Généralit és sur les voies de...

1O.Lascols / Nov2007

GGéénnééralitralitéés sur les s sur les

voies de signalisationvoies de signalisation

Olivier LascolsOlivier LascolsFaculté de Médecine Pierre et Marie CurieFaculté de Médecine Pierre et Marie Curie


I.I. CaractCaractéérisation drisation d’’une voie une voie

de transduction dde transduction d’’un signalun signal

Exemple du Signal Exemple du Signal MitogéniqueMitogénique de l’EGFde l’EGF

1. Quel récepteur ?1. Quel récepteur ?2.2. Quels relais intracellulaires ?Quels relais intracellulaires ?33. . Spécificité de ces relais intracellulaires ?Spécificité de ces relais intracellulaires ?

1. Interactions et transducteurs1. Interactions et transducteurs2.2. PléïotropiePléïotropie d’un signald’un signal33. . Intégration de signaux par la celluleIntégration de signaux par la cellule

II. Le rII. Le rééseau de la signalisation cellulaireseau de la signalisation cellulaire


????

La transduction des signaux: gLa transduction des signaux: géénnééralitralitééss

�� Début des années 1980Début des années 1980

membrane R

ligand

Cibles cellulaires

Système d’amplificationSystème d’amplification

arrivée du signal

transduction par récepteur

émission intracellulaire du signal

• quels seconds messagers ?• quels relais ?

effets biologiqueseffets biologiques


La transduction des signaux aujourdLa transduction des signaux aujourd’’huihui

R

ligand 2

NOYAU

R

ligand 3

Transports

Métabolisme

Etablissement de réseauxcomplexes par les progrèsen biologie cellulaire etmoléculaire :

� Directe : ligand 1

� Modèles cellulaires :• Modification

d’expression de protéines

• Mutagénèsedirigée

� Modèles animaux :• Souris Knock-out• Souris Knock-in

ligand 1

R

Stratégie de signalisation :

� Clonage de gènes

� Indirecte: ligand 2 ou 3




Exemple du Signal Exemple du Signal MitogéniqueMitogénique de l’EGF (de l’EGF (EpidermalEpidermal GrowthGrowth FactorFactor))

1. Quel récepteur ?1. Quel récepteur ?Méthodologie d’étude des récepteursMéthodologie d’étude des récepteurs

localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonctionfonction

2.2. Quels relais intracellulaires ?Quels relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude

test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation

b. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGFb. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGF

33. . Spécificité de ces relais intracellulaires ?Spécificité de ces relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude

inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèsetransgénèse

b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, tempsb. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps


MMééthodologie dthodologie d’é’étude des rtude des réécepteurscepteurs

ETAPEETAPE MATERIELMATERIEL METHODESMETHODES RESULTATSRESULTATS

Localisation . tissus . Test de liaison. cellules -autoradiographie

- microscopie proliférationélectronique différenciation

. Effets biologiques apoptose …

Localisation .membranes . fractionnementCellulaire . cytosol subcellulaire capacité

. test de liaison spécificité

Sélection . récepteurs . chromatographiepurifiés d’affinité (Ab, ligand)

. test de liaison

Clonage . ADNc . Criblage de banque . Séquence protéique. Domaines spécialisés. Expression du récepteur

cystéine

transmb

TKtyrosines

Caractérisation protéines . solubilisation . Structure . Activitésolubilisées . test de liaison nature, taille enzyme…

. électrophorèse

. immunoprécipitation

. test d’activité

Structure / . récepteurs . Mutagénè se dirigée . Mode de transductionFonction mutés . transfection

. cellules


Interaction LigandInteraction Ligand••RRéécepteurcepteur

� Réversible

� Saturable : nombre de site récepteur défini = Ro

L + R LR

*L + R *LRfixation spécifique

LR� Spécificité

� *L : ligand radioactif

*L + R + X *LR + *LX

*L + L + X *LX + LX

� L : excès de ligand « froid »

fixation totale

totale

spécifique

fixation non spécifique

non spécifique


Etude de la structure du rEtude de la structure du réécepteurcepteur

� Structure fixant l’EGF

• liaison de 125I-EGF

125I-EGF + R 125I-EGF/R

• pontage covalent

125I-EGF + R 125I-EGF/R

DSS

• électrophorèse en SDS• autoradiographie

� Identification par Western blot


Séquence I en aade la protéine

Expression de la protéine

Mutagénèse dirigée

Production d’anticorps

Clonage dClonage d’’une protune protééineine

ARNm

ADNc

vecteur recombinant

Banque d’ADNc

Protéine purifiée

séquence nucléotidiqueAAGTCCTGCGGTGACAACGGTCG

= SONDE

séquence partielleen acides aminés

Lys-prol-trp-tyr-asp-ser-cys-ala

Criblage de la banque

ADNc du gène

Séquence nucléotidique complète

cellule


Etude structure fonctionEtude structure fonction

� Construction de mutants du récepteur à l’EGF

� Autophosphorylation desmutants EGFR

� Répétitions richeen leucine

� Domaine riches en cystéine

� Domaine Tyrosine Kinase

� Domaine C-terminal


Activation dActivation d’’un run réécepteur tyrosine kinase (TK)cepteur tyrosine kinase (TK)

TK

P

ATP

ADPY

1. Autophosphorylationsur des résidus tyrosinesdu récepteur

TK

P

ATP ADP

Y

substratY

substratP

Y

2. Phosphorylationsur des résidus tyrosinesde substrats endogènes

Mb


Activation par Activation par dimdiméérisation risation et transphosphorylation et transphosphorylation

a. Forme repliée d’EGFR:-faible affinité de liaison de l’EGF- pas d’activité kinase

� Apport de la cristallographie et de la bioinformatique :Structure 3D

b. Fixation de l’EGF:- changement conformationnel du monomère (allostérie)

- démasquage de la boucle de dimérisation.

b. Dimérisation:- dos à dos- activation de la tyrosine kinase




Exemple du Signal Exemple du Signal Mitogénique Mitogénique de l’EGFde l’EGF










Etude des interactions : entre molEtude des interactions : entre moléécules connuescules connues

� Activation par le ligand

� Immunoprécipitation des complexes formésavec anticorps spécifique

� Séparation des constituants du complexe par électrophorèse

� Visualisation des protéinespar immunoblot avec des anticorps spécifiques


ApplicationApplication

Implication de Grb2 dans la voie de signalisation induite par EGImplication de Grb2 dans la voie de signalisation induite par EGFF

1. Le récepteur à l’EGF change de taille apparente

3. Induction d’une interaction entre EGFR et Grb2

IP : immunoprécipitation

IB : immunoblot

2. Le récepteur à l’EGF est phosphorylé sur une tyrosine

Lors de l’activation par EGF:


Clonage dClonage d’’un nouveau partenaireun nouveau partenaire

Expression de la protéine

Clones positifs radioactifs

Séquençage des ADN

Banque d’expression d’ADNcFragment EGFR marqué

Criblage de la banque

Y-125I

Production d’anticorps

Immunoprécipitation Immunoblot


SystSystèème double hybride me double hybride (1)(1)

BD : Binding DomainAD : Activating Domain

UAS : Upstream Activating Sequence


SystSystèème double hybride me double hybride (2)(2)

Criblage dCriblage d’’une librairie dune librairie d’’expressionexpression


Etude de la localisation dEtude de la localisation d’’un relaisun relais

stimulation par le ligand

Localisation de la protéine chimère

si TAG non fluorescent

Microscopie confocale en lumière fluorescente

si TAG fluorescent

Ex: GFPGreen Fluorescent Protein

Ab fluorescent anti-TAG

Expression de la protéine chimère

ADNc de protéine relais ADNc de protéine TAG

ADNc de protéine chimère


b. La voie db. La voie d’’activation des MAPK par lactivation des MAPK par l’’EGF : EGF :

recrutement drecrutement d’’un premier relais par EGFR activun premier relais par EGFR activéé

2. Interaction entre Tyr-P et SH2

Mb

P

TK

Y

TK

YP

Grb2sos

1. Complexe Grb2/sos

Grb2sos

Domaine SH2

Domaine SH3

Grb2 : Growth ReceptorBound Protein

sos : son of sevenless

3. Localisation à lamembrane de sos

Grb2sos

P

TK

Y

TK

YP

P


Activation dActivation d’’un 2un 2èème relais membranaireme relais membranaire

1. Interaction sos ras

Mb

ras : petite protéine Gmyristoyléelocalisation membranaire

Grb2sos

P

TK

Y

TK

YP

ras

GDP

2. Echange GDP-GTP

ras

GTP

P


Cycle dCycle d’’activationactivation--inactivation de la protinactivation de la protééine rasine ras

Protéine G : régulation allostériqueactivité GTPase

sos : protéine d’échangeRaf1 : protéine effectriceGAP : GTPase activating protein

ConductionConduction

du SIGNALdu SIGNAL

2. Echange GDP-GTP

1. ras.GDP inactive

ras

GTP

SIGNALSIGNAL

ras

GDP

GTP

GDP

Protéine

d’échange

Protéine

Effectrice

3. Ras GTP active

4. Interaction protéine effectrice

Pi

GAPGTPase

5. Hydrolyse du GTP


Structure de la Kinase RafStructure de la Kinase Raf--11

CR : conserved regionCRD : cystein rich domainRBD : ras binding domain

S : sérineT : thréonineY : tyrosine


ModModèèle dle d’’activation de Rafactivation de Raf--11

(Current Opinion in Cell Biology (1997) 9:174-179)

1. Ras et raf inactives

1

2. Activation ras - interaction raf

2

3. Activation de raf et déplacement de la protéine 14.3.3

3

4. raf: sérine/thréonine kinase,phosphorylable par Src ou prot X

4


Activation dActivation d’’une cascade de Kinasesune cascade de Kinases

P

Raf1

P

P

Noyau

activationde la transcription

3. Translocation MAPK nucléaire

MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase 2. MEK thr/tyr kinase sur MAPK

Thr

Tyr

Thr

Tyr

P

PATP ADP

MAPK

MEK : MAPK ou ERK Kinase 1. Raf1 ser/thr kinase sur MEK

Ser

Ser

Ser

Ser

P

PATP ADP

MEK




Exemple du Signal Exemple du Signal Mitogénique Mitogénique de l’EGFde l’EGF










Inhibition pharmacologique des voies de signalisationInhibition pharmacologique des voies de signalisation

� Points d’impact sur la voie mitogénique de l’EGF

RTK

Grb2, Shc

sos

Ras

Raf

MAPKK

MAPK

Noyau

Facteur de croissance

SH2

Anticorps

PLCg

PI3KPTP

Inhibiteur Tyrosine Kinase

Inhibiteur de SH2

Inhibiteur de SH3

Inhibiteur d’échange

Inhibiteur de farnésylationde Ras

Inhibiteur de Ras

Inhibiteur de Raf

Inhibiteur de MAPK

Inhibiteur de MAPKK

Inhibiteur Inhibiteur Inhibiteur


Inhibition pharmacologique des voies de signalisationInhibition pharmacologique des voies de signalisation


StratStratéégies de modification dgies de modification d’’une voie de signalisation une voie de signalisation (1)(1)

� Antisens� RNA silencing� Transfection cellulaire� Transgénèse chez l’animal

� Antisens

� RNA silencingThéorie du RNAi (RNA interférence)

Prix Nobel de médecine et de physiologie 2006 : Andrew Fire et Craig Mello.

� Éléments de régulation cellulaire� Outils d’étude



� RNA silencing Dicer: hélicase/RNase

RISC : RNA-induced silencing complexes

Application: synthèse in vitro de siRNA ciblé et transfection dans les cellules



� Transfection cellulaire

� Transfection d’un gène normal ou muté dans une cellule hôte

� Surexpression de forme mutée « dominant négatif »



� Transgénèse chez l’animal

� Surexpression d’un gène : transgénèse additive

� Invalidation d’un gène : transgénèse substitutive par recombinaison homologue : souris Knock-Out (KO)

Cellules ES : cellules souches embryonnaires



� Invalidation d’un gène : souris hétérozygotes et homozygotes

Processus de recombinaison sous contrôle d’un promoteur spécifique de tissu

� Knock-out conditionnel et spécifique de tissu: syst ème CRE-Lox

� Substitution d’un gène par un autre : souris Knock- in (KI)


b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, tem ps

�� Car nombreux éléments communsCar nombreux éléments communs ::•• Principes d’activationPrincipes d’activation

•• Intermédiaires communs Intermédiaires communs

•• Interactions protéineInteractions protéine--protéineprotéine

•• Effets biologiquesEffets biologiques

� Régulation spatio-temporelle :• Compartimentalisation• Cinétique des activations

Quelle spécificité du signal ?Quelle spécificité du signal ?


•• Nature : spNature : spéécificitcificitéé des signaux et des rdes signaux et des réécepteurs (1)cepteurs (1)

� Diversité des ligands

� Dimérisation de diverses isoformes du récepteur à l’ EGF : - HER1 (ou EGFR ou erbB1), HER2, HER3 et HER4.

Rq: HER3 est dépourvu d’activité tyrosine kinase.

- Homo- ou hétérodimères- Expression variable


•• Nature : spNature : spéécificitcificitéé des signaux et des rdes signaux et des réécepteurs (2)cepteurs (2)

� Dimérisation et diversité des effets biologiques.


Nature : voies des MAPKsNature : voies des MAPKs

• Familles de MAPK :

– ERK1, 2, 3

– JNK1, 2, 3

– p38 α,β,γ,δ

• Activation par cascade de phosphorylation:

– MAPKKK (MEKK) : ser/thr kinase

– MAPKK (MEK): ser/thr et tyrkinases

• Signaux cellulaires :

– Cycle cellulaire

– Différenciation

– Survie/apoptose

• Localisation des cibles:

– Cytosolique

– Nucléaire


•• LIEU : SCAFFOLD, ANCHOR, DOCKING, ADAPTOR LIEU : SCAFFOLD, ANCHOR, DOCKING, ADAPTOR ProtProtééines dines d’’assemblage de complexes macromolassemblage de complexes macromolééculaires culaires

�� 3 rôles clés dans les voies de 3 rôles clés dans les voies de tranduction tranduction de signaux :de signaux :

1. Reproupe les composants de la voie de signalisation dans un complexe multiprotéique très spécifique

2. Efficacité : présente les substrats aux enzymes séquentiellement et dans une orientation idéale pour une efficacité optimum.

3. Cible le complexe et donc le signal vers une localisation cellulaire spécifique


• Localisation cytosolique

• KSR constitutivementassocié :

• MEK,

•14-3-3, •phosphatase inactive (PP2A)

•IMP (impedes mitogenic signal propagation)• kinases (C-TAK, etc…)

• Régulation par phosphorylation/déphos-phorylation

Complexe Complexe

multiprotmultiprotééiqueique avec avec

KSRKSR


�� Réponse Réponse spatiospatio--temporelle temporelle spécifique sur spécifique sur des fibroblastesdes fibroblastes

•• CompartimentalisationCompartimentalisation

et duret duréée du signale du signal

RRééponses ponses

diffdifféérentielles des rentielles des

ERK aux facteurs ERK aux facteurs

de croissance:de croissance:

EGF et PDGFEGF et PDGF


Bilan des rBilan des réégulations gulations

spatiospatio--temporelles temporelles

dd’’ERK et ERK et

des rdes rééponses ponses

cellulairescellulaires

Ebisuya, M. et al. J Cell Sci 2005;118:2997-3002

�� Effet spécifique dépend du Effet spécifique dépend du type cellulairetype cellulaire

� Fibroblastes� Cellules PC12 :

• EGF : prolfération cellulaire

• NGF : différentiation neuronale

�� Effet spécifique dépend de la Effet spécifique dépend de la durée, de l’intensité et de la durée, de l’intensité et de la localisation cellulaire du signal.localisation cellulaire du signal.


II. Le rII. Le rééseau de la signalisation cellulaireseau de la signalisation cellulaire

1. Interactions et transducteurs1. Interactions et transducteursa. Domaines spécialisés d’interactiona. Domaines spécialisés d’interaction

b. Familles de récepteursb. Familles de récepteurs

c. Diversité des relaisc. Diversité des relais

2.2. PléïotropiePléïotropie d’un signald’un signal

33. . Intégration de signaux par la celluleIntégration de signaux par la cellule


Domaines protDomaines protééiques pour des interactions spiques pour des interactions spéécifiquescifiques

-Y-X-X-hy-

PI

SH2

-hy-X-N-P-X-Y-

PI

PTB

Domaine « Src Homology 2 »100 aaSpécificité: phosphotyrosine etenvironnement côté C-terminal

Domaine « Phospho-Tyrosine Binding »

200 aaSpécificité: phosphotyrosine etenvironnement côté N-terminal

-E-S/T-D-V-COOH

PDZ

14.3.3

-R-S-X-S-X-P-

PI

Dimère de protéine 14.3.3Spécificité: phosphosérine

Domaine 100 aaSpécificité: extrémité C-terminale

SH3

-P-X-X-P-X-

WW

-P-P-X-Y-

PH

Phospholipides

Domaine avec Tryptophane (W)40 aaSpécificité: proline

Domaine « Src Homology 3 »60 aaSpécificité: proline

Domaine « Pleckstrin Homology »

100 aaSpécificité: interaction avec phospholipides membranaires

+++ +++ +++

Siteprimaire

Sitesecondaire


Familles de rFamilles de réécepteurscepteurs


ProtProtééines relais et Domaines dines relais et Domaines d’’InteractionInteraction


Activation de relais protActivation de relais protééiques sans activitiques sans activitéé catalytiquecatalytique

effecteur

effecteur

effecteur

� Adaptateur

effecteur

� Protéine G

effecteur

GDP

GTP

effecteur

GTP

Inactif

Activé

Interactions effectrices

12

34

� Amarrage« docking »

12

34


PI3K

Grb2-sos

PLCγ

Shc

PlPléïéïotropie otropie dd’’un signal un signal (1)(1)

Mb

YYYY

Y

YYY

P

P

P

P

P

P

P

P

� Récepteur à l’EGF : protéine d’amarrage

Prolifération

Différenciation Apoptose

Motilité


PlPléïéïotropie otropie dd’’un signal un signal (2)(2)


IntIntéégration de diffgration de difféérents signauxrents signaux

� Régulation dela croissancecellulaire

a. S/u Gαααα activée pourdifférents récepteurscouplés aux protéines G

b. Transactivation derécepteurs Tyrosinekinases par RCPG

Inter-relations entredifférentes voies designalisation :

c. Diversité liée àhétérodimérisation de RTK

d. Interaction nucléaire avec les signaux stéroïdiens


Requiem du cancerRequiem du cancer

Implication des voies de signalisation de la prolifImplication des voies de signalisation de la proliféération cellulaire.ration cellulaire.

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