Hépatite C Virus et marqueurs.pdf

HEPATITE CHEPATITE CVirus & MarqueursVirus & Marqueurs

Stéphane ChevaliezStéphane Chevaliez

Centre National de RéférenceCentre National de RéférenceDes Hépatites B, C et deltaDes Hépatites B, C et delta

Laboratoire de Virologie & INSERM U955Laboratoire de Virologie & INSERM U955HHôpital Henri Mondorôpital Henri Mondor

Université Université Paris-EstParis-EstCréteilCréteil

• Découvert par Houghton en 1989

• 1ère cause d’hépatite chronique et de cirrhose

en Europe et en Amérique du Nord

• 1ère indication de transplantation hépatique

dans les pays industrialisés

Afdhal,NH.2004;SemLivDis,24(Supp2):3‐8

Hépatite C : virus et marqueurs

Virus de lVirus de l’’Hépatite CHépatite C

•• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae

•• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus

Phylogénie de la région codant la protéine NS5B

AdaptedfromSimmondsetal.,1999;2001.

•• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae

•• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus

•• HHôte naturel : Hommeôte naturel : Homme

•• Tropisme : HépatocyteTropisme : Hépatocyte

Virus de lVirus de l’’Hépatite CHépatite CHépatite C : virus et marqueurs

Organisation StructuraleOrganisation StructuraleHépatite C : virus et marqueurs

Organisation Génomique desOrganisation Génomique desFlaviviridaeFlaviviridae

0 1800 3600 5400 7200 9000 10800

C 4Ap7 NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E15’UTR 3’UTR

HepatitisCvirus

C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B4Ap7

5’UTR 3’UTR

Pestivirus

C prM E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap

5’UTR 3’UTR

Yellowfevervirus

Organisation GénomiqueOrganisation GénomiqueHépatite C : virus et marqueurs

PopescuandDubuisson,Bio.Cell2010,102(1):63‐74.

Protéines structurales Protéines non structurales

Organisation GénomiqueOrganisation GénomiqueHépatite C : virus et marqueurs

Bartenschlageretal,TrendsMicrobiol,inpress.

IRES et TraductionIRES et TraductionHépatite C : virus et marqueurs

FromDepartmentofStructuralBiology,StanfordUniversityMedicalSchool,USA.

Réseaux dRéseaux d’’InteractionsInteractionsHépatite C : virus et marqueurs

Parketal,BMCBioinformatics2010,11(Suppl1):S23.

Protéine de CapsideProtéine de CapsideHépatite C : virus et marqueurs

Boulantetal,JVirol2005,79(17):11353‐11365.

Piodietal.,Hepatology2008,48(1):16‐27.

VHC G1b

Capside et LipidesCapside et LipidesHépatite C : virus et marqueurs

Bartenschalgeretal.,TendsMicrobiol,inpress.

Interaction entre la Capside etInteraction entre la Capside etDGAT-1DGAT-1

Herkeretal.,NatMed2010,16(11):1295‐1298.

*Diacylglycérol diacyltransférase-1

Glycoprotéine E2Glycoprotéine E2Hépatite C : virus et marqueurs

• Hétérodimère avec E1• Régions hypervariables

– HVR1– HVR2– igVR

• Rôles– HVR2 et igVRindispensables au “folding“E1-E2– Étapes précoces(interaction avec CD81,peptide de fusion)

Kreyetal.,PLoSPathog.2010,6(2):e1000762;McCaffreyetal.,JGenVirol2011,92:112‐121.

Étape Précoce : Entrée du VHCÉtape Précoce : Entrée du VHC

Popescuetal.,BioCell2010,102:63‐74.

HVR1HVR1

Région HVR1 (27 amino-acides) 80% de divergence nucléotidique entre génotypes Epitope majeur de neutralisation

Timmetal.,WorldJGastroenterol2007;13(36)4808‐4817.

Transmission du VHCTransmission du VHCHépatite C : virus et marqueurs

6a_332b_JFH1Patient 1 (7/04)

5a_SA131b_HVR3812

S5 (7/05)Patient 3 (7/05)Patient 3 (9/05)Patient 2 (7/04)Patient 2 (9/04)Patient 3 (7/04)S4 (6/05)S3 (6/05)S2 (6/05)Patient 3 (01/05)S1 (6/05)

1a_HCT27X52a_Q2B

3a_CB1a_HCT18X5

Patient 61b_AWV2C33

Patient 8Patient 4

Patient 74a_ED43

Surfaces inertes

Girouetal.,ClinInfectDisease2008,47(5):627‐633.

Patients VHC chroniquesSéroconversion VHC

Analyse PhylogéniqueAnalyse Phylogénique

Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot

Protéine p7Protéine p7Hépatite C : virus et marqueurs

• Viroporine dont lastructure 3D a étérécemment déterminéepar ME

• Rôle(s) in vivo ?

• Cible thérapeutiquepotentielle

Luiketal.,ProcNatlAcadSci2009,4;106(31):12712‐6;GriffinS,ProcNatlAcadSci2009,106(31):12567‐68.

Activité Antivirale du BIT225Activité Antivirale du BIT225Hépatite C : virus et marqueurs

• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV• Activité synergique

Luscombeetal.,AntiviralRes2010May;86(2):144‐53.

Protéine NS2Protéine NS2Hépatite C : virus et marqueurs

• NS2 (région N-ter)– Rôle dans l’organisation

de la formation des

nucléocapsides

• NS2pro (région C-ter)

Jiraskoetal.,PLoSpathog2010Dec16;6(12):e1001233;Ivoetal.,Nature2006,442:831‐835.

Protéine NS3-4AProtéine NS3-4AHépatite C : virus et marqueurs

Raneyetal.,JBiolChem2010,285(30):22725‐731.

Inhibition de la Production Inhibition de la Production dd’’IFNIFNpar NS3par NS3

Hépatite C : Nouvelles Hepatite C : virus et marqueurs

Protéase NS3Protéase NS3Hépatite C : virus et marqueurs

Raneyetal.,JBiolChem2010,285(30):22725‐731.

Etudes de Phase III Présentées àEtudes de Phase III Présentées àll’’AASLDAASLD™™ 2010 2010

• SPRINT-2• RESPOND-2

• ADVANCE• ILLUMINATE• REALIZE

BOCEPREVIR (BOC)

TELAPREVIR (TVR)

SPRINT-2SPRINT-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : Design de lDesign de l’’EtudeEtude

SuiviPRLead-in PR + placebo

SuiviPRLead-in PR + boceprevir

48 PRn = 363

S4 S28 S48 S72

Suivi S24

PRLead-in PR + boceprevir

P/R + placebo

ARN-VHC indétectable à S8-24

ARN-VHC détectable à S8-24 BOC/TGRn = 368

BOC/PR48n = 366

*BOC 800 mg q8h; pegIFN alfa-2b 1,5 µg/kg/s; RBV 600-1400 mg/j adaptée au poids.

Poordadetal.,AASLD2010,AbstractLB4.

SPRINT-2SPRINT-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : CaractéristiquesCaractéristiquesdes Patientsdes Patients

Cohorte 1 (caucasiens) [n=938]

PR48n=311

BOC/RGTn=316

BOC/PR48n=311

Sexe masculin [n(%)] 171 (55) 198 (63) 187 (60)

Age (années) [moyenne] 48 49 49

IMC (kg/m2) [moyenne (±DS)] 27 (±5) 28 (±5) 27 (±5)

ARN du VHC >400,000 UI/mL [n(%)] 286 (92) 287 (91) 289 (93)

Type/sous-type du VHC [n(%)]*

1a 186 (60) 196 (62) 196 (63)

1b 112 (36) 110 (35) 102 (33)

Fibrose sévère/Cirrhose(METAVIR F3/F4) [n(%)]

22 (7) 25 (8) 37 (12)

*La détermination du type et du sous-type a été réalisée par séquençage d’une portion de la région NS5B codant l’ARNpol (méthode de référence)

SPRINT-2SPRINT-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : RVS et Taux deRVS et Taux deRechuteRechute

ortion

p<0,0001

Taux de rechuteTaux de RVS

SPRINT-2SPRINT-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : RVS et Taux deRVS et Taux deRechuteRechute

ortion

p<0,0001

➜ Le BOC améliore significativement les chances de guérison par rapport au SOC➜ L’adaptation de la durée du traitement à la réponse (TGR) ne semble pas diminuer les

chances de guérison

ADVANCEADVANCE——TVR + TVR + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : Design de lDesign de l’’EtudeEtude

S8 S24 S48 S72

*TVR 750 mg q8h; pegIFN alfa-2a 180 µg/s; RBV 1000-1200 mg/j adaptée au poids.eRVR : réponse virologique rapide étendue (ARN indétectable à S4 et à S12)

Jacobsonetal.,AASLD2010,Abstract211.

TVR+ PR

PRT8PR

(n = 364) PRPR

Placebo+ P/R PRPR48

(n = 361)

PRTVR + PR PR

T12PR(n = 363)

S12 S36

ADVANCEADVANCE——TVR + TVR + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : CaractéristiquesCaractéristiquesdes Patientsdes Patients

T12PR (n = 363) T8PR (n = 364) PR (n = 361)Sexe masculin [n (%)] 214 (59) 211 (58) 211 (58)Origine ethnique

Caucasiens [n (%)] 325 (90) 315 (87) 318 (88)Afro-Américains 26 (7) 40 (11) 28 (8)Hispaniques 35 (10) 44 (12) 38 (11)

Âge (années) [médiane (intervalle)] 49 (19-69) 49 (19-68) 49 (18-69)IMC (kg/m2) [médiane (intervalle)] 26 (18-47) 26 (17-46) 26 (17-48)ARN du VHC > 800 000 UI/ml* [n (%)] 281 (77) 279 (77) 279 (77)Type/sous-type du VHC** [n (%)]

1a 213 (59) 210 (58) 208 (58)1b 149 (41) 151 (41) 151 (42)1 non sous-typable 1 (< 1) 3 (1) 2 (1)

Stade de fibrose, n (%)Fibrose en ponts 52 (14) 59 (16) 52 (14)Cirrhose 21 (6) 26 (7) 21 (6)

*La charge virale (ARN du VHC, UI/ml) a été déterminée par PCR en temps réel (TaqMan® Roche), avec une limite de quantification de 25 UI/mL**La détermination du génotype viral a été réalisée par hybridation inverse, INNO-LiPA v1.0

ADVANCEADVANCE——TVR + TVR + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : RVSRVS

p<0,0001

ortion

tsayant

développ

ADVANCEADVANCE——TVR + TVR + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients NaPatients Naïfs de Génotype 1 : ïfs de Génotype 1 : RVSRVS

p<0,0001

ortion

tsayant

développ

➜ Le TVR améliore significativement les chances de guérison par rapport à labithérapie standard

➜ Le traitement par TVR 8 ou 12 semaines donne des taux de RVS comparables(différence NS)

RESPOND-2RESPOND-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients en échecPatients en échec Thérapeutique de G1 : Thérapeutique de G1 : DesignDesignde lde l’’EtudeEtude

SuiviPRLead-in PR + placebo

SuiviPRLead-in PR + boceprevir

PR48n = 80

S4 S28 S48 S72

Suivi S24

PRLead-in PR + boceprevir S32

PR +placebo

ARN-VHC indétectable à S8

ARN-VHC détectable à S8 BOC/TGRn = 162

BOC/PR48n = 162

*BOC 800 mg q8h; pegIFN alfa-2b 1,5 µg/kg/s; RBV 600-1400 mg/j adaptée au poids.

Baconetal.,AASLD2010,Abstract216.

RESPOND-2RESPOND-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients en échecPatients en échec Thérapeutique de G1 : Thérapeutique de G1 : RVS etRVS etTaux de RechuteTaux de Rechute

ortion

p<0,0001

17/60 8/25 95/162 17/111 107/161 14/121

Lead‐in+32BOC/PR±PR12

RESPOND-2RESPOND-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients en échecPatients en échec Thérapeutique de G1 : Thérapeutique de G1 : RVS etRVS etTaux de RechuteTaux de Rechute

ortion

p<0,0001

➜ Le BOC améliore significativement les chances de guérison par rapport auretraitement par SOC

17/60 8/25 95/162 17/111 107/161 14/121

RESPOND-2RESPOND-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients en échecPatients en échec Thérapeutique de G1 : Thérapeutique de G1 : RVSRVSSelon la Réponse AntérieureSelon la Réponse Antérieure

ortion

RRRépondeurs partiels

2/29 15/51 23/57 72/105 30/58 77/103

RESPOND-2RESPOND-2——BOC + BOC + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients en échecPatients en échec Thérapeutique de G1 : Thérapeutique de G1 : RVSRVSSelon la Réponse à S4Selon la Réponse à S4

ortion

Diminution de l’ARN ≥1 Log10

Diminution de l’ARN <1 Log10

17/66 15/46 80/110 15/44 17/66

➜ Intérêt de la phase de Lead-in comme facteur prédictif de la RVS

p<0,0001

REALIZEREALIZE——TVR + TVR + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients en Echec ThérapeutiquePatients en Echec Thérapeutique de G1 : de G1 : DesignDesignde lde l’’EtudeEtude

SuiviPR + placebo48 PRn = 130

*TVR 750 mg q8h; pegIFN alfa-2a 180 µg/s; RBV 1000-1200 mg/j adaptée au poids.

Pressrelease,Sept2010.

SuiviPR + TVRn = 260 PR(Ll) PR

SuiviPR(LI) PRn = 260

S4 S16 S48 S72S8 S12

PR + TVR

REALIZEREALIZE——TVR + TVR + PegIFN PegIFN + RBV chez des+ RBV chez desPatients en Echec ThérapeutiquePatients en Echec Thérapeutique de G1 : de G1 : RVSRVS

Pressrelease,Sept2010.

ortion

tsayan

T12/PR48* (n=520)PR48 (n=130)

*Braspoolés

TMC435 Administré en Monothérapie chezTMC435 Administré en Monothérapie chezdes Patients de Génotype 2, 3, 4, 5 et 6des Patients de Génotype 2, 3, 4, 5 et 6

Mannsetal.,AASLD2010,Abstract82.

inutionmoyen

nedel’A

duVHC(LogUI/mL)

Lesburgetal.,NatstructBiol1999,6:937‐943;Bressanellietal.,ProcNatlAcadSciUSA1999,96:13034‐13039;Agoetal.,SrructureFoldDes1999,7:1417‐1426.

Protéine NS5B: RdRpProtéine NS5B: RdRpNouvelles Hépatite C : virus et marqueurs

Réplication

– Modèle du poliovirus. Virus à ARN monocaténairede polarité positive

DeClercq.,NatureReviewDrugDiscovery,2007;6:1001‐18

Réplication ViraleRéplication ViraleHépatite C : virus et marqueurs

Variabilité GénétiqueVariabilité Génétique

• Erreurs au cours de la réplication– Fréquentes

• 10-4-10-4 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC

– Spontanées– Au hasard

• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’("proofreading")– Accumulation de mutations

• A l’origine de :– La diversification des types et des sous-types– La distribution en quasi-espèces

Diversification des GénotypesDiversification des Génotypes

Simmondsetal.,Hepatology2005,42(4):962‐73.

AdaptedfromFangJ.,etal.J.ClinLiverDis.1997.

Distribution des GénotypesDistribution des GénotypesHépatite C : virus et marqueurs

Distribution en Quasi-espèceDistribution en Quasi-espèce

Weineretal.,Virology1991;180:842‐848;Martelletal.,JVirol1992;66:3225‐36.

Cibles des Molécules AntiviralesCibles des Molécules AntiviralesHépatite C : virus et marqueurs

Site A (Thumb/fingertips)(JTK-109)

Mutants: 495, 496, 499

Site B (Thumb)HCV-371

Mutants: 419, 423, 482

Site C (Palm) (A-837093)

Mutants: 411, 414, 448

Site Actif(R7128)

Mutants: 282

Site D (Palm)(HCV796)

Mutants: 316

Site E (Finger, hypothetical)GS-9190

Mutants: 445,448,452

01234567

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70Days

TMA + + + + - - - - - - - - + +

LOQ(20 IU/mL)

MK-0608 at 1mg.kg-1 orally

- 4,6 - 4,1

wt S282R/T/I wt S282

Activité Antivirale du MK-0608Activité Antivirale du MK-0608Hépatite C : virus et marqueurs

Cycle ViralCycle ViralHépatite C : virus et marqueurs

AdaptedfromLindenbachandRice,Nature(2005),436:933‐938.

Complexes de RéplicationComplexes de Réplication

Moradpouretal.,NatureReviewsMicrobiology,2007;5:453‐463.

HEPATITE CHEPATITE CStratégie Diagnostique &Stratégie Diagnostique &

Suivi VirologiqueSuivi Virologique

Marqueurs VirologiquesMarqueurs VirologiquesStratégie diagnostique & suivi virologique

Marqueurs indirects

Anticorps anti-VHC totaux

Marqueurs directs

Ag de capside (AgC)

ARN VHC

Génotype VHC

Profil de résistance

Tests SérologiquesTests SérologiquesStratégie diagnostique & suivi virologique

• Détection et quantification de l’Ag decapside

• Test “Combo”– Détection simultanée de l’Ag de capside et des

anticorps anti-VHC

• Détection des anticorps anti-VHC à l’aided’une trousse de 3ème génération

Antigène de Capside : unAntigène de Capside : unMarqueur de la RéplicationMarqueur de la Réplication

Bouvier‐Aliasetal.,Hepatology2002,36(1):211‐218.

Stratégie diagnostique & suivi virologique

r = 0.92; p < 0.0001

• Spécificité– 99,2% à 100%

• Sensitivité– ≤10 fmol/L (i.e ~ 500 to 3 000 UI/mL d’ARN VHC)– Tous les génotypes (excepté génotype 2)

• Intervalle de quantification– 10 à 20 000 fmol/L (≤ 7,8 Log10 UI/mL d’ARN

• Stable à 37°C pendant 96 heures

Performances Performances Analytiques Analytiques de lade laTrousse Trousse Architect (Abbott)Architect (Abbott)

Rossetal.,JClinMicribiol2010,48(4):1161‐8;Mederackeetal.,JClinVirol2009,46(3):210‐5;Miedougeetal.,JClinVirol2010,48(1):18‐21.

Trousse Trousse Architect :Architect : MonitoringMonitoringdes des Cinétiques ViralesCinétiques Virales

RVR (G1b) SVR (G1b)

Relapser (G1b) NR (G1a)

Rossetal.,JClinMicrobiol2010,48(4):1161‐8.

Core AgRNA

IntérIntérêts Cliniques êts Cliniques de lade laQuantification de Quantification de ll’’AgCAgC

• Diagnostic de l’infection– Trousses commerciales– Facile à utiliser, automatisée, peu couteux (20% par

rapport à une charge virale VHC)

• Décision de traiter et suivi de l’efficacité destraitements antiviraux– Quantitatif (≤20,000 fmol/L*)– Alternative aux techniques de détection quantification

de l’ARN du VHC(*Abbott Architect HCV Ag Assay)

Tests Virologiques MoléculairesTests Virologiques Moléculaires

Tests quantitatifsSeuil de détection ≥ qualitatifs

Quelle quantité est présente ?

Tests qualitatifsTrès sensibles

(≤ 50 IU/mL)

Est-ce que le VHC est présent ?

Déterminationdu Génotype

Quel est le génotype du virus ?

Détection Détection de la résistancede la résistance

Quel type de VHC est présent ?

Tests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MoléculairesStratégie diagnostique & suivi virologique

Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?

Tests Qualitatifs-Quantitatifs

Déterminationdu Génotype

Quel est le génotype du virus ?

DétectionDétection de la résistance de la résistance

Quel type de VHC est présent ?

Intervalle de QuantificationIntervalle de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique

10 102 103 104 105 106 107 108

Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0

SuperQuant

LCx HCV RNAAssay

Versant HCV RNA3.0 (bDNA)

Avantages Techniques de la PCRAvantages Techniques de la PCRen Temps Réelen Temps Réel

- Diminution du risque de contamination

- Amélioration de la sensibilité

- Augmentation de l’intervalle dequantification linéaire

- Amélioration précision et reproductibilité

- Augmentation de débit à traversl’automatisation

Intervalle de QuantificationIntervalle de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique

10 102 103 104 105 106 107 108

*in development

Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0

SuperQuant

LCx HCV RNAAssay

Versant HCV RNA3.0 (bDNA)

TaqMan 48 HCVTaqMan 48 HCV(Roche)(Roche)

HCV Quant ASRHCV Quant ASR(Abbott)(Abbott)

Artus HCV QS-RGQArtus HCV QS-RGQ(Qiagen)*(Qiagen)*

Versant HCV RNAVersant HCV RNA1.0 (kPCR, Siemens)*1.0 (kPCR, Siemens)*

Plates-formesPlates-formesCAP-CTM96 (ROCHE)

kPCR (SIEMENS)

m2000SP-m2000RT (ABBOTT)

• Remplace les techniques qualitatives dedétection de l’ARN VHC

• Quantifie l’ensemble des charges viralesobservées en pratique clinique– Charges élevées préthérapeutiques– Faibles charges virales au cours du traitement

• Surveille efficacement les cinétiquesvirales (évaluation précoce des réponsesvirologiques au traitement)

Avantages Cliniques de la PCRAvantages Cliniques de la PCRen Temps Réelen Temps Réel

Quantification ARN du VHC(CTM, Roche)

Chevaliezetal.,2007;Hepatology,46(1):22‐31.

HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA(Log10 IU/mL)

Genotype 1 (n=29)

Genotype 2 (n=27)

Genotype 3 (n=29)

Genotype 4 (n=30)

Genotype 5 (n=9)

Genotype 6 (n=2)

r = 0.889; p < 0.0001

3876543

80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 |.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|F_7157 (4a): TAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATCGCCGGPatient 1 (4h): ...........................A.....................................A...................T...............Patient 2 (4l): ...........................A.....................................A...................T...............

190 200 210 220 230 240 250 260 270 .........|.........|......-...|.........| .........|.........|.........|.........| .........|........F_7157 (4a): GATGACCGGGTCCTTTCTTGGATTAA-CCCGCTCAATGCCCGGAAATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCPatient 1 (4h): ......................A.T.A..........................................................................Patient 2 (4l): .......................C..-.......................................................C.......T..........

280 290 300 310 320 330 340 |.........|.........|.........|.........|.........|.........|.F_7157 (4a): TTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCPatient 1 (4h): .............................................................Patient 2 (4l): .............................................................

Chevaliezetal.,2008;Hepatology,49(4):1397‐1398.

(Log10 IU/mL) CAP/CTM96 m2000SP/m2000RT Versant 3.0

Patient 1 (4h) <1.08 5.4 5.0

Patient 2 (4l) <1.08 6.0 5.7

Absence de Détection de l’ARN Viral depatients Fortement Virémiques Infectés parun Génotype 4

Quantification deQuantification de Transcrits dTranscrits d’’ARN Sauvages ouARN Sauvages ouMutés en Position 145 et/ou 165Mutés en Position 145 et/ou 165

Chevaliezetal.,Hepatology,2009,50(5):1681.

5.95±0.25

5.88±0.20

6.00±0.11

6.05±0.10

6.60±0.18<1.08*Double mutant (G145Aand A165T)

6.30±0.024.28±0.35Single mutant (G145 andA165T)

6.69±0.024.02±0.13Single mutant (G145A andA165)

6.43±0.015.73±0.13Wild-type (G145 andA165)

Versant 3.0CTM

bDNA assayReal-time PCR assays

Measured HCV RNA levels (Log10 IU/mL)

HCV 5’NC sequence

*Target not detected

Quantification ARN du VHC(m2000, Abbott)

Chevaliezetal.,JClinMicrobiol,2009,47(6):1726‐32.

r = 0.972; p < 0.0001

3876543H

HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA(Log10 IU/mL)

Genotype 1 (n=55)

Genotype 2 (n=21)

Genotype 3 (n=29)

Genotype 4 (n=24)

Genotype 5 (n=9)

Genotype 6 (n=3)

Quantification ARN du VHC(kPCR, Siemens)

DavidSherman.,MolecularSymposium,September2007(source:SiemensMedicalSolutionsDiagnostics).

132 clinical samples

• En pratique clinique, la quantificationde l’ARN du VHC doit être réalisée àl’aide d’une technique de PCR entemps réel– Avec une limite de détection de l’ordre de

10 à 15 UI/mL

Résumé

Génotypes du VHCGénotypes du VHC

Simmondsetal.Hepatology2005.

Répartition des GénotypesRépartition des GénotypesStratégie diagnostique & suivi virologique

AdaptedfromFangJ.,etal.J.ClinLiverDis.,1997.

Détermination du GénotypeDétermination du Génotype

• Méthodes moléculaires (genotyping)– Analyse de la séquence après séquençage direct– Hybridation inverse des produits d’amplification sur

des supports solides comportant des sondesgénotype sépcifique : Line Probe Assay (INNO-LiPAHCV, Innogenetics)

– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondesgénotype spécifique

• Méthodes sérologiques (“serotyping”)– ELISA compétitif

Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J ClinMicrobiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.

Arensetal.,JClinVirol,2001;22:11‐29;Davidsonetal.,JGenVirol1995;76:1197‐204;Lareuetal.,1997;LePogametal.,1998;JClinMicrobiol;36:1461‐3;Ilinaetal.,JClinMiocrobiol,2005;43(6):2810‐15.

• Méthodes moléculaires (genotyping)– Analyse de la séquence après séquençage direct– Hybridation inverse des produits d’amplification sur

des supports solides comportant des sondesgénotype sépcifique : Line Probe Assay (INNO-LiPAHCV, Innogenetics)

– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondesgénotype spécifique

• Méthodes sérologiques (“serotyping”)– ELISA compétitif

Détermination du GénotypeDétermination du GénotypeStratégie diagnostique & suivi virologique

Versant® HCV Genotype 2.0Assay (INNO-LiPA)

Intérêt de la Détermination duIntérêt de la Détermination duSous-Type Sous-Type ??

• Direct Acting Antivirals (DAAs) pourraientavoir des efficacités antivirales différentesselon les sous-types de VHC de génotype 1in vitro et in vivo

• Le traitement par DAAs pourrait être associéà des profiles de résistance différents selonles sous-types de VHV de génotype 1 in vitroet in vivo

Profils de Résistance duProfils de Résistance du BMS-BMS-70052, 70052, in vitroin vitroSubstitution aminoacidique EC50 fold-change Niveau de

Replication (%)Génotype 1bL31F/V 5-23 146±44P32L 17 18±6Y93H/N 19-28 20 ±7Génotype 1aM28T 683 31±23Q30E/H/R 1 450-24 933 130±56L31M/V 350-3 350 117±29P32L 233 18±5Y93C/H/N 1 850-47 017 18±11

Fridelletal.AntimicrobAgentsChemother.2010;54(9):3641‐50

Profils de Résistance du Profils de Résistance du TelaprevirTelaprevir(PROVE-2 trial), (PROVE-2 trial), in vivoin vivo

Pt-1 Pt-2 Pt-3 Pt-4 Pt-5 Pt-6R26K

V36L/M V36A V36AT42S

A40T A40TT54S T54S T54A

Y56FT91A

R155K R155K R155K/E R155T/AG174S

Génotype 1bGénotype 1a

Chevaliezetal.InternationalHIV&HEPATITISVIRUSDrugResistanceWorkshopandCurativeStrategies2010.

Détermination du Sous-Type parune Méthode de Référence*

*HCV genotype determination by means of phylogenetic analysis of aportion of the gene encoding the NS5B region was used as the referencemethod

Chevaliezetal.,PLoSOne2009,4(12):e820.

1st Generation of LineProbe Assay

(LiPA 1.0)

2nd Generation of LineProbe Assay

(LiPA 2.0)

RealTime HCVGenotype II

Sequence Analysis ofthe 5’NCR

GT 1a(n=237)

GT 1b(n=263)

77.6%(n=184)

90.5%(n=238)

70.5%(n=167)

91.3%(n=240)

97.5%(n=231)

96.2%(n=253)

93.2%(n=220)

88.6%(n=233)

Détermination du Sous-TypeStratégie diagnostique & suivi virologique

- Dans les essais cliniques évaluant les DAAs etprobablement en pratique clinique, le détermination dusous-type des souches de génotype 1 est nécessairepour la stratification et l’interprétation des profils derésistance

- La détermination du génotype sur la seule région 5’NCdoit être proscrite

- La 2nd génération de Line Probe Assay qui utilise dessondes dirigées contre la région core en plus de larégion 5’NC est la meilleure méthode permettant dedistinguer les sous-types 1a et 1b

RésuméStratégie diagnostique & suivi virologique

rs12979860rs12979860

En amont du géne de l’IL28B, codant l’IFN-λ3

Geetal.,Nature2009;461:399‐401.

IL28B “Single NucleotidePolymorphism” (SNP)

Thompsonetal.,Gastroenterology2010;139(1):120‐129.

RVS à la Bithérapie Standard enFonction du Génotype IL28B

Caucasians(n=1171)

African-Americans(n=300)

Hispanics(n=116)

Combined(n=1587)

51%37%

48%29%22%

- En pratique clinique, SNPs en amont du gène del’IL28B (rs12979860 et rs8099917) sont les facteursprédictifs les plus robustes de la RVS à la bithérapie

- Cependant, leur valeur prédictive à l’échelonindividuel n’est pas suffisante pour la prise en comptedans les décisions thérapeutiques

- La détermination du génotype IL28B en association àd’autre paramètres, comme la réponse virologique àS4, pourrait être utile pour adapter le traitement,éventuellement des patients sous triple combinaison

Geetal.,Nature2009;461:399‐401;Tanakaetal.,NatGenet2009;41(10):1105‐9;Afdhaletal,Hepatologyinpress.

Résumé

IntérIntérêts des Tests Virologiquesêts des Tests Virologiquesen Thérapeutiqueen Thérapeutique

Consensusconference:treatmentofhepatitisC;2002,GastroenterolClinBiol,26(2):B303‐20

• Décision de traiter

• Optimisation du schémathérapeutique

• Etude de la réponse virologique autraitement

Traitement de l’HépatiteChronique C

• Traitement standard– Interféron pégylé alpha-2a or alpha-2b et

ribavirine à doses fixe ou adaptée au poids

• Durée de traitement– 16 à 72 semaines en fonction du génotype et

de la réponse virologique

IntérIntérêts de la Détermination duêts de la Détermination duGénotypeGénotype

• Détermination systématique dugénotype– Facteur prédictif de la réponse au

traitement

– Conditionne. La dose de ribavirine

. La durée du traitement

Dose de RibavirineStratégie diagnostique & suivi virologique

Ribavirine0,8g/j

Ribavirin1,0–1,2g/j

Hadziyannis et al., Ann Intern Med 2004;140: 346-355.

ortion

tsavecRV

Durée de TraitementStratégie diagnostique & suivi virologique

Hadziyannisetal.,AnnInternMed2004;140:346‐355.

24semaines

48semaines

ortion

tsavecRV

IntérIntérêts de la Détection -êts de la Détection -Quantification de lQuantification de l’’ARN VHCARN VHC

• Evaluation de la réplication virale chez despatients anticorps anti-VHC positifs

• Evaluation de la réponse virologique aucours du traitement pegIFN - RBV

– Réponse virologique rapide (semaine 4)– Réponse virologique précoce (semaine 12)– Réponse fin de traitement (EoT)– Réponse virologique soutenue (semaine 24 post-Rx)

Réponses au Traitement enFonction des Cinétiques Virales

0 4 8 12Semaines

Detection cut-off(10-15 IU/mL)-6

Diminution ≥ 2 Log

Réponse Virologique Précoce :Facteur Prédictif de la RVS

EoTRVSRechute

AdaptedfromFerencietal.,JHepatol2005,43:425‐433.

Diminution >2 Log ou ARN indétectable à S12

Diminution <2 Log à S12

0 4 8 12Semaines

RVRSlow VR

Detection cut-off(10-15 IU/mL)-6

Diminution ≥ 2 Log

Réponses au Traitement enFonction des Cinétiques Virales

Semaines avec un ARN du VHC indétectableWeek to first undetectable HCV RNA

ViraferonPeg 1.5µg/kg/w + RBV 1000-1400 mg/dViraferonPeg 1.0µg/kg/w + RBV 1000-1400 mg/dPegIFN alpha-2a 180µg/w + RBV 1000-1200 mg/d

McHutchinsonetal.,NewEnglJMed2009,361(6):580‐593.

Taux de RVS

Longer Treatment DurationLonger Treatment DurationGenotype 1, Slow virological responders

>2 Log drop at week 12, but detectable HCV RNA

Bergetal.,Gastroenterology2006,130:1086‐97.

48 weeks

72 weeks

HCV RNA <50 IU/mL HCV RNA >50 IU/mL

34/51 27/35 104/130 90/119 78/179 94/190 17/100 31/106

p=0.040

121/230121/225

Genotype 1 and 4, Slow virological responders>2 Log drop at week 12, but detectable HCV RNA

Ferencietal.,Gastroenterology2010,138:503‐512.

HCV RNA <50 IU/mL

HCV RNA >50 IU/mL

p<0.01

p<0.05

48 weeks72 weeks

20/35 9/2916/72 11/81

Longer Treatment DurationLonger Treatment DurationStratégie diagnostique & suivi virologique

Shorter Treatment Duration

• A recent meta-analysis suggested that– In patients infected with HCV genotype 1 with

an RVR, 24 weeks of therapy with SOCshould be considered only in subjects withlow baseline viral loads

– The optimal cut-off defining low baseline HCVRNA level (400,000-800,000 IU/mL) is notclearly defined

Morenoetal.,JHepatol2010;52:25‐31.

Shorter Treatment DurationShorter Treatment DurationGenotype 2 and 3, Rapid virological responders

(<50 IU/mL at week 4)R

16weeks24weeksp<0.001 p<0.001

375/458 368/405 197/243 115/212 181/215 174/193

Diagoetal.,Hepatology.2010;51(6):1897‐903.

Shorter Treatment DurationShorter Treatment DurationGenotype 2 and 3, Rapid virological responderswith a low baseline viral load (<400,000 IU/mL)

16weeks24weeksp=0.20

111/122 95/100

Diagoetal.,Hepatology.2010;51(6):1897‐903.

HCV genotypeHCV-1 (4,5,6)

RNA quantificationHCV-2,3

SOC24 weeks

Ribavirin (800 mg.d-1)

SOC48 weeks

Ribavirin (1000-1400 mg.d-1)

Decrease < 2 Log Decrease ≥ 2 LogHCV RNA detectable

Stop antiviraltreatment

Continue Rx untilW24

If HCV RNAundetetectable

Continue Rx UntilW72

Decrease ≥ 2 LogHCV RNA

undetectable

Continue Rx untilW48

RNA quantification at W4

HCV RNAundetectable

HCV RNAdetectable

Continue Rxuntil W24

Consider16 weeks

of therapy2

1In patients with a low viral load at baseline (<400,000 IU/mL); 2In patients with a low viral load at baseline (400,000-600,000 IU/mL)

RNA quantification at W4

RNA quantification atW12

HCV RNAundetectable

HCV RNAdetectable

Consider24 weeks

of therapy1

Future HCV Therapy

• Future standard treatment– Pegylated interferon alpha-2a or alpha-2b– Ribavirin– Specific inhibitor of the NS3/4A protease

. Telaprevir

. Boceprevir

Weeksontherapy

T12PRN=363

T8PRN=364

PR48N=350

360 2412

TVR+PR

Follow‐up

TVR+PR PR

Follow‐up

60 728

PR Follow‐up

PRFollow‐up

PR Follow‐up

*eRVR=undetectableHCVRNAatweek4andweek12

ADVANCE TrialTelaprevir, Naïve, Genotype 1

p<0.0001

ortion

atients

withSV

p<0.0001

SVR Rates

SPRINT-2 TrialBoceprevir, Naïve, Genotype 1

Weeksontherapy

360 2412 48 60 72

*VR=HCVRNAundetectablebetweenweeks8and24

BOC+PR

Follow‐upPR

LI Follow‐up

Follow‐up

PR Follow‐up

BOC+PRLI

BOC/RGTN=368

BOC/PR48N=366

PR48N=363

Poordadetal.,AASLD2010,AbstractLB‐4.

Poordad et al., AASLD 2010, Abstract LB-4.

Taux Taux de RVSde RVSHow to use molecular techniques to optimize management of chronic heptitis C

p<0.0001

nofPatients

p<0.0001

Résumé

- Duration of triple therapy with pegylated IFN,ribavirin and a protease inhibitor will be tailoredto the virological response at week 4 or earlier

- Response-guided therapy is associated withhigh rates of SVR in genotype-1 treatment naïvepatients

- The ideal time points, frequency, and thefeasibility in real-life practice need to be furtherevaluated

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