Méthodes d'étude des pectines

C. RenardUMR SQPOV, Avignon

Fév 2010

Plan

• Les pectines: définition et structure• Méthodes d'étude des pectines

– Rappels– Dosages des constituants– Le fractionnement et les techniques lourdes

• Les pectines en tant qu'additifs: sources, méthodes d'extraction, propriétés et réactivité

• Les enzymes pectolytiques• Les pectines in situ: biosynthèse, rôles dans les

parois et dans la transformation des fruits et légumes• Quelques exemples de nos travaux

Structure des différents oses

ose Polyalcool portant une fonction réductrice (aldéhydique ou cétonique)

Dérivé du glyceraldéhyde (D ou L): oses de la série D ou L.D L

H

HC-OHHC=OHC-OH

cétoseHC=OHC-OHHC-OH

aldose

Construction de la série des aldoses

Cyclisations

Les plus courants: cinq ou six carbones => pentoses ou hexose

H2C-OH

CH2OH

HC=OHO-CH

HC-OHHC-OH

OC

C

C C

C

CH2OH6

5

4

3 2

1HH

H

H HOH

OH

OH

OH

Fischer Haworth

Carbone anomérique

AldoseCétose

HC=O

CH2OH

HC-OHHO-CH

HC-OHHC-OH

βα

Possibilité de cyclisation => furanose ou pyranose selon taille du cycle

La structure dans l’espace

Dérisés des sucres dans les pectines

Acides: acides uroniques : fonction carboxylique en C6

Acide D-galacturonique Acide D-glucuronique

Déoxy: déoxyhexose (méthylpentose): CH3 en C1

L-rhamnose6-déoxy-L-mannose

L-fucose6-déoxy-L-galactose

La liaison glycosidique

Les plus courantes: 1 - 41 - 6

Possibilité de ramification

Liaison glycosidique: entre la fonction hémiacétal d'un ose et un alcool d'un autre; plus rarement entre deux fonctions hémiacétal.

En général une extrémité réductrice (hémiacétal libre)

6

5

43 2

1

6

5

43 2

1

Stratégie d’analyse des pectines

• La logique:– Des renseignements les plus globaux aux plus détaillées– Des méthodes les plus simples aux plus couteuses

• Les points clés:– Détermination de la composition– Méthodes de fractionnement et d'étude de la distribution

intermoléculaire– Dégradations controlées– Méthodes physiques: RMN, Masse, IR

Dosage de l’acide galacturonique

• Le plus classique: titrimétrie– Standardisation– Teneur en GalA et estérification– (mais acétyls?)

• Les précautions indispensables– NaOH fraichement dosé– Eau bouillie (carbonatation)– Correction acide: V’

NaOH V2

PectineCOOHCOOMe

NaOH V1

NaOHHCl

DM = V2/(V1+V2) GalA = CNaOH (V1 +V2)

Dosage de l’acide galacturonique

• Colorimétrie: – le plus adapté aux échantillons nombreux– Mais acide…

• En milieu acide concentré et à chaud: – formation de dérivés furfuriques, – différents chromophores (polycycliques aromatiques) – globales ou spécifiques

• (méthode de Dubois – phénol sulfurique)• Méthode au mhdp• Méthode au carbazole

Dosage au mdhp

• Pectine ou GalA en solution– 3 tubes par échantillon (1 blanc, 2 dosages)– Ajout acide sulfurique concentré de manière répétable

• Déshydratation– Chauffage en présence d’acide sulfurique concentré (1 / 6)– Circa 5 min 100°C– Echantillons, blancs et standards

• Refroidissement• Ajout chromophore:

– 100 µl Mhdp 0,8 g/L dans NaOH 0,125 M (5g/L) (blanc: NaOH)– Homogénéiser– 15 min à température ambiante

• Lecture 520 nm

HO

Quelques pièges et astuces

• Ajout tétraborate de sodium: Na2B4O8– Égalise la réaction des différents acides uroniques– Faire par bouteille entière (dissolution: 1 nuit, garder au

froid)

• Attention à l’hydratation de l’acide sulfurique• Ajout • Température et durée de la déshydratation• Stabilité des solutions

– Garder le mhdp à 4°C et abri de la lumière

Dosage du méthanol

• Dosage spécifique après saponification– Saponification: NaOH 0,1 M, 4°C, 2h– MeOH et AcOH par HPLC– MeOH par méthodes colorimétriques (enzymatiques)

• Oxydation en méthanal: alcooloxydase, permanganate• Complexation avec

– MeOH par CPG• Très faibles températures

– MeOH par GC-MS• Standard interne: deutériométhanol• Saponification et head-space (Renard & Ginies, 2009)

• Infra-rouge

Infra-rouge

• DM mais aussi amidation– Déconvolution nécessaire– Calibration

DM

Guillotin et al. 2007

Dosage des sucres

• Deux étapes:– Passage du polymère aux monomères– Identification et dosage des monomères

• L’étape la plus cruciale est celle de la libération des sucres– Hydrolyse ou solvolyse

• hydrolyse acide (H2SO4, TFA)• méthanolyse (HCl dans MeOH)• enzymes

– Problème: • les liaisons glycosidiques ont des résistances à l'hydrolyse/solvolyse

TRES variables; difficulté d'avoir une hydrolyse enzymatique totale.AUA-AUA >> ON-AUA > AUA-ON >> Hex-Hex > Pent-Pent...

Hydrolyse

• Hydrolyse– Acide sulfurique

• prétraitement par H2SO4 13 M pour "dissoudre" la cellulose• hydrolyse par H2SO4 1M

– Acide trifluoroacétique 2M 120°C• Risque de dégradation Xyl, AUAs

OHO

OH

OH

OH

CH2OH

H+ (hydrolyse acide)

Polysaccharide Mélange d’oses libres

OO

O

OH

OH

CH2OHOO

O

OH

OH

CH2OH

123

4

56

OO

O

OH

OH

CH2OH6

5

4

3 2

1

Exemples de cinétique d’hydrolyse

Glucose en fonction du temps de préhydrolyse (MIA carotte)

Oses pectiques en fonction du temps d'hydrolyse (paroi de betterave)

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80

% de la teneur maximale mesurée

Durée de préhydrolyse (min)

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80

% de la teneur maximale mesurée

Durée de préhydrolyse (min)

020406080

100120

0 2 4 6 8

AraGalRha

% de la teneur maximale mesurée

Durée d'hydrolyse (h)

020406080

100120

0 2 4 6 8

AraGalRha

% de la teneur maximale mesurée

Durée d'hydrolyse (h)

Méthanolyse

• Méthanolyse: Rupture des liaisons glycosidiques et formation de méthylglycosides (HCl; anhydre)– Non quantitative pour les polygalacturonates

H+ (MeOH)

Polysaccharide Mélange de méthylglycosides libres

OO

O

OH

OH

CH2OHOO

O

OH

OH

CH2OH

123

4

56

OO

O

OH

OH

CH2OH

OHO

OCH3

OH

OH

CH2OH6

5

4

3 2

1

Détection et quantification

• Directe par HPLC: – HPAEC: fractionnement par échange d'ions en pH fortement

basique.• détection en ampérométrie pulsée.• TRES sensible (<0.1 mg/L) mais problème de stabilité des

réponses.• Plus adapté aux oligomères

– Après méthanolyse: HPLC phase inverse• Détection: indice de réfraction• Mais: très nombreux pics.

– Après hydrolyse par échange d'ion (Aminex HPX-87…:• Détection: indice de réfraction• Mais: mauvaise séparation.

Détection et quantification

• CPG après dérivatisation:– But: rendre les oses volatils– Siloxanes (greffés), FID– Méthodes:

• Acétates d'alditols: simple et robuste mais seulement oses neutres; après hydrolyse.

• Dérivés triméthylsilylés: plus versatile mais nombreux pics / ose (4-6); après méthanolyse.

• Dérivés méthylés: analyse des liaisons– Calculs: standard interne (inositol)

Acétates d’alditols

OHO

OH

OH

OH

CH2OH

Mélange d’oses libres

6

5

4

3 2

1

NaBH4en milieu alcalin

Alditol

CH2OH

CHOH

CHOH

CHOH

CHOH

CH2OH

1

2

3

4

5

6

Anhydride acétique(N-méthylimidazole)

CH2OAc

CHOAc

CHOAc

CHOAc

CHOAc

CH2OAc

1

2

3

4

5

6

Acétate d’alditol

FucoseRhamnose

Arabinose

Xylose

MannoseGalactose

Glucose

Inositol

Triméthylsylilés après méthanolyse

10 20 30 40 50

Minutes-19

0

50

100

150

mVolts

Ara

Ara

Rha

*Fu

c* F

ucX

yl (A

ra)

Xyl

** * G

lcU

AG

alU

A* *

Man

** *

Gal

Gal

UA

*G

al*

Glc

** G

lc* *

Man

nito

l

*

c:\star\data\std_1.run

Hexaméthyldisilane + triméthylchlorosilane

pyridine

OHO

OCH3

OH

OH

CH2OH6

5

4

3 2

1OTMSO

OCH3

OTMS

OTMS

CH2OTMS6

5

4

3 2

1

(Kits commerciaux)

Les séquences correctes

• Paroi (avec cellulose)– Préhydrolyse + hydrolyse:

oses neutres et GalA– (Hydrolyse: oses neutres

par différence estimation cellulose)

– Saponification: méthanol

• Pectines extraites– Saponification: mméthanol

et GalA– Hydrolyse: oses neutres

Identification des liaisons glycosidiques: la réaction de perméthylation

1- Méthylation

OO

O

OCH3

OCH3

CH2OCH3

Polysaccharide perméthylé 2- Hydrolyse

OHO

OH

OCH3

OCH3

CH2OCH3

Oses partiellement méthylés

3- Réduction(deutérium)

Polysaccharide

OO

O

OH

OH

CH2OH

1

23

4

5

6

4- Acétylation

CHDOH

CHOCH3

CHOCH3

CHOH

CHOH

CH2OCH3

D-alditolspartiellement méthylés

1

2

3

4

5

6

CHDOAc

CHOCH3

CHOCH3

CHOAc

CHOAc

CH2OCH3

1

2

3

4

5

6

Acétates d ’alditolspartiellement méthylés

Perméthylation

• Méthylation: en milieu anhydre (DMSO)– dissolution dans DMSO anhydre– présence d'anion methylsulfinylméthanide (dimsyl)– généré par KH, NaH, n-butyllithium, NaOH solide…– purification: dialyse, échange de phase, LH-20 (chloroforme-

méthanol)• Hydrolyse: à peu près idem polysaccharide initial; TFA.• Réduction: deutéro-réduction: marque les C-1

– (NaBD4 dans NH4OH, 3h).

• Acétylation: anhydride acétique– N-méthylimidazole, T°...

Quelques cas particuliers

• Polysaccharides acides: réduire les fonctions carboxyliques:– NaBH4 (NaBD4), pH 7, carbodiimide– LiAlH4 en milieu organique (éther)

• Oligomères: éviter la dégradation des oses réducteurs ("peeling"): préréduction (NaBH4)

Identification des oses partiellement méthylés

• CPG: deux colonnes pour résoudre les pics superposés, de polarités différentes (OV1 (diméthylsiloxane), OV225 (cyanoalkylphénylsiloxanes))

• Standard interne (Inositol) mais utilisation de facteurs de réponse calculés.

• Identification par spectrométrie de masse (impact électronique)– rupture préférentielle entre deux méthylés.– perte de CH3CO+.– fragmentation secondaire: sur le C en β: perte de méthanol (-42) ou

d'acide acétique (-60) .

Schéma de fractionnement

Exemples de spectres

1,2,5,6-tetra-O-acetyl-(2-deuterio)-3,4-di-O-methyl hexitol

1,4,5-tri-O-acetyl-(1-deuterio)-

2,3,6-tri-O-methyl hexitol

Méthodes de fractionnement

• Précipitations sélectives– Ethanol

• Pectines très facilement précipitées: oligomères (% EtOH, T°)• Arabinanes

– Cuivre (puis lavage acide)• Chromatographies:

– échange d'ions: • fractionnement en fonction de la densité de charges• Contre-ion NH4

+ pour un rendement élevé– exclusion stérique

• Dégradations sélectives:– enzymes– hydrolyse acide controlée

Chromatographie d’échanges d’ions

• Séparation en fonction de la densité de charge• DEAE (faible), QAE (fort – oligomères)• polysaccharides chargés / neutres• pectines: en fonction DM et distribution

++

++

+

+++

++

++ +

+

++

++

+

+++

++

++ +

+

Liaison (faible teneur en sels)

Désorption (forte teneur en sels)

--

--

--

Na+

Cl-

Na+

Cl-

Na+

Cl-

Na+

Cl--

-

--

--

Na+

Cl-

Cl-

Quelques exemples de fractionnements en échange d’ions

• Suivi de déméthylation des pectines

multichaînemonochaîne

0 20 40Volume d'élution (ml)

Rép

onse

col

orim

étriq

ue0

0.5

Tam

pon

acét

ate

(M)

75

72

69

64

43

DM

PME A.niger à pH 4,5

0 20 40Volume d'élution (ml)

Rép

onse

col

orim

étriq

ue

0

0.5

Tam

pon

acét

ate

(M)

75

72

69

63

42

DM

PME pomme à pH 7,0

• DEAE préparative

Monosaccharide composition (mol%) DM DAFractions Gal.A Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc Gal.A/Rha (%) (%)

A 0.3 0.6 21.7 1.0 22.9 23.3 30.2B 1.9 1.1 37.8 2.5 8.6 38.5 10.2C 2.0 0.7 34.6 1.4 6.8 48.2 6.7D 94.9 0.4 0.1 1.1 1.3 0.4 1.5 0.3 218 71 7E 40.4 7.6 0.6 28.1 1.2 2.1 19.2 0.8 5 38 23

Exemple du safou(Ella-Missang)

0 200 400 600 800 1000Elution volume (ml)

Abso

rban

ce (a

rbitr

ary

unit)

0

0.5

1

Sodi

um a

ceta

tebu

ffer m

olar

ity

A

C

D

EB

0 200 400 600 800 1000Elution volume (ml)

Abso

rban

ce (a

rbitr

ary

unit)

0

0.5

1

Sodi

um a

ceta

tebu

ffer m

olar

ity

A

C

D

EB

Utilisation conjointe des échanges d’ions et exclusion stérique BP

Echange d'ion sur BioRad AG 1X8 (après dialyse)

Fractions retenues: AUA, Rha

0

200

400

600

800

0 500 1000 1500 2000 2500

0

50

Volume d'élution (mL)

Concentration (mg/L) Conductivité (mS)Pulpe de betterave

Soluble

Rha: 25 mg/g

Rha 6 mol%GalA 13 mol%Ara 65 mol%Gal 13 mol%

Purification et caractérisation

0

50

100

150

200

250

0,0 0,5 1,0

Concentration (mg/L)

Kav

Rha/GalA: 1/1

Chromatographie d’exclusion stérique

• Principe– Diffusion dans un gel poreux (Kav)– Distribution des volumes hydrodynamiques– Courbes de calibration– le rayon hydrodynamique RH peut être décrit comme la

partie de la molécule qui ne permet pas la libre circulation du solvant.

VeV0 Vt

Mw

106

103

Exclusion totaleKav = 0

Kav = 1

Kav = Ve-V0/Vt-V0

Théorique

SEC pour les pectines

• Il faut écranter les charges– NaNO3 0,1M, acétate Na 0,4M pH 3…

• Calibration– Le volume hydrodynamique des PS est > protéines pour

même masse molaire– Le volume hydrodynamique des pectines est > pullulanes et

dextranes– HPSEC-MALLS

• Utilisation en suivi de dégradation

Exemples

Elution time (min) Kav values

Col

orim

etric

resp

onse

(mV

)

Buffer m

olarity

Col

orim

etric

resp

onse

(mV

)

0

0.5

0 20 40 60 80 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1h-CW

7h-CW

24h-CW

1h-CW

7h-CW

24h-CW

Ion-exchange Size-exclusion

Xylogalacturonane de pois

NaOH

HCl

pH 7

+ RGase

Electrophorèse capillaire

• Distribution intermoléculaire des groupements carboxyles libres– Position et forme des pics– Influence DP

Interprétation des courbes d’EC

Fraction de carboxyles libres

Mob

ilité

élec

troph

orét

ique

Densité de charge

RMN

• Enchaînement des sucres– Oligosaccharides

• Distribution des groupements méthyles– RMN du proton ou du 13C– RMN du proton: les H4, H1 et H5 ont des signaux qui

shiftent selon l’état de substitution du GalA et de ses voisins– Calcul de la distribution intra moléculaire– 80°C, D2O, pectines ou homogalacturonanes neutralisés (pH

6) puis deux échanges D2O

Signaux caractéristiques

Rhamnogalacturonane

Int5.004.41

r.e. (α/β)5,28/4,554,38/4,32

n.r.e.5,004,29

Lié au Rhaen r.e. (α/β)5,08/5,164,41

U-n.r.e.5,135,81

GalA

H-1H-4

Homogalacturonane

Acide4.45

Estérifié4.50

RhaInt5.273.40

r.e. (α/β)5,22/4,933.47/3.33

n.r.e.5,233.35

H-1H-4

H-4

Dénes et al., 2000

H-1Aa5.10

Ae5.15

Ea4.92

Ee4.98

Interprétation du spectre RMN 1H

4.254.755.25ppm

EEG

EGGGGE

GEEGEG

EEE

EGE

GGG

E

GGG

EE

EGGE

ODO

OO

OD

COOR

ODO

O

O

COOR

O

DOO

OD

COOR

H-1H-4H-5

Spectres RMN 1H : monades (H4), dyades (H1), triades (H5)

Méthodes de spectrométrie de masse

• Suivi de dégradations enzymatiques

• MSn: identification d’enchaînements

Nombre GalA, nombre Me

Principe de fractionnement en MSn

• Extrémité réductrice: 18O• A:

– C et B: fragments contenant l’extrémité non réductrice

– Y et Z: fragments contenant l’extrémité réductrice

• B: rupture du cycle glycosidiques

Conclusion

• Etude de la structure des pectines:– Extraction– Fractionnement: échange d’ions, (SEC)– Fractions purifiées:

• Analyse des liaisons• Dégradations enzymatiques

– Purification des oligomères: établissement des séquences• RMN• MS: FAB, ESI-MS (HPAEC-MSn)