PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 1

Le site d’infection

P.L. TOUTAIN

ECOLENATIONALEVETERINAIRE

T O U L O U S E

Update mars 2012

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PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 2

Les 3 questions auxquelles on doit répondre avant d’entreprendre une antibiothérapie

1. Où se trouve le site d’action de l’antibiotique (biophase)

2. Où est localisé le pathogène: en intra- ou en extracellulaire ?

3. Quelle est la signification thérapeutique des concentrations tissulaires?

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ispaïa 2010 -3

Q1: où est localisé le pathogène

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 4

Le site d’infection

• Point de départ: toujours tissulaire

• La bactériémie: présence transitoire de bactéries dans le sang correspondant au passage du pathogène du foyer initial d’infection vers la circulation

• La voie sanguine assure la diffusion de l’infection

• La multiplication du pathogène dans le sang est minimale ou nulle

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Le cas des mammites

Pathogènes LaitCanaux

Parenchyme VacheInf.systèmique

Streptococcus agalactiae

+++ - -

Streptococcus spp +++ + -Staphylococcus aureus + +++ -Staphylococcus spp +++ - -Coliformes + - +++Mycoplasmes, autres GN

- - +++

6

Localisation des pathogènes

Liquide interstitielsLa plupart des pathogènes

•S. Pneumoniae, E. Coli, Klebsiella

•Mannhemia ; Pasteurella

• Actinobacillius pleuropneumoniae •Mycoplasma hyopneumoniae

•Bordetalla bronchiseptica

Cellule(le plus souvent des phagocytes)

• Mycoplasma (some)• Chlamydiae• Brucella• Cryptosporidiosis• Listeria monocytogene• Salmonella• Mycobacteria• Rhodococcus equi

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ispaïa 2010 -9

Q2: où est la biophase

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 10

La concentration plasmatique libre de l’antibiotique est celle qui contrôle la concentration de la biophase

AUClibre plasma = AUC libre LEC (biophase)

AB Liée

AB Libre

LEC = biophase

Diffusion/perméabilité

CelluleCytosol

L

L

organites

Barrières-physiologiques: cerveau, prostate, rétine

-Pathologiques (caillot, abcès, …)

Bac

téri

e

AB liée

AB libre

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Activité des antibiotiques selon la localisation intra- ou extracellulaire du pathogène

Même quantité d’antibiotique ajoutée

Amoxicilline 0.94 ND non oui

Erythromycine 0.08 0.88 oui non

Clarithomycine 0.37 0.66 oui oui

Concentrations (µg/mL) Activité

S.aureus, legionella pneumonia, en suspension

Extracellaire Intracellulaire Extracellulaire

Scanglione et al. 1992

Legionella S. Aureus

Modèle in vitro où la même quantité d’antibiotique a été ajoutée pour voir l’efficacité sur Legionella (intracellulaire) ou sur S. aureus (extracellulaire) dans une suspension de macrophages, fibroblastes, PNN..;

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 13

Dans les infections aiguës des tissus non spécialisés, et en absence

d’abcès, les concentrations plasmatiques libres en antibiotique sont similaires aux concentrations

dans la biophase et elles servent de marqueur d’exposition

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Les indices PK/PD sont tous basés sur des concentrations

plasmatiques libres et non tissulaires

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Conséquence de la localisation extracellulaire de la plupart des pathogènes: la non signification

thérapeutiques des concentrations tissulaires totales

• Comparison of tissue concentrations with MIC should be strongly discouraged (O. Cars 1997)

• The best surrogate marker is the plasma free antibiotic concentration

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2. Les sites subcellulaires d’infection pour les

pathogènes intracellulaires facultatifs & obligatoires

17

Les sites d’infection possibles

• 3 localisations possibles despathogènes

Extracellulaires

S. pneumoniaeE. coliKlebsiellaMannhemia; pasteurellaActinobacillius pleuropneumoniaeMycoplasma hyopneumoniaeBordetala bronchoseptica

Intracellular (facultatifs)

S. aureus (mammites)S. typhiListeriaMycobacterium tuberculosisStreptococcus suis

Intracellulaires (obligatoires)

ChlamydiaeRickettsiaBrucellaLawsonia intracellularis(enterite proliferative du porc)Rhodococcus equi

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Le site d’infection pour les pathogènes intracellulaires facultatifs

• Développement initial dans l’espace interstitiel

• Phagocytoses par les neutrophiles et les macrophages

• Survie du germe aux mécanismes de destruction des phagocytes

• Peuvent survivre dans les phagocytes (et même s’y multiplier)

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 19

Les pathogènes intracellulaires obligatoires

– Sont incapables de se répliquer en dehors d’une cellule hôte

– La cellule assure le support nutritif pour la croissance du germe

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Localisation intracellulaire des pathogènes

Phagosome

Lysosome

Chlamydiae

Listeria

No fusion with lysosome

Phagolysosome

S.aureausBrucella

SalmonellaCoxiella burneti

pH=5.0

3

4

2

1

Fusion

pH=7.4

BB

B

B

B

B

B B

Cytosol

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 21

Aspects cinétiques pour une antibiothérapie intracellulaire

1. Quels sont les antibiotiques qui passent dans les cellules ?

2. Où se localise l’antibiotique dans la cellule

3. Quelle est l’activité de l’antibiotique dans un milieu intracellulaire ?

4. Quelle est la coopération entre l’antibiotique et les mécanismes de défense des cellules (cytokines)?

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 22

Localisation intracellulaire des antibiotiques

Phagolysosomevolume 1 to 5% of cell volume

pH=5.0

Macrolides (x10-50)Aminoglycosides (x2-4)

CytosolpH=7.4

Fluoroquinolones(x2-8)beta-lactams (x0.2-0.6)

Rifampicin (x2)Aminoglycosides (slow) Ion trapping for weak base

with high pKa value

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 24

Activité des AB dans le milieu intracellulaire

Phagolysosome

Macrolides Aminoglycosides

CytosolpH=7.2

Fluoroquinolonesbeta-lactamsRifampicin

Aminoglycosides

Good Low or nul

28

Coopération de l’antibiotique avec les mécanismes de défense cellulaires

Dans l’endosomes: probable

Dans le phagosomes probable

Dans le cytosol• inprobable

Myéloperoxydase

acidité, protéines cationiques...

Cytosol

Dans le phagolysosome• Très variable

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ispaïa 2010 -29

La question des concentrations tissulaires (totales) en

antibiotique

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ispaïa 2010 -30

La communication des firmes pharmaceutiques sur les concentrations totales en antibiotique

dans un tissu

Nombreuses publications en MV pour promouvoir l’idée que les antibiotiques ayant des concentrations tissulaires totales élevées (quinolones et surtout, macrolides) sont

plus efficaces que ne le suggèrent les faibles concentrations plasmatiques

Tulathromycine

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ispaïa 2010 -31

Ne pas confondre science, publicité rédactionnelle et marketing

Vrai mais les pathogènes ne sont pas là

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ispaïa 2010 -32

Ne pas confondre science, publicité rédactionnelle et marketing pour la tildipirosine

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse

Ispaïa 2010 -33

Ne pas confondre science, publicité rédactionnelle et marketing pour la

marbofloxacine

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 34

Considérations marketing

• Il est plus facile de promouvoir la vente d’un macrolide en vantant ses grandes concentrations tissulaires qu’en expliquant pourquoi de faibles concentrations plasmatiques sont efficaces

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 35

Que disent les scientifiques?

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 36

Statements such as ‘concentrations in tissue x h after dosing are much higher than the MICs for

common pathogens that cause disease’ are meaningless

Mouton & al JAC 2007

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 37

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Pourquoi une concentration tissulaire totale n’a pas de signification thérapeutique

• Elle est obtenue sur un homogénat tissulaire• l’AB n’est pas réparti de façon homogène dans un tissu

(LEC vs. intracellulaire) et à l’intérieur de la cellule, la répartition peut être très hétérogène (cytosol vs phagolysosome)

• Il en résulte qu’une concentration tissulaire totale peut tout aussi bien sous-estimer (bêtalactamines, aminoglycosides) que surestimer (quinolones, macrolides) les concentrations de la biophase (généralement extracellulaire

38

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 40

Méthodes actuelles pour l’étude des concentrations tissulaires des

antibiotiques

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 41

Microdialyse & ultrafiltration

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 42

Qu’est-ce que la microdialyse ?

• La microdialyse est une technique mis en œuvre pour évaluer la concentration libre d’une substance (antibiotique) dans un liquide biologique qui baigne le pathogène (biophase)

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 43

Microdialyse: Principe • La sonde de microdialyse se comporte sur le plan

des échanges avec le milieu extracellulaire comme un capillaire sanguin

•There is an exchange of substances via extracellular fluid

•Diffusion of drugs is across a semipermeable membrane at the tip of an MD probe implanted into the ISF of the tissue of interest.

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 44

Qu’avons-nous appris des études de microdialyse?

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 45

Similarité des concentrations libres de la substances (Moxifloxacine) et des

concentrations dans les liquides interstitels du muscle et du tissu adipeux

Muller AAC, 1999 Time (h)

Total (plasma, muscle)free (plasma)interstitial muscleinterstitial adipose tissue

2 6 10 12 30 4020

100

1000

Co

nce

ntr

ati

on

(n

g/m

L)

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 46

Qu’avons-nous appris des études de microdialyse en cas d’inflammation?

47

Tissue concentrations of levofloxacin in inflamed and healthy subcutaneous adipose tissue

Methods: Free Concentrations measured by microdialysis after

administration of a single intravenous dose of 500 mg.

Results:The penetration of levofloxacin into tissue appears to be unaffected by local inflammation.Same results obtained with others quinolones

Hypothesis: Accumulation of fibrin and other proteins, oedema, changed pH and altered capillary permeability

may result in local penetration barriers for drugs

Bellmann & al Br J Clin Pharmacol 2004 57

Inflammation

No inflammation

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 48

Qu’avons-nous appris des études de microdialyse en cas d’inflammation?

• Une inflammmation aiguë a peu d’influence sur la pénétration tissulaire des antibiotiques

• “These observations are in clear contrast to reports on the increase in the target site availability of antibiotics by macrophage drug uptake and the preferential release of antibiotics at the target site a concept which is also used as a marketing strategy by the drug industry” Muller & al AAC May 2004

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 49

La question des concentrations pulmonaires en antibiotique

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 51

Free muscle concentrations of cepodoxime were similar to free lung concentration and therefore provided a surrogate measure

of cefpodoxime concentraion at the pulmonary target site

Liu et al., JAC, 2002 50 Suppl: 19-22.

Cefpodoxime at steady state: plasma vs. ISF (muscle & Lung)

Plasma

Free plasma

Muscle Lung

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 52

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 53

The blood-alveolar barrier

The alveolar epithelial cells would not be expected to permit passive diffusion of

antibiotics between cells, the cells being linked by tight junctions

•Fenestrated pulmonary capillary bed• expected to permit passive diffusion of antibiotics with a molecular weight 1,000

Epithelial lining fluid

ELF

ISF

Capillarywall

AlveolarEpithelium

Thigh junctions

space

Alveolarmacrophage

ABAB

ISF

Capillarywall

AlveolarEpithelium

Thigh junctions

space

Alveolarmacrophage

ABAB

ISF

Capillarywall

AlveolarEpithelium

Thigh junctions

space

Alveolarmacrophage

ABAB

AlveolarAlveolarAlveolar

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 54

Conclusion 1: In acute infections, in non-specialized tissues (no

barrier), where there is no abscess formation, free serum levels of

antibiotics are good predictors of free levels in tissue fluid and must

be used to establish PK/PD indices

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 55

• Conclusion 2 : Currently, no equivalent recommendation has been published with tissular concentration as PK input and that, for any tissue or any type of infection including intracellular infection.

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 56

Some statements on total tissular concentrations

• For veterinary medicine (Apley, 1999)– people who truly understand tissue

concentration work in corporate marketing departments

• For human medicine (Kneer, 1993)– tissular concentrations are inherently inaccurate – tissular concentrations studies little contribute to

the understanding of in vivo efficacy and optimal dosing

PL Toutain; Ecole Vétérinaire de Toulouse 57

Tissue concentrations

According to EMEA

"unreliable information is generated from assays of drug concentrations in whole tissues (e.g. homogenates)"

EMEA 2000