B Barrou, EFPMO Juin 2010 Lésions dischémie reperfusion : le cauchemar du transplanteur.

B Barrou, EFPMO Juin 2010

Lésions d’ischémie reperfusion :

le cauchemar du transplanteur


Lésionsd’hypoxie

Lésionsd’hypothermie

Réaction inflammatoire

Ischémie froide Reperfusion

Lésionsliées à la réoxygénation

Lésionsliées au réchauffement/

Apoptose induite par la conservation

Lésions chroniques

Principaux mécanismes lésionnels au cours de l’ischémie reperfusion

T Hauet


En cas de DDAC : des lésions en 3 temps…

Ischémie

Hypothermie Revascularisation


Lésions d’ischémie reperfusion : Conséquences cliniques

Effet respectif de la reprise retardée de fonction et du rejet

aigu (Tx rénale)

Ni RRF ni RA

RA

RRF

RRF + RA

Effet à long terme


Rôle central de la mitochondrie

• Chaque jour un adulte utilise (et recycle) une quantité d'ATP équivalente à 75 % de son poids corporel !

• Dans les conditions de repos, un tiers est utilisé pour le fonctionnement des pompes membranaires comme les ATPases


La phosphorylation oxydative

Mitochondrie matricemembrane

interne

membraneexterne

espace intermembranaire

réactions d ’oxydo-réduction:transfert

d ’e-

I III IVCoQ

CoQH2

NaDH,H+

FADH2

NaD+

FAD

H+ H+ H+H+

1/2 O2

H2O

F1

F0

H+

ADP + Pi

ATP

II


Ischémie = arrêt de la phosphorylation oxydative

- O2

lactate

glucose

glycolyse

pyruvate

ATP

+O2

NADH, H+

acétyl CoA

cycle de Krebs

NADH, H+

FADH2

Acidose


Le bilan énergétique n’est pas brillant…

1 mole de glucose1 mole de glucose

Métabolisme

aérobie

Métabolisme

aérobie

38 moles d’ATP38 moles d’ATP

Métabolisme

anaérobie

Métabolisme

anaérobie

2 moles d’ATP

2 mol. d’a lactique

2 moles d’ATP

2 mol. d’a lactique


1O2

O2

h

H2O2 OH°O2 °-

e-e- e-

O2 °- = anion superoxyde OH ° = radical hydroxyle

H2O2 = peroxyde d ’hydrogène 1O2 = oxygène singulet

4 e-

H2OTetraréduction

Monoréduction physiologique

Il existe une production radicalaire physiologique au niveau mitochondrial

95%

3 à 5%


Qu’est-ce qu’un radical libre ?

Un radical libre (RL) est constitué par tout atome, groupe d’atomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe [•]

Le radical s’en trouve doté d’une réactivité particulière et peut ainsi réagir avec d’autres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin d’apparier son électron célibataire

Radical libre… de nuire !

Bref, c’est la patate chaude…

B Barrou, T Hauet EFPMO Juin 2009


Conséquences de l’ischémie : la lecture biochimique

ischémieischémiePrivation d’O² et nutriments

Accumulation de déchets

Privation d’O² et nutriments

Accumulation de déchetsInhibition du métabolisme

oxydatifInhibition du métabolisme

oxydatif

Déplétion

en ATP

Déplétion

en ATPGlycolyse

anaérobie

Glycolyse

anaérobie

Inhibition

pompes Na/K

Inhibition

pompes Na/KAcide

Lactique

Acide

Lactique

Ph ↓Ph ↓

Instabilité

lysosomale

Instabilité

lysosomale

Libération

Enzymes lytiques

Libération

Enzymes lytiques

Pertes électrolytes

Œdème intraCel.

Pertes électrolytes

Œdème intraCel.

Activité protéases

et phospholipases

Ouv canaux Ca++

Ca++ cytosol

Activité protéases

et phospholipases

Ouv canaux Ca++

Ca++ cytosol

hypoxanthinehypoxanthine

Production

radicaux libres

Production

radicaux libres

Altération cytosquelette, protéines

Peroxydation lipides membranaires

Altération cytosquelette, protéines

Peroxydation lipides membranaires


Le paradoxe de la reperfusion

Ischémie Reperfusion


Syndrome de reperfusion

Perico N, Lancet 2004, 364: 1814-1827

X 100


Conséquences immunologiques de l’IRI


Conséquences de l’ischémie : la lecture immunologique

Ligands endogènes

des TLR

Ligands endogènes

des TLR

ischémieischémie

Immunité innée Immunité innée

Alloreconnaissance Alloreconnaissance

lésions tissulaireslésions tissulaires

Engagement TLR sur DCEngagement TLR sur DC

Maturation DCMaturation DC

Migration DC vers OL IIMigration DC vers OL II

Activation des LT naifs

Ag spécifique

Activation des LT naifs

Ag spécifique

AlloantigèneAlloantigène

Evènements Ag indépendants, non spécifiques

CD80 CD86

sur DC

CD80 CD86

sur DC

Evènements Ag dépendants, spécifiques

La costimulation indispensable provient de l’ischémie via la voie des TLR

La costimulation indispensable provient de l’ischémie via la voie des TLR


Théorie du signal dangerversion chirurgicale

AlloreconnaissanceAlloreconnaissance

+ inflammation


Ligands endogènes des TLR : les «DAMPs»damage associated molecular pattern molecules

• TLRs, including TLR2 and TLR4, could function as:

– detectors of sterile (not pathogen-associated) injury upon binding to endogenous ligands released by damaged cells

– damage-associated molecular patterns, (DAMPs).

• Examples of putative endogenous ligands– heat-shock proteins, – high-mobility group box 1 (HMGB1),– heparan sulfate,– hyaluronan fragments,– fibronectin .

• Is it true in the clinical setting ?


TLR4 Expression Human kidney biopsy before reperfusion

Krüger et al. Blood 2009

Cold isch: 0.5 h (n=15)

Cold isch: 20 h (n=9)

1. TLR4 is expressed in normal human kidneys

2. TLR4 is significantly upregulated by ischemic injury


HMGB1 expression in implantation biopsies

Krüger et al. Blood 2009LD = living donor, DD = deceased donor


HMGB1-induced TLR4-mediated inflammationKrüger et al. Blood 2009

Proximal tubular cell line (HK-2) cultured without (Unstim) or with the TLR4-specific ligand LPS (1 μg/ml) or with rHMGB1 (5 μg/ml)

rHMGB1 stim


TLR2 Expression: kidney >> Leukocytes

Kidney TLR-2-/-

Leukocytes TLR-2-/-

Leemans /Florquin et al. J Clin Invest. 2005


TLR4 Expression: kidney >> Leukocytes

Huiling Wu et al. J Clin Invest. 2007 Kidney: KO, leuco: WT

Kidney: WT, leuco: KO


Zhai et al. J. Immunol. 2004

TLR4 dependent liver ischaemia reperfusion injury

Differences between organs


Principes de conservation

• Conserver en hypothermie :– Loi de Van’t Hoff : activité enzymatique de 50% par pallier de 10°C– 10 à 12 % du métabolisme persiste à 4°C

• Limiter l’œdème intracellulaire :– Imperméants : qui « imperméabilisent » la membrane– Colloïdes : pression oncotique dans compartiment vasculaire

• Limiter la perte énergétique (stock en ATP) : – Composition extracellulaire des solutions

• Prévenir l’acidose intracellulaire… mais pas trop :– Sévère : activation phospholipases, protéases– Modérée (6.9 – 7) : inhibition fructokinase glycolyse

• Prévenir les lésions oxydatives des radicaux libres :– Chélation ? La plupart sont produits lors de la reperfusion…

• Développer la préservation dynamique

• Immunomasquage : Théorie du signal danger (Polly Matzinger)


Solution intra ou extra cellulaire ?

Na+

K+K+

Na+

En ischémie : lésions des membranes 02

ATP

Niveau ATP

de l’activité des pompes


31P Magnetic Resonance Spectroscopy of Isolated perfused rat kidney

(37°C + continuous perfusion 95%O2 5% CO2)

ATP (%)

Bauza G, Hauet T, Eugene M

Effect of depolarizing (high K+) solutions

0

20

40

60

80

100

120

C 1 2 3 4 5 6 7 8

Krebs - PEG 30 g/L

Eurocollins

U W

time (h)

high K+

low K+

Laboratoire de RMN - Physiologie - Cryobiologie- Michel EUGENE


Comment limiter ces lésions ?Les solutions de préservation

• Composition extracellulaire : K+ bas– Lutter contre le spasme

Gokina et al Am.J Physiol Heart Circ.Physiol 278:H2105-H2114, 2000

Effects of elevation in external K+ concentration on contractile force and membrane potential in rabbit MCA

M Eugène


activité Na-K ATPase entrée passive Na+ œdème cellulaire

ImperméantsImperméants ColloidesColloides

saccharidessaccharides

• Glucose (monoS de PM 180) : abandonné car produisant des lactates Eurocollins

• Mannitol (monoS de PM 182) : propriétés anti-oxydantes Marshall’s, HTK, celsior

• Sucrose (diS de PM 342) PBS

• Raffinose (triS de PM 504) UW

Anions non saccharidiquesAnions non saccharidiques

Agissent au niveau interstitium et mbe

• Gluconate

• Citrate

• Lactobionate

• tous chargés négativement

•Agissent par propriétés électro-chimiques


activité Na-K ATPase entrée passive Na+ œdème cellulaire

ImperméantsImperméants ColloidesColloides

Agissent au niveau du compartiment vasculaire

• HES (amidon) UW

PM > 106 daltons

viscosité, agrégation GR

• Dextran :

• PEG : SCOT 15, IGL1

différentes longueurs de chaine

• immunomasquage


L’avenir : la préservation normothermique ?

• Eviter l’hypothermie, qui a des effets délétères en elle-même

• Dissocier les paradoxes de la réadministration d’O2 de l’effet cataclysmique des leucocytes lors de la reperfusion

• Par une solution acellulaire capable de transporter l’O2– Restauration de la phosphorylation oxydative– Induction de mécanismes de réparations des lésions d’ischémie– Avant la seconde claque de la reperfusion– En dehors de toute inflammation et de toute infiltration du

greffon par les leucocytes

• Induction de facteurs susceptibles d’induire des phénomènes de réparation cellulaire et de prévenir les lésions de reperfusion :– Hème Oxygénase I– HSP 70– …


Modèle d’autotransplantation chez le chien, sans ischémie chaude initialeBrasile L, AJT 2003, 3: 674-9

Place respective des différentes modalités…

Viaspan, statique, 4°

Mox 100, viaspan, 4°

Perfusion pulsatile

32°, EMS + Hb bov

+ 02


Conclusion

• Une bonne greffe commence par une bonne préservation

• L’ischémie froide doit rester la plus courte possible

• Les chirurgiens doivent connaître les lésions d’IR et les différentes solutions de préservation

• La préservation sur machine pour les reins va concerner 1/3 à la 1/2 des greffons

• Nombreuses perspectives de réanimation ex vivo des greffons

• Laboratoires de perfusion ?

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