Post on 11-Aug-2020
Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites (iPS)
Dr. Said Assou
Développement humain
o L’œuf fécondé génère un individu de 10 000 milliards (1e14) de cellules regroupées au sein de ~ 200 tissus.
Stabilité cellulaire
Constance au cour de la vie
sein de ~ 200 tissus.
Tout part d’une seule cellule…….
Renouvellement cellulaire
Tissus normaux
Cellule souche
o Exemple: La totalité de l'épithélium intestinal est renouvelé tous les 3 à 5
jours à partir de cellules souches dans la crypte
Maladies dégénératives
Médecine régénérative
Cellules souches ?
La thérapie cellulaire consiste à remplacer une cellules
défectueuse ou absente par une cellule fonctionnelle
o CS multipotentes
o Déjà engagées dans un programme tissulaire spécifique
Adulte
Cellules souches
o CS pluripotentes
o Toutes les cellules spécialisées d’un individu
Em
bry
on
Cellules
médicaments
Applications thérapeutiques majeures
Les cellules souches pluripotentes présentent un potentiel thérapeutique majeur
In Vitro
Dr. James Thomson, 1998
Les CSE sont des cellules souches pluripotentes issues d’un embryon au stadede blastocyste
Séparation de la MCI du trophoblaste
Dérivation d’une lignée de CSEh
J3
J6
J0
J8 J9
Aprés passage
x20 x20
x20
x10
x10 x10
Plusieurs types d’embryons peuvent être envisagés pour dériver des CSEh:
Les embryons congelés obtenus parFIV, ne faisant plus l’objet d’unprojet parental
Les embryons obtenus par FIV mais
Les embryons porteurs d’uneanomalie génétique recherchée dansle cadre d’un diagnosticpréimplantatoire (DPI)
Les embryons obtenus par FIV maisde qualité insuffisante pour êtreréimplantés ou congelés
CSEh:
Système reproductible
Capacité illimitée de multiplication
Capacité de différenciation modulableCapacité de différenciation modulable
Modélisation in vitro du développement
humain
Applications thérapeutiques majeures
Source de cellules embryonnaires
Allogénicité (HLA incompatible)
Immunosuppression
Limites à un usage thérapeutique
Immunosuppression
Banque de lignées compatibles
Ethique Manipulation d’embryon
Existe-il d’’’’autre alternative que détruire l’’’’embryon ?
o Diagramme de
Waddington
o Réseaux de facteurs
de transcription
Différenciation: irréversible?
de transcription
o Méthylation de
l’ADN, Modification
des histones
(Epigénome)
o miRNA, lnc RNA
Waddington, C. H., 1956, Principles of Embryology, op. cit., p. 412
o Peut-on réverser la
différenciation?
??
La différenciation : un processus unidirectionnel ?
différenciation?
Waddington, C. H., 1956, Principles of Embryology, op. cit., p. 412
Fibroblaste
Lympho B
Macrophage
NeuronPancreas
Endo
Pancreas
Exo
Cellule différenciée
de batracien
Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques
* Clonage
Sir John B. Gurdon
Oeuf de batracien
Prendre un ovocyte
L’énucléer
Injecter le noyau d’une cellule différencié
Sir John B. Gurdon
Clonage chez le mammifère
Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques
DollyCellule
mammaire
Macrophage
NeuronPancreas
Endo
Pancreas
Exo
Nature, I Wilmut et al. 1997 vol. 385 (6619) pp. 810-3
Lympho B
Ovocyte
o Souris
o Vache
o Cochon
o Chat
Autres mammifères
o Lapin
o Chien
o Etc.
o … homme?
Clonage
reproductif
30 ans
Clonage
Lignée ES personnalisée
Clonage
thérapeutique
7 ans
Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques
24 TF => 4
??c-Myc
Reprogrammation de Fib. en cellules « pluripotentes » Induced pluripotent stem cells (iPS)
Cell, Takahashi T. et al. Cell 126, 1–14, August 25, 2006
Nature, Okita, 2007 vol. 448 (7151) pp. 313-7
??
Macrophage
NeuronPancreas
Endo
Pancreas
ExoLympho B
Macrophage
Pancreas
Endo
Pancreas
ExoLympho B
c-Myc
Oct4,
Klf4,
Sox2
Fibroblaste
Shinya Yamanaka
Oct4 KLF4
Sox2
Expression forcée de 4 facteur de transcription
Changements génétiques des cellules
Induced pluripotent stem cells (iPS)
Reprogrammation génétique
Sox2C-myc
Vecteurs Rétroviraux/lentiviraux
Oct4 KLF4
Sox2
Les cellules reprogrammées deviennent pluripotentes
Reprogrammation en cellules souches
Induced pluripotent stem cells (iPS)
Reprogrammation génétique
Sox2C-myc
deviennent pluripotentes
Fibroblasts J0 iPS J25Non-iPS J14
Génération d’iPS à partir de fibroblastes
(Yamanaka et al, Cell, 2007)
Passage 6Passage 6 Passage 6
The Nobel Prize in Physiology or Medicine
2012 was awarded jointly to Sir John B.
Gurdon and Shinya Yamanaka "for theGurdon and Shinya Yamanaka "for the
discovery that mature cells can be
reprogrammed to become pluripotent"
Résultats reproductibles : reproduits dans le laboratoire
Facteurs intrinsèques
La pluripotence des iPS est sous le
contrôle de réseaux de facteurs de
transcription (Oct4, Nanog….)
CSEh
Niche
bFGF
FGFR1
BMPO2
SIP+PDGF
Erk 1/2
?
?
Facteurs extrinsèques
IGF-II
O2
iPS
Niche
Erk 1/2?
bFGF
Propriétés des iPS
Auto renouvellement
Fort pouvoir de multiplication
Un véritable réservoir illimité pour la thérapie cellulaire
Méthode de passage
Deux méthodes de passage des hESC
dissociation non mécanique Enzymatique (trypsine, collagénase, dispase,
accutase…)
Dissociation mécaniqueDissociation mécanique
Dissociation non mécanique
Beaucoup de cellules isolées
favorise l’apparition d’altération géniques
Dissociation mécanique
diminue le risque d’anomalie génétique
Morphologie
Nom du marqueur iPS
SSEA3 (Antigènes) +
SSEA4 (Antigènes) +
TRA-1-60 (Glycoprotéines) +
Marqueurs de la pluripotence
PAL SSEA4
SSEA3OCT4
TRA-1-60 (Glycoprotéines) +
TRA-1-81 (Glycoprotéines) +
OCT4/POU5F1 +
NANOG +
SOX2 +
Phosphatase alcaline (PAL) +
Activité télomères +
TRA-1-60PAL
Fibroblastes cutanés
iPS
Différenciation in vitro
Cardiomyocytes Neuroblastes Hepatocytes Leucocytes
Différenciation in vitro
iPS
Cellules Corps embryoïdes MonocoucheCellules
nourricières
Corps embryoïdes
(EB)
Monocouche
o Source de facteurs de
croissance
o Cellules déposées sur une
surface permettant
l’agrégation entre les
cellules et empêchant leur
adhésion au fond des
boites (Culture en 3D)
o Différenciation spontanée
après suppression des
facteurs de la
pluripotence
o Différenciation dirigée
avec des facteurs
spécifiques
o Simple et rapide
o Le choix du substrat est
un facteur critique
Différenciation in vitro: Corps embryoïdes (EB)
o Les EBs se différencient à vitesse
variable puisqu’ils n’ont ni la
même forme, ni la même taille
o La taille des EBs affecte la
différenciation
hiPS
DifférenciationCorps
embryoides
Différenciation directe
hiPS
Induction de la différenciation
Mise en place d’un test permettant de quantifier le potentiel de différenciation
Rapide
Cytométrie en flux
Combinatoire de
marqueurs de surface
Densité cellulaire
Type de lignée & méthode de passage
Facteurs de croissance
qui peuvent diriger la
différenciation de façon
reproductibleEfficacité
du test
Temps d’exposition au
facteurs de croissance
Marqueur de surface
Type de substrat
du test
Différenciation in vivo
iPS
Formation des tératomesLes iPS introduites dans un animal adulte prolifèrent intensément et se différencient en tumeurs agressives (Tératomes) qui sont formé de plusieurs types de tissus
Tératomes
sont formé de plusieurs types de tissus différenciés
Fibroblastes cutanésFibres musculaires
Différenciation in vivo
Tératome dans souris immunodéficiente (NSG)
iPS
Cartilage
Tube digestif
Les iPS conservent un génotype
et un caryotype normaux.
Caryotype
et un caryotype normaux.
Malgré leurs taux de
prolifération
XX
Autres techniques de reprogrammation
Autres combinaisons de gènes Nanog, Oct4, Lin28, Sox2
Reprogrammation sans vecteur intégratifs Virus non intégratifs (EBV) Virus non intégratifs (EBV)
Virus de Sendaï
ARN (Warren et al., Cell Stem Cell 2010)
Protéines + activation du système immunitaire inné (Lee et al. Cell 151: 547, 2012)
Oct4 Sox2 Lin28Nanog
l'acide valproïque
Augmenter l'efficacité de la reprogrammation avec des molécules chimiques
Ces composés modifient la structure de l'ADN, le
rendant plus accessible aux processus de régulation
génétique.
5-aza-cytodine, BIX-01294 ….
Reprogrammation « 100% chimique » (Hou et al. Science 341: 651) (souris seulement)
Génération d’une lignée iPSC à partir d’un sujet sain
Sendaï virus
OCT4
SOX2
c-MYC
KLF4
hiPSCsPrélèvement
sanguin :
PBMCs post Ficoll
Différenciation des cellules
CD34+ circulantes
en progéniteurs érythroides
Reprogrammation
des EPC
Reprogrammation des PBMCs : modification morphologique
1. Modélisation in vitro du développement humain
normal et des maladies génétiques
2. Une source illimité de cellules pour une médecine
régénérative autologue
Applications
régénérative autologue
3. Un outil pour rajeunir des cellules âgées et/ou
sénescentes
VERS LA CLINIQUE?
les CSEh restent une référence indispensable
Obtenir des cellules différenciées pertinentes
o NB : problématique partagée avec les ES
Rrégénération de la rétine
USA (CSEh)
UK
ESSAIS CLINIQUES
UK
Corée du Sud
Japan (iPS): début 2013
iPS : un patient inclus (Japon) : rétine (autologue) (M Takahashi)
o Anomalies épigénétiques
o mémoire épigénétique de la cellule de départ
o aberration épigénétiques
o Anomalies génétiques
o mutagénèse insertionnelle
iPS = ES ?
Q. Bai, R. Desprat, B. Klein, J.-M. Lemaitre, and J. De Vos, “Embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells? A
DNA integrity perspective.,” Curr Gene Ther, vol. 13, pp. 93–98, Apr. 2013.
o mutagénèse insertionnelle
o autres anomalies génétiques
o Dépend du protocole de reprogrammation? de la
cellule de départ?
Instabilité génétique des CSP
Instabilité génétique des CSP
Les CSP acquièrent des anomalies génétiques au cours de la culture compromettant ainsi leur utilisation à des fins de thérapie
Long time in culture
REPIQUAGE
MECANIQUE
REPIQUAGE
ENZYMATIQUE
découpage
manuel
Instabilité génétique des CSP
Lignée hESC HD291 p13
MORT
CELLULAIRE
manuel
découpage
manuel
+
ROCK
inhibitor
(Y27632)
REPIQUAGE
MECANIQUE
REPIQUAGE
ENZYMATIQUE
Instabilité génétique des CSP
manuel(Y27632)
ADAPTATION
Lignée hESC HD291 p13
découpage
manuel
+
ROCK
inhibitor
(Y27632)
REPIQUAGE
MECANIQUE
REPIQUAGE
ENZYMATIQUE
Instabilité génétique des CSP
manuel(Y27632)
ADAPTATION
Lignée hESC HD291 p13
Instabilité génétique des CSP
PEAU COEUR
iPS
Differentiation
Cas de l’infarctus du myocarde
La promesse des iPS
PEAU COEUR
• Coronaropathie -> 1ère cause de mortalité dans le monde
• Cœur = organe totalement différencié : pas ou peu de régénération
• Traitement en aigu : • Reperfusion
• Insuffisance cardiaque• Greffe d’organe
• Une alternative :Greffe de cellules progénitrices ou contractiles
Mise en évidence d’aires de cellules contractiles
DAPI
-SM actin
Reprogrammation par transdifférenciation
Ascl1,
19 TF => 3
Transdifférenciation
Ascl1,
Brn2,
Myt1l
Fibroblaste
Macrophage
NeuronPancreas
Endo
Pancreas
Exo
Nature, Vierbuchen et al. 2010 Feb 25;463(7284):1035-41
Lympho B
CS hématopoïétiques CS neuronales CS musculaire
Transdifférenciation (« plasticité »)
CS hématopoïétiques
Moelle osseuse
CS neuronales CS musculaire