Comment pourrait on obtenir un nouveau

recombinant Myxo-VHD

Virus de la Myxomatose 2OO nmADN double brin161 773 Paires de bases

Virus de la VHD

40 nm

ARN simple brin

7437 bases

VHD 125 fois moins volumineux que celui de la myxo

Virus pathogène de la VHDStructure déterminée aux rayons X .

• La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides).

• Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.

VHD souche Pascal Harlaud

• 1/ Foie de lapin mort de la VHD envoyé par Pascal Harlaud.

2/ Extraction de l’ARN viral

broyage,centrifugation,

purification

3/ Transcription en ADN

Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b)

Il est fragile.

Nous l’avonstraduit en ADNdouble brin, plusstable pourl’étudier et lemodifier.

ReverseTranscriptase-PCR

4/ Lecture du code ADN

a) description du code (4 lettres A, T, C, G)

Code ADN

à

Double brin

b) Lecture du code

Rouge = T

Noir = G

Vert = A

Bleu = C

Code des 7437 pb de l’ADN complémentaire du virus VHD Pascal H.

Nous avons

• Identifié et isolé la seule partie du code qui exprime la protéine VP60.

En rouge les1737 pb du gène de la VHD codant pour la VP60

Travaux réalisés pour cloner le géne de laVP60Travaux réalisés pour cloner le géne de laVP60

Genome viral completExtrait du foie d’un lapinEnvoyé par Pascal.

Vecteurs de clonage Bluescript II(plasmides) DNA 3000 PbCapables de vectoriserles DNA

Ligation de l’ ADN du génomeavec le vecteur de DNA

plasmide recombiné

Incorporation dans une bacterie

Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide. (nous avons maintenant cet objet)

fraction du génomeCorrespondant à la VP60

P.VP60

Géne de la Thymidine kinase

PCR

TK Gauche TK Droit

K1L

LacZpiv86

K1L LacZ

Génome RHDV

pTG2131

pTKLacZ pTKVP60

Digestion

Constructions des vecteurs de transfert OK.

Nous ne sommes pas allés vers le recombinant. (1 an de travail supplémentaire si on veut)

P7.5

P7.5 promoteur

VP60

TK

TK

TK TK

K1LpromoteurLacZ donne gal

Digestion

P.VP60

pTKPBluescriptII

Nous avons cet objet Nous avons cet objet

Génome du virus de la Myxo (BE4)

161 773 bp