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COURS CHM 3102Chimie Bioanalytique
Eric Bonneil et Pierre ThibaultLocal: D-659Courriel: [email protected]
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Séparation de peptides et de protéinesavec systèmes microfluidiques
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Systèmes Microfluidiques
Pourquoi utiliser des systèmes microfluidiques?
Réduction des volumes morts. Permet d’obtenir une meilleure efficacite chromatographique et donc une meilleure sensibilitéRéduction de la quantité d’echantillons du fait de la meilleuresensibilité et de la miniaturization.Réduction de la quantité de réactifs. Réduction du nombre de connexions: problèmes instrumentauxplus facilement détectables.Augmentation du débit d’analyse: temps d’analyse plus court.Permet d’effectuer plusieurs réactions ou séparations en parrallèle.Intégration: automatisation de réactions, synthèse sur micropuce.
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Systèmes Microfluidiques
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Micropuces d’ADN
Microréacteurs
Chambre de mélange Chambre de réactionCanaux d’introductiondes réactifs
Micropucespour séparations
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Microfabrication
Premières micropuces furent faits avec de la silice ou du verre. Gravage des canaux sur verre est relativement coûteuxet le verre est relativement fragile.
Les micropuces sont maintenant faits à partir de polymères: PDMS poly(dimethylsiloxane)
Bon marché.Élastomère.D’autres matériaux peuvent être facilement intégrés.Stabilité thermique pour T: 40-95°C.Transparents, permettant la détection UV et fluorescence.Réduction de l’adsorption de cellules et protéinescomparativement au verre.
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MicromachiningDesign est crée par ordinateur et est imprimé sur un film transparent qui servira de masque pour la photolithographie
A
LumièreMasque
Si
Photoresist: matériau qui polymérise à la lumière (epoxy)B
Dissolution du matériau non polymérisé: “master”pour la réalisation des puces
Prépolymère PDMS est versé, chauffé à 60-80°C
micropuce avec canaux qui peuvent être remplis ougréffés avec une phase stationnaire.
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Modes d’utilisation
Préparation d’échantillon
Extraction sur phase solide
Digestion de protéines
Séparation
Électrophorèse sur gel
Électrophorèse capillaire.
Électrophorèse capillaire micellaire.
Électrochromatographie.
Chromatographie en phase inverse.
Séparation bi-dimensionnelle
Électrochromatographie/Électrophorèse capillaire.
Échange d’ions/Chromatographie en phase inverse.
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Micropuce-Électrophorèse sur gel
gel
SDSBioanalyzer AgilentMulti-fonctions: Préparation de l’échantillon, réaction avec fluorophore, application du gel, séparation et détectionN= 3750 plateaux/s.
Dubrow et al. Anal. Chem. 2001, 73, 1207-1212
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Micropuce-Électrophorèse Capillaire
Canal de séparation
Électrodes
B: tamponS: échantillonBW: vidange tamponSW: vidange échantillon
Dimension du canal de séparation: Longueur: 5-7 cm, largeur: 50-90 µmprof.: 20 µmÉlectrodes sont placées dans les 4 puits: injection életrocinétiqueVoltage < 30 kV
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Micropuce-Électrophorèse Capillaire
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S SW
B
BW
B
S SW
BW
+ -
Injection
S SW
B
BW
+
-
B
BW
S SW
+
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Séparation
Dubrow et al. Anal. Chem. 2001, 73, 1207-1212
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Micropuce-Électrophorèse Capillaire
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Digestat de protéines
Thibault et al Anal. Chem. 1999, 71, 3036-3045
TM (min.)
Mélange de 5 peptides
W½= 1.5 s.N= 10500 plateaux/s
TM (min.)
TM (min.)
Thibault et al Anal. Chem. 2000, 3, 599-609
Mélange de 4 protéines
Harrison et al. J Chromatogr A. 2002 947(2):277-86
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Digestion de protéines sur micropuce
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Digestion mellitinRéservoir d’enzymeT1: GIGAVLKT2: VLTTGLPALISWIKT2R: VLTTGLPALISWIKR
Mellitin 0.3 µg billes d’enzyme 0.85 unités/g mellitinDigestion faite en 3 minPlus de mellition intacteRapport de pics T1, T2, T2R est le même dans une analyse faite à partir de la
digestion avec l’enzyme liquide. Temps de digestion diminué par 3.Pas de pics d’autolyse de la trypsine.
Thibault et al. RCMS 2000, 14, 1377-1383
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Extraction sur phase solide dans un micropuce
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Temps d’enrichissement
Flu
ore
scen
ce
Parois modifiées avec C18
Injection électrocinétiqueDésorption est faite par pompage d’une solution d’acétonitrile à 60 %Enrichissement de la coumarine à 8.7 nMTemps d’enrichissement de 160 s (facteur de 50 p/r à XXX). Contrainte de sensibilité dûe à la capacité limitée de la surface d’adsorption.
Ramsey et al. J. Microcol. Sep 2000, 12, 93-97
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Extraction sur phase solide dans un micropuce
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micropuce remplie avec des billes de C18
Phénomène d’electro-osmoseoccasionné par la double couchesur les parois et les billes de silice
Harrison et al. Anal. Chem. 2000, 72, 585-590
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Extraction sur phase solide dans un micropuce
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Thibault et al. Mol. Cell. Proteomics 2002, 1, 157-165
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Extraction sur phase solide dans un micropuce
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Injection séquentielle d’un peptide à différentes concentrations (5 µl)
Injection séquentielle de trois peptides (5 µl 0.5 µM)
Injection et séparation electrocinetiquesLimite de détection: 25 fmol.
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Préparation de l’échantillon dans un micropuce
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Digestion de la BSA dérivéeavec FITC, isolation et séparation des peptides contenant des histidines.
Remplissage de la colonnepar les billes de 5 µm de trypsin et de IMAC a été faiteélectrocinétiquement
Tampon d’élution de la colonne IMAC est dans le puitsG.
échantillon
Ref: XXX
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Électrophorèse capillaire micellaire
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Création d’un gradient d’acétonitrile en faisant varier les voltages dans les puits de solvants
Solvant 1: 10 mM SDS, 10 mM borate, 10 % ACN/MeOHSolvant 2: 10 mM SDS, 10 mM borate, 30 % ACN/MeOHMélange de solvants est fait en controllant les voltages dans les puits des solvants 1 et 2: gradient de solvants est possible.
Ramsey et al. Anal. Chem. 1997, 69, 5165-5171
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Électrophorèse capillaire micellaire
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1: C440, 2: C490, 3: C450, 4: C460, 5: C480 Isocratique (a: 14%, b: 22%, c: 30%) gradient (d: linéaire, e: concave, f:convexe)Quel est le mode d’élution permettant une meilleure resolution???
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Électrochromatographie sur micropuce
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Canal modifié avec C18
Augmentation de la surface d’adsorption comparativement a l’approcheutilisant la modification de la paroi du capillaire.
Séparation de peptides de la BSA
Regnier et al. J. Chromatogr. A 2002, 948, 225-233
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Électrochromatographie sur micropuce
Séparation de peptidesCanal rempli de billes garnies de C18
Singh et al. Anal. Chem. 2002, 74, 784-789
Inconvénients majeurs de cette technique sont la limitation du volume d’échantillon (
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LC-micropuce-Spectrométrie de masse
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micropuce with packed columns
micropuce avec colonneempaquetée
Canal de séparation5 cm × 50 µm
Precolonne
Spray TipOrifice SM
Pivot de l’interface
Contact électrique
Colonne d’enrichissement
Colonne analytique
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LC-micropuce-Spectrométrie de masse
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Lors de l’injection, l’échantillonest retenu sur la phase stationnaire, le solvant estéliminé: pas de limitation quant au volume d’échantilloninjecté.
La valve tourne et l’échantillonest élué avec un gradient d’acétonitrile (pompage).
La séparation se fait dans un canal rempli de billes de C18: plus grande capacité.
Van de Goor et al. soumis à Anal. Chem.
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CLHP-micropuce-Spectrométrie de masse
24CHM 3102
Séparation d’un mélange de digestats de 8 protéines (>1000 peptides)
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
(b)
26 27 28 29Temps de rétention (min)
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
Inte
nsité
(10E
6)
a b
0.34 min
0.74 min
m/z = 501.72 (2+)
b/a (10%) = 1.22
Temps de rétention (min)
Efficacité similaire à celle obtenuepour une colonne capillaire de 75 µm × 12 cm
Élargissement de pics plus faiblequ’avec une colonne
Capacite chromato (n1/2) ~ 150
Wt
n∆
=2/1 où: mt: Gamme de temps d’elutionW1/2: Largeur de pic a mi-hauteur
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CLHP-micropuce-Spectrométrie de masse
25CHM 3102
0,5 fmol
40 fmol
20 fmol
10 fmol
4 fmol
2 fmol
1 fmol
100 fmol
200 fmol
0,5 fmol
1 fmol
2 fmol
4 fmol
10 fmol
20 fmol
40 fmol
100 fmol
200 fmol
m/z 724.6 m/z 582.3
~ Limite de détection 1 fmol comparable avec celle obtenue avec une colonne capillairede 75 µm de large
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Séparation bi-dimensionelle
26CHM 3102
Pour l’analyse de mélange complexe, une seule technique séparative a une capacité de pics insuffisante. Par exemple, unecapacité, nc ~ 150 est typiquement obtenue par chromatographieC18. Cette capacité limite l’analyse d’echantillons complex tels les digestats de E. Coli ou plus de 80,000 peptides trypsiques peuventêtre présents a différents niveaux d’abondance (en assumant4000 protéines avec en moyenne 20 peptides chacune).
Couplage de deux techniques de séparation pour effectuer uneanalyse devient un avantage significatif.
Capacité bi-dimensionnelle,
Les deux techniques peuvent être couplées en série2
2
1
122/1
Wt
Wt
nc∆
•∆
=
(automatisation, gain de temps, limitation dans le choix des tampons) ou découplées (flexibilité dans le choix des tampons, temps d’analyse plus long).
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Séparation bi-dimensionelle
27CHM 3102
Électrochromatographie/Électrophorèse capillaire
Diagramme d’injection
CEC CE
Séparation de peptides de la β-caseine
Ramsey et al. Anal. Chem. 2001, 73, 2669, 2674
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Séparation bi-dimensionelle
28CHM 3102
Échange d’ions/Chromatographie en phase inverse
SCX C18 MS
ProtéinesPeptides
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Séparation bi-dimensionelle
29CHM 3102
2 µg, 8 fractions de sel
Secreted or extracellular: 28 %
Total: 47 protein clusters
Classic plasma proteins: 36 %
Cellular leakage: 17 %
Unknown: 13 %
Immunoglobulins: 6 %Classic plasma proteins: 29 %
Unknown: 12 %
Immunoglobulins: 7 %
Cellular leakage: 18 %Secreted or extracellular: 34 %
Total: 111 protein clusters
250 ng 1 analyse
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