Yanagida T. et Wada Y., Science (1999) 286, 1722-1724]

Ni-NTA sur plaque de verre

streptavidine

His-tag

Actine fluorescente

Sous-unité Sous-unité

Sous-unités c

Actine fluorescente

[D ’après Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita K., Nature (1997) 386, 299-302]

Petit fluorochrome

Lumière polarisée

Sous-unité

V

H

[D’après Adachi K., Yasuda R., Noji H., Itoh H., Harada Y., Yoshida M. et Kinosita K., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (2000) 97, 7243-7247]

[d’après Yasuda R., Noji H., Yoshida M., Kinosita K. et Itoh H., Nature (2001) 410, 898-904]

BSA

Bille (or colloïdal)

détection

intervalles de temps: 0,5 ms

ROTATION DE ET CYCLE CATALYTIQUE (HYDROLYSE D ’ATP)

ATP fort

ATP moyen

ATP faible

360

°

temps

2/ détection directe de la rotation de en molécule unique de TF1 [d’après Yasuda R., Noji H., Yoshida M.,

Kinosita K. et Itoh H., Nature (2001) 410, 898-904]

[d’après Itoh H., Takahashi A., Adachi K., Noji H., Yasuda R., Yoshida M. et Kinosita

K., Nature (2004) 427, 465-468]

h

ATP + luciférine

+ O2

+ AMP + PPi + oxyluciférine

+ CO2

LL

B

bille magnétiqueØ 700 nm

échantillon

observation

électro-aimants

détection par réflection

détection par fluorescence(lumière polarisée tournante)

[d’après Nishizaka T., Oiwa K., Noji H., Kimura S., Muneyuki E., Yoshida M et Kinosita K., Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11, 142-148]

Rotation due à la force protomotrice

[d’après Zhang Y., Wang J., Cui Y., Yue J. et Fang X., Biochem. Biophys. Res. Commun. 331 (2005) 370-374]

suppression de la sous-unité

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

bactériorhodopsineLIPOSOME

libre rotation de

ATPhyd

ADP + P

80° 40°

40°

ADP + P

ATP

80°

tri-site

bi-site

Le mécanisme d'hydrolyse (et de synthèse) d'ATP est-il "tri-site"

ou "bi-site"?

occupation des sites nucléotidiques dans les cristaux de MF1

MF1 de coeur de boeuf cristallisé dans D2O en présence d’azide, d’AMP-PNP, d’ADP (non saturant) et de Mg2+

MF1 de foie de rat cristallisé dans H2O en présence d’ATP et de Pi

AMP-PNPMg

AMP-PNPMg AMP-

PNPMg

AMP-PNPMg

ADPMg

ATPMg

ADPPi

ATPMg

ATPMg

ADPADP

Pi

MF1 de coeur de boeuf cristallisé dans D2O en présence d’AMP-PNP, d’ADP, de fluoroaluminate, de sulfate et de Mg2+

AMP-PNPMg

AMP-PNPMg

AMP-PNPMg

ADPMgAlF4

ADPSO4Mg

ADPMgAlF4 site fermé

site « semi-fermé »

site ouvert

[D’après Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R. et Walker J.E., Nature (1994) 370, 621-628]

[D’après Bianchet M.A., Hullihen J., Pedersen P.L. et Amzel L.M., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1998) 95, 11065-11070]

[D’après Menz R.I., Walker J.E. et Leslie A.G., Cell (2001) 106, 331-341]

Tyr345(MF1)

ATP

Stacking de l’ATP avec la Tyr 345 du site catalytique

(ATPsynthase mitochondriale), homologue de Tyr 331 de E.coli

320 340 360 380, nm

Y331 ou W331+ATP saturant

W331

Spectres de différence (x3)spectre 1 - spectre 21 site occupé - spectre 22 sites occupés - spectre 22 sites occupés - spectre 2

Fluorescence du mutant bW331 (TyrTrp et extinction par la fixation de nucléotides

aux sites catalytiques (E.coli)

0 1 2 3

Vitesse d ’hydrolyse d ’ATP en fonction du nombre de

sites occupés (E.coli)

[D’après Weber J., Wilke-Mounts S., Hammond S.T. et Senior A.E., Biochemistry (1998) 37, 12042-10250 et Lobau S., Weber J. et Senior A.E., Biochemistry (1998) 37, 10846-10853]

PPi

ANP

PPi

PPi

ANP

ATP

ADP + P

système enzymatique

régénérant l'ATPF1-ATPase

mesure des nucléotides libres mesure de la vitesse d'hydrolyse d'ATP

calcul des nucléotides liés

0

1

0.5

1.5

site

s ca

taly

tique

s oc

cupé

s

0.01 0.1 1 10 100 1000

[ANP] libre, µM

1

0.5

0

V / Vmax

[D’après Milgrom Y.M. et Cross R.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 102, 13831-13836]

Scénario pour la synthèse d’ATP

Mécanisme de rotation basé sur la combinaison du

mouvement brownien et des contraintes électrostatiques [d’après Junge W., Lill H. et

Engelbrecht S., Trends Biochem. Sci. (1997) 22, 420-423]

mécanisme possible par torsion proton-induite de la sous-unité c [D’après Rastogi V.K. et Girvin M.E., Nature (1999) 402, 263-268]

P43

F54

Y73

D61A24

P43

F54

Y73

D61 A24

pH 8 pH 5

H+

H+ H+H+H+

H+

H+

H+ H+

H+

H+ H+

H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+

H+H+

H+H+

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+H+

H+H+

H+

H+

H+

H+ H+

H+

H+H+H+

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

déprotoné protoné

La 4ème hélice de la sous-unité a (stator) pourrait jouer un rôle particulier

dans la canalisation des protons[D’après Fillingame R.H., Angevine C. M. & Dmitriev O. Y., Biochim. Biophys. Acta (2002) 1555, 29-36)]

R210R210

résidus accessible à Ag+ après mutation en cystéine

résidus accessible à Ag+ et NEM après mutation en cystéine

[D’après Fillingame R.H., Angevine C. M. & Dmitriev O. Y., Biochim. Biophys. Acta (2002) 1555, 29-36)]

rotation concertée c-H2rotation a-H4mouvement des sous-unités c

+

conformation« bas pH »

conformation« haut pH »

déprotonationde c

+


conformation «haut pH» contrainte

CYTOPLASME

PÉRIPLASME

tunnel côtécytoplasme cH1

cH2

cH1cH2

aH4

rotation de aH4

+



tunnel côtépériplasme


protonationde c

+

+



=

Arg210 Asp61

Synthèse d'ATP si n H

~ >Gp

Hydrolyse d'ATP si n H

~ <Gp

Equilibre si n H

~ = Gp

n est la stoechiométrie H +/ATP

H+

H+

ADP + P ATP + H2O

H+

Gp

c c cc

H+ = F - 2,3 RT pH

Gp = G0’+ 2.3 RT log[ATP]

[ADP][Pi]

Equilibre: Gp = n H+ ~

~

~

ADP + PATPADP + PATP

ATP

ADP

Transfert d’électrons

µH+

lumière ADP + P

Différents régimes fonctionnels de l’ATP

synthase(thylacoïdes isolés)

QUELQUES STOECHIOMETRIES H+/ATP

Value Method System Reference Remark3 Flow-flow

proton flow estimatedfrom electron flow

thylakoids withoxidized ATPase

Portis andMcCarty, 1976

overcorrection of theextra proton flow?

3 Flow-flowproton flow estimatedfrom electron flow


Rathenow andRumberg, 1980

time-response?

3.4 [2.4] inintactmitochondria (1)2.2 in smp

Force-force atequilibrium

mung beanmitochondria andsubmitochondrialparticles (smp)

Moore andBonner, 1981

optical probes forpH and.1 proton should besubtracted due to theATP/ADP/P transport

at least 3 Force-force out ofequilibrium (pH and K+jump)Geq extrapolated


Hangarter andGood, 1982

3°CExtrapolationquestionable

3 Force-force atequilibrium

bovine heartsubmitochondrialparticles

Berry andHinkle, 1983

Equilibriuminterpolated morethan really reached;important correctionsfor probe binding

3 [2] Force-force atequilibrium

rat livermitochondria

Woelders et al.,1985

1 proton should besubtracted due to theATP/ADP/P transport

4.5 Force-force out ofequilibrium (light-induced) (1)Geq interpolated

thylakoids withreduced ATPase

Gräber et al.,1987


thylakoids withreduced ATPase

Strotmann andLohse, 1988Lohse et al.,1989

pH measured with9-AA fluorescence;actinic effect of theanalytic beam

4 Flow-flowproton flow estimatedfrom electron flowForce-force atequilibrium and out ofequilibrium (with Geq

interpolated)


Rumberg et al.,1990

2.7 [1.7],increasd upto 5.5 [4.5]byalmitrine

Flow-flowproton flow estimated byelectrophoretic K+diffusion

yeastmitochondria

Rigoulet et al.,1990


QUELQUES STOECHIOMETRIES H+/ATP (suite)

Value Method System Reference Remark4 [3] Flow-flow

proton flow estimatedfrom electron flow

rat livermitochondria

Hinkle et al.,1991


increasingwith pH,from 3.2 to3.8 (1)decreasingwith pH,from 4.7 to3.3 (2)

Force-force out ofequilibrium (pH jump)Geq extrapolated

vesicles fromSynechococcus(1)chromatophoresfrom R. Rubrum(2)

Krenn et al.,1993

Extrapolationquestionable

4 Flow-flowProton flow estimatedby pH relaxation

Spinachthylakoidmembranes, CF1

in oxidized state

Berry andRumberg, 1996

Initial rates difficultto measure; a lot ofcorrections (justified)


proteoliposomeswithbacteriorhodopsin and TF0TF1

Pitard et al.,1996

Stoichiometryactually increasingwith BRconcentration.

4 Force-force out ofequilibrium (light-induced) (1)Geq interpolated

thylakoids withreduced ATPase(1)

Van Walravenet al., 1996

A mix of selecteddata from differentgroups, some of thembeing corrected

Force-force atequilibrium (2)


Force-force out ofequilibrium (pH jump)(3)Geq interpolated


Force-force out ofequilibrium (pH jump)(4)Geq extrapolated

vesicles fromSynechococcus(4)

from 3 to 4,dependingon growthconditions

Force-force out ofequilibrium (light-induced and pH jump)Geq extrapolated

vesicles fromSynechococcus

Van Walravenet al., 1997

Extrapolationquestionablecorrection for kinaseactivity?

4 Force-force out ofequilibrium (pH jump)

CF0CF1-liposomes

Turina et al.,2003

The only publishedvalue posterior to thedetermination of thenumber of c subunits

1

2

3

4 5 6

7

8

910

Nombre de sous-unités c

Structure 3D de MF0MF1 de levure [d’après Stock D., Leslie A.G. et Walker J.E., Science (1999) 286, 1700-1705]

n=10

123

4

5

6

78 9

10

11

12

13

14

Cristal 2D de sous-unités c de CF0CF1. Microscopie de force atomique [d’après Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Stahlberg H. et Müller, D. J., Nature (2000) 405, 418-419]

n=14

Cristal 2D de sous-unités c de Ilyobacter Tartaricus. Microscopie

électronique par transmission [d’après Stahlberg H., Müller D.J., Suda K., Fotiadis D., Engel A., Meier T., Matthey U. et Dimroth P.,

EMBO Rep.(2001)2, 229-233]

n=11

1 23

4

2 nm

5

678910

11

12

13

1415

Cristal 2D de sous-unités c de F0F1 de Spirulina platensis Microscopie de force atomique [d’après Pogoryelov D., Yu J., Meier T., Vonck J., Peter P. & Muller D. J., EMBO Reports (2005)]

n=15

c

total

puits dénergie

LE FAIT QUE LE NOMBRE DE SOUS-UNITES c NE SOIT PAS UN MULTIPLE DE 3 AMELIORE-T-IL LES PERFORMANCES CINETIQUES?

9 sous-unités c

rotation

c

total

rotation

puits dénergie

10 sous-unités c

1

2

+

+

rotation partiellede 33torsion de b

translocation de H

+

rotation de c10 rotation partielleet torsion de 3-4 H

3-4 H

(Mg)ADP + P

(Mg)ATP + H2O

3

relaxation de retour de 33relaxation de b

fixation d’ADPlibération d’ATP

Einactif

Eactif

µH+~

µH+~

ADP +Pi

ATP

Le gradient électrochimique de protons a un doublerôle: activateur et énergétique

Evènements liés à l’activation:Changements structuraux de et (CF0CF1)Expulsion d ’ADP fortement lié (CF0CF1)Dissociation ou changement de position du peptide IF1 (MF0MF1)

Facteurs synergiques:Nucléotides non catalytiques ?Réduction de la sous-unité(CF0CF1)

Einactif: ATP synthase inactive en synthèse comme en hydrolyse d ’ATP

100 %

0amplitude du gradient de protons

proportiond’ATPasesactivées

100 %

0amplitude du gradient de protons

proportiond’ATPasesactivées

oxydé réduit

La réduction de la sous-unité , catalysée par une thiorédoxine, facilite l’activation de l’ATPase

thiorédoxine oxydée (E.coli)

thiorédoxine réduite

domaine d’ interaction avec la thiorédoxine (spécifique du CF1,

structure non résolue)

pédo

ncul

e ex

tern

e (s

tato

r)

masqué

ATPsynthasedésactivée

démasqué

ATPsynthaseactivée par legradient de

protons

Une hypothèse de démasquage du site de fixation de la thiorédoxine

en accord avec le mécanisme rotatif

ATPsynthasesynthétisant

de l’ATP

alternativementmasqué et démasqué

[D’après He, X., Miginiac-Maslow, M.., Sigalat, C., Keryer, E. et Haraux, F., J. Biol. Chem. (2000) 275, 13250-13258]

LA SOUS-UNITE bactérienne et chloroplastique est-elle un cliquet moléculaire?

c10

Pontage cQ42C-A117Cactif en hydrolyse d ’ATPactif en synthèse d ’ATP

(d’après Tsunoda et al., 2001)

c10

Pontage L99C-A118Cinactif en hydrolyse d ’ATPactif en synthèse d ’ATP

Interaction possible

CLIQUET

[D ’après Tsunoda S.P., Rodgers A.J., Aggeler R., Wilce M.C., Yoshida M. et Capaldi R.A., Proc Natl Acad. Sci. USA (2001) 98, 6560-6564]

ENLEVER LES RESIDUS CORRESPONDANTS DE LA SOUS-UNITE DE L’ATP SYNTHASE CHLOROPLASTIQUE N ’AFFECTE PAS LA FONCTION ATP SYNTHASE, MAIS DIMINUE LE POUVOIR INHIBITEUR DE (Nowak et al., Biochemistry 41 (2002),15130-15134)

CONFIRMATION DU RÔLE REGULATEUR DE LA PARTIE C-TERMINALE DE LA SOUS-UNITE BACTERIENNE ET CHLOROPLASTIQUE

DANS E.COLI, NE GARDER QUE CETTE PARTIE DE CONSERVE AU MOINS PARTIELLEMENT SON EFFET INHIBITEUR

SI L’ON NE GARDE QUE CETTE PARTIE DE L’ATP SYNTHASE RESTE FONCTIONNELLE MAIS N ’EST PLUS INHIBITEUR

(Kuki et al., J. Biol.Chem. 263 (1988),17437-17442)

REGULATION DES ATP SYNTHASES DE E.COLI ET DE CHLOROPLASTE

Dans E.coli, la régulation fait intervenir la sous-unité , qui peut exister au moins sous deux conformations différentes, haute et basse, de sa partie C-terminale. En conformation haute, l’hydrolyse d’ATP est inhibée, mais pas sa synthèse.L’ADP et le gradient de protons favoriseraient la position haute.L’ATP favoriserait la position basse.Un détecteur d ’ATP pourrait être présent sur la sous-unité .

Dans l’ATPase chloroplastique, la sous-unité inhibe l’hydrolyse d’ATP, également par sa partie C-terminale.Le gradient de protons favorise l’activation de l’enzyme, à la fois pour la synthèse et l’hydrolyse d’ATP. L’hydrolyse d ’ATP est totalement inhibée en absence de gradient de protons. L’ADP, ajouté directement ou provenant de l ’hydrolyse d ’ATP, est inhibiteur.La régulation fait également intervenir la sous-unité . La réduction du pont disulfure de favorise l’activation de l’enzyme. Dans les membranes, cette activation (ou levée d’inhibition) porterait à la fois sur la synthèse et l’hydrolyse de l’ATP.La réduction de a probablement deux effets activateurs différents: un effet direct dû à un changement de conformation de , et un effet indirect de sur la sous-unité diminuant son pouvoir inhibiteur. Il n’y a pas encore d’interprétation structurale de ces effets.

La fonction de cette régulation pourrait être d’adapter l’ATP synthase aux besoins de la cellule, en lui faisant, selon les conditions, synthétiser de l’ATP ou maintenir le gradient de protons à travers la membrane cytoplasmique si celui-ci tend à diminuer. Mais par ailleurs, la disparition totale du gradient de protons conduit à l’inactivation de l’ATPase en présence d’ADP, ce qui est paradoxal.

La fonction de cette régulation pourrait être d’éviter l’hydrolyse de l’ATP en inactivant l’enzyme durant les périodes où la chaîne de transfert d’électrons ne génère pas de force protomotrice, par exemple la nuit.

Toutefois, le rôle de la forme oxydée et de la forme réduite n’est pas clair. In vivo, la forme réduite pourrait être constamment active.

Conclusion: malgré la parenté structurale et fonctionnelle évidente entre les sous-unités bactérienne et chloroplastique, les modalités de la régulation de l’activité ATPasique peuvent différer notablement. De plus, cette régulation n’a peut-être pas le même rôle physiologique dans ces deux systèmes.

c10

c10

IF1

Dans le cas de l'ATPase mitochondriale, seule existe la configuration où les deux hélices de la sous-unité sont plaquées sur la couronne des sous-unités c. Cette configuration est non inhibitrice. Même si les hélices avaient envie de basculer vers le haut, la présence de la sous-unité additionnelle les en empêche.

Dans ce cas, le rôle inhibiteur est rempli par

une sous-unité dissociable, IF1

La force protomotrice (ou la rotation de l’enzyme dans le sens de la synthèse d ’ATP?) favorise la dissociation de IF1, ou éventuellement sa fixation sur un site non inhibiteur. La dissipation de la force protomotrice (ou plutôt la rotation dans le sens de l ’hydrolyse?) entraîne l’inhibition.

INHIBITION DES F1-ATPases MITOCHONDRIALES

LES EFFECTEURS CONNUS DE L’INTERACTION IF1-MF0MF1

Nter

Cter

Nter

Cter

Nter

Cter

Cter

Nter

Tétramère de IF1 animal (Cabezon et al., 2001)

force protomotricepH élevé

ATP

pH faible

IF1 8-49

DPDP

E

ETP

TP

DPDP

IF1 8-49

Gledhill, J. R.., Montgomery, M.G., Leslie, G. W. & Walker, J. E. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 15671-15676

REGULATION DES ATP SYNTHASES MITOCHONDRIALES

Dans les mitochondries, l’hydrolyse d ’ATP est inhibée par un peptide inhibiteur appelé IF1. IF1 inhibe l’ATPase de façon stoechiométrique.L’inhibiteur IF1 (de boeuf) se fixe sur l ’ATPase à l ’interface et interagit aussi avec , quoique plus faiblement.La composante électrique du gradient de protons () favorise la dissociation de IF1.Un pH élevé favorise la dissociation de IF1.L’ATPase ne peut fixer IF1 que si elle est en train d’hydrolyser de l ’ATP.

Il a été proposé que IF1 pourrait rester fixé sur l’ATP synthase en n’inhibant que l’hydrolyse de l’ATP, mais pas sa synthèse.

Propriétés spécifiques au modèle bovinLe peptide IF1 de boeuf existe sous forme dimérique et tétramérique. Le tétramère serait inactif.Un pH élevé favorise la tétramérisation du IF1. In vitro (sous-complexe MF1 purifié), la fixation de IF1 favorise la formation de dimères d’ATPase. Cette propriété n ’est pas nécessairement extrapolable au complexe lié à la membrane.

Propriétés spécifiques au modèle levureSaccharomyces cerevisiae possède deux peptides inhibiteurs de l’ATPase mitochondriale, IF1 et STF1. Leurs séquences sont très proches.Les propriétés d’oligomérisation de ces deux peptides sont différentes de celles du IF1 de boeuf.La seule différence fonctionnelle claire entre IF1 et STF1 est que l’affinité de STF1 pour l’ATP synthase est nettement plus faible que celle de IF1.A l’heure actuelle, personne ne sait à quoi sert STF1, ni même s’il sert à quelque chose.

Le rôle physiologique de l’inhibition de l’hydrolyse d’ATP par IF1 pourrait être d’éviter l’hydrolyse d’ATP lors d’arrêts de la chaîne respiratoire.

Cependant, d’autres phénomènes limitent déjà sévèrement l’hydrolyse de l’ATP dans les mitochondries. IF1 pourrait devenir réellement nécessaire si la membrane mitochondriale devenait in vivo très perméable aux protons (ouverture du «MPT», situations pré-apoptotiques, etc).

On pourrait imaginer que IF1, en empêchant la génération d’un gradient de protons lors d’arrêts de la chaîne respiratoire, limite l’apparition de radicaux libres.

V0

V1

nomenclature MM correspondanceF0F1

rôle

A 73 nucléotidescatalytique

B 58 nucléotidenon

catalytiqueC 40D 34 E 33F 14

1003819

c 17 c protons

Modèle structural de l’ATPase des vésicules tapissées [d’après Arata Y., Nishi T., Kawasaki-Nishi S., Shao E., Wilkens S. & Forgac M., Biochim. Biophys. Acta (2001) 1555, 71-74]

Les cousins proches: les ATPases vacuolaires et apparentées

UI

U

UI

sous-unité c

-type V0 (6 copies)

type F0 ou A0

(9-12 copies)

U

I I-

Structure de l’ATPase de Clostridium fervidus vue en microscopie électronique [D’après Boekema E.J.,

Ubbink-Kok T., Lolkema J.S., Brisson A. et Konings W.N., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (1997) 94, 14291-

14293]

H

CB A

B

A

a

E d

B

D

A

G2

c4c’c’’

F

c c c cc

b

F-ATPase

a

V-ATPase

cc’’

A BB

cc

GE

d F

A A

D

B

c c’

C

H

a

c4-5c’c’’

adapté d’après [Wilkens S., Inoue T. et Forgac M. (2004) J. Biol. Chem. 279, 41942-41949]

appartiennent au rotor (expérience de rotation)

structure de la sous-unité C (Iwata M., Imamura H., Stambouli E., Ikeda C., Tamakoshi M., NagataK., Makyio H., Hankamer B., Barber J., Yoshida M., Yokoyama K. et Iwata S. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 59-64)

C

non essentielle pour l’assemblage (rôle activateur ?)

appartient au pédoncule périphérique pour tout le monde, sauf pour un groupe qui pense qu’elle appartient à l’axe central (Lolkema J. S., Chaban Y. et Boekema E. (2003) J. Bioenerg. Biomembr. 35, 323-335; Chaban Y. L., Coskun Ü, Keegstra W., Oostergetel G. T., Boekema E. J. et Grüber G. (2004) J. Biol. Chem., sous presse

appartient au stator (expérience de rotation)

structure de la sous-unité H (Sagerann M., Stevens T. H. et Matthews B. W. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7134-7139)

H

c c c cca

b

F1 et F0 actifs

Dissociation F0 F1 biochimique

c c c cca

bH+

ATP

iADP+P

cc’’

A BB

cc

GE

d F

A A

D

B

c c’

C

H

a

Dissociation V0 V1 physiologique

A BB

G

F

A A

D

B

H

cc’’cc

d

c c’a

EC ??

V1 et V0 inactifs

F D

BA A

bille

His-Tag

[d’après Imamura H., Nakano M., Noji H., Muneyuki E., Ohkuma S., et Yoshida M. et Yokoyama K. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2312-2315]

intervalles de temps: 33 ms

c

ABB

c

G EF

A A

D

B

ca His-Tag

[d’après Hirata T., Iwamoto-Kihara A., Sun-Wada G.-H., Okajima T, Wada Y. et Futai M. (2003) J. Biol. Chem. 278, 23714-23719]

actineintervalles de temps: 10 ms

côté V1

La sous-unité c de la V-ATPase de S. cerevisiae

E137A

A

GI I

IY

GL

V70V

S

S

V

VL

CY

AKSGVGICATCVLRPD

L50L

FK

TG

N IV

PYA

AG

V IM

LS

TF

II

AA

A

S

CG

G

I

FF

P

P

AYV

M T E LC

LG

80QK

Q A L Y T G FIQ90LGA

G

G

LS

V

L

S100G

LA

AGF

AI

GI 110

VG DAG

VR

G S S Q Q P R LF VG

I 130

LL

L

F A

VG 140

L

L

Y G

IV A

L LLNSRATQ D V V C 160

I

I

M

sous-unité c sous-unité c’

sous-unité c’’

M1

P12

E145

I II III IV

A39 S59

L84 C101

V124 G136

N159

E164

E137

I II III IV

M1

P6

A33N53

L78 A93

V116 G128

N151

C160

F80

L62

M1

?

M100

E108

L125 A148

A171 K183

A206

Q213

[D’après Nelson N. et Harvey W.R., Physiol. Rev. (1999) 79, 361-385]

Quelques fonctions des ATPases de type V

1. Dans la membrane cytoplasmique de certaines cellules.

Energisation de la membrane apicale de l’épithélium de l’intestin moyenchez les Lépidoptères. Excrétion de potassium par un échangeur électrophorétiqueH+/K+

Energisation de la membrane apicale de l’épiderme de grenouille.Absorption de Na+ par un antiport H+/Na+, et du Cl - par un échangeurélectrophorétique Cl-/HCO3

-

Excrétion d’ions H+ de plusieurs types de cellules : cellules rénales,macrophages, ostéoclastes.

Acidification des phagosomes (activation des protéases et des lipases).

Acidification des vésicules chromaffines et des vésicules synaptiquesconduisant à l’accumulation de neurotransmetteurs.

Energisation de la membrane des vacuoles de plantes pour effectuer destransports secondaires (Na+, Ca2+, métabolites).

Acidification des endosomes (dissociation pH-dépendante des ligands deleurs récepteurs).

Acidification des lysosomes (activation des réactions de dégradation).

Quelques modes de régulation des ATPases de type V

Régulation rédox : pontage de deux cystéines situées dans les sous-unitéscatalytiques. La forme oxydée (pontée) est inactive.

Dissociation réversible de la partie V 0 et de la partie V 1, produisant deuxsous-complexes inactifs.

Interaction avec des effecteurs spécifiques.

2. Dans les différents compartiments cellulaires

lumenATPADP + Pi

H+

2 H+

K+cellule

épithéliale

Déconnexion de V0 et V1 dans l’épithélium de l’intestin moyen d’une chenille durant la mue

[d’après Sumner J.P., Dow J.A., Earley F.G., Klein U., Jager D. et Wieczorek H., J. Biol. Chem. (1995) 270, 5649-5653]

(La chenille photographiée n’est pas de la même espèce que celle de l’expérience; elle provient d’un site WEB:

http://www.univ-lille1.fr/orchid/frichorc/orinjava.htm#../premices/prem_p11.htm)

RER

Golgi

vésicule de tri

lysosome

vésicule d’endocytose

vésicule d’exocytose

recyclage des récepteurs

vésicule de

transport


Vésicules et trafic cellulaire

H+

H+

Cl-

H+

Cl-

H+

H+

H+H+ H+

H+

Cl- Cl-

Cl-

vésicule tapissée

endosomeprécoce

endosometardif

lysosome pH 5

compartiment de découplage ligand-récepteur pH 5,5

fusion


membrane plasmique

[d’après Forgac M., Adv. Mol. Cell Biol. (1998) 23B, 403-453]

clathrine

récepteur

ligand

membrane

adaptateurV-ATPase

Un modèle (contesté) d ’internalisation de la V-ATPase lors des étapes précoces de l’endocytose

[d’après Forgac M., Adv. Mol. Cell Biol. (1998) 23B, 403-453]

La stoechiométrie H+/ATP: une affaire de pignon ?

pignon à6 dents

sous-unité de typeATPase vacuolairegroupe protonable

modèle biochimique à6 groupes protonables

sous-unité de typeATP synthasegroupe protonable

pignon à12 dents

modèle biochimique à12 groupes protonables

Glu139

Glu139

Le rotor de la V-ATPase d’Enterococcus hirae contient dix segments protonables

[Murata T., Yamato I., Kakinuma Y., Leslie A.G. & Walker J.E. Science (2005) 308, 654-659]

Les cousins éloignés: les hélicases

hélicase hexamérique de papillomavirus

[d’après Fouts E.T., Yu X., Egelman E.H. et Botchan M.R., J. Biol. Chem. (1999) 274, 4447-4458]

5 ’

3 ’

H2OATP

ATP

ADP + Pi ATP

ATP ATP

ADP + Pi

ADP + Pi

ATP ATP ATP

Changement de conformation

Une hélicase hexamérique au travail [D’après Ahnert P. et Patel S.S., J Biol Chem. (1997) 272, 32267-32273]

Mécanisme proposé pour une hélicase hexamérique, comparable à celui de la F1-ATPase

[d’après Hingorani M.M., Washington M.T., Moore K.C. et Patel S.S., Proc. Natl Acad. Sci. USA. (1997) 94, 5012-5017]

brin retardé

brin direct

protéines

fragment d'Okazaki

polymérase

clamp

clamp

Facteur

primasepolymérase

hélicase

La fourche de réplication (ou réplisome en langage moderne) est composée de moteurs moléculaires synchronisés

Léonard de Vinci (1452-1519)

Etude des vertèbres cervicales de la base du crâne (Royal Collection, Londres)

Etude des vertèbres cervicales; analogie avec un mât de navire (Royal Collection,

Londres)

Direction des Sciences du Vivant Institut de Biologie et de Technologies de Saclay Service de...

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