Gain de fonction, perte de fonction

hypothesis-driven research

Ce gène active la division cellulaire

Puce à ADN

Discovery-driven research

Comparaison ARNm de cellules à division rapide Vs ARNm de cellules à division lente

gène x= candidat

Sur-expression

Gain de fonction

Sous-expression

Perte de fonction

expressionphysiologique

24 h après

Produit de gène x

Gain de fonction

Organisme

Cellule

perte de fonction

sous-expression

Knock Out

sur-expression

Transgénique

Sur-expression

expressionphysiologique

Produit de gene x = protéine x

ARNm codant protéine x

ADN codant protéine x

Approche : Gain de fonction

protéine x

macromolécule informationnelle

protéine x

ARNm codant protéine x

ADN codant protéine x

transcription

traduction

? - Source de la macromolécule informationnelle

? - Introduction dans la cellule

Source de la macromolécule informationnelle

Purifiée à partird’une source biologiqueProtéine recombinante

ADN

ARN

Protéine

PCR, Clonage

Transcription in vitro

Transcription in vitro

Plasmide

Promoteur d’ARN polymérasede bactériophage

recombinant

ADN codant protéine x

recombinant

Transcription in vitro

Plasmide

ARN polymérasede bactériophage

ARN

Protéine recombinante

Escherichia coli

Transfection

Extraction et purification

Protéine x

Plasmide

ADN codant protéine x

recombinant

Promoteur bactérien

Introduction dans la cellule

Transfection*

Transformation*

Transduction*Transfert de matériel génétique d'une bactérie à une autre ou d'une cellule à une autre par l'intermédiaire d'un virus.

Transfert de matériel génétique exogène dans une cellule.

Acquisition par un organisme de caractères héréditaires nouveaux après pénétration dans ses cellules de matériel génétique exogène.

La membrane plasmique est une barrièrephysique à la transfection de protéines

et acides nucléiques

Lipopolysaccharides

peptidoglycan

MembranePlasmiqueintérieurpeptidoglyca

n

MembranePlasmiqueextérieur

Périplasme

lipoprotéine

Porine(protéine)

Transporteur (protéine)

Paroi bactérien (gram -)

Paroi de lévure

Paroi d’une cellule végétale

Paroipectocellulosique

Membraneplasmique

Digestionenzymatique

protoplaste

Cellulevégétale

Production de protoplastes

Digestionenzymatique

Production de sphéroplastes

levure

sphéroplaste

Micro-rupture de la membrane plasmique

Endocytose

Comment faire pénétrer une macromoléculeInformationelle à l’intérieure d’une cellule ?

Fusion membranaire

- Micro-rupture de la membrane plasmique

- Micro-injection

- Choc-osmotique/choc-thermique

- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

- Endocytose

- Fusion membranaire

Micro-rupture de la membrane plasmique

- Micro-injection

- artificielle

- biologique

- Choc-osmotique/choc-thermique

- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

Micro-injection : artificielle

Micro-injection : artificielle

Avantages : transfection très efficace

Inconvénients : lourdeur technique

transfection de populations de cellules impossible

Micro-injection : biologique : bactéries

Pilus F

Bactériophage M13

M13

T7

Bactériophage T7

Agrobacterium tumefaciens

galles

Micro-injection : biologique : cellules végétales

Agrobacterium :cycle de vie

Micro-rupture de la membrane plasmique

- Micro-injection

- Choc-osmotique/choc-thermique

- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

CaCl2

Cl-

Ca++

LiCH3CO2

Li+

CH3CO2-

Choc-osmotique/choc-thermique

bactérielevure

37°C 42°C

perméabilisation perméabilisation

ADN

H2Oturgescence turgescence

Avantage :

Inconvenients :

Peu onéreuse

transfection de populations de cellules

toxicité

échanges non-spécifiquesd’autres molécules

Choc-osmotique/choc-thermique

faible efficacité

Micro-rupture de la membrane plasmique

- Micro-injection

- Choc-osmotique/choc-thermique

- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

- ++++

++

+

--

-

---

10 - 100 kV/cm

10 - 1000 s

Electroporation

Electroporation

Interrupteur # 1

Interrupteur # 2

résistance alimentation

capacitance

Electroporation

Avantage :

Inconvenients :

efficacité de transfection

transfection de populations de cellules

toxicité

échanges non-spécifiquesd’autres molécules

transfectées

....

....

....

....

....

....

....

Rupture de la

hélium

Onde de choc

Biolistique

…………

membrane calibrée

Capsule à microbilles

Grille de rétention

cellules

microbilles en or

hélium

Biolistique

Biolistique

Avantage :

Inconvenients :

Utilisation avec cellules à paroi

transfection de populations de cellules

Endommage les cellules

Transfection peu uniforme

Nanosecond pulsed laser-induced stress wave

Nanosecond pulsed laser-induced stress wave

Avantage :

Inconvenients :

Technique trop récente

?

?

Agrolistique

Micro-rupture de la membrane plasmique

Endocytose

Comment faire pénétrer une macromoléculeInformationelle à l’intérieure d’une cellule ?

Fusion membranaire

Endocytose

L’endocytose implique la

capture spécifique de

macromolécules ou

nanoparticules par la

membrane plasmique

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

Peptides passe-membranes(cell-penetrating peptides : CPP)

-de la protéineantennapaedia

-de la protéinetat de VIH

- oligo arginine

R Q I K I W F Q N R R M K W K K+++ + + ++

G R K K R R Q R R R P P Q C+++ ++ + ++

R R R R R R R R R+++ ++ + +++

Peptides cationiquesEndocytose :

cargo

CPP (conjugaison chimique)

CPP(peptide de synthèse)

conjugaison chimique(liaison covalente)

ProtéineARNADN

G R K K R R Q R R R P P Q C

ADN codant protéine x

ADN codant CPP

Transfection dans E.coli

RQIKIWFQNRRMKWKK- Protéine x

Plasmiderecombinant

CPP (protéine de fusion recombinante)

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

Phosphate de calcium

3 CaCl2 + 2 Na3PO4 Ca3PO4 + 6NaCl

nanoparticules

endosome

Précipitée Ca3PO4 / ADNnanoparticulaire

Membrane plasmique

ADNARNProtéine ?

Endocytose :

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

-

-

-

-

-

--

-

-

-

-

-

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

Polymères ramifiés

Polyéthylénimine (PEI)

Complexe PEI / ADNnanoparticulaire

+

++

++

+

+

+

ADNARNProtéine ?

Endocytose :

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

lipides amphipathiques

régioncationique

région lipidique(hydrophobe)

+

+

++

+

+

+

+

++

++

++

Lipoplexe (nanoparticule)

example : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)

Endocytose :

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

+ - +p ++++- -p pp p

K E T W W E T W W T E W S Q P K K K R K V Cp

Pep-1

Endocytose :peptides amphipathiques

N

O

O

O

O

C

C

régioncationique

régionhydrophobe

+++++++

+++

+++++

+++++

+++++

+++++

+++++

Nanoparticule de Pep-1/cargo (protéine)

Endocytose :peptides amphipathiques

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

ADNARNProtéine

Endocytose :nanoparticules hydrophobes

Lipofection

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

recepteur membranaire

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

virus

virus

Les virusGénome

ADN

ARN

db

sb

Famille

sb+

sb-

PoxviridaeHerpesviridae

Rhabdoviridae

Coronaviridae

Adenoviridae

Picornaviridae

Parvoviridae

Filoviridae

Retroviridae

Réoviridae

Les virusGénome

ADN

ARN

db

sb

Famille

sb+

sb-

PoxviridaeHerpesviridae

Rhabdoviridae

Coronaviridae

Adenoviridae

Picornaviridae

Parvoviridae

Filoviridae

Retroviridae

Réoviridae

Adenoviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Ligands de protéines membranaires :

Adenoviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Adenoviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Adenoviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

= réplication incompétente

E1 déleté

Adenoviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

transgène

Cellules transformées par E1

promoteur E1 genome avec transgène

plasmide

réplication incompétente transgènique virus

transfection

Adenoviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Avantages : transduction très efficace

grande tropisme

Inconvénients : Expression transitoire

Sécurité

Les virusGénome

ADN

ARN

db

sb

Famille

sb+

sb-

PoxviridaeHerpesviridae

Rhabdoviridae

Coronaviridae

Adenoviridae

Picornaviridae

Parvoviridae

Filoviridae

Retroviridae

Réoviridae

Genres :

* Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus

Retroviridae

Genres :

* Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus

Retroviridae

retroviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Avantages : transduction très efficace

Expression stable (intégration)

Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose

faible tropisme

sécurité

retroviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Avantages : transduction très efficace

Expression stable (intégration)

Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose

faible tropisme

sécurité

Genres :

* Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus

Retroviridae

retroviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Avantages : transduction très efficace

Expression stable (intégration)

Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose

faible tropisme

sécurité

rétrovirus : défective pour la réplication

retroviridae

nanoparticules :Endocytose : ligands membranaires :virus

Plasmide

LTR

LTR

Plasmide

Plasmide

gag/pol

env

transfection

Cellule productrice

Recombinaison pendant transcription inverse

U3 R U5 U3 R U5

transgene

3’ LTR inactive

U3 R U5 U3 R U5

transgene

5’ LTR auto-inactivé

promoteur

promoteur

Comment savoir si les cellules transfectées/transduites

expriment la protéine x

- anticorps spécifique

- western blot

- immunofluorescence

- anticorps contre étiquette (epitope tag)

- western blot

- immunofluorescence

- protéine de fusion (fluorescente)

Comment savoir si les cellules transfectées/transduites

expriment la protéine x

- anticorps spécifique

- western blot

- immunofluorescence

- anticorps contre étiquette (epitope tag)

- western blot

- immunofluorescence

- protéine de fusion (fluorescente)

HIS HHHHHH

c-MYC EQKLISEEDL

HA YPYDVPDYA

VSV-G YTDIEMNRLGK

HSV QPELAPEDPED

V5 GKPIPNPLLGLDST

FLAG DYKDDDDK

étiquetage (epitope tagging)

Plasmide

ADN codant

étiquette

ADN codant

Protéine x

promoteur

Comment savoir si les cellules transfectées/transduites

expriment la protéine x

- anticorps spécifique

- western blot

- immunofluorescence

- anticorps contre étiquette (epitope tag)

- western blot

- immunofluorescence

- protéine de fusion (fluorescente)

Etiquetage

Green Fluorescent Protéine (GFP) dsRED

Co-marquageco-transfectionco-traduction (IRES)

mTrim17Pcmv his6 SV40 polyA

ires YFP

his6

YFP

expression transitoire

ou

expression stable

expression transitoire

expression stable

Nécessite une intégration génomique

rétrovirus intégration fortuite

Événement rare

sélection

promoteur 1 promoteur 2

ADN x polyA

polyA

Gene de résistanceantibiotique

expression inductible

tTA-NLSP CMV

SV40 polyA

P CMVmintetO tetOtetO tetO tetO tetO Gene x

Tet repressor/TA

doxycycline

expression inductible

rtTA-NLSP CMV

SV40 polyA

P CMVmintetO tetOtetO tetO tetO tetO Gene x

Reverse Tet repressor/TA

doxycycline