Gain de fonction, perte de fonction. hypothesis-driven research Ce gène active la division...

Gain de fonction, perte de fonction

hypothesis-driven research

Ce gène active la division cellulaire

Puce à ADN

Discovery-driven research

Comparaison ARNm de cellules à division rapide Vs ARNm de cellules à division lente

gène x= candidat

Sur-expression

Gain de fonction

Sous-expression

Perte de fonction

expressionphysiologique

24 h après

Produit de gène x

Gain de fonction

Organisme

Cellule

perte de fonction

sous-expression

Knock Out

sur-expression

Transgénique

Sur-expression

expressionphysiologique

Produit de gene x = protéine x

ARNm codant protéine x

ADN codant protéine x

Approche : Gain de fonction

protéine x

macromolécule informationnelle

protéine x

ARNm codant protéine x


transcription

traduction

? - Source de la macromolécule informationnelle

? - Introduction dans la cellule

Source de la macromolécule informationnelle

Purifiée à partird’une source biologiqueProtéine recombinante

ADN

ARN

Protéine

PCR, Clonage

Transcription in vitro


Plasmide

Promoteur d’ARN polymérasede bactériophage

recombinant


recombinant


Plasmide

ARN polymérasede bactériophage

ARN

Protéine recombinante

Escherichia coli

Transfection

Extraction et purification

Protéine x

Plasmide


recombinant

Promoteur bactérien

Introduction dans la cellule

Transfection*

Transformation*

Transduction*Transfert de matériel génétique d'une bactérie à une autre ou d'une cellule à une autre par l'intermédiaire d'un virus.

Transfert de matériel génétique exogène dans une cellule.

Acquisition par un organisme de caractères héréditaires nouveaux après pénétration dans ses cellules de matériel génétique exogène.

La membrane plasmique est une barrièrephysique à la transfection de protéines

et acides nucléiques

Lipopolysaccharides

peptidoglycan

MembranePlasmiqueintérieurpeptidoglyca

n

MembranePlasmiqueextérieur

Périplasme

lipoprotéine

Porine(protéine)

Transporteur (protéine)

Paroi bactérien (gram -)

Paroi de lévure

Paroi d’une cellule végétale

Paroipectocellulosique

Membraneplasmique

Digestionenzymatique

protoplaste

Cellulevégétale

Production de protoplastes

Digestionenzymatique

Production de sphéroplastes

levure

sphéroplaste

Micro-rupture de la membrane plasmique

Endocytose

Comment faire pénétrer une macromoléculeInformationelle à l’intérieure d’une cellule ?

Fusion membranaire

- Micro-rupture de la membrane plasmique

- Micro-injection

- Choc-osmotique/choc-thermique

- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

- Endocytose

- Fusion membranaire


- Micro-injection

- artificielle

- biologique


- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

Micro-injection : artificielle

Micro-injection : artificielle

Avantages : transfection très efficace

Inconvénients : lourdeur technique

transfection de populations de cellules impossible

Micro-injection : biologique : bactéries

Pilus F

Bactériophage M13

M13

T7

Bactériophage T7

Agrobacterium tumefaciens

galles

Micro-injection : biologique : cellules végétales

Agrobacterium :cycle de vie


- Micro-injection


- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

CaCl2

Cl-

Ca++

LiCH3CO2

Li+

CH3CO2-

Choc-osmotique/choc-thermique

bactérielevure

37°C 42°C

perméabilisation perméabilisation

ADN

H2Oturgescence turgescence

Avantage :

Inconvenients :

Peu onéreuse

transfection de populations de cellules

toxicité

échanges non-spécifiquesd’autres molécules

Choc-osmotique/choc-thermique

faible efficacité


- Micro-injection


- éléctroporation

- Biolistique

- Onde de choc

- ++++

++

+

--

-

---

10 - 100 kV/cm

10 - 1000 s

Electroporation

Electroporation

Interrupteur # 1

Interrupteur # 2

résistance alimentation

capacitance

Electroporation

Avantage :

Inconvenients :

efficacité de transfection


toxicité

échanges non-spécifiquesd’autres molécules

transfectées

....

....

....

....

....

....

....

Rupture de la

hélium

Onde de choc

Biolistique

…………

membrane calibrée

Capsule à microbilles

Grille de rétention

cellules

microbilles en or

hélium

Biolistique

Biolistique

Avantage :

Inconvenients :

Utilisation avec cellules à paroi


Endommage les cellules

Transfection peu uniforme

Nanosecond pulsed laser-induced stress wave

Nanosecond pulsed laser-induced stress wave

Avantage :

Inconvenients :

Technique trop récente

?

?

Agrolistique


Endocytose

Comment faire pénétrer une macromoléculeInformationelle à l’intérieure d’une cellule ?

Fusion membranaire

Endocytose

L’endocytose implique la

capture spécifique de

macromolécules ou

nanoparticules par la

membrane plasmique

Nanoparticules

- molécules amphipathiques

- peptides cationiques

- phosphate de calcium

- polymères ramifiés

Endocytose

- lipides- peptides

Macromolécules cationiques

- hydrophobes - liposomes

- cationiques

- ligands membranaires - virus

Peptides passe-membranes(cell-penetrating peptides : CPP)

-de la protéineantennapaedia

-de la protéinetat de VIH

- oligo arginine

R Q I K I W F Q N R R M K W K K+++ + + ++

G R K K R R Q R R R P P Q C+++ ++ + ++

R R R R R R R R R+++ ++ + +++

Peptides cationiquesEndocytose :

cargo

CPP (conjugaison chimique)

CPP(peptide de synthèse)

conjugaison chimique(liaison covalente)

ProtéineARNADN

G R K K R R Q R R R P P Q C


ADN codant CPP

Transfection dans E.coli

RQIKIWFQNRRMKWKK- Protéine x

Plasmiderecombinant

CPP (protéine de fusion recombinante)