Gain de fonction, perte de fonction. hypothesis-driven research Ce gène active la division...

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  • Gain de fonction, perte de fonction
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  • hypothesis-driven research Ce gne active la division cellulaire Puce ADN Discovery-driven research Comparaison ARNm de cellules division rapide Vs ARNm de cellules division lente gne x = candidat
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  • Sur-expression Gain de fonction Sous-expression Perte de fonction expression physiologique 24 h aprs Produit de gne x
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  • Gain de fonction Organisme Cellule perte de fonction sous-expression Knock Out sur-expression Transgnique
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  • Sur-expression expression physiologique Produit de gene x = protine x ARNm codant protine x ADN codant protine x Approche : Gain de fonction protine x macromolcule informationnelle
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  • protine x ARNm codant protine x ADN codant protine x transcription traduction
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  • ? - Source de la macromolcule informationnelle ? - Introduction dans la cellule
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  • Source de la macromolcule informationnelle Purifie partir dune source biologique Protine recombinante ADN ARN Protine PCR, Clonage Transcription in vitro
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  • Plasmide Promoteur dARN polymrase de bactriophage recombinant ADN codant protine x
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  • recombinant Transcription in vitro Plasmide ARN polymrase de bactriophage ARN
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  • Protine recombinante Escherichia coli Transfection Extraction et purification Protine x Plasmide ADN codant protine x recombinant Promoteur bactrien
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  • Introduction dans la cellule Transfection * Transformation * Transduction * Transfert de matriel gntique d'une bactrie une autre ou d'une cellule une autre par l'intermdiaire d'un virus. Transfert de matriel gntique exogne dans une cellule. Acquisition par un organisme de caractres hrditaires nouveaux aprs pntration dans ses cellules de matriel gntique exogne.
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  • La membrane plasmique est une barrire physique la transfection de protines et acides nucliques
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  • Lipopolysaccharides peptidoglycan Membrane Plasmique intrieur peptidoglycan Membrane Plasmique extrieur Priplasme lipoprotine Porine (protine) Transporteur (protine) Paroi bactrien (gram -)
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  • Paroi de lvure
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  • Paroi dune cellule vgtale Paroi pectocellulosique Membrane plasmique
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  • Digestion enzymatique protoplaste Cellule vgtale Production de protoplastes
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  • Digestion enzymatique Production de sphroplastes levure sphroplaste
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  • Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Comment faire pntrer une macromolcule Informationelle lintrieure dune cellule ? Fusion membranaire
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  • - Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - lctroporation - Biolistique - Onde de choc - Endocytose - Fusion membranaire
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  • Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - artificielle - biologique - Choc-osmotique/choc-thermique - lctroporation - Biolistique - Onde de choc
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  • Micro-injection : artificielle
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  • Avantages : transfection trs efficace Inconvnients : lourdeur technique transfection de populations de cellules impossible
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  • Micro-injection : biologique : bactries Pilus F Bactriophage M13 M13 T7T7 Bactriophage T7
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  • Agrobacterium tumefaciens galles Micro-injection : biologique : cellules vgtales
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  • Agrobacterium : cycle de vie
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  • Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - lctroporation - Biolistique - Onde de choc
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  • CaCl 2 Cl - Ca ++ LiCH 3 CO 2 Li + CH 3 CO 2 - Choc-osmotique/choc-thermique bactrie levure 37C 42C permabilisation ADN H2OH2O turgescence
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  • Avantage : Inconvenients : Peu onreuse transfection de populations de cellules toxicit changes non-spcifiques dautres molcules Choc-osmotique/choc-thermique faible efficacit
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  • Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - lctroporation - Biolistique - Onde de choc
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  • - + + + + + + + - - - - - - 10 - 100 kV/cm 10 - 1000 s Electroporation
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  • Interrupteur # 1 Interrupteur # 2 rsistance alimentation capacitance
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  • Electroporation Avantage : Inconvenients : efficacit de transfection transfection de populations de cellules toxicit changes non-spcifiques dautres molcules
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  • transfectes............................ Rupture de la hlium Onde de choc Biolistique membrane calibre Capsule microbilles Grille de rtention cellules microbilles en or hlium
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  • Biolistique
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  • Avantage : Inconvenients : Utilisation avec cellules paroi transfection de populations de cellules Endommage les cellules Transfection peu uniforme
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  • Nanosecond pulsed laser-induced stress wave
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  • Avantage : Inconvenients : Technique trop rcente ? ?
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  • Agrolistique
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  • Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Comment faire pntrer une macromolcule Informationelle lintrieure dune cellule ? Fusion membranaire
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  • Endocytose Lendocytose implique la capture spcifique de macromolcules ou nanoparticules par la membrane plasmique
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  • Nanoparticules - molcules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymres ramifis Endocytose - lipides - peptides Macromolcules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus
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  • Nanoparticules - molcules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymres ramifis Endocytose - lipides - peptides Macromolcules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus
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  • Peptides passe-membranes (cell-penetrating peptides : CPP) -de la protine antennapaedia -de la protine tat de VIH - oligo arginine R Q I K I W F Q N R R M K W K K + ++ +++ + G R K K R R Q R R R P P Q C + + + +++++ R R R R R R R R R ++++++++ + Peptides cationiques Endocytose :
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  • cargo CPP (conjugaison chimique) CPP (peptide de synthse) conjugaison chimique (liaison covalente) Protine ARN ADN G R K K R R Q R R R P P Q C
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  • ADN codant protine x ADN codant CPP Transfection dans E.coli RQIKIWFQNRRMKWKK- Protine x Plasmide recombinant CPP ( protine de fusion recombinante )
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  • Nanoparticules - molcules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymres ramifis Endocytose - lipides - peptides Macromolcules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus
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  • Phosphate de calcium 3 CaCl 2 + 2 Na 3 PO 4 Ca 3 PO 4 + 6NaCl nanoparticules endosome Prcipite Ca 3 PO 4 / ADN nanoparticulaire Membrane plasmique ADN ARN Protine ? Endocytose : + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - -
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  • Nanoparticules - molcules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymres ramifis Endocytose - lipides - peptides Macromolcules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus
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  • Polymres ramifis Polythylnimine (PEI) Complexe PEI / ADN nanoparticulaire + + + + + + + + ADN ARN Protine ? Endocytose :
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  • Nanoparticules - molcules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymres ramifis Endocytose - lipides - peptides Macromolcules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus
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  • lipides amphipathiques rgion cationique rgion lipidique (hydrophobe) + + + + + + + + + + + + + + Lipoplexe (nanoparticule) example : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Endocytose :
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  • Nanoparticules - molcules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymres ramifis Endocytose - lipides - peptides Macromolcules cationiques - hydrophobes - liposomes - cationiques - ligands membranaires - virus
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  • +-+ p ++++-- pppp K E T W W E T W W T E W S Q P K K K R K V C p Pep-1 Endocytose : peptides amphipathiques N O O O O C C rgion cationique rgion hydrophobe
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  • + + + + + + + + + + +++++ +++++ +++++ + + + + + + + + + + Nanoparticule de Pep-1/cargo (protine) Endocytose : peptides amphipathiques
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  • Nanoparticules - molcules amphipathiques - peptides cationiques - phosphate de calcium - polymres ramifis Endocytose - lipides - peptides Macromolcules cationiques - hydrophobes - liposomes - cation