Plan
• Les pectines: définition et structure• Méthodes d'étude des pectines
– Rappels– Dosages des constituants– Le fractionnement et les techniques lourdes
• Les pectines en tant qu'additifs: sources, méthodes d'extraction, propriétés et réactivité
• Les enzymes pectolytiques• Les pectines in situ: biosynthèse, rôles dans les
parois et dans la transformation des fruits et légumes• Quelques exemples de nos travaux
Structure des différents oses
ose Polyalcool portant une fonction réductrice (aldéhydique ou cétonique)
Dérivé du glyceraldéhyde (D ou L): oses de la série D ou L.D L
H
HC-OHHC=OHC-OH
cétoseHC=OHC-OHHC-OH
aldose
Cyclisations
Les plus courants: cinq ou six carbones => pentoses ou hexose
H2C-OH
CH2OH
HC=OHO-CH
HC-OHHC-OH
OC
C
C C
C
CH2OH6
5
4
3 2
1HH
H
H HOH
OH
OH
OH
Fischer Haworth
Carbone anomérique
AldoseCétose
HC=O
CH2OH
HC-OHHO-CH
HC-OHHC-OH
βα
Possibilité de cyclisation => furanose ou pyranose selon taille du cycle
Dérisés des sucres dans les pectines
Acides: acides uroniques : fonction carboxylique en C6
Acide D-galacturonique Acide D-glucuronique
Déoxy: déoxyhexose (méthylpentose): CH3 en C1
L-rhamnose6-déoxy-L-mannose
L-fucose6-déoxy-L-galactose
La liaison glycosidique
Les plus courantes: 1 - 41 - 6
Possibilité de ramification
Liaison glycosidique: entre la fonction hémiacétal d'un ose et un alcool d'un autre; plus rarement entre deux fonctions hémiacétal.
En général une extrémité réductrice (hémiacétal libre)
6
5
43 2
1
6
5
43 2
1
Stratégie d’analyse des pectines
• La logique:– Des renseignements les plus globaux aux plus détaillées– Des méthodes les plus simples aux plus couteuses
• Les points clés:– Détermination de la composition– Méthodes de fractionnement et d'étude de la distribution
intermoléculaire– Dégradations controlées– Méthodes physiques: RMN, Masse, IR
Dosage de l’acide galacturonique
• Le plus classique: titrimétrie– Standardisation– Teneur en GalA et estérification– (mais acétyls?)
• Les précautions indispensables– NaOH fraichement dosé– Eau bouillie (carbonatation)– Correction acide: V’
NaOH V2
PectineCOOHCOOMe
NaOH V1
NaOHHCl
DM = V2/(V1+V2) GalA = CNaOH (V1 +V2)
Dosage de l’acide galacturonique
• Colorimétrie: – le plus adapté aux échantillons nombreux– Mais acide…
• En milieu acide concentré et à chaud: – formation de dérivés furfuriques, – différents chromophores (polycycliques aromatiques) – globales ou spécifiques
• (méthode de Dubois – phénol sulfurique)• Méthode au mhdp• Méthode au carbazole
Dosage au mdhp
• Pectine ou GalA en solution– 3 tubes par échantillon (1 blanc, 2 dosages)– Ajout acide sulfurique concentré de manière répétable
• Déshydratation– Chauffage en présence d’acide sulfurique concentré (1 / 6)– Circa 5 min 100°C– Echantillons, blancs et standards
• Refroidissement• Ajout chromophore:
– 100 µl Mhdp 0,8 g/L dans NaOH 0,125 M (5g/L) (blanc: NaOH)– Homogénéiser– 15 min à température ambiante
• Lecture 520 nm
HO
Quelques pièges et astuces
• Ajout tétraborate de sodium: Na2B4O8– Égalise la réaction des différents acides uroniques– Faire par bouteille entière (dissolution: 1 nuit, garder au
froid)
• Attention à l’hydratation de l’acide sulfurique• Ajout • Température et durée de la déshydratation• Stabilité des solutions
– Garder le mhdp à 4°C et abri de la lumière
Dosage du méthanol
• Dosage spécifique après saponification– Saponification: NaOH 0,1 M, 4°C, 2h– MeOH et AcOH par HPLC– MeOH par méthodes colorimétriques (enzymatiques)
• Oxydation en méthanal: alcooloxydase, permanganate• Complexation avec
– MeOH par CPG• Très faibles températures
– MeOH par GC-MS• Standard interne: deutériométhanol• Saponification et head-space (Renard & Ginies, 2009)
• Infra-rouge
Infra-rouge
• DM mais aussi amidation– Déconvolution nécessaire– Calibration
DM
Guillotin et al. 2007
Dosage des sucres
• Deux étapes:– Passage du polymère aux monomères– Identification et dosage des monomères
• L’étape la plus cruciale est celle de la libération des sucres– Hydrolyse ou solvolyse
• hydrolyse acide (H2SO4, TFA)• méthanolyse (HCl dans MeOH)• enzymes
– Problème: • les liaisons glycosidiques ont des résistances à l'hydrolyse/solvolyse
TRES variables; difficulté d'avoir une hydrolyse enzymatique totale.AUA-AUA >> ON-AUA > AUA-ON >> Hex-Hex > Pent-Pent...
Hydrolyse
• Hydrolyse– Acide sulfurique
• prétraitement par H2SO4 13 M pour "dissoudre" la cellulose• hydrolyse par H2SO4 1M
– Acide trifluoroacétique 2M 120°C• Risque de dégradation Xyl, AUAs
OHO
OH
OH
OH
CH2OH
H+ (hydrolyse acide)
Polysaccharide Mélange d’oses libres
OO
O
OH
OH
CH2OHOO
O
OH
OH
CH2OH
123
4
56
OO
O
OH
OH
CH2OH6
5
4
3 2
1
Exemples de cinétique d’hydrolyse
Glucose en fonction du temps de préhydrolyse (MIA carotte)
Oses pectiques en fonction du temps d'hydrolyse (paroi de betterave)
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80
% de la teneur maximale mesurée
Durée de préhydrolyse (min)
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80
% de la teneur maximale mesurée
Durée de préhydrolyse (min)
020406080
100120
0 2 4 6 8
AraGalRha
% de la teneur maximale mesurée
Durée d'hydrolyse (h)
020406080
100120
0 2 4 6 8
AraGalRha
% de la teneur maximale mesurée
Durée d'hydrolyse (h)
Méthanolyse
• Méthanolyse: Rupture des liaisons glycosidiques et formation de méthylglycosides (HCl; anhydre)– Non quantitative pour les polygalacturonates
H+ (MeOH)
Polysaccharide Mélange de méthylglycosides libres
OO
O
OH
OH
CH2OHOO
O
OH
OH
CH2OH
123
4
56
OO
O
OH
OH
CH2OH
OHO
OCH3
OH
OH
CH2OH6
5
4
3 2
1
Détection et quantification
• Directe par HPLC: – HPAEC: fractionnement par échange d'ions en pH fortement
basique.• détection en ampérométrie pulsée.• TRES sensible (<0.1 mg/L) mais problème de stabilité des
réponses.• Plus adapté aux oligomères
– Après méthanolyse: HPLC phase inverse• Détection: indice de réfraction• Mais: très nombreux pics.
– Après hydrolyse par échange d'ion (Aminex HPX-87…:• Détection: indice de réfraction• Mais: mauvaise séparation.
Détection et quantification
• CPG après dérivatisation:– But: rendre les oses volatils– Siloxanes (greffés), FID– Méthodes:
• Acétates d'alditols: simple et robuste mais seulement oses neutres; après hydrolyse.
• Dérivés triméthylsilylés: plus versatile mais nombreux pics / ose (4-6); après méthanolyse.
• Dérivés méthylés: analyse des liaisons– Calculs: standard interne (inositol)
Acétates d’alditols
OHO
OH
OH
OH
CH2OH
Mélange d’oses libres
6
5
4
3 2
1
NaBH4en milieu alcalin
Alditol
CH2OH
CHOH
CHOH
CHOH
CHOH
CH2OH
1
2
3
4
5
6
Anhydride acétique(N-méthylimidazole)
CH2OAc
CHOAc
CHOAc
CHOAc
CHOAc
CH2OAc
1
2
3
4
5
6
Acétate d’alditol
FucoseRhamnose
Arabinose
Xylose
MannoseGalactose
Glucose
Inositol
Triméthylsylilés après méthanolyse
10 20 30 40 50
Minutes-19
0
50
100
150
mVolts
Ara
Ara
Rha
*Fu
c* F
ucX
yl (A
ra)
Xyl
** * G
lcU
AG
alU
A* *
Man
** *
Gal
Gal
UA
*G
al*
Glc
** G
lc* *
Man
nito
l
*
c:\star\data\std_1.run
Hexaméthyldisilane + triméthylchlorosilane
pyridine
OHO
OCH3
OH
OH
CH2OH6
5
4
3 2
1OTMSO
OCH3
OTMS
OTMS
CH2OTMS6
5
4
3 2
1
(Kits commerciaux)
Les séquences correctes
• Paroi (avec cellulose)– Préhydrolyse + hydrolyse:
oses neutres et GalA– (Hydrolyse: oses neutres
par différence estimation cellulose)
– Saponification: méthanol
• Pectines extraites– Saponification: mméthanol
et GalA– Hydrolyse: oses neutres
Identification des liaisons glycosidiques: la réaction de perméthylation
1- Méthylation
OO
O
OCH3
OCH3
CH2OCH3
Polysaccharide perméthylé 2- Hydrolyse
OHO
OH
OCH3
OCH3
CH2OCH3
Oses partiellement méthylés
3- Réduction(deutérium)
Polysaccharide
OO
O
OH
OH
CH2OH
1
23
4
5
6
4- Acétylation
CHDOH
CHOCH3
CHOCH3
CHOH
CHOH
CH2OCH3
D-alditolspartiellement méthylés
1
2
3
4
5
6
CHDOAc
CHOCH3
CHOCH3
CHOAc
CHOAc
CH2OCH3
1
2
3
4
5
6
Acétates d ’alditolspartiellement méthylés
Perméthylation
• Méthylation: en milieu anhydre (DMSO)– dissolution dans DMSO anhydre– présence d'anion methylsulfinylméthanide (dimsyl)– généré par KH, NaH, n-butyllithium, NaOH solide…– purification: dialyse, échange de phase, LH-20 (chloroforme-
méthanol)• Hydrolyse: à peu près idem polysaccharide initial; TFA.• Réduction: deutéro-réduction: marque les C-1
– (NaBD4 dans NH4OH, 3h).
• Acétylation: anhydride acétique– N-méthylimidazole, T°...
Quelques cas particuliers
• Polysaccharides acides: réduire les fonctions carboxyliques:– NaBH4 (NaBD4), pH 7, carbodiimide– LiAlH4 en milieu organique (éther)
• Oligomères: éviter la dégradation des oses réducteurs ("peeling"): préréduction (NaBH4)
Identification des oses partiellement méthylés
• CPG: deux colonnes pour résoudre les pics superposés, de polarités différentes (OV1 (diméthylsiloxane), OV225 (cyanoalkylphénylsiloxanes))
• Standard interne (Inositol) mais utilisation de facteurs de réponse calculés.
• Identification par spectrométrie de masse (impact électronique)– rupture préférentielle entre deux méthylés.– perte de CH3CO+.– fragmentation secondaire: sur le C en β: perte de méthanol (-42) ou
d'acide acétique (-60) .
Exemples de spectres
1,2,5,6-tetra-O-acetyl-(2-deuterio)-3,4-di-O-methyl hexitol
1,4,5-tri-O-acetyl-(1-deuterio)-
2,3,6-tri-O-methyl hexitol
Méthodes de fractionnement
• Précipitations sélectives– Ethanol
• Pectines très facilement précipitées: oligomères (% EtOH, T°)• Arabinanes
– Cuivre (puis lavage acide)• Chromatographies:
– échange d'ions: • fractionnement en fonction de la densité de charges• Contre-ion NH4
+ pour un rendement élevé– exclusion stérique
• Dégradations sélectives:– enzymes– hydrolyse acide controlée
Chromatographie d’échanges d’ions
• Séparation en fonction de la densité de charge• DEAE (faible), QAE (fort – oligomères)• polysaccharides chargés / neutres• pectines: en fonction DM et distribution
++
++
+
+++
++
++ +
+
++
++
+
+++
++
++ +
+
Liaison (faible teneur en sels)
Désorption (forte teneur en sels)
--
--
--
Na+
Cl-
Na+
Cl-
Na+
Cl-
Na+
Cl--
-
--
--
Na+
Cl-
Cl-
Quelques exemples de fractionnements en échange d’ions
• Suivi de déméthylation des pectines
multichaînemonochaîne
0 20 40Volume d'élution (ml)
Rép
onse
col
orim
étriq
ue0
0.5
Tam
pon
acét
ate
(M)
75
72
69
64
43
DM
PME A.niger à pH 4,5
0 20 40Volume d'élution (ml)
Rép
onse
col
orim
étriq
ue
0
0.5
Tam
pon
acét
ate
(M)
75
72
69
63
42
DM
PME pomme à pH 7,0
• DEAE préparative
Monosaccharide composition (mol%) DM DAFractions Gal.A Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc Gal.A/Rha (%) (%)
A 0.3 0.6 21.7 1.0 22.9 23.3 30.2B 1.9 1.1 37.8 2.5 8.6 38.5 10.2C 2.0 0.7 34.6 1.4 6.8 48.2 6.7D 94.9 0.4 0.1 1.1 1.3 0.4 1.5 0.3 218 71 7E 40.4 7.6 0.6 28.1 1.2 2.1 19.2 0.8 5 38 23
Exemple du safou(Ella-Missang)
0 200 400 600 800 1000Elution volume (ml)
Abso
rban
ce (a
rbitr
ary
unit)
0
0.5
1
Sodi
um a
ceta
tebu
ffer m
olar
ity
A
C
D
EB
0 200 400 600 800 1000Elution volume (ml)
Abso
rban
ce (a
rbitr
ary
unit)
0
0.5
1
Sodi
um a
ceta
tebu
ffer m
olar
ity
A
C
D
EB
Utilisation conjointe des échanges d’ions et exclusion stérique BP
Echange d'ion sur BioRad AG 1X8 (après dialyse)
Fractions retenues: AUA, Rha
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
0
50
Volume d'élution (mL)
Concentration (mg/L) Conductivité (mS)Pulpe de betterave
Soluble
Rha: 25 mg/g
Rha 6 mol%GalA 13 mol%Ara 65 mol%Gal 13 mol%
Purification et caractérisation
0
50
100
150
200
250
0,0 0,5 1,0
Concentration (mg/L)
Kav
Rha/GalA: 1/1
Chromatographie d’exclusion stérique
• Principe– Diffusion dans un gel poreux (Kav)– Distribution des volumes hydrodynamiques– Courbes de calibration– le rayon hydrodynamique RH peut être décrit comme la
partie de la molécule qui ne permet pas la libre circulation du solvant.
VeV0 Vt
Mw
106
103
Exclusion totaleKav = 0
Kav = 1
Kav = Ve-V0/Vt-V0
Théorique
SEC pour les pectines
• Il faut écranter les charges– NaNO3 0,1M, acétate Na 0,4M pH 3…
• Calibration– Le volume hydrodynamique des PS est > protéines pour
même masse molaire– Le volume hydrodynamique des pectines est > pullulanes et
dextranes– HPSEC-MALLS
• Utilisation en suivi de dégradation
Exemples
Elution time (min) Kav values
Col
orim
etric
resp
onse
(mV
)
Buffer m
olarity
Col
orim
etric
resp
onse
(mV
)
0
0.5
0 20 40 60 80 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1h-CW
7h-CW
24h-CW
1h-CW
7h-CW
24h-CW
Ion-exchange Size-exclusion
Electrophorèse capillaire
• Distribution intermoléculaire des groupements carboxyles libres– Position et forme des pics– Influence DP
Interprétation des courbes d’EC
Fraction de carboxyles libres
Mob
ilité
élec
troph
orét
ique
Densité de charge
RMN
• Enchaînement des sucres– Oligosaccharides
• Distribution des groupements méthyles– RMN du proton ou du 13C– RMN du proton: les H4, H1 et H5 ont des signaux qui
shiftent selon l’état de substitution du GalA et de ses voisins– Calcul de la distribution intra moléculaire– 80°C, D2O, pectines ou homogalacturonanes neutralisés (pH
6) puis deux échanges D2O
Signaux caractéristiques
Rhamnogalacturonane
Int5.004.41
r.e. (α/β)5,28/4,554,38/4,32
n.r.e.5,004,29
Lié au Rhaen r.e. (α/β)5,08/5,164,41
U-n.r.e.5,135,81
GalA
H-1H-4
Homogalacturonane
Acide4.45
Estérifié4.50
RhaInt5.273.40
r.e. (α/β)5,22/4,933.47/3.33
n.r.e.5,233.35
H-1H-4
H-4
Dénes et al., 2000
H-1Aa5.10
Ae5.15
Ea4.92
Ee4.98
Interprétation du spectre RMN 1H
4.254.755.25ppm
EEG
EGGGGE
GEEGEG
EEE
EGE
GGG
E
GGG
EE
EGGE
ODO
OO
OD
COOR
ODO
O
O
COOR
O
DOO
OD
COOR
H-1H-4H-5
Spectres RMN 1H : monades (H4), dyades (H1), triades (H5)
Méthodes de spectrométrie de masse
• Suivi de dégradations enzymatiques
• MSn: identification d’enchaînements
Nombre GalA, nombre Me
Principe de fractionnement en MSn
• Extrémité réductrice: 18O• A:
– C et B: fragments contenant l’extrémité non réductrice
– Y et Z: fragments contenant l’extrémité réductrice
• B: rupture du cycle glycosidiques
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