Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale
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Anomalies des gènes et leur exploration
Alain Hovnanian
Service de Génétique Médicale
Hôpital Purpan
Tél: 05 61 77 90 79 05 62 74 45 00
EnhancerSilencer
Locus controlregion
5 ’ 3 ’CAAT TATA
promoteurséquences amont
TAATGATAG AATAAAATG
codond’initiation
stop signal de polyadénylation
GèneTranscription clivage
Unité de transcription
exons introns
Structure générale d ’un gène chez l ’homme
EnhancerSilencer
Locus controlregion
Expression d ’un gène chez l ’homme
5 ’ 3 ’CAAT TATA
promoteurséquences amont
TAATGATAG AATAAAATG
codond’initiation
stop signal de polyadénylation
CAP
AAAAAAAA
Gène
ARNm immature
ARNm mature
3 ’5 ’
5 ’ 3 ’
Transcription
Maturation
AAAAAAAA
Noyau
CytoplasmeNH2 COOHTraduction Protéine
clivage
exons introns
épissage des introns
MUTATIONS
Définition: Modification du matériel génétique (maladie/polymorphisme)
Origines:- Spontanées:
- Anomalies de la réplication de l ’ADN- les plus fréquentes (10-6 paires de bases par
génération)- erreurs de l ’ADN polymérase (misapariements)- favorisées par les séquences répétées
- Accidents de recombinaison méiotique- surviennent lors de la méiose- favorisés par des séquences d ’homologie entre chromosomes- délétions, duplications, recombinaisons illégitimes
Origines des mutations (suite):
- Spontanées:- Désamination d ’une cytosine méthylée
- très fréquent en pathologie humaine- non reconnu par les systèmes de réparation de l ’ADN- ex: Arg CGA -> Stop TGA
- Provoquées:- agents génotoxiques - 3 types: chimiques, physiques (radioactivité naturelle et autres rayonnements ionisants, UV…) ou biologiques (virus)- normalement corrigés au cours de la réplication par les systèmes de réparation de l ’ADN- déficients dans certaines maladies génétiques (ex: ataxie télangiectasie, xéroderma pigmentosum…)(cancers)
Types de mutations
A - Mutations ponctuelles
B - Insertion ou délétions de plusieurs bases
C - Expansions de triplets (mutations instables)
D - Macrolésions
A - Mutations ponctuelles
Les plus fréquentes, extra ou intra-géniques, polymorphismes (RFLP, SNPs) ou mutations responsables de maladies génétiques
1 - Substitutions de baseDéfinition: remplacement d ’un nucléotide par un autre Leur effet dépend de leur nature et position dans le gène:
- régions codantes:- mutation silencieuse- mutation faux-sens
- changement d ’un acide aminé par un autre - conservatrice (acide aminé de même classe)
ou non conservatrice- mutation non-sens
- changement d ’un acide aminé en un codon stop prématuré (TAA, TGA, TAG)
1 - Substitutions de base (suite)
- régions codantes:
cas particuliers:
- codon d ’initiation de la traduction
- codon de terminaison de la traduction
- séquences « Exonic splicing enhancer »
(-> anomalie d ’épissage)
- mutation non-sens entraînant le saut de
l ’exon correspondant
(-> rétablissement de la phase)
1 - Substitutions de base (suite)
- régions non codantes:- introns:
- sites consensus d ’épissage (site donneur gt, site accepteur ag)- sites non consensus d ’épissage- site de branchement- conséquences:
-> saut d ’exon-> rétention d ’intron-> activation d ’un site cryptique d ’épissage, exonique ou intronique
- séquences régulatrices en amont du gène -> anomalies de régulation de la transcription
- séquences 3 ’UTR -> instabilité de l ’ARNm
Exemples anomalies d ’épissage
gtgt gtag ag
c
gtgt gtag ag
a
gtgt gtag ag
stop
gt
Saut d ’exon
Activation d ’un site cryptique d ’épissage
Saut d ’exon
2 - Délétion ou insertion d ’une base
- régions codantes:
entraînent un décalage du cadre de lecture
(« mutations décalantes ») conduisant le plus
souvent à un codon stop prématuré
- régions non codantes:selon leur localisation:- région promotrice; anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage- région 3 ’ UTR: instabilité ARNm
B - Insertion ou délétions de plusieurs bases (micro-délétions ou micro-insertions)
Perte ou ajout de plusieurs bases
- régions codantes:
- Si multiple de 3:
perte ou ajout d ’un ou plusieurs acides aminés
- Si non multiple de 3
entraînent un décalage du cadre de lecture
conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré
- régions non codantes:selon leur localisation:- région promotrice: anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage- région 3 ’ UTR: instabilité ARNm
6081del28
6847del27
Délétions génomiques de COL7A1 dans l’EBD dominante
Conséquences des mutationsMutation respectant le cadre de lecture:
- ex: mutation faux-sens, insertion ou délétion multiple de 3,
anomalie d ’épissage respectant ou rétablissant la phase
- conduisent à la synthèse d ’une protéine anormale présentant:
- le remplacement d ’un acide aminé par un autre
- la perte ou le gain d ’un ou plusieurs acides aminés
-> protéine produite, mais stabilité et/ou fonction compromises
Conséquences des mutations (suite)Mutation interrompant le cadre de lecture:
- ex: mutations non-sens, insertion ou délétion non multiples de 3
- conduisent à un codon stop prématuré pouvant entraîner:
- instabilité de l ’ARNm muté (NMRD)
- synthèse d ’une protéine tronquée ayant une extrémité
COOH anormale
- synthèse d ’une protéine amputée d ’une séquence
peptidique (saut d ’exon portant un PTC)
-> protéine non produite, ou instable et/ou non fonctionnelle
C - Expansions de triplets (mutations instables)
- Répétitions instables de triplets nucléotidiques
- Nature, nombre, localisation (région codante/non codante) variables
- Souvent maladies neuro-dégénératives
- Le plus souvent transmission autosomique dominante
- Exemples
Syndrome de l ’X fragile CGG 5 ’UTR XR Xq27
Dystrophie myotonique de Steinert CTG 3 ’UTR AD 19q13
Chorée de Huntington CAG codante AD 4p16
Ataxie de Friedreich GAA intron 1 AR 9q13
D - Macrolésions
- Conséquences délétères en pathologie et au cours de
l ’évolution
- Délétions de quelques centaines à plusieurs milliers de pb
- Duplications
- Fusion de gènes suite à une double cassure de l ’ADN
(ex. translocation)
- Inversions de gènes (orientation tête-bêche d ’un fragment
d ’ADN)
Stratégies de recherche d ’anomalie des gènes(Maladie et gène connus +++)
Analyse directe
Mutation connue
de petite taille de grande taille
PCR
- Enzyme de restriction- Hybridation spécifique d ’allèles- Séquençage +++
- Long PCR ou- Southern-blot
Identification d ’une mutation non sens de COL7A1 par séquençage
Arg->StopCGA -> TGA
EB
Mère
Père
Tropho
Arg->StopCGA -> TGA
Analyse directe
Mutation inconnue
PCR
Détection:- SSCP Single strand conformational polymorphism- DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis- CSGE Conformation sensitive gel electrophoresis- DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography
Identification:- Séquençage +++
Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)
Pic d ’élution anormal
Analyse directe
Macrolésions
Cytogénétique Biologie moléculaire
- Hybridation sur chromosome
(FISH, Fluorescent in situ hybridization)
- Southern-blot
- PCR:
Perte d ’hétérozygotie
Défaut d ’amplification de l ’ADN
Analyse indirecte
Etude de marqueurs génétiques polymorphes:
- intra-géniques ou flanquant le gène
- microsatellites ou bi-alléliques
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
SNPs: single nucleotide polymorphism)
A
3p21
COL7A 48,948-48,980PvuIID3S1581D3S1568
D3S1588 54,62
45
50
Mb
D3S3582 43,88
D3S3629 46,47-48,91
48,985
49,48
Distance physiqueMarqueurs génétiques
Centromère
TélomèreEtude de liaison génétiqueutilisant les marqueurs de COL7A1
Chromosome 3
219 221
227 237
219 237
Père
Mère
Enfant atteintd ’EB récessive
Génotypage de marqueurs de COL7A1
219 221
227 237
219 237
Père atteint
Mère
Enfant atteintd’ EB dominante familiale
Génotypage de marqueurs de COL7A1
Père Mère
Enfant EBDR Enfant sain Trophoblaste Porteur sain
Diagnostic prénatal d ’EBDR par étude indirecte (marqueurs de COL7A1)
ADN
Génotypage (marqueurs de COL7A1)et Recherche de mutations de COL7A1
COL7A1amplifié
Sang
Diagnostic moléculaire des EB dystrophiques
Vérification des mutations
Exemples de conséquences des mutations
Codons stop prématurés
Instabilité ARNm
Protéine non produite
Allèle nul(perte de fonction)
Maladies récessivesMaladies dominantes par haploinsuffisance
Mutations faux-sens
Protéine qualitativement anormale
Stabilité variable
Fonction anormale(diminution, perte
ou nouvelle fonction)
Maladies dominantes (effet dominant négatif)Cancers
Nomenclature des mutations
Mutations faux-sens: ex: E117K
Mutations non-sens: ex: R542X
Mutations d ’épissage: ex: 621 +1G ->A, 622 -2A->C
Délétions, insertions: ex: F508del
6232-6236del ou
6232delATAAG
409-410insC ou 409insC