ISIS Biologie Santé

La promesse des cellules souches pluripotentes induites

The Promise of Induced Pluripotent Stem Cell

Rapport de l’ISIS en date du 24/05/2011

Les cellules ordinaires des êtres vivants peuvent être amenées à devenir des cellules souches pluripotentes, ce qui rend inutile l'utilisation des embryons humains ; mais cette technique, nouvellement disponible, est-elle vraiment sûre et inoffensive en matière de sécurité et de santé publique ? D’après le Dr Eva Sirinathsinghji

L’article original en anglais avec toutes les références s’intitule The Promise of Induced Pluripotent Stem Cells ; il est accessible sur le site www.i-sis.org.uk/ Induced _ Pluripotent _ Stem _ Cells .php

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Les cellules souches pluripotentes sont des cellules qui peuvent se multiplier indéfiniment et se différencier pour donner toutes sortes de cellules du corps ; elles ont longtemps généré une grande excitation dans les milieux scientifiques et auprès du grand du public, en raison de leur utilisation potentielle pour la régénération tissulaire ou en médecine régénérative.

L'intérêt porté à ce type de cellules a augmenté encore plus récemment, avec le développement d'une nouvelle technique pour générer artificiellement des cellules pluripotentes sans utiliser des embryons. Les ‘cellules souches pluripotentes induites’ (cellules iPS) ont provoqué une onde de choc dans la communauté scientifique, car elles ont montré qu’une cellule adulte peut revenir à un état pluripotent. Yamanaka et ses collègues, basés à Kyoto, ont montré qu’en exprimant seulement quatre gènes dans les cellules de la peau à l’état adulte, celles-ci sont devenues semblables à des souches de cellules embryonnaires, en présentant la capacité unique de se renouveler et de se transformer en presque tous les types de cellules qui existent dans le corps humain.

Auparavant, il y avait eu un certain nombre de méthodes mises au point pour fournir des cellules souches pluripotentes, soit à partir d'embryons ordinaires, soit à partir d’embryons créés par la transplantation nucléaire de cellules somatiques (méthode utilisée pour

cloner la brebis Dolly) et la fusion cellulaire.

Depuis la première génération des cellules iPS de souris en 2006 [1] et des cellules iPS humaines en 2007 [2], cette technique a explosé dans un champ de recherche énorme et en constante évolution.

De toutes les techniques, celle qui fait appel aux cellules iPS est la seula à ce jour qui contourne l'utilisation des embryons, et elle a également la capacité de générer des lignées cellulaires spécifiques au patient, en évitant la transplantation et le rejet immunitaire qui suit souvent. En théorie, un patient nécessitant une greffe de cellules souches n'a besoin que de faire don de ses cellules de la peau, qui peuvent être re-programmées et multipliées à un nombre suffisant de cellules, induites à se différencier en un type cellulaire nécessaire ; il reste alors à les réimplanter chez le patient concerné.

Cette nouvelle technique a semblé étonnamment simple et reproductible et elle a suscité un intérêt énorme pour son utilisation potentielle en médecine régénératrice et pour la recherche scientifique. Cependant, la sécurité, l’inocuité de ces procédures cliniques a été mise en cause dans la revue Nature : il a été démontré que les cellules iPS ont déclenché une réponse immunitaire après une transplantation à des souris qui présentaient le même patrimoine génétique que les cellules transplantées [3].

Que sont les cellules iPS?

Les ‘cellules souches pluripotentes induites’ ou cellules iPS ont d'abord été générées par l'expression forcée d'un ensemble spécifique de gènes chez des types de cellules spécialisées adultes, comme les cellules de la peau. Ces gènes étaient déjà connus pour jouer un rôle important dans le maintien de la pluripotence, et ils pouvaient donc reprogrammer des cellules différenciées vers un stade antérieur, à un état indifférencié et pluripotent.

En examinant un ensemble de 24 gènes, les chercheurs ont réussi à réduire une combinaison de seulement 4 de ces gènes qui ont la capacité de reprogrammer les cellules: c-Myc, Klf-4, Oct3/4 and Sox2. Ces gènes ont été introduits dans des cellules de la peau, et sur une période de 3-4 semaines une partie des cellules de la peau ont changé leur morphologie, leur croissance et leurs caractéristiques moléculaires pour ressembler à des cellules souches embryonnaires. Ces cellules iPS se sont avérées être en mesure de fonctionner dans le cerveau, dans le cœur ainsi que dans les cellules osseuses.

Un examen détaillé de la technique de production de cellules iPS

Cette technique a été réalisée dans des cellules humaines en utilisant des vecteurs de gènes viraux (transporteurs) pour insérer les gènes d'intérêt dans le génome hôte. Ces vecteurs viraux (avec suppression des gènes du virus responsables de maladies) sont utilisés dans d'autres domaines de la recherche médicale comme dans la thérapie génique.

Les inconvénients de l'approche de vecteurs viraux classiques incluent l'insertion permanente de l'ADN dans le génome hôte, ce qui peut conduire à des perturbations du fonctionnement normal des gènes, un phénomène dénommé mutagenèse insertionnelle (voir [4] Naked and Free Nucleic Acids - Unregulated Hazards, ISIS un rapport sur les dangers de vecteurs viraux et sur la thérapie génique).

Ceci est une limitation majeure de la valeur clinique de ces cellules iPS en vue d’une transplantation. Les premières publications ont trouvé au moins 20 insertions de la combinaison des 4 gènes dans les lignées cellulaires iPS générées. Avec un tel nombre élevé d'ADN viral présent dans ces cellules, les risques de mutagenèse insertionnelle sont encore plus grands. En outre, bien que l'expression des 4 gènes semble n’être que temporaire, leur réactivation pourrait avoir de graves conséquences pour les risques de formation de tumeurs.

Ces gènes ne sont pas seulement importants pour le maintien de la pluripotence, mais ils sont également connus pour jouer un rôle dans divers types de cancers. Un cancer implique également une reprogrammation de cellules différenciées à un état de prolifération, qui partage de nombreuses caractéristiques avec des cellules souches embryonnaires. En effet, la réactivation de c-Myc a entraîné la formation de tumeurs dans environ 20 pour cent des souris généréess uniquement à partir de cellules iPS [5].

Le succès de la reprogrammation cellulaire a été réalisé avec moins de gènes, surtout sans le gène c-Myc [6]. Des composés chimiques, tels que l'acide valproïque, ont également été utilisés pour accroître l'efficacité de la reprogrammation [7]. Ces composés modifient la structure de l'ADN, le rendant plus accessible aux processus de régulation génétique, une caractéristique de conformation qui est étroitement associée à des cellules indifférenciées.

Plus récemment, des cellules iPS ont été générées sans vecteurs viraux, mais plutôt avec une livraison directe des produits protéiques des gènes nécessaires [8]. En modifiant les protéines pour héberger un peptide d'ancrage, les protéines ont pu être acheminées dans la cellule pour induire la reprogrammation. Cela élimine les problèmes mentionnés précédemment, liés à une modification du génome des cellules iPS de façon permanente, ce qui les rend ces protéines plus adaptées pour un usage thérapeutique.

Le test ultime pour voir que les cellules iPS sont réellement pluripotentes est la génération d'adultes viables, dérivés uniquement à partir de ces cellules. Ce fut d'abord fait en 2009 par des essais de complémentation tétraploïde [9] (voir aussi [10] Unacceptable Death Rates End Cloning Trials in New Zealand , SiS 50 *, pour une explication succincte de l'analyse de complémentation tétraploïde).

* La version en français s’intitule : "Des taux de mortalité inacceptables mettent fin aux expérimentations sur le clonage animal en Nouvelle-Zélande" par le Dr. Mae-Wan Ho, traduction et compléments de Jacques Hallard ; elle est accessible sur le site http://yonne.lautre.net/spip.php?article4880

Des souris viables ont été obtenues, même si beaucoup de sujets expérimentaux sont morts au

stade embryonnaire ou à la naissance, un phénomène qui est commun à cette technique.

Les utilisations potentielles

La reprogrammation de cellules iPS aborde des questions intéressantes et importantes sur ce qui est nécessaire pour maintenir une cellule dans un état pluripotent, et comment fonctionne la dynamique des cellules dans notre corps. En identifiant les gènes clés qui sous-tendent le phénomène, notre compréhension de la pluripotence avance. Ces études de la différenciation peuvent être appliquées à la recherche contre le cancer. Elles fournissent également des cellules humaines qui pourraient être utiles pour la modélisation de la maladie, fournissant un complément, ou même une alternative à la recherche animale.

Certaines lignées cellulaires spécifiques à certaines maladies ont été rapidement mises en place, avec une publication qui indique la production de 10 lignées de cellules provenant de patients atteints de maladies, dont le syndrome de Down, la maladie de Huntington, le diabète juvénile, ainsi que la maladie de Parkinson [11].

De nombreux chercheurs espèrent obtenir des cellules iPS pour la médecine régénérative, avec le potentiel supplémentaire de fabrication de cellules spécifiques au patient, en évitant les risques de rejet immunitaire. Ces cellules pourraient aussi être utilisées pour des programmes de traitement sur mesure [12]. Certains traitements de la maladie ne peuvent fonctionner que sur un certain pourcentage de patients ; des pré-tests sur les cellules du patient peuvent augmenter la prévisibilité de l'efficacité des médicaments et la toxicité pour chaque patient.

Une utilisation plus sinistre des cellules iPS est la génération d'animaux transgéniques pour la consommation alimentaire. L'utilisation de cellules iPS pourraient contourner les expériences de clonage qui sont réputées pour causer des niveaux élevés de morts et de la souffrance chez les animaux d'élevage, (voir [13]).

Inconvénients

Comme avec les cellules embryonnaires ES, il existe un risque important de formation de tumeurs, si les cellules iPS sont destinées à la transplantation. Les tumeurs peuvent se former lorsque quelques autres cellules indifférenciées continuent de proliférer après la transplantation. C’est une préoccupation bien établie qui est largement discutée, et pour une bonne raison. Il faut y ajouter des limitations du fait que certaines cellules iPS présentent des possibilités de mutagenèse insertionnelle.

Une reprogrammation incomplete peut aussi conduire à l'incapacité de différencier pleinement des cellules spécialisées adultes. Toutefois, des études récentes portant à la fois sur des cellules embryonnaires et sur des cellules iPS présentent une capacité de différenciation similaire, qui est fonction de la lignée cellulaire utilisée [12].

Une autre préoccupation est l'accumulation de mutations et de réarrangements génomiques au cours du processus de production de cellules iPS. Un article publié récemment dans Nature, a montré que 124 mutations ont été découvertes dans 22 lignées différentes de cellules iPS [14].

En outre, un certain nombre de ces mutations ont été découvertes dans des gènes liés à des cancers, avec des mutations dans le même gène à travers de nombreuses lignées différentes. Le fait de développer la même mutation dans des lignées cellulaires suggère qu'il pourrait y avoir un avantage sélectif à leur acquisition. Cette limitation ne peut jamais être surmontée si les cellules sont cultivées pendant de longues périodes de temps : c’est là quelque chose de difficile à éviter, dès lors qu’un nombre élevé de cellules sont nécessaires pour la transplantation.

Avec ces risques associés à des thérapies qui font appel aux cellules embryonnaires et aux cellules iPS, la recherche alternative sur les méthodes de stimulation des cellules souches propres à un patient donné, pour une thérapie régénérative, peut s'avérer plus efficace, (voir [15] Stem Cells Repair Without transplant, SiS 50) *.

* La version en français s’intitule "Des cellules souches utilisables sans transplantation pour une médecine régénératrice" par le Dr. Eva Sirinathinghji, traduction et compl »ments de Jacques Hallard ; elle est accessible sur le site http://yonne.lautre.net/spip.php?article4872&lang=fr

D'autres recherches se concentrent également sur les perspectives de transdifférenciation des cellules d'un type cellulaire à un autre, sans revenir à un état pluripotent dans le processus [16].

Pour conclure

Les cellules iPS peuvent se révéler importantes pour la découverte de médicaments et pour les recherches sur les mécanismes de la maladie, fournissant une source unique de cellules humaines qui peuvent être obtenues à partir de la peau des individus malades ou en bonne santé.

Cependant, leur utilisation pour la régénération tissulaire en médecine régénérative pose des risques considérables en matière de santé, et elle exige au préalable des recherches approfondies quant à leur valeur clinique, et ces recherches n’en sont encore qu’à un stade préliminaire.

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Définitions et compléments

Acide valproïque – Un article de Wikipédia

L'acide valproïque ou acide 2-propylpentanoïque (C8H16O2) ainsi que ses sels, les valproates (principalement le valproate de sodium, le sel de sodium) sont des médicaments antiépileptiques.

Mode d'action [modifier]

L'acide valproïque affecte les neurotransmetteurs GABA (en tant qu'inhibiteur de la GABA transaminase). L'acide valproïque est aussi un inhibiteur des histones désacétylases (HDAC) aux concentrations correspondant à une utilisation clinique 2. Cet activité sur les HDAC se traduit par une activité de différentiation sur certains types cellulaires y compris cancéreux, et pourrait expliquer les effets tératogènes de ce médicament.

Indications [modifier]

L'acide valproïque, est un anticonvulsivant et calmant, essentiellement utilisé pour le traitement de :

• l'épilepsie (toutes les épilepsies sont sensibles à son action, épilepsies partielles ou généralisées, adultes et enfants).

• le trouble bipolaire,• les migraines.

Effets secondaires connus [modifier]

• Dyspepsie et/ou gain de poids.• Troubles digestifs• Plus rarement, vertiges ou fatigue, chute de cheveux, maux de tête, nausées,

somnolence, tremblements,• Une thrombocytopénie, abaissement du niveau de plaquettes dans le sang.• Une cytolyse hépatique sévére avec dans de très rares cas, des troubles hépatiques,

jaunisse, et ralentissement de la coagulation.• Des dysfonctionnements cognitifs et syndrome parkinsonien ont été signalés chez

quelques sujets traités à long-terme.

Effets sur la grossesse et/ou la lactation [modifier]

Chez 5 % à 10% des utilisatrices enceintes, l'acide valproïque, pris au cours du premier trimestre, est responsable de malformations congénitales3 (exemple : non fermeture du tube

neural prévenu par la prise d'acide folique). De plus, les enfants nés de mères sous valproate semblent avoir un risque de déficit cognitif plus important4.

Contre-indications [modifier]

• Hépatopathie sévère préexistante (voir foie)• Allergie au produit• Porphyrie (accumulation de précurseurs toxiques de l'hème)• Anomalies héréditaires du cycle de l'urée (dont déficit en ornithine carbamyl

transférase) : risque d'encéphalopathie hyperammoniémique

Interactions avec d'autres traitements [modifier]

• L'association avec les barbituriques, la lamotrigine, la méfloquine est contre-indiquée.• L'association avec d'autres antiépileptiques est une précaution d'emploi.ppellations

commerciales [modifier]

Notes et références[modifier]

Acide valproïque et/ou Valproate de sodium

Noms commerciaux :Convulex® (Belgique, Suisse)Depakine® (Belgique, France, Suisse)Dépakine® (France)Dépakote® (France)Merck-valproate® (Belgique)MICROPAKINE L.P.® (France)Orfiril® (Suisse)VALPROATE DE SODIUM x (génériques, France : x = BIOGARAN, EG, IREX, MERCK, QUALIMED, RATIOPHARM, RPG, SANDOZ, TEVA, WINTHROP)

Classe :Antiépileptique

1. ↑ Masse molaire calculée d’après Atomic weights of the elements 2007 [archive] sur www.chem.qmul.ac.uk

2. ↑ Martin Göttlicher et al. Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells [archive]

3. ↑ Jentink J, Loane MA, Dolk H et Als, for the EUROCAT Antiepileptic Study Working Group Valproic acid monotherapy in pregnancy and major congenital malformations [archive], N Eng J Med, 2010;362:2185-2193

4. ↑ Meador KJ, Baker GA, Browning N et Als.Cognitive function at 3 years of age after fetal exposure to antiepileptic drugs [archive], N Eng J Med, 2009;360:1597-1605

Source : http://fr.wikipedia.org/wiki/Acide_valpro%C3%AFque

Cellule souche

En biologie, une cellule est dite cellule souche (ou cellule indifférenciée) à deux conditions :

1. Elle peut donner des cellules spécialisées par différenciation cellulaire et,2. Elle peut se renouveler un grand nombre de fois, au moins à l'intérieur de la limite de

Hayflick (2^50 = 10^15 environ)

Elles sont présentes au stade embryonnaire et dans l'organisme adulte, mais elles sont bien plus rares dans l'organisme adulte (citons les cellules souches hématopoïétiques régénérant en continu les cellules du sang, les cellules souches intestinales, les cellules souches nerveuses dans des régions précises du cerveau (hippocampe, zone subventriculaire)).De manière générale, les cellules souches sont présentes chez tous les êtres vivants multicellulaires. Elles jouent en effet un rôle très important dans le développement des organismes ainsi que dans leur maintien.

Il est à distinguer plusieurs types de cellules souches :

• Les cellules souches totipotentes : du zygote au blastomère à huit cellules (au quatrième jour du développement embryonnaire), pouvant donner tous types cellulaires, et donc un organisme entier.

• Les cellules souches pluripotentes, capables de donner tous les types cellulaires sauf les annexes embryonnaires

• Les cellules souches multipotentes, susceptibles de donner différents types de cellules, mais spécifiques d'un lignage cellulaire donné. Elles sont présentes dans l'organisme adulte mais en très petite quantité.

• Les cellules souches unipotentes, qui ne peuvent donner qu'une seule sorte de cellule (elles peuvent cependant, comme toute cellule souche, s'auto-renouveller, d'où l'importance de les distinguer des précurseurs). Elles sont aussi présentes, en très faible nombre, chez l'adulte.

La cellule la plus indifférenciée est donc le zygote ou ovule fécondé, puisque cet œuf va produire l'ensemble des cellules d'un organisme.

Cellule souche embryonnaire de souris.

Un zygote : Spirogyra sp.(zygnematales).

Biologie [modifier]

Articles détaillés : cellule souche animale et méristème.

Historique des découvertes [modifier]

Article détaillé : Cellules souches embryonnaires.

Les travaux initiés par Leroy Stevens et Barry Pierce dans les années 1950 sur l’étude des tératocarcinomes murins ont permis d’isoler les cellules souches embryonnaires (en abrégé ES pour embryonic stem)1. Des cellules capables de générer toutes les cellules sanguines sont découvertes dans la moelle osseuse. La première greffe de moelle osseuse est effectuée en 1958.

Dans les années 60, Joseph Altman 2 , Gopal Das et André Gernez révisent le dogme de la fixité neuronale formulé par Santiago Ramón y Cajal 3 .

En 1981, les cellules souches embryonnaires ont été identifiées chez la souris par Martin Evans, Kaufman et Martin 4,5, et en 1998 chez l’homme par les équipes de l'américain James Alexander Thomson, de Joseph Istkovitz-Eldor et de l'israélien Benjamin Reubinoff 6 ,7. En 2000, ce dernier transforme des cellules ES en neurones8.

Fonctions biologiques [modifier]

• l'organe contenant le tissu doit grandir soit durant la croissance, soit pour pouvoir assurer une fonction, par exemple le cœur des athlètes est plus gros, l'utérus grossit durant la grossesse, etc.

• les cellules vieillissent et meurent (par exemple les globules rouges 9 dont la durée de vie est de 120 jours ou encore les kératinocytes de la surface de la peau) et celles-ci doivent se renouveler.

• un traumatisme, une ischémie, ou d'autres phénomènes peuvent créer la mort de cellules qui doivent être régénérées; cette régénération est parfois imparfaite soit par manque de cellules souches, soit parce que l'architecture du tissu est trop bouleversée (ce qui dépend à la fois du tissu et du dommage qu'il a subi).

Tout tissu animal contient aussi des cellules souches, mais moins « pluripotentes » que celles constituant l'embryon : elles ne pourront pas en général donner en se différenciant un autre type de tissus que celui auquel elles appartiennent déjà (voir Cellule souche animale). Elles peuvent toutefois se différencier dans l'ensemble des cellules d'un tissu donné; par exemple pour le tissu sanguin qui contient les cellules sanguines, les cellules souches hématopoïétique (CSH) permettent à elles seules de recréer toutes les cellules sanguines; le plus souvent, les cellules souches d'un tissu ne sont cependant contenues que dans ce tissu.

Les cellules souches seraient en partie responsables de la régénération des membres chez certains animaux. Ce phénomène fréquent chez les métazoaires existe aussi chez certains vertébrés (comme le lézard, le triton ou la salamandre).

Recherche et bioéthique [modifier]

Article détaillé : cellule souche (médecine).

En médecine, les cellules souches animales et humaines font l'objet de nombreuses recherches depuis les années 1990, avec l'espoir de régénérer des tissus, voire d'en créer de toute pièce, et idéalement de reconstruire des organes (thérapie cellulaire). Ces avantages potentiels ont suscité des expérimentations de clonage thérapeutique pour en maîtriser la fabrication en grand nombre.

En 2007, le professeur Yamanaka (Université de Kyoto) a réussi à produire des cellules souches à partir de cellules somatiques adultes, par l'introduction de facteurs de transcription dans des cellules somatiques via un vecteur présente plusieurs inconvénients[pas clair]. Ces cellules peuvent sous l'action de certains facteurs (également oncogènes) se différencier en divers types de tissus, et on espère dans un futur proche, pouvoir utiliser des cellules souches pour soigner des maladies cérébrales telles que la maladie d'Alzheimer.

Risques et limites ? [modifier]

Les cellules souches ont été récemment mises en cause dans l'origine de cancers. Elles seraient les seules à avoir la possibilité de muter de manière à devenir des cellules cancéreuses, en raison du temps nécessaire à ces mutations - plusieurs années - alors que les cellules différenciées ont une espérance de vie de quelques semaines seulement. Elles sont aussi responsables des récidives de cancers. Ces données jettent donc une ombre sur ces cellules qui ont inspiré beaucoup d'espoirs.

Dans le cas de cancers, une cellule indifférenciée est une cellule qui a perdu son caractère différencié, principalement par le dérèglement du programme génétique spécifique qu'elle

avait acquis. Ainsi une cellule nerveuse cancéreuse, par exemple, ne possède plus les caractères du neurone. Ce phénomène s'accompagne d'une multiplication anarchique car les cellules concernées ne répondent plus aux signaux régulateurs. Il y a perte par exemple de l'inhibition de croissance par contact, un processus stoppant la prolifération d'une cellule lorsque celle-ci établit un contact avec une autre cellule.

Notes et références [modifier]

1. ↑ Prix Nobel de Médecine 2007 : Des souris mutantes à façon [archive]2. ↑ Postnatal Neurogenesis in the Guinea-pig, J Altman & G Das, Nature 214, 1098 - 1101

(10 June 1967) {{doi:10.1038/2141098a0}}3. ↑ Néo-postulats biologiques et pathogéniques, André Gernez, éd. Verschave, Roubaix.,

1968, p. 19. [archive]4. ↑ (en) Nature, 1981, Vol. 292:154-6, Evans and Kaufman, Establishment in culture of

pluripotential cells from mouse embryos [archive]5. ↑ (en) Proc Natl Acad Sci U S A. 1981, 78:7634-8., Martin GR, Isolation of a pluripotent

cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells [archive]

6. ↑ (en) Thomson JA et al. Science 1998, 282:1145-7 Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. [archive]

7. ↑ (en) Nat Biotechnol. 2000, 18:399-404, Reubinoff BE et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. [archive]

8. ↑ Cellules souches : elles repoussent les limites de la vie !, Science et Vie, n°1070, novembre 2006, page 57.

9. ↑ Cas particulier, puisque ce sont des cellules sans noyau et privées d'ADN

Voir aussi [modifier]

Sur les autres projets Wikimédia :

• « Cellule souche », sur le Wiktionnaire (dictionnaire universel)• « Cellule souche », sur Wikinews (actualités libres)

Bibliographie [modifier]

• Max de Ceccatty, Conversations cellulaires, , ed. du Seuil, Paris, 1991 (épuisé, mais disponible dans les bibliothèques; ne parle pas des cellules-souches en elles-mêmes, mais détaille les processus de communication qui les rendent utiles)

Articles connexes [modifier]

• Bioéthique (voir cellule souche (médecine) pour les enjeux concernant précisément ces dernières)

• Cellule souche hématopoïétique • Médecine régénérative

Source : http://fr.wikipedia.org/wiki/Cellule_souche

Cellules souches pluripotentes induites (Cellules iPS)

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Cellules souches pluripotentes ou totipotentes induites (iPS) : une nouvelle source de cellules souches mettant fin au problème éthique ?

L’obtention de lignées de cellules souches à partir d’embryon se heurte toujours à des questions éthiques. Deux équipes de chercheurs ont identifié en juin 2007 chez la souris quatre protéines jouant le rôle de facteurs de transcription suffisant pour reprogrammer une cellule adulte en cellule souche similaire aux cellules souches embryonnaires (1), permettant donc de ne plus utiliser de cellules embryonnaires. Ces deux équipes publient en même temps en novembre 2007 les développements de ces travaux sur des cellules humaines, montrant que l’on peut désormais créer des cellules souches humaines, appelées pluripotentes induites (induced pluripotent stem cells, iPS), à partir des cellules adultes de tout un chacun (2, 3).

L’équipe de S. Yamanaka, de l’Université de Kyoto au Japon, a reprogrammé des cellules de la peau et de tissu conjonctif d’adultes en cellules souches pluripotentes induites. Cette équipe a utilisé des rétrovirus qui en infectant les cellules adultes, insèrent quatre gènes, Oct3/4, Sox2, Klf4, et c-Myc, et les font exprimer par la cellule, alors que l’expression endogène de ces gènes avait été perdue depuis que les cellules s’étaient différenciées de cellules embryonnaires en cellules somatiques (adultes). Apres plusieurs jours, ces cellules transfectées ressemblent à des cellules souches embryonnaires. L’équipe de J. Thomson, de l’Université du Wisconsin aux Etats-Unis, a reprogrammé des cellules de peau fœtales et de nouveau-né en cellules souches pluripotentes induites avec quatre facteurs légèrement différents, Oct3, Sox2, Nanog et Lin28.

Les deux équipes ont montre les analogies de ces cellules souches pluripotentes induites avec les lignées de cellules souches embryonnaires existantes. Comme ces dernières, ces nouvelles cellules iPS induisent des tumeurs (tératomes) chez des souris ne pouvant pas les rejeter lorsqu’elles sont greffées. Ces cellules sont également capables de former les trois types de cellules germinales retrouvées au stade embryonnaire. Leur profile d’expression de gènes est comparable, et plus éloigné des cellules de peau utilisées à l’origine.

La morphologie, les antigènes de surface et les marqueurs épigénétiques de ces cellules iPS sont aussi comparables à ceux des cellules souches embryonnaires, ainsi que leur activité télomerase, l’enzyme responsable d’allonger les télomères et ainsi assurer l’immortalité des cellules. Ces travaux suggèrent donc que l’obtention de cellules souches ne passera peut-être désormais plus par l’obtention de cellules embryonnaires, évitant le problème éthique posé par l’utilisation de cellules embryonnaires et le moratoire sur ce type de recherche décrété par les gouvernements de nombreux pays.

Ces premiers travaux se basaient sur l’utilisation de rétrovirus pour induire l’expression de ces quatre gènes, ce qui posaient le problème de sécurité d’une insertion du génome viral dans un

gène critique pour le bon fonctionnement de la cellule (gène suppresseur de tumeur par exemple), et la dérive de ces cellules en cellules tumorales. Depuis le début de l'année 2009, trois équipes ont démontré qu'en utilisant des éléments génétiques temporaires qui ne s'insèrent pas dans le génome de la cellules (transposons et épisomes), une reprogrammation de ces cellules adultes en cellules souches pouvait être initiée (4, 5).

Apres élimination de l'élément génétique temporaire, le génome des cellules souches iPS est resté semblable à la cellule de départ. Les experts pensent que ces travaux poussent désormais à comparer les cellules iPS obtenues grâce à ces différentes technologies et les lignées de cellules souches embryonnaires, afin d'identifier quelle technologie permet d'obtenir un profil de cellules iPS le plus proche des cellules souches (pluripotence, profil de méthylation ou de compaction de l'ADN, etc.).

Une application des ces nouvelles cellules souches iPS a déjà été démontrée chez la souris pour vaincre la drépanocytose, ou anémie falciforme (6). L’équipe de T. Townes, de l’Université d’Alabama aux Etats-Unis, a travaillé à partir de cellules de peau de souris atteintes de drépanocytose, les reprogrammant en cellules souches iPS. Ces chercheurs ont ensuite corrigé le gène responsable de la maladie, l’hémoglobine, dans ces cellules souches. Apres les avoir différenciées en cellules précurseurs de cellules sanguines, ils ont ré-administré aux souris dépletées de leurs cellules sanguines ces cellules souches corrigées. Ces chercheurs ont alors pu observer que les symptômes de la maladie s’estompaient.

Les cellules souches iPS constituent donc une petite révolution pour l’utilisation thérapeutique de cellules souches, permettant de s’affranchir des limites éthiques des cellules souches embryonnaires. La différenciation de cellules souches iPS par l’une des équipes en cellules cardiaques formant un agglomérat se contractant de façon rythmée, comme un cœur, fait pourtant se poser de nouvelles questions, sur la limite entre des cellules embryonnaires, la capacité à donner la vie et les cellules souches iPS.

D'autres techniques présentées en décembre 2007 proposent aussi de contourner les problèmes éthiques de l'utilisation de blastocytes, en créant des lignées de cellules souches a partir d'œufs forces à dupliquer leur génome (parthénogenèse) pour donner des cellules souches homozygotes.

Références

(1) Wernig M, Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, Bernstein BE, Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 2007 Jul 19;448(7151):318-24. Epub 2007 Jun 6. Article

(2) Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72. Article

(3) Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir

GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 2007 Dec 21;318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov 20. Article

(4) Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, Hämäläinen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M, Kaji K, Sung HK, Nagy A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 2009 Mar 1. Article

(5) Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 2009 Mar 26. Article

(6) Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, Sun CW, Meissner A, Cassady JP, Beard C, Brambrink T, Wu LC, Townes TM, Jaenisch R. Treatment of Sickle Cell Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. Science. 2007 Dec 21;318(5858):1920-3. Epub 2007 Dec 6. Article

A lire également, autres découvertes sur des sujets similaires

- Les dernières découvertes sur les cellules souches

- Les cellules souches iPS comme traitement de la drépanocytose

Source : http://www.questions-science.com/index.php?title=Cellules_souches_pluripotentes_induites_%28iPS%29

Cellules iPS – voir la rubrique ci-dessus Cellules souches pluripotentes induites (Cellules iPS)

Exemple d’application emprunté à l’article : The Methuselah Manifesto - Witnessing the launch of Immortality, Inc.? - Ronald Bailey | November 17, 2009

Schéma de la

IPS cells are created by dosing normal adult cells, say skin cells, taken from a patient with various embryonic

factors that cause it to revert to an earlier stage of development. IPS cells can be transformed into other types of cells which can be used to repair damage or rejuvenate tissues and organs. For example, new hemangioblasts, the precursor cells of blood, could be used to reconstitute and rejuvenate the human immune system.

Source : http://reason.com/archives/2009/11/17/the-methuselah-manifesto

Médecine régénérative – D’après Wikipédia

La médecine régénérative a pour objectif de créer des tissus vivants fonctionnels permettant de remplacer des tissus ou des organes endommagés ou de remédier à des maladies congénitales. La régénération peut se faire in situ par la stimulation des organes endommagés ou en laboratoire (une avancée majeure pour la problématique du don d'organe). Autre intérêt : la résolution du problème du rejet de greffe, puisque la situation est analogue à une isogreffe.

L'utilisation des cellules souches est un élément majeur de la médecine régénérative.

Projet SENS

Article détaillé : SENS.

SENS (Strategies for Engineered Negligible Senescence) est un projet scientifique qui a pour but l'extension radicale de l'espérance de vie humaine. Par une évolution progressive allant du ralentissement du vieillissement, suivi de son arrêt, jusqu'au rajeunissement. Il s'agit de rester jeune plus longtemps que 80 ans.

Articles connexes

• Cellules souches

Source : http://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9decine_r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9rative

Cellules souches de sang de cordon et médecine regénérative.

Par Nico Forraz le jeudi 14 mai 2009, 13:14 - 4-Protocoles de recherche - Lien permanent

Le 21ème siècle sera sans doute celui de la thérapie cellulaire et de la médecine régénérative (ou régénératrice): elles consistent à utiliser des cellules humaines afin de réparer ou d’améliorer les fonctions d’un organe endommagé. Aujourd'hui la recherche travaille sur des cellules souches qui sont d'origines différentes; les résultats obtenus sont très hétérogènes selon les lignées suivantes.

• Les cellules souches embryonnaires : elles sont en général produites à partir

d’embryons humains dits « surnuméraires » suite à une fécondation in vitro. Elle entraine la destruction d’embryons humains, à des fins scientifiques voire thérapeutiques, et pose à ce titre de multiples controverses éthiques..

• Les cellules souches « pluripotentes » induites : aussi appelées cellules « IPS », elles sont fabriquées en laboratoire à partir de cellules adultes comme les cellules de la peau. Le génie génétique permet de transformer ces cellules adultes en cellules souches à des fins de recherche et peut être un jour pour soigner.L’efficacité de cette technique doit être encore améliorée et son innocuité sur le long terme reste à confirmer.

• Les cellules souches adultes, qui sont isolées à partir de tissus adultes tels que la moelle osseuse, les muscles ou bien les graisses, qui gardent l’âge de leur donneur.

• Les cellules souches du cordon ombilical et du sang placentaire : le cordon ombilical attaché au placenta contient deux artères et une veine dans lesquelles circulent le sang placentaire, ou sang de cordon ombilical. Ce sang de cordon contient de nombreuses cellules et en particulier les cellules souches sanguines dites « hématopoïétiques ». Ces vaisseaux sont entourés dans le cordon par la gelée de Wharton.

Les cellules souches du sang placentaire sont utilisées depuis plus de vingt ans pour des greffes dites de « moelle osseuse » : on utilise les cellules souches sanguines afin de reconstituer le système immunitaire ou sanguin d’un patient.

Des recherches prometteuses sur les cellules souches du sang de cordon et du cordon

Notre groupe de recherche, et d’autres depuis, a démontré, qu'il était possible en laboratoire d’obtenir une variété de tissu (les tissus nerveux, hépatiques, pancréatiques, osseux, cartilagineux, adipeux) à partir des cellules souches du sang de cordon ombilical et du cordon ombilical. Il est par exemple possible de créer des petit blocks de tissus nerveux ou de foie qui sur le court terme pourraient être utiles pour tester de nouveaux médicaments et sur le long terme permettraient d’offrir des pistes thérapeutiques pour des patients en souffrance cérébrale ou hépatique. De nouveaux essais thérapeutiques émergent dans ce domaine notamment pour le traitement d’enfants atteints d’infirmité motrice cérébrale ou encore de diabète juvénile qui sont traités aux Etats Unis et bientôt en Allemagne pour des malformations cardiaques avec leurs propres cellules souches issues du cordon ombilical ou de son sang.

Avec plus de 130 millions de naissances dans le monde chaque année et plus de 816 000 en France, le cordon ombilical et son sang forment un réservoir exceptionnel de cellules souches facilement accessibles et sans controverse éthique.

En France il n’est possible de donner le sang de cordon ombilical de son enfant que dans quelques maternités affiliées à une banque publique en faisant un don anonyme et gratuit. Contrairement à la plupart des autres pays européens, la France n’a pas créé de cadre spécifique pour encadrer le développement de biobanques privées. Ainsi de plus en plus de parents font le choix de conserver le sang de cordon ombilical de leur enfant dans une biobanque privée à l’étranger pour une utilisation familiale. Une troisième voie de conservation « familiale solidaire » (développée par exemple par la biobanque Cryo-Save) permet aux parents qui le souhaitent de conserver de manière privée le sang de cordon ombilical de leur

enfant avec la possibilité de mettre ces cellules à disposition d’un patient compatible.

Ces formidables progrès de la recherche et de la médecine ne pourront se développer que si le sang de cordon et le cordon ombilical ne sont plus considérés comme des déchets mais en donnant la possibilité aux parents de conserver ces cellules au sein de bio-banques spécialisées.

Docteur Nico FORRAZ et Professeur Colin McGUCKIN

Institut de Recherche en Thérapie Cellulaire, Parc Technologique de Lyon-Saint Priest, Rhône.

Source : http://bioethique.catholique.fr/index.php?post/2009/05/14/cellules-souches-de-sang-de-cordon-et-m%C3%A9decine-reg%C3%A9n%C3%A9rative.

Nous conseillons vivement de consulter le diaporama suivant Cellules souches et médecine régénérative

Format de fichier: PDF/Adobe Acrobat - Cellules Souches et médecine régénérative Académie vétérinaire de France 21 février ..... Application de la Médecine régénérative par les cellules souches ...www.academie-veterinaire-defrance.org/.../chapelw.pdf

Mutagenese insertionnelle :

Mutation causée par l'insertion de matériel génétique dans un gène déjà présent.

http://www.agrojob.com/dictionnaire/definition-mutagenese-insertionnelle-2503.html

La mutagenèse insertionnelle est une mutagenèse de l'ADN par l'insertion d'une ou plusieurs bases.

Les mutations d'insertion peuvent se produire naturellement, médiée par le virus ou de transposons, ou peut être créé artificiellement à des fins de recherche dans le laboratoire.

Signature Tagged Mutagenesis

Voir aussi Signature mutagenèse tagué

Virus mutagenèse insertionnelle

Comme mentionné dans l'introduction, mutagenèse insertionnelle se réfère à la mutation d'un organisme provoquée par l'insertion de bases d'ADN complémentaires dans l'ADN préexistant de l'organisme. Parce que de nombreux virus (pas tous) d'intégrer leur propre génome dans le génome de la cellule hôte pour se répliquer, mutagénèse provoquée par des infections virales est un phénomène assez courant. Pas tous les virus intégrant cause mutagenèse insertionnelle,

cependant.

Il est important de noter que tous les insertions d'ADN conduiront à une mutation notable. En fait, la plupart ne seront pas. Toutefois, il s'agit d'un accident assez commun dans les insertions de l'ADN viral que les biologistes des recherches de thérapie génique utilisant des virus permettra d'éviter que d'intégrer leur ADN dans le génome de l'hôte quand il n'est pas nécessaire de le faire, optant plutôt pour des virus qui transitoirement exprimer leur ADN (quitter leur flottant librement dans la cellule d'ADN, plutôt que de s'intégrer dans le génome de l'hôte).

Pour ceux qui ne virus intégrer leur ADN dans celui de l'hôte, la gravité de toute mutation qui a suivi dépend entièrement de la localisation dans le génome de l'hôte dans laquelle l'ADN viral est inséré. Si l'ADN est insérée au milieu d'un gène essentiel des effets sur la cellule sera drastique. En outre, l'insertion dans la région du promoteur d'un gène peut provoquer des effets tout aussi drastiques. Par exemple, si l'ADN viral est inséré dans un répresseur, le gène correspondant à ce promoteur peut être surexprimé - conduisant à une surabondance de son produit et modification de l'activité cellulaire. Si l'ADN est insérée dans une région enhancer, le gène peut être sous-exprimés - entraînant une absence relative de son produit, ce qui peut considérablement interrompre l'activité de la cellule.

La modification des gènes différents ont des effets variables sur la cellule. Toutes les mutations de façon significative l'effet de la prolifération de la cellule. Toutefois, si l'insertion a lieu dans un gène essentiel ou un gène qui est impliqué dans la réplication cellulaire ou la mort cellulaire programmée, l'insertion peut compromettre la viabilité de la cellule ou même causer la cellule de reproduire interminablement - conduisant à la formation d'une tumeur, qui peuvent devenir cancéreuses.

Voici un exemple d'un changement important dans l'activité des cellules due à l'insertion d'un gène viral dans une partie du génome qui contrôle la réplication hôtes.

La mutagenèse insertionnelle des Virus est seulement possible avec un virus réplicatif. Le virus insère un gène (appelé onocogene virale) normalement près de la myc cellulaire (c-myc) gène. Le gène c-myc est normalement désactivé dans la cellule, mais quand il est allumé, il est capable de pousser la cellule dans la phase G1 du cycle cellulaire et provoquer la cellule pour commencer la réplication qui permet le gène viral à répliquer. Après de nombreuses répétitions où le gène viral reste tumeurs latentes commencent à croître. Ces tumeurs sont généralement issus d'une mutation / cellule transformée (clonale d'origine). virus de la leucose aviaire est un exemple d'un virus qui provoque une maladie par mutagenèse insertionnelle. Des poussins nouvellement éclos infectés par le virus de la leucose aviaire va commencer à former des tumeurs commencent à apparaître dans leur bourse de Fabricius (comme le thymus humain). Cette insertion des gènes viraux est également connue comme l'insertion d'un promoteur car il entraîne l'expression du gène c-myc. Il est un exemple d'un événement de mutagenèse insertionnelle provoqué par un rétrotransposon dans le génome humain où il provoque Fukuyama type dystrophie musculaire.

inactivation insertionnelle

L’inactivation insertionnelle est une technique utilisée dans l'ingénierie d'ADN recombinant, où un plasmide (comme pBR322) est utilisé pour désactiver l'expression d'un gène.

L'inactivation d'un gène en insérant un fragment d'ADN dans le milieu de sa séquence codante. Tous les produits futurs du gène inactivé ne fonctionnera pas parce que des codes supplémentaires ajoutés. pBR322 principalement à deux sites d'antibiotiques qui sont amphicilin et la région tétracycline.

http://dicotop.kegtux.org/mutagen%C3%A8se_insertionnelle

Insertional mutagenesis approaches and mechanisms.

From the following article : Insertional mutagenesis in mice: new perspectives and tools Corey M. Carlson & David A. Largaespada Nature Reviews Genetics 6, 568-580 (July 2005) - doi:10.1038/nrg1638

Various approaches have been used to mutate genes by insertional mutagenesis, including replacement and insertion vectors. a | Traditional gene-targeting by homologous recombination involves the careful design of vectors that contain two homology arms to create defined mutations in a gene of interest. Areas noted 1–4 are exons. b | The Velocigene system from Regeneron Pharmaceuticals exploits BAC vectors (BACvecs) to rapidly generate gene knockouts. BACvecs have two very long homology arms that target the specified locus more efficiently than traditional targeting vectors and they can create large deletions. The Velocigene system removes the entire gene on targeting11. c |

The mutagenic and chromosome engineering resource (MICER) is a collection of insertion vectors that target specific loci using a single homology arm and that exploit cellular gap repair pathways. MICER vector insertion results in a genomic duplication of endogenous sequences, resulting in mutation of a targeted gene12. d | Gene traps can be delivered on a plasmid, retrovirus or transposon to integrate within genes and elicit endogenous splicing disruption using elements within the trap15, 16. pA, polyadenylation signal; SA, splice acceptor.

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• © 2011 Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved.

• partner of AGORA, HINARI, OARE, INASP, CrossRef and COUNTER

Source : http://www.nature.com/nrg/journal/v6/n7/fig_tab/nrg1638_F1.html

Pluripotence

La pluripotence est la faculté de certaines cellules à se différencier en tout type cellulaire d'un organisme: cellules d'un des trois feuillets embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme ), cellules du trophectoderme 1 ou cellules germinales.

Photo d’une colonie de la lignée de cellules souches embryonnaires humaine HD90 dérivée au CHRU de Montpellier.

Ceci les différencie des cellules souches unipotentes, multipotentes, et totipotentes.

Eléments de définition [modifier]

Les cellules pluripotentes ne peuvent pas produire un organisme entier car elles prolifèrent et se différencient de manière anarchique. In vitro, elles forment spontanément des corps embryoïdes.

Les trois types de cellules souches pluripotentes décrites à ce jour de manière reproductibles sont :

• les cellules souches embryonnaires (CSE) ;• les cellules souches pluripotentes induites (IPS) ;• les cellules MUSE (pour Multilineage-differentiating Stress Enduring 2), trouvées dans la

peau et la moelle osseuse (1 cellule sur 5000 environ) des adultes.

Biologie [modifier]

Obtention [modifier]

Les cellules souches embryonnaires sont isolées in vitro à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste (au 5 ou 6ème jour pour l’embryogénèse humaine). Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont issues de la reprogrammation de cellules somatiques adultes en cellules pluripotentes par la surexpression de certains facteurs de transcription.

Marqueurs [modifier]

Il existe un certain nombre de marqueurs de surface relativement spécifiques des cellules pluripotentes tels SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (chez l’homme) ou SSEA-1 (chez la souris). L'activité phosphatase alcaline est également un bon marqueur des cellules souches pluripotentes indifférenciées. Récemment de nouveaux marqueurs ont été mis en évidence à l'aide des puces à ADN: CD24, SEMA6A, FDZ7 3.

Facteurs de transcription [modifier]

Les cellules souches pluripotentes se caractérisent par une forte expression des facteurs de transcription OCT4/POU5F1, NANOG 4,5.et SOX2. Ces trois facteurs de transcription constituent le « core transcriptional regulatory circuitry »6.

Facteurs de croissance [modifier]

Le Leukemia Inhibitory Factor (LIF)7 et les Bone morphogenetic proteins (BMPs) 8 sont nécessaires pour la culture des cellules souches pluripotentes de souris. En revanche, le bFGF est requis dans le milieu de culture pour le maintien de la pluripotence des cellules souches pluripotentes humaines, tandis que les BMPs induisent une perte de leur pluripotence (différenciation).

Applications [modifier]

Recherche [modifier]

L'étude des cellules souches pluripotentes permet une meilleure connaissance des premiers stades du développement embryonnaire. Les lignées de cellules souches pluripotentes génétiquement anormales constituent un modèle d'étude des maladies génétiques rares. Elles peuvent également permettre de tester de nouveaux médicaments.

Médecine [modifier]

Les cellules souches pluripotentes pourraient être une source très intéressante de cellules pour une médecine régénératrice : amplification in vitro illimitée, possibilité de différenciation en n’importe quel type cellulaire. Elles ouvrent la voie à une thérapie cellulaire de la maladie de Parkinson, du diabète, de l'infarctus du myocarde, etc. Les principales limites à ces applications pour l'instant sont: la formation de tératomes due à leur prolifération intense et non régulée lorsqu'elles sont injectées à l’état indifférencié, la difficulté à obtenir des cellules matures capables de réparer l’organe endommagé et le problème de la compatibilité immunologique d'où l'intérêt majeur des iPS (cellules souches pluripotentes induites). Les cellules souches pluripotentes pourraient également avoir un intérêt en thérapie génique.

Éthique et législation [modifier]

La recherche sur les cellules souches pluripotentes a accusé un retard en France du fait de l'interdiction de recherche sur les embryons humains depuis la loi de bioéthique de 1994. En 2004, cette loi a été révisée 9: l'interdiction est maintenue avec néanmoins la possibilité pour les équipes de recherche d'obtenir une dérogation pour cinq ans sous certaines conditions: « les recherches peuvent être autorisées sur l'embryon et les cellules embryonnaires lorsqu'elles sont susceptibles de permettre des progrès thérapeutiques majeurs et à condition de ne pouvoir être poursuivies par une méthode alternative d'efficacité comparable, en l'état

des connaissances scientifiques ». Les embryons doivent avoir été conçut dans le cadre d'une AMP et il faut l'accord des deux parents. Le tout est encadré par l'Agence de la biomédecine. La découverte des iPS permet aux chercheurs de conduire une recherche sur les cellules souches pluripotentes sans travailler sur l’embryon. Cependant, les iPS et les cellules souches embryonnaires sont similaires mais pas identiques: il reste à caractériser ces différences et comprendre leur impact en vue d'une médecine régénératrice.

Voir aussi [modifier]

Articles connexes [modifier]

• Totipotence (La totipotence est la propriété d’une cellule de se différencier en n’importe quelle cellule spécialisée et de se structurer en formant un être vivant multicellulaire).

• Cellules souches ; Une cellule souche est une cellule d'un être multicellulaire capable à la fois de se renouveler tout au long de la vie (autorenouvellement) et de se différencier en un ou plusieurs types cellulaires spécialisés différents.

Liens externes [modifier]

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Notes et références [modifier]

1. ↑ (en) Interaction between Oct3/4 and Cdx2 Determines Trophectoderm Differentiation.Hitoshi Niwa. Cell 2005 123:917–929 [archive]

2. ↑ Type cellulaire récemment découvert, isolé et cultivé au Japon par l'équipe du Pr. Mari DEZAWA (Université du Tohoku) ; source : ADIT, BE Japon 536 [archive] du 2010/04/23

3. ↑ (fr) Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l’embryon humain à la médecine régénératrice de demain. De Vos J,et al. Gynecol Obstet Fertil. 2009 Jul-Aug;37(7-8):620-6. Epub 2009 Jul 4 [archive]

4. ↑ (en) Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Nichols J,et al. Cell. 1998 Oct 30;95(3):379-91 [archive]

5. ↑ (en) The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Mitsui K,et al. Cell. 2003 May 30;113(5):631-42 [archive]

6. ↑ (en) Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. BOYER LA,et al. Cell 2005 Sep 23;122(6):947-56 [archive]

7. ↑ (en) Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Williams RL,et al. Nature. 1988 Dec 15;336(6200):684-7 [archive]

8. ↑ (en) BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Ying QL,et al. Cell. 2003 Oct 31;115(3):281-92 [archive]

9. ↑ loi n°2004-800 du 6 août 2004 relative à la bioéthique [archive]

Source : http://fr.wikipedia.org/wiki/Pluripotence

Réponse immunitaire – D’après l’Encyclopédie médicale Larousse

Ensemble des mécanismes permettant à un organisme de se défendre contre une substance

étrangère (antigène) menaçant son intégrité.

DIFFÉRENTS TYPES DE CELLULE IMMUNOCOMPÉTENTE

La réponse immunitaire met en jeu plusieurs types de cellules, dites immunocompétentes, appartenant à la famille des leucocytes. Elles interviennent en cas d'échec des premières lignes de défense de l'organisme (immunité non spécifique), constituées par les cellules phagocytaires (les polynucléaires et les macrophages), chargées d'absorber et de détruire les micro-organismes, et par les molécules (système du complément) dont les différents composants facilitent la captation de ces micro-organismes par les cellules phagocytaires.

— Les lymphocytes B, issus de la moelle osseuse, ont pour mission principale de produire des anticorps, ou immunoglobulines, en très grande quantité après s'être transformés en plasmocytes sous l'influence de cytokines (molécules solubles permettant aux cellules de communiquer entre elles). Ils possèdent à leur surface des éléments de reconnaissance des antigènes (récepteurs d'antigènes) sous la forme d'immunoglobulines ancrées dans la membrane cellulaire. Le lymphocyte B, capable de reconnaître un antigène grâce à ses immunoglobulines de membrane, sécrète alors des anticorps ayant les mêmes propriétés de se lier à l'antigène et donc de le neutraliser ou de faciliter son élimination. Certains d'entre eux conservent cette propriété des mois, voire des années après leur rencontre avec l'antigène : ils sont appelés pour cette raison lymphocytes « mémoire ».

— Les lymphocytes T proviennent eux aussi de la moelle osseuse, mais leur maturation a lieu dans le thymus. Ils représentent la majorité des lymphocytes du sang (80 %). On distingue plusieurs sous-populations de lymphocytes T : les lymphocytes T-auxiliaires (T CD4 ou T4) assurent la coordination entre les différentes cellules jouant un rôle dans la réponse immunitaire ; les lymphocytes T cytotoxiques (T CD8) ont pour fonction de détruire sélectivement les cellules infectées. Comme les lymphocytes B, les lymphocytes T possèdent des structures de reconnaissance, ou récepteurs, grâce auxquelles chacun d'entre eux reconnaît un antigène unique. Il existe en outre des lymphocytes T dits suppresseurs dont le rôle est de contrôler la réponse immunitaire. On a longtemps pensé qu'il s'agissait d'une partie des lymphocytes T CD8, or il s'est avéré que la population des lymphocytes T CD4 comportait une famille de lymphocytes T CD4 que l'on appelle lymphocytes T-régulateurs, mais qui sont des lymphocytes T-suppresseurs.

Dans la mesure où toute l'information nécessaire au bon déroulement d'une réponse immunitaire dépend des lymphocytes T-auxiliaires, leur destruction sélective dans l'infection par le V.I.H. (virus de l'immunodéficience humaine) conduit inéluctablement à un déficit immunitaire caractéristique du sida (syndrome d'immunodéficience acquise).

— Les macrophages sont des cellules phagocytaires, capables comme les polynucléaires d'absorber et de détruire les antigènes, mais qui possèdent en outre une fonction essentielle : celle d'informer les lymphocytes T de la présence d'une substance étrangère dont l'élimination nécessite la mise en œuvre d'une réponse immunitaire spécifique et adaptée. Ils jouent le rôle de cellules présentatrices d'antigène aux autres éléments du système immunitaire.

DÉROULEMENT DE LA RÉPONSE IMMUNITAIRE

Une substance étrangère déclenche une réaction immunitaire lorsqu'elle est présentée aux lymphocytes T par une cellule, le plus souvent un macrophage, qui la phagocyte, la digère et en sélectionne des fragments (peptides antigéniques), qu'elle expose sur sa membrane, associés à des molécules de « présentation », les molécules HLA du système d'histocompatibilité.

Chaque lymphocyte T ne reconnaît qu'un seul antigène : la réponse est ici dite spécifique. Celle-ci est plus longue à se mettre en place que la réponse non spécifique, mais elle est plus efficace. Les lymphocytes T auxiliaires, qui reconnaissent l'antigène qui leur est présenté, sont alors activés et sécrètent des cytokines, qui se comportent à la fois comme des facteurs de croissance, à l'origine de la multiplication des lymphocytes T et B spécifiques de l'antigène, et comme des facteurs de différenciation, permettant la production d'anticorps (réponse immunitaire humorale) ou l'activation de cellules (réponse immunitaire cellulaire). Certains d'entre eux constituent une population de cellules dites « mémoire », support d'une protection acquise contre une agression ultérieure par le même antigène.

— La réponse immunitaire humorale, qui repose sur les lymphocytes B, est dirigée contre des antigènes libres, toxines ou micro-organismes. Cette réponse est favorisée par les lymphocytes T-auxiliaires, ou T-helper, de type 2. Elle aboutit à la production de grandes quantités d'immunoglobulines, qui se diffusent dans le sang (IgM), dans les tissus (IgG) et dans les muqueuses (IgA) et dont la synthèse et la nature dépendent de certaines cytokines, notamment les interleukines IL4, IL5 et IL10, sécrétées par les lymphocytes T-auxiliaires (on connaît aujourd'hui 35 interleukines). Ces immunoglobulines sont aptes à neutraliser les toxines, à empêcher l'infection par de nouveaux virus et à faciliter la capture de tous les agents infectieux par les cellules phagocytaires, qui les détruiront.

— La réponse immunitaire cellulaire fait intervenir soit des lymphocytes T cytotoxiques, ayant acquis la capacité de détruire des cellules de l'organisme vues comme étrangères lorsqu'elles hébergent des agents infectieux (virus), soit des macrophages, dont les capacités d'élimination des micro-organismes sont amplifiées. Cette réponse est favorisée par les lymphocytes T-auxiliaires, ou T-helper, de type 1. Ces deux types cellulaires sont sensibles à des cytokines, comme l'interleukine IL2 et l'interféron gamma (IFN), qui sont synthétisées par les lymphocytes T-auxiliaires et qui vont leur permettre d'acquérir ces propriétés, dites effectrices.

Source : http://www.larousse.fr/encyclopedie/medical/r%C3%A9ponse_immunitaire/15829

Reprogrammation cellulaire – Définition de Futura-Sciences

La reprogrammation cellulaire est un processus artificiel qui permet de modifier l'état d'une cellule.

Dans son état normal, la cellule exprime des gènes de manière régulée. Chaque cellule du corps humain possède le même génome, mais l'expression des gènes est différente en fonction du rôle de la cellule (cellule du foie, du cœur...) ou de son contexte environnemental (en division cellulaire, attaquée par un microbe...).

La reprogrammation cellulaire consiste en la modification de l'expression des gènes, par exemple pour transformer une cellule adulte en cellule pluripotente.

Source : http://www.futura-sciences.com/fr/definition/t/biologie-4/d/reprogrammation-cellulaire_6293/

Thérapie génique - La thérapie génique est une méthode thérapeutique, pour l'heure expérimentale, qui repose sur une idée simple : si un gène est responsable d'une maladie, il suffit de remplacer le gène défectueux par le gène intact pour guérir la maladie. La thérapie génique utilise des gènes comme médicaments pour traiter certaines maladies génétiques ou pour modifier un comportement cellulaire. Il s’agit de transférer des gènes dans les cellules des patients afin de produire des protéines thérapeutiques spécifiques nécessaires pour combattre ou corriger les maladies visées.Aujourd'hui, quand on parle de thérapie génique, il s'agit de la thérapie génique somatique : des gènes sont introduits exclusivement dans des cellules somatiques, c'est à dire non sexuelles.

Si l'expérience est portée sur des cellules sexuelles, il s'agit de thérapie génique germinale. Cette une technique qui n'est pas encore maîtrisée. Elle consisterait à appliquer la thérapie génique à un embryon au stade précoce ou aux cellules germinales d'un adulte (ovule ou spermatozoïdes). Le gène introduit serait alors transmis à toutes les cellules du futur individu modifiant son patrimoine génétique. Cette méthode pose des problèmes éthiques, notamment parce qu'elle touche au patrimoine héréditaire de l'homme. Pour plus d'informations, consultez :

Fiche pédagogique

La thérapie génique : qu’est-ce que c’est, comment ça marche ?

Textes officiels

AvisAvis n°4 du groupe européen d'éthique (GEE) sur les aspects éthiques de la thérapie génique, 13/12/1994Avis n°36 du CCNE sur l'application des procédés de thérapie génique somatique, 22/06/1993Avis n°22 du CCNE sur la thérapie génique, 13/12/1990Lois

Loi de bioéthique du 6 août 2004Loi n° 96-452 du 28 mai 1996, portant diverses mesures d'ordre sanitaire, social et statutaire concerne le statut et le développement des produits de thérapies géniques et cellulairesLa loi du 29 juillet 1994 relative au respect du corps humainLoi 94-630 du 25 juillet 1994 modifiant le livre II bis du Code de la santé publique relatif à la protection des personnes qui se prêtent à des recherches biomédicalesLoi n° 88-1138 du 20 décembre 1988, relative à la protection des personnes qui se prêtent à des recherches biomédicales modifiée par la loi 94-630 du 25 juillet 1994RapportsRapport des Académies de Médecine et de pharmacie "La thérapie génique : bilan et perspectives", novembre 2001Rapports du Comité International de Bioéthique de l'Unesco sur la thérapie génique

Les bulletins Gènéthique sur ce thème

Thérapie génique, des succès isolés ?, n°1Coup d'arrêt pour la thérapie génique ?, n°2

Le Téléthon : quel espoir pour quelle maladie ?, n°12Essais interrompus : quel avenir pour la thérapie génique ?, n°34

L’Europe réglemente les thérapies du futur : quelle éthique ? n°89

La revue de presse pour consulter tous les articles parus sur ce sujet.

Source à consulter http://www.genethique.org/doss_theme/dossiers/therapie_genique/acc.therapie.htmTransplantation nucléaire ou transfert de noyau

Synonymes de TRANSPLANTATION NUCLEAIRE

Transplantation nucléaire (n.) (Cismef)

Technique de transfert nucléaire de cellules somatiques (Cismef), Techniques de transfert nucléaire (Cismef), Transfert nucléaire (Cismef), Transfert nucléaire somatique (Cismef), Transplantation nucléaire somatique (Cismef)

Transplantation nucléaire somatique (n.) (Cismef)

Technique de transfert nucléaire de cellules somatiques (Cismef), Techniques de transfert nucléaire (Cismef), Transfert nucléaire (Cismef), Transfert nucléaire somatique (Cismef), Transplantation nucléaire (Cismef)

Source : http://dictionnaire.sensagent.com/transplantation+nucl%C3%A9aire/fr-fr/

Schéma d’une expérience de transplantation nucléaire chez la souris

Source : http://jeanmarc.darrigan.free.fr/portables/svtnet/l1html/chromosomes/activites/transpla.html

Transfert nucléaire de cellules somatiques chez le bétail et les chevaux d'élevage

Document Organisation Mondiale de la Santé Animale

Article 4.11.1.

Préface

Suite à la première réunion du Groupe ad hoc de l'OIE sur la biotechnologie qui s’est tenue du 3

au 5 avril 2006, la Commission des normes biologiques de cette Organisation a suggéré de limiter le mandat « à l’élaboration de recommandations relatives aux risques que constituent pour la santé animale le clonage par transfert nucléaire de cellules somatiques (TNCS) des animaux de rente, y compris les critères d’évaluation de la santé des embryons et des animaux issus de ce clonage ». Les recommandations qui suivent sont une amorce permettant l’identification et la caractérisation des risques pour la santé animale associés à la technologie du clonage par TNCS, ainsi qu’une base de discussion sur ces risques.

Article 4.11.2.

Généralités

Lors de la première réunion du Groupe ad hoc sur la biotechnologie, il a été recommandé que le Sous-groupe chargé des biotechnologies de la reproduction animale rédige des recommandations sur l’analyse des risques réalisée selon le principe du cycle de vie pour les animaux issus de la biotechnologie. Il a été proposé de définir les « Biotechnologies de la reproduction animale » comme étant « la production d’animaux grâce à l’utilisation des technologies de reproduction assistée (TRA), qui vont de l’insémination artificielle aux techniques faisant appel à une composante in vitro importante, telles que la fécondation in vitro, le transfert d’embryons, la scission d’embryon et englobant la reproduction asexuée telle que le transfert nucléaire ». Les recommandations qui suivent sont limitées au clonage par TNCS, et reposent sur une analyse des risques appliquée aux animaux issus des biotechnologies subdivisés en catégories selon le principe du cycle de vie qui suit le schéma suivant : i) embryons, ii) receveurs, iii) descendance, iv) progéniture des animaux clonés.

Article 4.11.3.

Champ d’application

Les présentes recommandations portent sur les aspects liés à la santé des animaux de rente issus de certaines biotechnologies de la reproduction.

Compte tenu du mandat qui a été assigné à l’OIE et de la suggestion de la Commission des normes biologiques de cette Organisation, le Groupe ad hoc sur la biotechnologie recommande d’identifier les paramètres de l’analyse des risques pour la santé animale et leurs conséquences sur la sécurité de l’environnement et la sécurité sanitaire des denrées alimentaires et des produits d’alimentation animale. Les présentes recommandations seront initialement axées sur les critères scientifiques appliqués à l'évaluation des risques, aux mesures de prévention et aux conseils en matière d’animaux de rente et de chevaux issus du clonage par TNCS. Cette orientation initiale n’exclut nullement l’ajout de questions importantes à un stade ultérieur. À l’heure actuelle, les présentes recommandations englobent les points suivants :

• identification des risques pour la santé animale et recommandations relatives à la gestion de ces risques chez les embryons, les receveurs, les animaux clonés et la progéniture des animaux clonés ;

• risques et mesures de prévention liés aux techniques de clonage par TNCS ;• quelques questions liées au bien-être des animaux.

Sachant en outre que les questions suivantes ont été prises en compte par d'autres instances ou instruments, ou sont susceptibles de l'être, ou encore qu’elles pourront être traitées ultérieurement par l’OIE, le document ne traite pas des points suivants :

• sécurité sanitaire et aspects nutritionnels des aliments issus des technologies de reproduction assistée, tels que les aliments transgéniques (traités par le Codex)

• risques liés à l’introduction dans l’environnement d’animaux clonés .• risques liés aux animaux transgéniques qui n’ont pas été obtenus par transfert

nucléaire de cellules somatiques ou autres techniques de clonage ;• biotechnologies appliquées aux animaux non reproducteurs ;• risques liés aux animaux produits à des fins de xénotransplantation ou comme donneurs

d’organes ;• technologies liées aux cellules souches ;• risques lié à la santé des animaux aquatiques, y compris les poissons clonés ;• risques liés aux autres animaux terrestres tels que les animaux sauvages (mammifères

et autres), y compris les volailles et les insectes.

Article 4.11.4.

Cadre général : analyse de risque – principes généraux

1. En général, l’analyse de risque comporte l’identification des dangers, l’appréciation du risque, la gestion du risque et la communication relative au risque. L’appréciation du risque est le volet de l’analyse qui permet d’estimer les risques associés à un danger (voir chapitre 2.1.). Ces principes sont systématiquement utilisés par les organismes de surveillance pour prendre des décisions concernant les rejets expérimentaux ou commerciaux. Ces analyses peuvent ensuite être utilisées pour déterminer si les résultats obtenus appellent une gestion ou une réglementation. La gestion du risque est la démarche par laquelle les experts évaluent les autres actions ou politiques possibles en réponse au(x) résultat(s) de l’appréciation du risque en prenant en compte les différents aspects sociaux, économiques et juridiques qui constituent le cadre dans lequel ces activités se déroulent.

2. Pour ce qui est des maladies animales, en particulier celles figurant dans le Code terrestre, un accord général existe sur la nature des risques potentiels ; ces risques peuvent être qualitatifs ou quantitatifs (voir chapitre 2.1.). Dans les scénarios de maladie, il est plus probable qu'une appréciation qualitative du risque soit la seule requise. Les évaluations qualitatives ne nécessitent pas de recourir à une modélisation mathématique pour procéder aux prises de décision courantes. Les appréciations quantitatives ou semi-quantitatives attribuent aux risques une valeur numérique (par exemple, 1/1 000 000) ou descriptive (élevé/moyen/faible).

3. Dans le contexte du clonage animal, on distingue deux grandes catégories d'appréciation du risque : l’appréciation du risque absolu et l’analyse comparée des risques. L’appréciation du risque absolu permet de caractériser le risque sans le rapporter à un élément de comparaison (par exemple, la probabilité qu’un animal transmette une maladie du bétail donnée). L’analyse comparée des risques (ou appréciation du risque relatif) place le risque dans le contexte d’une comparaison : par exemple, la probabilité qu'un animal produit par une technique de reproduction transmette une maladie donnée à un autre animal de la même espèce comparée à la probabilité qu’un animal similaire produit par une autre technique de reproduction transmette la même maladie à un autre animal de la même espèce.

4. Quelle que soit la méthodologie employée, l’identification des dangers constitue une étape préliminaire dans toutes les appréciations du risque fondées sur des critères scientifiques. Dans le cadre de l’appréciation des risques associés au clonage animal (TNCS), de l’embryon au développement de l’animal cloné puis à la descendance, il est important d'affirmer clairement à ce stade que seule une appréciation comparative

semi-quantitative du risque peut être réalisée. L'appréciation systématique, absolue, quantitative des risques potentiels est difficile en raison du caractère relativement nouveau de la technologie et de la variabilité des résultats selon les laboratoires et les espèces clonées. En outre, avec la technique du TNCS, il n’existe aucun danger découlant de l’introduction de nouveaux gènes (ce qui peut se produire dans le cas de la transgénèse). En conséquence, l’analyse des facteurs qui contribuent aux risques pour la santé animale passe par l’analyse des éléments de référence existants.

5. En résumé, il faut identifier les points spécifiques sur lesquels doit être axée l’appréciation du risque. Comme l’illustre le diagramme ci-joint – l’accent est mis sur l’examen des éléments essentiels de la création d’un embryon – selon la terminologie actuelle, en commençant par la sélection du donneur d’ovocyte et des cellules pour aller jusqu’à la création d’un embryon par la méthode du clonage. La deuxième phase sera axée sur le receveur de l’embryon cloné et les aspects liés à la santé et aux soins des animaux. Le clone d’embryon qui représentera une descendance constitue la troisième partie du système dont l'évaluation nécessite des recommandations claires, et la génération suivante, soit la descendance de l'animal cloné (qui est le fruit d’une reproduction sexuée normale), soit les animaux produits par reclonage (clones de clones), est la quatrième et dernière étape.

Article 4.11.5.

Gérer les risques pour la santé animale associés aux embryons

La production d’embryons par des techniques in vitro existe depuis de nombreuses années. Bien que les étapes supplémentaires que comporte le clonage confèrent une nouvelle dimension à cette technique, nombre de risques associés au TNCS ont été antérieurement identifiés pour des biotechniques de reproduction animale bien établies (voir chapitre 4.8.). Une analyse de la méthodologie appliquée au TNCS permet de classer comme suit les éléments de l'opération :

a. Ovocytes (obtenus à l’abattoir, recueillis par ponction transvaginale échoguidée ou par laparotomie)

Les ovaires qui font l’objet d’un prélèvement dans un abattoir doivent être prélevés, transportés et traités conformément aux recommandations exposées dans le chapitre 4.8.

Les principaux risques sont associés à l’état de santé de l’animal chez lequel les ovaires sont prélevés et à la qualité des ovocytes.

b. Cellules donneuses (cellules obtenues chez l’animal choisi pour qu’il soit cloné – par biopsie, recueillies à l’abattage ou après la mort)

Actuellement, on ne constate aucun nouveau risque spécifique lié au clonage par TNCS. On a suggéré l’existence d’un risque lié à l’activation de rétrovirus endogènes lors des techniques de transfert cellulaire, mais ce risque pourrait être plus théorique que réel. Dans certaines techniques expérimentales actuelles, la cellule donneuse peut être traitée par des agents chimiques pour modifier sa composition, par exemple par inhibiteurs de cycle cellulaire ou modificateurs de la chromatine.

c. Mise en culture in vitro des embryons reconstruits (technique utilisée pour la fusion du matériel du donneur et du receveur et pour la mise en culture de l'embryon reconstruit)

d. Risques associés à la méthode de fusion des cellules donneuses avec des ovocytes receveurs énucléés et en conditions de culture.

En outre, le manipulateur doit veiller à ce que la gestation du clone soit compatible avec la race, l’anatomie et la physiologie de la mère de remplacement.

1. Ovocytes

Le laboratoire ou le producteur doit établir un dossier détaillé relatif aux ovaires – leur origine, l’état de santé de l’animal chez lequel ils ont été obtenus, les informations sur les lésions systémiques présentes sur l’animal et les données adaptées relatives au troupeau. Ces renseignements sont particulièrement utiles lorsque le mélange des ovaires est susceptible de donner lieu à une contamination croisée du tissu ovarien.

Les liquides folliculaires peuvent contenir différents agents infectieux tels que le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) et peuvent contaminer le liquide folliculaire mélangé provenant d’animaux sains. En outre, le choix de la technique permettant le recueil des ovocytes, telles que l’aspiration ou le découpage en tranches des follicules ovariens, détermine le degré de contamination sanguine ou la quantité de matériel étranger. Il convient de recueillir un échantillon représentatif pour démontrer l’absence de matériel biologique infectieux pour chaque lot mélangé.

Les ovocytes sont amenés à maturation en tant que complexes ovocytes-cumulus (COC) puis placés dans la plupart des cas dans un milieu de culture ou maturation. Il faut apporter un soin et une attention tous particuliers à la sélection et à la maturation des ovocytes issus des mélanges qui sont satisfaisants d'un point de vue morphologique ; de même, la qualité du milieu utilisé doit avoir été testée. Il faut s’abstenir d’utiliser des éléments sériques ou protéiques provenant d’une source non définie ou non testée. L’ajout d’antibiotiques adaptés et sans danger dans les milieux de culture pour empêcher la prolifération de bactéries opportunistes doit être encouragé.

L’application de mesures sanitaires ou de méthodes de désinfection adaptées revêt une importance capitale, et doit être privilégiée dans tout laboratoire de fécondation in vitro (FIV). La manipulation correcte et le respect des protocoles sanitaires lors de la maturation et de la mise en culture ultérieure des embryons doivent être encouragés.

2. Cellules donneuses

Afin de réduire les risques, il faut respecter ce qui suit :

o Les cellules donneuses doivent être recueillies comme il convient à partir de l’animal et mises en culture dans les conditions sanitaires appropriées selon les bonnes pratiques de laboratoire.

o Le cas échéant, le repiquage des cellules utilisées pour la procédure de clonage doit être documenté et un échantillonnage peut s'avérer nécessaire à différentes étapes pour rechercher la présence d'éléments chromosomiques des lignées cellulaires. Si possible, il doit exister des procédures permettant

l’échantillonnage régulier des cellules pour mettre en évidence des caractéristiques morphologiques ou autres.

o Les lignées de cellules souches (destinées au clonage à une étape ultérieure) doivent être conservées dans des conditions jugées optimales pour le maintien de leur viabilité. L’absence d’agents étrangers doit être établie en recherchant la présence de bactéries, de champignons, de mycoplasmes ou de virus, à l’aide de tests appropriés (voir Manuel de la Société internationale de transfert d’embryons).

o3. Techniques de clonage ou reconstruction

La méthode de clonage qui fait appel à l’utilisation d'agents chimiques ou d’autres réactifs doit être soigneusement évaluée en termes de qualité des embryons et d’efficacité globale.

La fusion entre le matériel du receveur et du donneur par des moyens chimiques et physiques exige attention et minutie. Il faut déterminer l’optimisation du mode opératoire sur la base des protocoles de laboratoire ou des rapports publiés pour éviter une mortalité embryonnaire précoce.

Si une co-culture de la cellule est réalisée pour la mise en culture après reconstruction des embryons, un dépistage approprié des cellules de co-culture doit être effectué. On peut rechercher dans un échantillon de chaque lot la présence de bactéries, champignons, mycoplasmes ou virus.

Les embryons doivent être mis en culture et collectés pendant un laps de temps approprié en vue de leur transfert ou de leur cryoconservation pour un usage ultérieur. Il faut suivre les modes opératoires basés sur les normes internationales (Codes d’usages de la Société internationale de transfert d’embryons) pour le lavage et la conservation des embryons.

Il faut veiller à ce qu’un certain nombre de conditions soient respectées concernant la qualité des embryons avant transfert (voir chapitres 4.7. et 4.8.).

Article 4.11.6.

Gestion des risques pour la santé animale liés aux receveurs (mères de substitution)

1. Risques pour la santé animale chez les mères de substitution

Actuellement la gestation dans le cadre du TNCS, comparée aux embryons produits in vitro, est associée à un taux élevé d’échecs et, chez certaines espèces, cette technique est à l’origine d’anomalies placentaires. Les pertes dues à des anomalies des embryons ou à l’échec de l’implantation dans l’utérus de la mère de substitution ne représentent pas un danger pour la mère. Dans ces cas, on observe simplement chez la mère de substitution une résorption de tous les tissus embryonnaires et une reprise de ses cycles. Les avortements spontanés en milieu et en fin de gestation peuvent être dangereux pour elle si elle ne parvient pas à expulser le fœtus et ses membranes. La plupart des avortements survenant dans le cadre de gestations naturelles et par

insémination artificielle chez les bovins ne sont pas diagnostiqués en raison des coûts de laboratoire et de la faible marge bénéficiaire de la filière bovine et laitière. Les producteurs et les vétérinaires s’inquiètent quand le taux d’avortement dans un troupeau dépasse 3 à 5 %. Il faut prendre en compte l’impact potentiel des influences extérieures pour l’évaluation des gestations utilisant le TNCS ou d'autres techniques de reproduction. On sait que les maladies, la sous-nutrition et les mauvaises conditions ambiantes sont des facteurs de stress qui compromettent la fécondité des animaux et la survie des embryons. Dans ces circonstances, le risque est directement lié aux facteurs de stress et non à la technique utilisée.

On observe actuellement des effets spécifiquement liés à l’espèce. Les anomalies touchant les clones peuvent être dues à une reprogrammation incomplète du noyau donneur. La reprogrammation épigénétique se produit chez les embryons de différentes espèces. De nombreuses anomalies signalées dans le cadre de gestations bovines et ovines n'ont pas été observées chez les caprins ou les porcs portant des clones obtenus par TNCS. Les chances de succès de la gestation sont inversement proportionnelles au degré de manipulation in vitro de l'embryon. Ce phénomène a été observé à la fois chez les embryons produits par TNCS et chez ceux obtenus par fécondation in vitro. Contrairement aux autres types de techniques de reproduction, les pertes de gestation par le TNCS se produisent à tous les stades de la gestation chez les bovins. Les pertes de clones constatées durant le deuxième et le troisième trimestre de gestation ont été associées à une hydropisie, une hypertrophie ombilicale ou une placentation anormale.

2. Risques pour la santé des embryons clonés dus à la mère de substitution

Aucun nouveau risque pour le développement du fœtus cloné lié à la mère de substitution n’a été identifié comparativement aux gestations classiques. Les risques dans le cadre de ces dernières sont les maladies transmises verticalement et les anomalies dues au stress métabolique ou physiologique.

En ce qui concerne les risques pour la santé animale liés à la mère de substitution, il est difficile de réunir des informations sur la fréquence relative des pertes à un stade précoce d’embryons obtenus par TNCS comparée à celle des pertes à un stade précoce des autres gestations puisque ces avortements ne sont généralement pas diagnostiqués dans le cas des autres techniques de reproduction. En outre, les facteurs de stress extérieurs ont le même impact sur les gestations par le clonage par TNCS.

Les vétérinaires doivent suivre l’évolution de la gestation étant donné que les anomalies communes de la gestation constatées dans d'autres technologies de reproduction assistée peuvent se manifester et être diagnostiquées pendant l'examen physique. Une base de données contenant les problèmes communément rencontrés dans les gestations par clonage rendrait service aux experts de la santé animale si elle était accessible.

o Il faut veiller à évaluer la santé générale de la mère de substitution avant de la choisir pour qu'elle porte les embryons clonés. L'état de santé général de la mère doit être déterminé en fonction de l'absence d'infection et de maladie, d'une vaccination et d'un suivi adéquats et, si possible, de la preuve de gestations antérieures sans incidents, d'absence de problèmes de parturition, et de rétablissement adéquat après la gestation.

o Les pertes de gestations les plus importantes sont constatées avec les embryons obtenus par TNCS chez les bovins avant 60 jours de gestation. Cela correspond au schéma que l'on observe avec les autres technologies reproductives. Toutefois, dans le cas des clones, les fortes pertes de gestation pendant cette

étape de formation placentaire (entre 45 et 60 jours) portent à croire que la mort embryonique est peut être due à un défaut de nidation. Une nidation anormale peut déclencher une accumulation de déchets chez le fœtus et dans les membranes qui l'entourent, ou un transfert insuffisant de nutriments et d'oxygène de la mère au fœtus. Il faut suivre de près la mère de substitution pendant la gestation. Dés que la gestation est constatée et confirmée, il convient d'effectuer des examens vétérinaires réguliers et un suivi constant de l'état sanitaire de l'animal jusqu'à la naissance de la descendance.

o Pour s'assurer que l'animal receveur est gravide et pour suivre sa santé pendant les trois premiers mois, il est utile d'effectuer des évaluations par échographie, de déterminer le profil hormonal et d'évaluer les paramètres physiologiques généraux. À partir de ces données, il faut veiller soigneusement au bon déroulement de la gestation en assurant des conditions adéquates d'élevage et de nutrition.

o Les animaux doivent être observés attentivement pour déceler les signes de travail quand le moment de la naissance approche. Chez certaines espèces, un des problèmes les plus fréquents est l'inertie utérine et l'absence de contractions. Cette absence peut provoquer une gestation prolongée avec des séquelles associées qui peuvent nécessiter une assistance à la parturition.

o Si la situation le justifie, il faut avoir recours à une intervention chirurgicale et elle doit être accessible à l'animal proche du terme. On doit employer des procédures adéquates pour garantir une manipulation correcte de la descendance et de la mère de substitution.

o Des problèmes de santé peuvent survenir par suite de l’intervention chirurgicale, de tractions excessives ou d'autres complications comme la rétention des membranes fœtales. Dans ces cas les soins post partum peuvent s'avérer nécessaires.

3. Gestion des risques pour la santé animale chez les animaux clonés

Les problèmes de santé des animaux clonés peuvent être observés in utero et post-partum. Ce sont apparemment les mêmes que ceux observés chez les autres animaux issus des technologies de la reproduction assistée, mais ils peuvent être plus fréquents chez les clones. Il est essentiel de déterminer si les anomalies sont d'origine génétique ou épigénétique. Le syndrome du gros veau (LOS = large offspring syndrome), qui est vraisemblablement associé à des anomalies placentaires plutôt qu’à des anomalies fœtales, ont été fréquemment constatés notamment chez les ovins et bovins clonés, consécutivement à des conditions suboptimales de manipulation in vitro. Ces anomalies sont moins courantes chez les petits ruminants.

o Les bonnes pratiques d'élevage sont importantes pour la santé des animaux clonés. Il faut veiller à leur fournir du colostrum et à leur assurer un environnement propre et hygiénique. On doit les surveiller pendant les quelques semaines suivant la naissance.

o On doit rechercher systématiquement chez les animaux clonés les anomalies phénotypiques les plus communes, comme l'atrésie de l'anus, la hernie ombilicale, les contractions des muscles fléchisseurs, l'insuffisance respiratoire ou cardiaque et l'impossibilité de téter. Ces précautions permettront de traiter et soigner convenablement le nouveau-né et augmenteront les chances de survie du jeune animal.

o Pour accroître les connaissances actuelles sur le statut sanitaire des animaux clonés, on doit effectuer un examen vétérinaire complet afin de suivre l'évolution du clone, étant donné que l'on a publié des cas de morts inexpliquées ou dues à des complications systémiques. Il est recommandé de suivre le profil de santé des animaux au moins jusqu'au stade de maturité reproductive (indice de fertilité).

o Les préoccupations de santé animale qui vont du LOS aux anomalies graves sont très souvent mentionnées dans les débats portant sur la technologie du clonage. Il faut mettre en œuvre des recherches adéquates et constituer des données revues par les pairs. Les animaux clonés doivent faire l'objet d'évaluations

simples du bien-être spécifiques à l'espèce. Si l'on détecte des inquiétudes en matière de bien-être, il faut effectuer une caractérisation plus poussée de ce phénotype pour obtenir des informations sur ce type d'inquiétudes.

o Il faut recueillir des données sur le suivi de la population animale pendant les diverses étapes de la vie, de la naissance à la puberté, afin d'étudier et de valider le potentiel génomique des animaux clonés.

4. Gestion des risques pour la santé animale liés à la progéniture des clones issue d'une reproduction sexuée

Rien ne prouve actuellement que le risque pour la santé est aggravé si l'on utilise la reproduction sexuée pour obtenir une progéniture. Certaines données indiquent que les erreurs de reprogrammation au cours du processus de clonage peuvent en fait être corrigées pendant le processus naturel d'accouplement et de reproduction.

a. La caractérisation du profil sanitaire, y compris l'état de santé et les données sur le bien-être animal, renforcerait les connaissances sur la progéniture issue d'une reproduction sexuée.

b. Le suivi de la performance reproductive de la progéniture des clones issue d'une reproduction sexuée serait utile pour évaluer leu capacité reproductive par comparaison à celle de leurs équivalents ordinaires.

2. Gestion des risques pour la santé animale liés au reclonage/clones de clones

Les premières informations sur le reclonage commencent seulement à être disponibles. Il est donc nécessaire de suivre la démarche présentée ci-dessous :

a. Le profil de santé (état de santé et données sur le bien-être animal) doit être caractérisé pour renforcer les connaissances.

b. Il faut suivre la performance reproductive des clones de clones pour évaluer la capacité sexuelle de ces animaux par comparaison à celle de leurs équivalents ordinaires.

Article 4.11.7.

Examen

Les présentes dispositions ont pour objectif de fournir une base scientifique et des recommandations sur les risques pour la santé et le bien-être des animaux qui sont impliqués dans le clonage par TNCS comparés à ceux liés aux autres animaux issus des technologies de la reproduction assistée. Elles se centreront initialement sur la base scientifique sur laquelle reposent les aspects d'appréciation du risque, les mesures de prévention et les orientations pour la production de bétail et de chevaux issus du clonage par TNCS. Par ailleurs, elles devront être revues à la lumière des nouvelles informations scientifiques.

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Vecteurs viraux

Les vecteurs viraux et non viraux – D’après Reflexiences

Certains vecteurs sont présents dans la nature depuis des millions d’années et nous avons tous déjà fait leur connaissance : ce sont les virus, des parasites qui ont besoin de cellules hôtes pour se multiplier.

Vecteurs viraux

En pénétrant dans nos cellules ils mélangent leur matériel génétique au nôtre dans le but de nous nuire. Dans le cas de la thérapie génique, ils peuvent aussi servir au transport d’un gène sain vers sa cible.

Mais pour pouvoir les utiliser sans danger, plusieurs précautions doivent être prises. Il faut d’abord atténuer leur virulence pour que leur introduction dans le corps d’un patient n’engendre pas de nouvelles pathologies. Ensuite, il est nécessaire de diminuer leurs pouvoirs antigéniques afin d’éviter les réactions immunologiques (formation d'anticorps, mobilisation des lymphocytes, etc.). Pour finir, il faut impérativement accorder les antigènes de surface du virus avec ceux des cellules cibles, pour qu’ils ne se trompent pas de cellules à traiter.

Vecteur non viraux

La manipulation des virus étant extrêmement délicate, les chercheurs explorent d’autres pistes pour le transport des gènes correcteurs. Ils fabriquent des vecteurs synthétiques à base de protéines, de lipides ou de polymères cationiques - des particules inertes, donc inoffensives. Malheureusement, elles sont actuellement beaucoup moins efficaces que les virus : il faut au moins 100 000 molécules d’ADN par cellules cibles pour qu’une seule séquence (codant un gène) ne parvienne à pénétrer le noyau. Et de telles concentrations posent des problèmes de toxicité.

Source : http://www.reflexiences.com/dossier/137/comprendre-les-mecanismes-de-la-therapie-genique/3/les-vecteurs-viraux-et-non-viraux/

Risques associés à l'utilisation de vecteurs viraux, d'inserts ou de cultures cellulaires - Utilisation confinée d'OGM et de pathogènes – Origine Bergian Biosafety Server(Dernière révision: 4 juin 2004)

(sans préjudice des éventuelles dispositions en vigueur dans les arrêtés réglementant l'utilisation confinée d'OGMs et de pathogènes en Région wallonne, en Région de Bruxelles-Capitale et en Région flamande)

• Vecteurs viraux o Principes généraux de classement o Cas particuliers

Vecteurs adénoviraux défectifs dérivés des adénovirus humains de sérotype 2 ou 5

Vecteurs défectifs dérivés des rétrovirus leucémogènes murins (MLV) Vecteurs défectifs dérivés des lentivirus (HIV-1)

Vecteurs propagatifs dérivés des poxvirus (vaccine et canarypox ALVAC) Vecteurs dérivés des parvovirus dépendants (AAV-2) et autonomes (MVM

et H-1)• Potentialisation du risque résultant de la nature de l'insert • Cultures cellulaires

o Cultures primaires o Cultures de lignées cellulaires

A. Vecteurs viraux

1. Principes généraux de classement

Les vecteurs viraux sont des particules virales véhiculant un génome artificiellement modifié en regard de celui de la souche virale dont le vecteur est dérivé.

La pathogénicité de nombreux virus parentaux utilisés, l'instabilité des génomes viraux et les possibilités de recombinaison avec d'autres virus ou avec des séquences d'origine cellulaire imposent la prise en compte d'un danger potentiel particulier lors de la production et de l'utilisation de virus génétiquement modifiés. Parmi les dangers potentiels, sont considérés comme particulièrement sérieux :

- l'éventualité de la production accidentelle d'une souche recombinante hautement pathogène pour l'homme, les animaux ou les plantes;- la propagation incontrôlable d'une souche virale artificielle, quelle que soit sa pathogénicité;- l'utilisation médicale ou industrielle de préparations de vecteurs viraux contaminées par des espèces virales non identifiées et/ou non détectées.

On peut opposer deux types de vecteurs viraux selon que la capacité du virus de se propager indéfiniment a été conservée ou supprimée dans le vecteur du fait des modifications génétiques effectuées.

Les vecteurs propagatifs consistent soit en une préparation de particules virales génétiquement modifiées mais compétentes pour la réplication, telles que les vecteurs dérivés des poxvirus, soit d'un mélange de particules génétiquement modifiées défectives pour la réplication et de particules auxiliaires compétentes pour la réplication, classiquement le virus sauvage parental. Ces dernières peuvent compléter en trans le défaut de réplication du vecteur. C'est le cas par exemple de certains vecteurs dérivés des virus de l'Herpès (amplicons). Les conditions de confinement requises pour la manipulation des vecteurs propagatifs sont soit plus strictes, soit équivalentes à celles requises pour la manipulation du virus sauvage dont est issu le vecteur propagatif, ceci selon que les séquences étrangères véhiculées ou inserts présentent ou non un danger propre.

Les vecteurs non propagatifs consistent en une préparation a priori pure de particules virales défectives pour la réplication. Entrent dans cette catégorie la plupart des vecteurs dérivés des rétrovirus MLV, des lentivirus, de l'Adeno-Associated Virus (AAV) et des adénovirus. Un vecteur incapable de se propager apparaît a priori moins dangereux qu'un vecteur construit à partir de la même souche virale mais capable de se propager. Les conditions de confinement des vecteurs défectifs pour la réplication sont équivalentes ou moins strictes que celles du virus sauvage dont ils dérivent à moins que les séquences étrangères véhiculées ne présentent un danger propre. Elles dépendent de l'appréciation du risque que ces vecteurs acquièrent de

manière accidentelle une capacité de propagation incontrôlable. Ce risque varie selon que l'on considère la phase de production ou la phase d'utilisation du vecteur. La production fait appel à des systèmes cellulaires de trans-complémentation qui expriment transi-toirement ou de manière constitutive les gènes viraux nécessaires pour l'assemblage et/ou la réplication des particules virales. Durant cette phase, le phénotype est celui d'un vecteur propagatif et les risques de dissémination accidentelle sont équivalents. Le confinement requis durant cette phase est donc celui d'un vecteur propagatif issu de la même souche virale. En dehors de la phase de production, le risque de dissémination étant moindre, le confinement peut être moins strict.

Il existe toutefois un risque persistant lié à l'éventualité que des conditions de transcomplémentation soient créées accidentellement. Lors de la phase de production, on peut craindre une recombinaison génétique avec les séquences transcomplémentantes ou une contamination de la préparation avec des particules sauvages. Lors de la phase d'utilisation, on considère les éventualités d'une transcomplémentation par une protéine cellulaire capable de se substituer à une protéine virale et d'une infection par le virus parental sauvage de cellules ayant incorporé le vecteur. L'appréciation de ce risque tient compte de la nature du virus dont est dérivé le vecteur, de la conception du vecteur, des modalités de sa production, du nombre de particules vectrices produites, du nombre de cellules cibles transduites et de la nature de l'organisme receveur.

Le caractère défectif des vecteurs viraux non propagatifs peut être plus ou moins profond selon le nombre de gènes viraux dont la fonction a été abolie par la modification génétique. La probabilité d'une réversion accidentelle vers un phénotype compétent pour la réplication diminue avec le nombre des fonctions altérées.

Les vecteurs comportant peu ou pas de phase de lecture codant pour des protéines virales sont considérés comme les plus sûrs.

Le classement d'une activité mettant en oeuvre un vecteur viral peut être déduit de la nature du vecteur viral, de la nature des séquences véhiculées et du type d'utilisation considérée. Des règles sont formalisées ci-dessous pour les vecteurs viraux tels que les vecteurs adénoviraux, les vecteurs dérivés des rétrovirus leucémogènes murins (MLV), les vecteurs dérivés des lentivirus, les vecteurs dérivés des poxvirus, les vecteurs dérivés des parvovirus dépendants (AAV) et autonomes (MVM). Pour les autres vecteurs, les classements doivent être examinés au cas par cas.

Des exceptions à ces règles de classement sont instaurées :

- quand les séquences véhiculées codent pour une protéine particulièrement dangereuse, telle une toxine;- quand la séquence véhiculée est susceptible de conduire à la génération d'un virus hybride entre des virus pathogènes.

2. Cas particuliers

2.1. Vecteurs adénoviraux défectifs dérivés des adénovirus humains de sérotype 2 ou 5

Les virus parentaux sont des organismes pathogènes qui appartiennent à la classe de risque 2

pour l'homme et dont l'utilisation nécessite un niveau de confinement 2. La production et l'utilisation des vecteurs qui en dérivent nécessitent au minimum un niveau de confinement 2. Toutefois, les animaux traités par des vecteurs adénoviraux pourront être hébergés dans une animalerie de niveau de confinement 1 si l'insert n'est pas de nature à potentialiser le risque et si l'absence de vecteur dans les liquides biologiques, sécrétions et excrétions est démontrée.

De même, en cas d'essai clinique chez l'homme, les patients ne sont plus soumis à aucun confinement après que l'absence de vecteur ait été démontrée dans les liquides biologiques, sécrétions et excrétions. Un niveau de confinement 3 est requis pour la production des vecteurs viraux porteurs d'un insert de nature à potentialiser le risque et pour toute autre utilisation en grandes quantités (grands volumes et/ou titres élevés) des suspensions virales produites (manipulation des suspensions virales, cultures cellulaires traitées par ces suspensions, animaux traités par ces suspensions)

2.2. Vecteurs défectifs dérivés des rétrovirus leucémogènes murins (MLV)

Le virus parental est un organisme pathogène qui appartient à la classe de risque 3 pour l'animal et dont l'utilisation nécessite un niveau de confinement 2. La production et l'utilisation des vecteurs écotropes qui en dérivent nécessitent au maximum un niveau de confinement 2. La production et l'utilisation des vecteurs amphotropes qui en dérivent s'effectuent au minimum dans un niveau de confinement 2. La production et l'utilisation en grandes quantités de vecteurs viraux amphotropes porteurs d'un insert de nature à potentialiser le risque nécessitent l'adoption d'un niveau de confinement 3.

Les animaux traités par des vecteurs rétroviraux pourront être hébergés dans une animalerie de niveau de confinement 1 si l'insert n'est pas de nature à potentialiser le risque et si l'absence de vecteur dans les liquides biologiques, sécrétions et excrétions est démontrée. De même, en cas d'essai clinique chez l'homme, les patients ne sont plus soumis à aucun confinement après que l'absence de vecteur ait été démontrée dans les liquides biologiques, sécrétions et excrétions.

2.3. Vecteurs défectifs dérivés des lentivirus (HIV-1)

Le virus parental est un organisme pathogène qui appartient à la classe de risque 3 pour l'homme.

La production et l'utilisation des vecteurs qui en dérivent s'effectuent au minimum dans un niveau de confinement 2. La production et l'utilisation en grandes quantités de vecteurs viraux porteurs d'un insert de nature à potentialiser le risque nécessitent l'adoption d'un niveau de confinement 3. Par ailleurs, une vigilance particulière doit être accordée à la manière dont ces vecteurs sont conçus, notamment au niveau des séquences lentivirales conservées qui n'apparaissent pas strictement nécessaires pour la production des vecteurs. Les protocoles suivis pour démontrer l'absence de virus réplicatifs dans les préparations obtenues doivent être examinés avec attention.

2.4. Vecteurs propagatifs dérivés des poxvirus (vaccine et canarypox ALVAC)

Vaccine : le virus parental vaccinia WT est classé en classe de risque 2 pour l'homme et pour l'animal. Son utilisation nécessite un niveau de confinement 2. La production et l'utilisation des

virus recombinants qui en dérivent s'effectuent dans un niveau de confinement 2.

Les souches virales parentales fortement atténuées par délétion, tel que par exemple la souche NYVAC, sont par contre classées en classe de risque 1. L'utilisation des vecteurs recombinants qui en dérivent peut s'effectuer dans un niveau de confinement 1 si l'insert utilisé n'est pas de nature à potentialiser le risque.

Canarypox - ALVAC : la souche virale parentale ALVAC appartient à la classe de risque 1; son utilisation nécessite un niveau de confinement 1. La production et l'utilisation des virus recombinants qui en dérivent nécessitent un niveau de confinement 1 ou 2, respectivement selon que l'insert n'est pas ou est de nature à potentialiser le risque.

2.5. Vecteurs dérivés des parvovirus dépendants (AAV-2) et autonomes (MVM et H-1)

AAV-2 : l'AAV-2 sauvage est un organisme non pathogène classé en classe de risque 1 dont l'utilisation nécessite un niveau de confinement 1. Les vecteurs non propagatifs qui en dérivent nécessitent le même niveau de confinement. Toutefois, en cas de potentialisation du risque due à la nature de l'insert, le niveau de confinement requis est au minimum 2. Si la production des vecteurs AAV entraîne l'utilisation d'adénovirus sauvage, celle-ci nécessite alors au minimum un niveau de confinement 2.

MVM et H-1 : ces virus appartiennent à la classe de risque 1 pour l'homme et 2 pour l'animal. Leur manipulation nécessite l'adoption d'un niveau de confinement 2. La manipulation des vecteurs qui en dérivent nécessite également un niveau de confinement 2. Un niveau de confinement 1 pourra être néanmoins adopté si l'insert utilisé n'est pas de nature à potentialiser le risque et si le système constitué par le vecteur proprement dit et les cellules transcomplémentantes utilisées ne peut produire de RCV de façon théorique et expérimentalement démontrée.

B. Potentialisation du risque résultant de la nature de l'insert

Il y a potentialisation du risque lorsque, capable d'expression, l'insert encode la synthèse d'un produit dangereux pour l'homme ou l'environnement. Il y a également potentialisation du risque lorsque l'insert augmente la capacité d'expression, d'intégration et/ou de réplication du vecteur.

Les séquences d'ADN suivantes requièrent une évaluation de risque particulière lorsqu'elles sont pratiquement capables d'expression (par exemple clonées dans un vecteur viral d'expression) :

- les gènes dont le produit d'expression intervient dans les mécanismes de prolifération cellulaire, d'immortalisation cellulaire et d'apoptose. Cette définition inclut notamment les protooncogènes et oncogènes;- Les gènes humains ou leur équivalent des mammifères supérieurs dont le produit d'expression peut exercer une fonction physiologique importante (par exemple facteurs de croissance, interleukine, neurotransmetteurs, etc.);- les séquences d'ADN ou gènes codant pour les déterminants viraux, bactériens, fongiques, parasitaires de spécificité d'hôte;- les gènes codant pour - ou intervenant dans la régulation de - la production d'une toxine;

- les séquences d' ADN issues d'organismes de classe 3 ou 4 de pathogénicité;- toute séquence d'ADN dont le rôle est inconnu.

C. Cultures cellulaires

Seules les cultures cellulaires génétiquement modifiées ou porteuses d'agents pathogènes sont visées par le présent arrêté.

Parmi les risques liés à la manipulation des cultures cellulaires, on distingue essentiellement d'une part les risques liés aux propriétés intrinsèques des cultures cellulaires, y compris la nature des modifications génétiques éventuelles, et d'autre part les risques liés à une contamination accidentelle ou l'infection voulue par des agents pathogènes ou génétiquement modifiés (par exemple virus sauvages ou recombinants).

Le risque associé à une modification génétique réside soit dans les caractéristiques propres du produit recombinant exprimé (par exemple protéines recombinantes), soit dans la probabilité d'intégration, de réplication et d'expression du matériel génétique étranger (par exemple la probabilité d'intégration, de réplication et d'expression du matériel génétique étranger véhiculé par des virus recombinants dans les cellules de l'expérimentateur). Ceci doit être évalué au cas par cas.

1. Cultures primaires

Les risques propres aux utilisations confinées mettant en oeuvre des cultures primaires sont essentiellement liés aux types de cellules prélevées (tissu normal ou tumoral), à leur origine (existence potentielle d'agents infectieux), aux conditions de prélèvement et de manipulation des explants destinés à être mis en culture, à la nature de la modification génétique et au type d'usage envisagé. Le niveau de confinement à adopter est donc déterminé en fonction de ces facteurs.

a) les utilisations confinées mettant en oeuvre des cultures primaires qui ne sont pas d'origine humaine ou primate, et qui sont exemptes d'organismes pathogènes (par exemple les cellules dérivées d'animaux SPF ou "Specific Pathogen Free" et dont les conditions de prélèvement et de manipulation permettent d'éviter leur contamination éventuelle par des organismes pathogènes ou dont le contrôle de qualité a prouvé l'absence de contamination), peuvent a priori être considérées comme appartenant à la classe de risque 1.

La classe de risque de l'utilisation confinée sera aussi fonction du matériel génétique introduit. Dans la mesure où le matériel génétique introduit ne potentialise pas le risque, ces cultures peuvent être manipulées dans un niveau de confinement 1 moyennant le respect des principes de bonnes pratiques microbiologiques afin d'éviter leur contamination accidentelle par des organismes pathogènes et au besoin, un contrôle de qualité régulier de ces cellules pour vérifier cette absence de contamination.

b) les utilisations confinées mettant en oeuvre des cultures primaires d'origine humaine ou primate appartiennent au minimum à la classe de

risque 2 du fait de la potentialisation du risque due à la présence éventuelle d'organismes pathogènes (en particulier, les cultures réalisées à partir de sang, lymphocytes, tissus nerveux ou tissus tumoraux sont considérées comme du matériel à haut risque).

Elles nécessitent au moins un niveau de confinement 2 ou supérieur en fonction de la classe de risque probable du ou des organismes pathogènes contaminants, ainsi que du matériel génétique introduit. Elles nécessitent aussi l'utilisation d'une enceinte de sécurité microbiologique de classe II. En aucun cas ces cultures ne peuvent être manipulées dans une hotte à flux laminaire horizontal.

c) la classe de risque des utilisations confinées mettant en oeuvre des cultures primaires porteuses d'organismes pathogènes ou infectées volontairement par des organismes pathogènes sera fonction de la classe de risque biologique de l'organisme pathogène concerné.

Ces utilisations confinées nécessitent au moins le confinement requis pour l'organisme pathogène concerné ou supérieur en fonction du matériel génétique introduit, ainsi que l'utilisation d'une enceinte de sécurité microbiologique de classe II. En aucun cas ces cultures ne peuvent être manipulées dans une hotte à flux laminaire horizontal.

2. Cultures de lignées cellulaires

Les risques propres aux utilisations confinées mettant en oeuvre des cultures de lignées cellulaires reprennent les risques des cultures primaires dont elles dérivent ainsi que les risques liés au mode d'immortalisation (par exemple, transformation virale ou utilisation d'oncogènes clonés), et les risques liés au type d'utilisation envisagé.

a) les utilisations confinées mettant en oeuvre des lignées cellulaires qui ne sont pas d'origine humaine ou primate peuvent a priori être considérées comme appartenant à la classe de risque 1. La classe de risque de l'utilisation confinée sera aussi fonction du matériel génétique introduit.

Dans la mesure où le matériel génétique introduit ne potentialise pas le risque, ces lignées cellulaires peuvent être manipulées dans un niveau de confinement 1 moyennant le respect des principes de bonnes pratiques microbiologiques afin d'éviter leur contamination accidentelle par des organismes pathogènes et au besoin, un contrôle de qualité régulier de ces cellules pour vérifier cette absence de contamination.

b) les utilisations confinées mettant en oeuvre des lignées cellulaires d'origine humaine et primate, dans la mesure où celles-ci sont bien caractérisées et authentifiées, exemptes de virus endogènes et sans risque apparent pour la santé et l'environnement, peuvent a priori être considérées comme appartenant à la classe de risque 1.

La classe de risque de l'utilisation confinée sera aussi fonction du matériel génétique introduit. Dans la mesure où le matériel génétique introduit ne potentialise pas le risque, ces lignées cellulaires peuvent être manipulées dans un niveau de confinement 1 moyennant le respect des principes de bonnes pratiques microbiologiques afin d'éviter leur contamination

accidentelle par des organismes pathogènes et au besoin, un contrôle de qualité régulier de ces cellules pour vérifier cette absence de contamination. L'utilisation d'une enceinte de sécurité microbiologique de classe II est néanmoins requise. En aucun cas ces cultures ne peuvent être manipulées dans une hotte à flux laminaire horizontal.

c) les utilisations confinées mettant en oeuvre des lignées cellulaires d'origine humaine et primate non entièrement caractérisées et authentifiées, à l'exception de celles susceptibles de contenir des organismes pathogènes endogènes tels que des virus contaminant du sang, appartiennent au minimum à classe de risque 2 du fait de la potentialisation du risque liée à la présence éventuelle d'organismes pathogènes non encore identifiés.

La classe de risque sera aussi fonction du matériel génétique introduit. Ces lignées cellulaires nécessitent au moins un niveau confinement 2 ou supérieur en fonction du matériel génétique introduit, et l'utilisation d'une enceinte de sécurité microbiologique de classe II. En aucun cas ces lignées cellulaires ne peuvent être manipulées dans une hotte à flux laminaire horizontal.

d) la classe de risque des utilisations confinées mettant en oeuvre des lignées cellulaires porteuses d'organismes pathogènes ou infectées volontairement par des organismes pathogènes sera fonction de la classe de risque biologique de l'organisme pathogène concerné.

Ces utilisations confinées nécessitent au moins le confinement requis pour l'organisme pathogène concerné ou supérieur en fonction du matériel génétique introduit, ainsi que l'utilisation d'une enceinte de sécurité microbiologique de classe II. En aucun cas ces lignées cellulaires ne peuvent être manipulées dans une hotte à flux laminaire horizontal.

Source : http://www.biosafety.be/CU/Annexes/virFR.html

Traduction, définitions et compléments :

Jacques Hallard, Ing. CNAM, consultant indépendant.Relecture et corrections : Christiane Hallard-Lauffenburger, professeur des écoleshonoraire.Adresse : 19 Chemin du Malpas 13940 Mollégès FranceCourriel : jacques.hallard921@orange.fr

Fichier : ISIS Biologie Santé The Promise of Induced Pluripotent Stem Cells French version.1---