Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la...

62
Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites (iPS) Dr. Said Assou

Transcript of Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la...

Page 1: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites (iPS)

Dr. Said Assou

Page 2: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Développement humain

o L’œuf fécondé génère un individu de 10 000 milliards (1e14) de cellules regroupées au sein de ~ 200 tissus.

Stabilité cellulaire

Constance au cour de la vie

sein de ~ 200 tissus.

Tout part d’une seule cellule…….

Page 3: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Renouvellement cellulaire

Tissus normaux

Cellule souche

o Exemple: La totalité de l'épithélium intestinal est renouvelé tous les 3 à 5

jours à partir de cellules souches dans la crypte

Page 4: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Maladies dégénératives

Médecine régénérative

Cellules souches ?

La thérapie cellulaire consiste à remplacer une cellules

défectueuse ou absente par une cellule fonctionnelle

Page 5: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse
Page 6: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

o CS multipotentes

o Déjà engagées dans un programme tissulaire spécifique

Adulte

Cellules souches

o CS pluripotentes

o Toutes les cellules spécialisées d’un individu

Em

bry

on

Page 7: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Cellules

médicaments

Applications thérapeutiques majeures

Les cellules souches pluripotentes présentent un potentiel thérapeutique majeur

Page 8: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

In Vitro

Dr. James Thomson, 1998

Les CSE sont des cellules souches pluripotentes issues d’un embryon au stadede blastocyste

Page 9: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Séparation de la MCI du trophoblaste

Dérivation d’une lignée de CSEh

J3

J6

J0

J8 J9

Aprés passage

x20 x20

x20

x10

x10 x10

Page 10: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Plusieurs types d’embryons peuvent être envisagés pour dériver des CSEh:

Les embryons congelés obtenus parFIV, ne faisant plus l’objet d’unprojet parental

Les embryons obtenus par FIV mais

Les embryons porteurs d’uneanomalie génétique recherchée dansle cadre d’un diagnosticpréimplantatoire (DPI)

Les embryons obtenus par FIV maisde qualité insuffisante pour êtreréimplantés ou congelés

Page 11: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

CSEh:

Système reproductible

Capacité illimitée de multiplication

Capacité de différenciation modulableCapacité de différenciation modulable

Modélisation in vitro du développement

humain

Applications thérapeutiques majeures

Page 12: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Source de cellules embryonnaires

Allogénicité (HLA incompatible)

Immunosuppression

Limites à un usage thérapeutique

Immunosuppression

Banque de lignées compatibles

Ethique Manipulation d’embryon

Existe-il d’’’’autre alternative que détruire l’’’’embryon ?

Page 13: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

o Diagramme de

Waddington

o Réseaux de facteurs

de transcription

Différenciation: irréversible?

de transcription

o Méthylation de

l’ADN, Modification

des histones

(Epigénome)

o miRNA, lnc RNA

Waddington, C. H., 1956, Principles of Embryology, op. cit., p. 412

Page 14: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

o Peut-on réverser la

différenciation?

??

La différenciation : un processus unidirectionnel ?

différenciation?

Waddington, C. H., 1956, Principles of Embryology, op. cit., p. 412

Fibroblaste

Lympho B

Macrophage

NeuronPancreas

Endo

Pancreas

Exo

Page 15: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Cellule différenciée

de batracien

Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques

* Clonage

Sir John B. Gurdon

Oeuf de batracien

Prendre un ovocyte

L’énucléer

Injecter le noyau d’une cellule différencié

Sir John B. Gurdon

Page 16: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Clonage chez le mammifère

Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques

DollyCellule

mammaire

Macrophage

NeuronPancreas

Endo

Pancreas

Exo

Nature, I Wilmut et al. 1997 vol. 385 (6619) pp. 810-3

Lympho B

Ovocyte

Page 17: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

o Souris

o Vache

o Cochon

o Chat

Autres mammifères

o Lapin

o Chien

o Etc.

o … homme?

Page 18: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Clonage

reproductif

30 ans

Clonage

Lignée ES personnalisée

Clonage

thérapeutique

7 ans

Page 19: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse
Page 20: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Stratégies pour induire la reprogrammation des cellules somatiques

24 TF => 4

??c-Myc

Reprogrammation de Fib. en cellules « pluripotentes » Induced pluripotent stem cells (iPS)

Cell, Takahashi T. et al. Cell 126, 1–14, August 25, 2006

Nature, Okita, 2007 vol. 448 (7151) pp. 313-7

??

Macrophage

NeuronPancreas

Endo

Pancreas

ExoLympho B

Macrophage

Pancreas

Endo

Pancreas

ExoLympho B

c-Myc

Oct4,

Klf4,

Sox2

Fibroblaste

Shinya Yamanaka

Page 21: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Oct4 KLF4

Sox2

Expression forcée de 4 facteur de transcription

Changements génétiques des cellules

Induced pluripotent stem cells (iPS)

Reprogrammation génétique

Sox2C-myc

Vecteurs Rétroviraux/lentiviraux

Page 22: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Oct4 KLF4

Sox2

Les cellules reprogrammées deviennent pluripotentes

Reprogrammation en cellules souches

Induced pluripotent stem cells (iPS)

Reprogrammation génétique

Sox2C-myc

deviennent pluripotentes

Page 23: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Fibroblasts J0 iPS J25Non-iPS J14

Génération d’iPS à partir de fibroblastes

(Yamanaka et al, Cell, 2007)

Passage 6Passage 6 Passage 6

Page 24: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

The Nobel Prize in Physiology or Medicine

2012 was awarded jointly to Sir John B.

Gurdon and Shinya Yamanaka "for theGurdon and Shinya Yamanaka "for the

discovery that mature cells can be

reprogrammed to become pluripotent"

Page 25: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Résultats reproductibles : reproduits dans le laboratoire

Page 26: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Facteurs intrinsèques

La pluripotence des iPS est sous le

contrôle de réseaux de facteurs de

transcription (Oct4, Nanog….)

CSEh

Niche

Page 27: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

bFGF

FGFR1

BMPO2

SIP+PDGF

Erk 1/2

?

?

Facteurs extrinsèques

IGF-II

O2

iPS

Niche

Erk 1/2?

bFGF

Page 28: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Propriétés des iPS

Auto renouvellement

Fort pouvoir de multiplication

Un véritable réservoir illimité pour la thérapie cellulaire

Page 29: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Méthode de passage

Deux méthodes de passage des hESC

dissociation non mécanique Enzymatique (trypsine, collagénase, dispase,

accutase…)

Dissociation mécaniqueDissociation mécanique

Dissociation non mécanique

Beaucoup de cellules isolées

favorise l’apparition d’altération géniques

Dissociation mécanique

diminue le risque d’anomalie génétique

Page 30: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Morphologie

Page 31: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Nom du marqueur iPS

SSEA3 (Antigènes) +

SSEA4 (Antigènes) +

TRA-1-60 (Glycoprotéines) +

Marqueurs de la pluripotence

PAL SSEA4

SSEA3OCT4

TRA-1-60 (Glycoprotéines) +

TRA-1-81 (Glycoprotéines) +

OCT4/POU5F1 +

NANOG +

SOX2 +

Phosphatase alcaline (PAL) +

Activité télomères +

TRA-1-60PAL

Page 32: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Fibroblastes cutanés

iPS

Différenciation in vitro

Cardiomyocytes Neuroblastes Hepatocytes Leucocytes

Page 33: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Différenciation in vitro

iPS

Cellules Corps embryoïdes MonocoucheCellules

nourricières

Corps embryoïdes

(EB)

Monocouche

o Source de facteurs de

croissance

o Cellules déposées sur une

surface permettant

l’agrégation entre les

cellules et empêchant leur

adhésion au fond des

boites (Culture en 3D)

o Différenciation spontanée

après suppression des

facteurs de la

pluripotence

o Différenciation dirigée

avec des facteurs

spécifiques

o Simple et rapide

o Le choix du substrat est

un facteur critique

Page 34: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Différenciation in vitro: Corps embryoïdes (EB)

o Les EBs se différencient à vitesse

variable puisqu’ils n’ont ni la

même forme, ni la même taille

o La taille des EBs affecte la

différenciation

Page 35: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

hiPS

DifférenciationCorps

embryoides

Différenciation directe

hiPS

Induction de la différenciation

Page 36: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Mise en place d’un test permettant de quantifier le potentiel de différenciation

Rapide

Cytométrie en flux

Combinatoire de

marqueurs de surface

Page 37: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Densité cellulaire

Type de lignée & méthode de passage

Facteurs de croissance

qui peuvent diriger la

différenciation de façon

reproductibleEfficacité

du test

Temps d’exposition au

facteurs de croissance

Marqueur de surface

Type de substrat

du test

Page 38: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Différenciation in vivo

iPS

Formation des tératomesLes iPS introduites dans un animal adulte prolifèrent intensément et se différencient en tumeurs agressives (Tératomes) qui sont formé de plusieurs types de tissus

Tératomes

sont formé de plusieurs types de tissus différenciés

Page 39: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Fibroblastes cutanésFibres musculaires

Différenciation in vivo

Tératome dans souris immunodéficiente (NSG)

iPS

Cartilage

Tube digestif

Page 40: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Les iPS conservent un génotype

et un caryotype normaux.

Caryotype

et un caryotype normaux.

Malgré leurs taux de

prolifération

XX

Page 41: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse
Page 42: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Autres techniques de reprogrammation

Autres combinaisons de gènes Nanog, Oct4, Lin28, Sox2

Reprogrammation sans vecteur intégratifs Virus non intégratifs (EBV) Virus non intégratifs (EBV)

Virus de Sendaï

ARN (Warren et al., Cell Stem Cell 2010)

Protéines + activation du système immunitaire inné (Lee et al. Cell 151: 547, 2012)

Page 43: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse
Page 44: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Oct4 Sox2 Lin28Nanog

l'acide valproïque

Augmenter l'efficacité de la reprogrammation avec des molécules chimiques

Ces composés modifient la structure de l'ADN, le

rendant plus accessible aux processus de régulation

génétique.

5-aza-cytodine, BIX-01294 ….

Reprogrammation « 100% chimique » (Hou et al. Science 341: 651) (souris seulement)

Page 45: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Génération d’une lignée iPSC à partir d’un sujet sain

Sendaï virus

OCT4

SOX2

c-MYC

KLF4

hiPSCsPrélèvement

sanguin :

PBMCs post Ficoll

Différenciation des cellules

CD34+ circulantes

en progéniteurs érythroides

Reprogrammation

des EPC

Page 46: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Reprogrammation des PBMCs : modification morphologique

Page 47: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

1. Modélisation in vitro du développement humain

normal et des maladies génétiques

2. Une source illimité de cellules pour une médecine

régénérative autologue

Applications

régénérative autologue

3. Un outil pour rajeunir des cellules âgées et/ou

sénescentes

Page 48: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

VERS LA CLINIQUE?

les CSEh restent une référence indispensable

Page 49: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Obtenir des cellules différenciées pertinentes

o NB : problématique partagée avec les ES

Rrégénération de la rétine

USA (CSEh)

UK

ESSAIS CLINIQUES

UK

Corée du Sud

Japan (iPS): début 2013

iPS : un patient inclus (Japon) : rétine (autologue) (M Takahashi)

Page 50: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

o Anomalies épigénétiques

o mémoire épigénétique de la cellule de départ

o aberration épigénétiques

o Anomalies génétiques

o mutagénèse insertionnelle

iPS = ES ?

Q. Bai, R. Desprat, B. Klein, J.-M. Lemaitre, and J. De Vos, “Embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells? A

DNA integrity perspective.,” Curr Gene Ther, vol. 13, pp. 93–98, Apr. 2013.

o mutagénèse insertionnelle

o autres anomalies génétiques

o Dépend du protocole de reprogrammation? de la

cellule de départ?

Page 51: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Instabilité génétique des CSP

Page 52: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Instabilité génétique des CSP

Les CSP acquièrent des anomalies génétiques au cours de la culture compromettant ainsi leur utilisation à des fins de thérapie

Long time in culture

Page 53: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

REPIQUAGE

MECANIQUE

REPIQUAGE

ENZYMATIQUE

découpage

manuel

Instabilité génétique des CSP

Lignée hESC HD291 p13

MORT

CELLULAIRE

manuel

Page 54: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

découpage

manuel

+

ROCK

inhibitor

(Y27632)

REPIQUAGE

MECANIQUE

REPIQUAGE

ENZYMATIQUE

Instabilité génétique des CSP

manuel(Y27632)

ADAPTATION

Lignée hESC HD291 p13

Page 55: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

découpage

manuel

+

ROCK

inhibitor

(Y27632)

REPIQUAGE

MECANIQUE

REPIQUAGE

ENZYMATIQUE

Instabilité génétique des CSP

manuel(Y27632)

ADAPTATION

Lignée hESC HD291 p13

Page 56: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Instabilité génétique des CSP

Page 57: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

PEAU COEUR

Page 58: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

iPS

Differentiation

Cas de l’infarctus du myocarde

La promesse des iPS

PEAU COEUR

• Coronaropathie -> 1ère cause de mortalité dans le monde

• Cœur = organe totalement différencié : pas ou peu de régénération

• Traitement en aigu : • Reperfusion

• Insuffisance cardiaque• Greffe d’organe

• Une alternative :Greffe de cellules progénitrices ou contractiles

Mise en évidence d’aires de cellules contractiles

Page 59: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

DAPI

-SM actin

Page 60: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Reprogrammation par transdifférenciation

Page 61: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

Ascl1,

19 TF => 3

Transdifférenciation

Ascl1,

Brn2,

Myt1l

Fibroblaste

Macrophage

NeuronPancreas

Endo

Pancreas

Exo

Nature, Vierbuchen et al. 2010 Feb 25;463(7284):1035-41

Lympho B

Page 62: Reprogrammation et cellules souches pluripotentes induites ... · o mémoire épigénétique de la cellule de départ o aberration épigénétiques o Anomalies génétiques o mutagénèse

CS hématopoïétiques CS neuronales CS musculaire

Transdifférenciation (« plasticité »)

CS hématopoïétiques

Moelle osseuse

CS neuronales CS musculaire