Atténuer le virus naturel de la VHD par

mutagénèse dirigéeet à terme l'extrapoler à

l'EBHS

Virus de la VHD

40 nm

ARN simple brin

7437 bases

Virus pathogène de la VHDStructure déterminée aux rayons X .

• La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides).

• Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.

VHD souche Pascal Harlaud

• 1/ Foie de lapin mort de la VHD envoyé par Pascal Harlaud.

2/ Extraction de l’ARN viral

broyage,centrifugation,

purification

3/ Transcription en ADN

Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b)

Il est fragile.

Nous l’avonstraduit en ADNdouble brin, plusstable pourl’étudier et lemodifier.

ReverseTranscriptase-PCR

4/ Lecture du code ADN

a) description du code (4 lettres A, T, C, G)

Code ADN

à

Double brin

b) Lecture du code

Rouge = T

Noir = G

Vert = A

Bleu = C

Code des 7437 pb de l’ADN complémentaire du virus VHD Pascal H.

cDNA (ADN complémentaire) du virus Pascal Harlaud

F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050

BstBI BamH IBamH I AvrII

On n’a pas pu insérer le génome entier dans un plasmide,

on a donc décidé de le couper en 3 morceaux

F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050

Coupure par des ciseaux spécifiques (enzymes)

…G G A T C C …………………..C C T A G G …………

…C C T A G G …………………..G G A T C C …………Exemple

ADN viral

Ou plasmide

…G G A T C C …………………..C C T A G G …………

…C C T A G G …………………..G G A T C C …………

…G C T A G G …………

…C C T A G C …………

Ciseaux

Plasmide

Ouvert avec

Un brin en

Moins.

Colle…G C T A G G …………

…C C T A G C …………

Plasmide

Ouvert avec

Un brin en

Moins.

G A T C C …………………………………………..C

G……………………………………………G G A T C

Fragment

du génome

Du virus de

La VHD

Association

spontanée

…G G A T C C …………………………………………C C T A G G ……

…C C T A G G………………………………………….G G A T C C ……

Création de la

Liaison :

(ADN ligase

+ ATP)

…G G A T C C …………………………………………C C T A G G ……

…C C T A G G………………………………………….G G A T C C ……

Liaison à créer

Litmus 28i

Multi site de clonage

promoteurT7

RNA Viral RHDV

RT-PCR

F3F1

BamHIBamHIAvrII

BstBI

4/ DigestionBstBI-BamHI

1/ Digestion du plasmide 1 par BamHI-AvrII

pF3

pF1+F3

Construction d'un cloneInfectieux de RHDV

Plasmide 1

2/ ajout de F3 préparé

par RT-PCR

3/ Ligation de plasmide 1

et F3 par ADN ligase.5/ ajout de F1 préparé

par RT-PCR

6/ Ligation de pF3 et F1

par ADN ligase.

Nous avons déjà les 2/3

du génome complet

quelques mois de travaux supplémentaires

semblent nécessaires pour pouvoir insérer

Le troisième fragment F2 et avoir le génome

complet de la VHD dans un plasmide.

F2

Extraction du RNA viral

ReverseTranscriptase-PCR

cDNA (ADN complémentaire)

F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050

Clonage dans un plasmide

Séquençage pour confirmation des séquences

Mutagénèse dirigée

Transcription in vitro (ADN-ARN)

Transfection (cellules permissives, lapin)

BstBI BamH IBamH I

AvrII

Purification du virus VHDGénome viral complet

RNA 7437 b