Post on 15-Jul-2020
1
ACADEMIE UNIVERSITAIRE WALLONIE-EUROPE
UNIVERSITE DE LIEGE
FACULTE DE MEDECINE VETERINAIRE
DEPARTEMENT DE MORPHOLOGIE ET PATHOLOGIE
SERVICE DE PATHOLOGIE SYSTEMIQUE ET AUTOPSIES
CARACTÉRISATION DES FACTEURS IMPLIQUÉS DANS LA
RÉSISTANCE/SENSIBILITÉ À L’INFECTION PAR UN VIRUS INFLUENZA A EN
MODÈLES MURINS MX-NÉGATIFS
CHARACTERIZATION OF HOST FACTORS INVOLVED IN
RESISTANCE/SUSCEPTIBILITY TO ONE INFLUENZA A VIRUS INFECTION IN
MX-NEGATIVE MOUSE MODELS
Tomás CASANOVA BUSTOS
THESE PRESENTEE EN VUE DE L’OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR EN
SCIENCES VETERINAIRES
ANNEE ACADEMIQUE 2015-2016
2
Remerciements
Je souhaite tout d’abord remercier les professeurs Daniel Desmecht et Freddy Coignoul pour
m’avoir accueilli au sein du laboratoire de Pathologie de la Faculté de Médecine Vétérinaire
de l’Université de Liège.
Merci à Daniel Desmecht pour m’avoir invité à faire partie de son équipe et donné tous les
moyens nécessaires pour développer cette recherche de la meilleure façon possible.
Merci à mon promoteur et ami Mutien Garigliany pour son aide infinie, sa confiance et son
implication dans le travail. Merci de m’avoir transmis des bases scientifiques solides qui
m’ont ainsi permis de progresser en autonomie et en capacité de travail, je lui en serai
toujours reconnaissant.
Aux enseignants, pour avoir partagé avec moi vos précieuses connaissances en pathologie,
merci Daniel, Mutien, Dominique, Thierry, Sandra et Calixte.
Merci à Nathalie, pour son aide administrative, ses conseils, ses corrections de la langue
française et surtout pour son amitié.
Pour votre aide, disponibilité et nos discussions professionnelles et plus généralement sur la
vie, je remercie à Michaël, Etienne, Gautier, Nidal, Fran, Jessy, Annalisa, Deborah, Jérôme,
Michel, Hoang, Thomas, Nathalie C., Adélite, Hussein, Marie-Pierre, Martin, Els, François,
Tam, Phai, Anne-Sophie et Audrey.
A toute l’équipe, aux membres passés et présents, pour m’avoir fait sentir comme chez moi et
m’avoir montré la « chaleur » de la Belgique, je vous dois beaucoup plus que ces petits
paragraphes, merci !
A maman, papa, Romina, ma famille et mes amis.
3
Liste des abréviations
ADN / DNA : acide désoxyribonucléique / desoxyribonucleic acid
ADNc / cDNA : ADN complémentaire / complementary DNA
AMs : alveolar macrophages
ARN / RNA : acide ribonucléique / ribonucleic acid
ARNc / cRNA : ARN complémentaire / complementary RNA
ARNm / mRNA : ARN messager / messenger RNA
BEBM : bronchial epithelial cell basal medium
BSA : bovine serum albumin
CanX : calnexin
CD : cluster of differentiation
CPSF : Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor
CRM1 : Chromosome Maintenance Protein 1
Ct : cycle threshold
DC-HIL : dendritic cell-associated heparan sulfate proteoglycan-integrin ligand
DMEM : Dulbecco’s minimal essential medium
dsRNA : double-stranded RNA
EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay
F1 : first filial generation
FACS : fluorescence activated cell sorting
FBS : fetal bovine serum
GCP-2 : granulocyte chemotactic protein 2
G-CSF : granulocyte-colony stimulating factor
4
Gpnmb : transmembrane glycoprotein NMB
HA : hémagglutinine / hemagglutinin
Hc : hemolytic complement
HE : hematoxylin and eosin
HEPA : high efficiency particulate air filter
HPAI/LPAI : highly/low pathogenic avian influenza
HTAB : hexadecyltrimethyl ammonium bromide
IFN : interféron / interferon
IFNAR : interferon-alpha/beta receptor
Ig : immunoglobuline
IHC: immunohistochimie
IL : interleukine / interleukin
IP-10 : interferon gamma-induced protein 10
IRF3 : interferon regulatory factor 3
IRF3 : IFN-regulatory factor 3
ISGs : IFN-stimulated genes
JAK : Janus kinase
KC : keratinocyte chemoattractant
MAVS : mitochondrial antiviral signaling protein
MCP-1 : monocyte chemoattractant protein-1
MDA-5 : melanoma differentiation-associated protein 5
MHC : major histocompatibility complex
MIP-1α : macrophage inflammatory protein 1α
MIP-2 : macrophage inflammatory protein 2
MOI : multiplicity of infection
5
MPO : myeloxperoxydase
Mx : myxovirus resistance
NA : neuraminidase
NEP : nuclear export protein
Neu5Ac : N-acetylneuraminic acid
Neu5Gc : N-glycolylneuraminic acid
NF-κB : nuclear factor-kappa b
NK : natural killer
NLRP3 : NOD-like receptor familly, pyrin domain-containing 3
NOD : nucleotide-binding oligomerization domain receptors
NP : nucléoprotéine / nucleoprotein
NS1 : non structural protein 1
OD : optic density
OIE : Organisation mondiale de la santé animale
P32 : virus influenza A/swine/Iowa/4/1976 murinisé
PA : polymerase acidic protein
PAMPs : motifs moléculaires associés aux pathogènes
PAR2 : proteinase-activated receptor 2
PB1 : polymerase basic protein 1
PB2 : polymerase basic protein 2
PBS : phosphate buffered saline
PFU : plaque forming unit
pi : post-infection
PKR : protein kinase R
PRRs : pattern recognition receptors
6
QTL : quantitative trait loci
RANTES : regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
RIG-I : retinoic acid-inducible gene I
RPMI : Roswell park memorial institute
RT-PCR : reverse transcription – polymerase chain reaction
SA : sialic acid
SD : standard deviation
STAT : signal transducer and activator of transcription
T II P : type II alveolar cells
TCID50 : 50% tissue culture infective dose
TEC : tracheal epithelial cells
TLR : toll-like receptors
TNFα : tumor necrosis factor α
TPCK : tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone
TRIF: TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β
Trl3 : tuberculosis resistance locus 3
UV : ultra violet
WHO : World Health Organization
7
Résumé
Le virus influenza A constitue un problème majeur de santé publique. On estime que
chaque année entre 10 et 15% de la population mondiale est infectée par une souche
épidémique saisonnière de virus influenza A. Généralement, le syndrome présenté est bénin et
est caractérisé par un épisode fébrile. Par contre, chez les personnes à risque, le tableau
clinique peut être plus sévère voire fatal et consister en une pneumonie virale souvent
aggravée par des infections bactériennes secondaires. Par ailleurs, les souches pandémiques
présentent généralement des taux de morbidité et de mortalité plus élevés. Chez les animaux,
le virus influenza est responsable de pertes économiques importantes dans les élevages de
porcs et de volailles, par diminution des performances de production et par la mise en œuvre
de programmes de contrôle et de prévention. Des souches spécifiques sont décrites chez le
cheval, les mammifères marins et les oiseaux, dont certaines possèdent un potentiel
zoonotique.
Bien que la souris ne soit pas une hôte naturel du virus, elle est largement utilisée comme
modèle pour étudier la pathogénie de la maladie chez les mammifères. Les souris DBA/2J et
C57BL/6J constituent deux extrêmes en termes de sensibilité/résistance au virus influenza A
parmi les lignées de souris Mx-négatives. Lorsque ces deux lignées de souris ont été infectées
par différentes souches de virus influenza A, la souris DBA/2J s'est systématiquement
montrée beaucoup plus sensible. Plusieurs équipes se sont attelées à l’étude des facteurs
expliquant cette différence par des approches génétiques, ayant eu recours à des Recombinant
Inbred Lines entre ces deux lignées. Ces études ont résulté en de longues listes de gènes-
candidats, dont l’importance relative n’a pas pu être déterminée. Nous avons de notre côté
choisi une approche phénotypique, en disséquant chaque étape de l’infection, de manière à
identifier directement les facteurs liés aux différences de sensibilité entre les lignées. Des
observations préliminaires menées au sein de notre laboratoire suggéraient que soit les voies
8
respiratoires de DBA/2J amplifient le virus de façon plus importante, soit les macrophages
alvéolaires de C57BL/6J phagocytent les particules virales et/ou limitent la réplication virale
plus efficacement, soit une conjonction de ces phénomènes. Par ailleurs, l’impact de la
déficience des souris DBA/2J en facteur C5 du complément sur leur sensibilité exacerbée au
virus influenza devait être analysé.
Sur cette base, nous avons étudié la permissivité in vitro de différents types cellulaires de
l’arbre respiratoire des souris DBA/2J et C57BL/6J à l’infection par le virus et l’influence des
récepteurs membranaires de type acides sialiques sur cette permissivité. Cela nous a permis de
montrer que l’amplification des particules virales était plus efficace dans les cellules des voies
respiratoires de DBA/2J, en corrélation avec une expression accrue de récepteurs au virus en
surface des cellules de cette lignée. Ensuite, nous avons comparé les capacités de phagocytose
des macrophages alvéolaires des deux lignées de souris, ainsi que leur expression de
cytokines et chimiokines après infection, ce qui a mis en évidence des capacités de
phagocytose conservées mais une activité d’expression de cytokines et chimiokines très
diminuée chez les macrophages de DBA/2J. Par ailleurs, nous n’avons pas identifié d’effet de
l’absence de facteur C5 du complément sur la sensibilité des souris DBA/2J au virus influenza
A. Enfin, nos expériences de déplétion et de transfert adoptif des macrophages alvéolaires ont
clairement démontré le rôle central joué par les macrophages alvéolaires, et notamment leur
taux d’expression des interférons de type I, sur la résistance des souris à l’infection par le
virus influenza.
9
Summary
Influenza A virus represents a major threat to public health. It is estimated that about 10 to
15% of the global population is annually infected by a seasonal influenza A strain. In most
cases, symptoms are mild and characterized by transient fever. But in high-risk patients the
clinical picture can be much more severe or even lethal and consists of a viral pneumonia
often followed by bacterial superinfection. Besides, pandemic strains of the virus are
generally associated with higher levels of morbidity and mortality. In animals, influenza virus
is responsible for significant economic losses in pig and poultry sectors, due to decreased
performance in production and to the cost of prevention and control plans. Specific influenza
strains have been described in horses, marine mammals and birds, some of which are
potentially zoonotic.
Although mouse is not a natural host for the virus, it has been widely used as a model to study
the pathogenesis of influenza pneumonia in mammals. DBA/2J and C57BL/6J laboratory
mice are extremes in terms of susceptibility and resistance, respectively, to influenza A virus
infection among Mx-negative inbred lines. After infection by a series of influenza A virus
strains, DBA/2J mouse was systematically much more susceptible. Several research teams
specifically addressed the question of the factors involved in such differences in susceptibility
using genetic methods based on recombinant inbred lines between the two parental mouse
strains. These studies resulted in large lists of candidate genes whose individual contribution
has not been confirmed so far. We chose a phenotypic approach, aiming at analyzing every
single step of the infection process, to put the finger on the factors associated to susceptibility
or resistance. Preliminary observations in the laboratory suggested that either DBA/2J airways
are more permissive to the virus or alveolar macrophages of this mouse line are inefficient in
terms of phagocytosis and/or control of the viral infection, or a mix of these two mechanisms.
10
Beside this, the role played by the absence of C5 complement factor in DBA/2J on the
increased susceptibility of this mouse strain to influenza infection remains to be determined.
To answer these questions, we assessed the in vitro permissivity to influenza of several cell
types from the airways of DBA/2J and C57BL/6J and the impact of the relative amounts of
sialic acid receptors on cells from both mouse strains. We observed that the infection of
respiratory cells from the susceptible DBA/2J mice resulted in higher viral titers, together
with an increased expression of viral receptors on cells from this mouse strain. Next, we
compared the phagocytic activity of alveolar macrophages from both mouse lines and the
expression of cytokines and chemokines by this cell type upon infection. It appeared that
alveolar macrophages from DBA/2J were not deficient in terms of phagocytosis but showed a
dramatically lower expression of cytokines and chemokines when infected by the virus
compared to those from C5BL/6J mice. Besides, we showed that the absence of C5
complement factor in DBA/2J mice was not responsible for its high susceptibility to influenza
A virus. Finally, experiments of depletion and adoptive transfer of alveolar macrophages
allowed us to conclude to the critical role played by this cell type in the resistance to influenza
A virus, at least in part thanks to its ability to produce type I interferons.
11
Table de matières
Remerciements……………………………………………………………………………….. 2
Liste des abréviations………………………………………………………………………… 3
Résumé……………………………………………………………………………………….. 7
Summary……………………………………………………………………………………….8
Table des matières…………………………………………………………………………… 11
1 INTRODUCTION ............................................................................................................ 13
1.1 Le virus influenza A .................................................................................................. 13
1.1.1 Classification .......................................................................................................... 13
1.1.2 Structure virale ....................................................................................................... 13
1.1.3 Les protéines du virus influenza ............................................................................ 14
1.1.4 Le cycle viral .......................................................................................................... 24
1.1.5 Epidémiologie et pathogénie .................................................................................. 31
1.2 La souris comme modèle d’infection par le virus influenza A .................................. 33
1.2.1 Avantages pratiques ............................................................................................... 33
1.2.2 Limites du modèle murin ....................................................................................... 34
1.2.3 Sensibilité et signes cliniques ................................................................................ 35
1.2.4 Les récepteurs au virus influenza A chez la souris ................................................ 35
1.2.5 Adaptation du virus à la souris ............................................................................... 36
1.2.6 Les souris DBA/2J et C57BL/6J comme extrêmes de sensibilité/résistance au virus
influenza parmi les souches Mx-négatives ........................................................................ 37
1.3 Immunité innée et virus influenza ............................................................................. 44
1.3.1 Mécanismes de détection du virus influenza A ..................................................... 45
1.3.2 Les médiateurs de l’inflammation ......................................................................... 48
1.3.3 Rôle du macrophage alvéolaire .............................................................................. 56
12
1.3.4 Rôle d’autres types cellulaires ............................................................................... 61
1.4 Résultats préliminaires .............................................................................................. 63
1.5 Objectifs..................................................................................................................... 69
2 RESULTATS .................................................................................................................... 71
2.1 Hyporeactivity of alveolar macrophages and higher respiratory cell permissivity
characterize DBA/2J mice infected by influenza A virus ..................................................... 71
2.2 The critical role played by alveolar macrophages in the resistance to influenza
pneumonia is mediated by type I interferons ...................................................................... 115
3 DISCUSSION GENERALE ........................................................................................... 140
4 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ......................................................................... 158
5 BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................... 161
13
1 INTRODUCTION
1.1 Le virus influenza A
1.1.1 Classification
Le virus influenza A est un virus enveloppé, composé d’ARN monocaténaire, segmenté et de
polarité négative ; il fait partie de la famille des Orthomyxoviridae. Dans cette famille, cinq
genres sont décrits : influenza de type A, B, et C, thogotovirus et isavirus (Baltimore, 1971).
On distingue plusieurs sous-types de virus influenza A, selon les propriétés antigéniques de
leur hémagglutinine (HA) et de leur neuraminidase (NA), deux glycoprotéines de l’enveloppe
virale. A ce jour, dix-huit sous-types d’HA et 11 sous-types de NA ont été décrits, avec
plusieurs combinaisons possibles (Webster et al., 1992; Fouchier et al., 2005). Les deux
derniers sous-types d’HA et de NA identifiés à ce jour, correspondant aux souches H17N10 et
H18N11, ont été isolés à partir de chauves-souris au Guatemala (Tong et al., 2012; Tong et
al., 2013).
L’International Committee on Taxonomy of Viruses a défini un format standard pour la
dénomination des souches de virus influenza A : type/espèce animale de laquelle a été isolée
la souche virale (sauf si isolé chez l’homme)/lieu d’isolement/année/numéro de la souche
(sous-type). Par exemple, l’isolat 15 d’une souche de sous-type H1N1 isolée d’un porc en
Iowa en 1930 est désigné « A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1) ».
1.1.2 Structure virale
Les virus influenza de type A possèdent huit segments d’ARN génomique, codant chacun
pour une ou deux (jusqu’à quatre potentiellement pour le segment 7) protéines/peptides
(Wright et al., 2007). Les protéines du virus sont l’hémagglutinine (HA), la neuraminidase
14
(NA), les protéines de la matrice M1 et M2, la protéine non structurale (NS1), la protéine
d’export nucléaire (NEP, anciennement appelée NS2), la nucléoprotéine (NP) et les trois
composants de la polymérase virale, PB1 (polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) et
PA (polymerase acidic) (Webster et al., 1992). Pour certains sous-types, le segment
génomique 2 (PB1) code pour une seconde protéine, appelée PB1-F2 (Chen et al., 2001). Les
protéines M2, le peptide M3 (pour certaines souches, le peptide M4), ainsi que la protéine
NEP sont générés par « splicing » (épissage) des ARN messagers de M1 et NS1,
respectivement (Inglis et al., 1979; Lamb et Choppin, 1979; Lamb et al., 1981; Robb et
Fodor, 2012). La PB1-F2 est transcrite au départ d’un cadre de lecture alternatif du gène PB1
(Chen et al., 2001). L’enveloppe virale est composée d’une membrane lipidique provenant de
la cellule de l’hôte et comprend trois types de protéines de surface, HA, NA et M2, un canal à
ions. Les proportions de HA et NA vont respectivement de 4:1 à 5:1 et on compte environ dix
protéines M2 par 100 HA (Wright et al., 2007). La protéine M1 est la plus abondante (3000
par virion). Le complexe « ribonucléoprotéine » (RNP) est composé de l’ARN génomique et
de la polymérase virale (30 à 60 unités par virion) comprenant les sous-unités PB1, PB2 et
PA, ainsi que de la NP (Inglis et al., 1976; Wright et al., 2007). Figure 2(A)-Tableau 1
1.1.3 Les protéines du virus influenza
Les protéines du virus influenza A peuvent être classées selon leur localisation dans le virion
en protéines externes et internes. L’HA, NA et le canal ionique M2 sont les protéines externes
incrustées dans l’enveloppe du virus provenant de la membrane plasmique (figure 2), elles
sont synthétisées dans les ribosomes liés au réticulum endoplasmique et insérées dans la
membrane via l’appareil de Golgi. Les protéines internes sont synthétisées dans les ribosomes
libres du cytoplasme, ce sont : NP, les polymérases, NS1, M1 et NEP. Les principales
fonctions des protéines du virus sont décrites dans le tableau 1. Ci-dessous, nous détaillons
15
brièvement les protéines du virus influenza A et leurs fonctions, en insistant sur les protéines
virales impliquées dans l’inhibition de la réponse immunitaire et dans l’induction du « shut
off » (extinction) des fonctions cellulaires.
1.1.3.1 L’hémagglutinine
Encodée par le segment 4 du génome viral, l’HA forme des homotrimères dans lesquels
chaque sous-unité a une taille de 74 kDa dans sa conformation HA0 (non clivée). Son nom
vient des propriétés d’agglutination des globules rouges qu’elle confère aux particules de
virus influenza (Henle et Henle, 1949). Ses fonctions principales sont l’attachement à la
cellule-hôte et la fusion de la membrane plasmique cellulaire (endosomale) avec l’enveloppe
virale. L’HA est l’antigène majeur du virus influenza A. Au cours de sa synthèse et du
transport dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi, elle subit une série de
glycosylations (Ward et al., 1980; Naim et Roth, 1993).
1.1.3.2 La neuraminidase
La NA est une protéine tétramérique, présente à la surface du virion et encodée par le segment
6 du génome viral. Elle est exprimée en phase tardive du cycle viral et est, comme l’HA,
glycosylée. La neuraminidase est le deuxième déterminant antigénique (après l’HA) et elle
possède une action enzymatique de type « sialidase » qui permet par clivage des acides
sialiques de la membrane plasmique de l’hôte de libérer les particules virales néoformées. La
neuraminidase est la cible moléculaire des drogues antivirales oseltamivir (Tamiflu, Roche) et
zanamivir (Relenza, GlaxoSmithKline) (Palese et al., 1974; Varghese et Colman, 1991).
16
1.1.3.3 Le canal à protons M2
La protéine M2 est encodée par le segment 7 du génome viral par épissage alternatif du
transcrit de la protéine M1 (Lamb et al., 1981). La protéine M2 possède un poids moléculaire
de 11 kDa (97 résidus) et forme des homotétramères. La protéine M2 forme des canaux à
protons qui assurent l’acidification interne du virion au sein de l’endosome, action
primordiale pour la libération des ribonucléoprotéines de la protéine de matrice M1
(Stegmann, 2000; Nishimura et al., 2002).
1.1.3.4 La protéine de matrice M1
La protéine M1 constitue l’élément le plus abondant du virion. C’est une protéine de 28 kDa
(252 acides aminés), également encodée par le segment 7 du génome viral (Lamb et Krug,
2001). C’est la protéine structurale principale du virus, elle tapisse l’intérieur de l’enveloppe
viral et détermine la forme des virions. La protéine M1 interagit à la fois avec la membrane
lipidique et avec les segments du génome viral et joue à ce titre un rôle crucial durant la phase
d’encapsidation (Gregoriades, 1980; Ye et al., 1987). De plus, l’expression ectopique de la
protéine M1 provenant d’un plasmide recombinant induit la formation des structures
tubulaires et des particules « pseudo-virales », ce qui fait supposer leur rôle central dans le
processus de libération du virion (Gomez-Puertas et al., 2000).
1.1.3.5 La nucléoprotéine NP
La NP est une protéine de 58 kDa (498 acides aminés) encodée par le segment 5 du génome
viral. Cette protéine se lie à l’ARN du virus et est un facteur indispensable à la transcription et
la réplication virale (Huang et al., 1990; Mena et al., 1994). La protéine NP constitue la base
structurelle des ribonucléoprotéines virales et, grâce à la présence de signaux de localisation
17
nucléaire, elle permet l’import nucléaire des RNPs entrantes (Ruigrok et Baudin, 1995;
Neumann et al., 1997; Wang et al., 1997).
1.1.3.6 Le complexe polymérase
La polymérase virale est composée de trois sous-unités, les polymérases basiques PB1 et PB2
et la polymérase acide PA. Les trois sous-unités sont indispensables à l’accomplissement du
cycle complet de transcription et réplication du génome viral.
Brièvement, l’activité « polymérase » au sens strict est assurée par la sous-unité PB1, encodée
par le segment 2. PB2 est encodée par le premier segment du génome viral , elle reconnait les
coiffes 5’ m7 Gppp des ARN messagers cellulaires, partie essentielle du phénomène de « cap
snatching » par le virus (Li et al., 2001). La sous-unité polymérase acide (PA) est une
phosphoprotéine encodée par le segment génomique 3, elle appartient à la famille des serines
protéases de type chimiotrypsine. Elle est impliquée dans la dégradation de certaines
protéines et possède également l’activité endonucléase permettant le clivage des ARN
messagers cellulaires 10 à 13 nucléotides en aval de leur coiffe au cours du « cap snatching »
(Sanz-Ezquerro et al., 1995; Sanz-Ezquerro et al., 1998; Hara et al., 2001).
1.1.3.7 Protéine PB1-F2
Cette protéine est encodée par le segment 2 du génome viral, dans un cadre de lecture
alternatif (ORF2) du gène PB1 pour certaines souches de virus influenza (Chen et al., 2001).
Cette protéine se localise principalement dans les mitochondries des cellules infectées et peut
induire l’apoptose et la mort cellulaire (Chen et al., 2001). PB1-F2 forme des canaux ioniques
non sélectifs, induit de l’inflammation et stimule la réponse en anticorps ; quand elle est liée à
la PB1, elle augmente son activité polymérase (Mcauley et al., 2010). Bien que PB1-F2
18
puisse être considérée comme un facteur de virulence, le mécanisme n’est pas tout à fait
compris. La version active de PB1-F2 est présente chez la plupart des virus d’origine aviaire
mais elle devient tronquée au cours du processus d’adaptation aux hôtes mammifères. Il en
résulte une perte du signal de localisation mitochondriale, ce qui induit une baisse de
virulence (Chakrabarti et Pasricha, 2013; Pasricha et al., 2013).
La capacité de PB1-F2 à induire l’apoptose des cellules de l’hôte est liée la formation de
pores dans la membrane mitochondriale. Cette action est menée grâce à l’hélice alpha de
PB1-F2 qui déstabilise et perméabilise la membrane interne de la mitochondrie, provoquant
ainsi sa fragmentation (Chanturiya et al., 2004; Zamarin et al., 2005). L’exposition de cellules
à une protéine PB1-F2 recombinante induit leur apoptose. A l’opposé, la suppression de
l’expression de PB1-F2 par le virus diminue considérablement sa capacité à induire
l’apoptose dans des cellules immunitaires, probablement les principales cibles de PB1-F2
(Chen et al., 2001). De plus, un lien a été établi entre la mitochondrie et l’activation de
l’immunité innée via activation des interférons de type I par voie des récepteurs
intracellulaires RIG-1, MAVS et NLRP3 (voir point 1.3.1 : Mécanismes de détection du
virus). Ainsi, PB1-F2 serait impliquée dans l’inhibition de la réponse des IFNs de type I par
suppression des signalisations RIG-1 et NLRP3 (Seth et al., 2005; West et al., 2011; Zhou et
al., 2011; Koshiba, 2013).
1.1.3.8 La protéine PA-X
La protéine PA-X est encodée par le segment 3 du génome viral par un cadre de lecture
alternatif du gène PA (Jagger et al., 2012). Parmi les fonctions décrites pour PA-X figurent la
diminution de la réponse immunitaire et l’induction du « shut off » de la cellule infectée. Des
expériences in vitro ont mis en évidence que PA-X diminuait l’expression des gènes
19
cellulaires dont l’expression des ARNm d’IFN-β et de β-actine, qu’elle inhibait l’apoptose et
qu’elle modulait la virulence des virus influenza A (Jagger et al., 2012; Hayashi et al., 2015).
1.1.3.9 La protéine non structurale NS1
NS1 est encodée par le segment 8 du génome viral (Inglis et al., 1979; Lamb et Choppin,
1979). Cette protéine est exprimée dans la cellule infectée, mais pas dans le virion, d’où son
nom. C’est une protéine de 27 kDa et 230 résidus. NS1 possède plusieurs fonctions, dont la
plus importante est l’inhibition de la réponse immunitaire innée (Ayllon et Garcia-Sastre,
2015), mais aussi l’inhibition de l’export nucléaire des ARNm cellulaires par liaison du
facteur CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) (Nemeroff et al., 1998) et la
stimulation de la traduction des ARNm viraux (Salvatore et al., 2002).
La protéine NS1 constitue le principal antagoniste de la réponse immunitaire innée au cours
de l’infection par le virus influenza, notamment par sa capacité à inhiber le système des IFNs
de type I, phénomène qui se passe à différents niveaux. De par l’effet antiviral majeur des
interférons, cette fonction de NS1 est critique pour l’efficacité de la réplication virale. Ainsi,
l’histoire de la protéine NS1 se croise avec celle des interférons. En effet, trois ans seulement
après la découverte des IFNs, Lindenmann (1960) décrit l’ « interférence inverse », qui faisait
référence à la capacité du virus influenza infectant à bloquer la production des IFNs par la
cellule, phénomène principalement médié par la protéine NS1 (Egorov et al., 1998; Garcia-
Sastre et al., 1998).
Les cellules des mammifères ont développé un système défensif sophistiqué, basé
principalement sur la reconnaissance de l’intrusion des agents pathogènes et le déclenchement
de cascades de signalisation visant principalement la production des IFNs de type I. Ces IFNs
sont des cytokines à action autocrine et paracrine, avec pour objectif d’alerter les cellules
adjacentes de la présence d’un pathogène et promouvoir un état antiviral efficace, à travers
20
l’expression de toute une série de gènes stimulés par les interférons (ISG) (Garcia-Sastre,
2011; Schneider et al., 2014c). Ce système non seulement limite la réplication et la
propagation virale, mais va également stimuler la réponse immunitaire adaptative (Iwasaki et
Medzhitov, 2010). Il n’est pas surprenant que les souches de virus influenza aient développé
des moyens de contrôle de la réponse IFN, dont la protéine NS1 est le principal protagoniste
(Ayllon et Garcia-Sastre, 2015). Cet effet, variable selon les souches du virus, est médié par
une action de NS1 à plusieurs niveaux.
Inhibition pré-transcriptionelle : l’activation des IFNs est déclenchée suite à la reconnaissance
de patrons moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) par des détecteurs spécialisés, les
récepteurs PRRs, qui se classent selon leur localisation intracellulaire (voir 1.3.1 Mécanismes
de détection du virus) (Takeuchi et Akira, 2009). RIG-1 (retinoic acid-inductible gene 1) est
un récepteur PRRs cytosolique qui détecte le groupement « 5’-triphosphate » présent à
l’extrémité des ARN non coiffés, groupement absent de la grande majorité des ARN
cellulaires et relativement spécifique des ARN viraux, bien que certains ARN bactériens et
synthétiques puissent également activer cette voie (Yoneyama et al., 2004). Suite à cette
liaison, RIG-1 subit un changement de conformation qui va lui permettre de se lier à
l’adaptateur mitochondrial MAVS (mitochondrial antiviral signaling). Celui-ci va activer un
système de « multi kinase » qui conduit à la translocation nucléaire des facteurs de
transcription IRF3 et NF-κB, lequels, une fois dans le noyau, vont déclencher l’expression des
gènes des IFNs (Mcwhirter et al., 2005). La protéine NS1 est capable de bloquer l’activation
de IRF3 et NF-κB, et donc de provoquer la suppression pré-transcriptionnelle des IFNs (Talon
et al., 2000; Wang et al., 2000). Cette inhibition va se produire tout au début de la voie de
signalisation, la protéine NS1 se liant à RIG-1 et formant un complexe, détectable par co-
immunoprécipitation (Opitz et al., 2007; Pichlmair et al., 2012) mais l’action de NS1 sur la
voie RIG-1 se fait aussi par liaison à des molécules nécessaires à son oligomérisation et son
21
activation par ubiquitination, dont les ligases TRIM25 et Riplet ubiquitin E3 (Gack et al.,
2009; Rajsbaum et al., 2012). Figure 1
Inhibition co- et post-transcriptionnelle : la protéine NS1 de plusieurs souches de virus
influenza A peut aussi supprimer de façon efficace l’expression des gènes cellulaires en
interférant directement avec le processus d’export nucléaire des pré-ARNm de l’hôte. Dans
les cellules eucaryotes, les extrémités 3’ des transcrits sont clivées et polyadénylées suite à la
reconnaissance de la séquence conservée « AAUAAA », près du site de clivage. Le
« Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor » (CPSF) est un complexe protéique,
constitué de quatre sous-unités, qui reconnait la séquence « AAUAAA », se lie à l’ARNm
naissant et va permettre l’addition d’une queue Poly(A) (Wahle et Keller, 1996; Colgan et
Manley, 1997). La protéine NS1 se lie à la sous-unité « CPSF30 » et va inhiber la liaison du
complexe CPSF avec les pré-ARNm et par là-même le clivage et la polyadénylation de ces
derniers (Barabino et al., 1997; Twu et al., 2006; Das et al., 2008). Le blocage du CPSF
entraîne l’inhibition du processus d’export nucléaire des ARNm cellulaires et l’expression des
gènes cellulaires, dont les « gènes stimulés par les interférons » (ISGs) (Fortes et al., 1994;
Qiu et Krug, 1994). Figure 1
Inhibition post-traductionnelle des ISGs : la protéine NS1 est de plus capable de bloquer les
effets antiviraux des certains ISGs par action directe. Les mieux connus sont les effets sur la
protéine kinase R « PKR » et sur l’OAS (2’-5’-oligo(A) synthetase). La PKR est une protéine-
kinase se liant à l’ARN exprimée constitutivement dans une conformation inactive et qui est
activée par changement de conformation suite, entre autres, à la liaison à de l’ARN double
brin (Hovanessian, 1989). En bref, la PKR suite à son activation, va phosphoryler plusieurs
substrats menant à l’activation de plusieurs voies et mécanismes de contrôle de l’infection.
L’activité antivirale la mieux décrite est celle médiée par la phosphorylation par la PKR du
« Facteur Initiateur de la Traduction Eucaryote » (eIF2) qui induit le blocage de la synthèse
22
des protéines dans la cellule par conséquent un « avortement » du cycle viral (Garcia et al.,
2006). Il a été démontré que la protéine virale NS1 était capable de lier à l’extrémité N-
terminale de la PKR et d’empêcher le changement de conformation de PKR nécessaire à son
activation (Li et al., 2006; Min et al., 2007). De son côté, l’OAS est une protéine dont
l’expression est stimulée par les interférons et qui a comme fonction l’activation de l’enzyme
« ARNase L », un puissant inhibiteur du cycle viral de par sa capacité à dégrader l’ARN viral
(Silverman, 2007). Le mécanisme par lequel la protéine NS1 est capable d’inhiber l’OAS et
l’action enzymatique de l’ARNase L n’est pas encore complètement connu et pourrait
impliquer la séquestration des ARN viraux, les rendant ainsi inaccessibles à ces enzymes
(Min et Krug, 2006). Figure 1
23
Figure 1 : Vue générale des principales fonctions de la protéine NS1 du virus influenza A
dans le cytoplasme et noyau cellulaire des cellules infectées. La protéine NS1 est le principal
antagoniste viral des IFNs cellulaires et joue également un rôle critique dans le contrôle viral
de la machinerie d’expression des gènes cellulaires. NS1 inhibe la voie des IFNs au niveau
pré-transcriptionnel el par blocage de la plateforme de détection et de signalisation RIG-1,
mais aussi au niveau post-traductionnel par suppression de l’activation des gènes antiviraux
PKR et OAS. Dans le noyau, la NSI inhibe le processus d’export des ARNm cellulaires,
24
empêchant ainsi l’expression des gènes cellulaires, dont les ISGs (Ayllon et García-Sastre,
2015).
1.1.3.10 La protéine d’export nucléaire NEP (ex NS2)
La NEP est une petite protéine de 14 kDa, constituée de 121 acides aminés, produite par
l’épissage de l’ARNm de la protéine NS1, encodée par le segment génomique 8 du virus
(Inglis et al., 1979; Lamb et Choppin, 1979). Bien que son ancien nom était « protéine non
structurale 2 », elle est en réalité présente dans le virion (Yasuda et al., 1993). Comme son
nouveau nom l’indique, NEP va se lier à l’exportine cellulaire CRM1 (Chromosome
Maintenance Protein 1), permettant ainsi l’export nucléaire des ribonucléoprotéines virales
natives (Neumann et al., 2000; Akarsu et al., 2003).
1.1.4 Le cycle viral
1.1.4.1 Attachement
Pour entamer le cycle réplicatif, le virus influenza A doit adhérer à la surface des cellules de
l’hôte, plus spécifiquement aux acides sialiques terminaux des glycoprotéines des membranes
cellulaires. Ce contact entre le virus et les acides sialiques membranaires cellulaires de l’hôte
se fait au travers de l’hémagglutinine (Weis et al., 1988; Wright et al., 2007). Ces acides
sialiques se trouvent au niveau de l’extrémité des N-glycans, O-glycans et
glycospohingolipides en surface des cellules-cibles (Suzuki, 2005). Il existe plus de 40 types
différents d’acides sialiques dans la nature, mais les principaux sont l’acide 5-N-
acétylneuraminique (Neu5Ac) et l’acide 5-N-glycolylneuraminique (Neu5Gc), qui diffèrent
au niveau du groupe fonctionnel en position C-5 (Masuda et al., 1999). Le Neu5Gc a été
décrit dans la trachée du cheval et du porc, dans l’intestin du canard mais pas dans
l’épithélium des voies respiratoires de l’homme. Les souches équines de virus influenza sont
25
capables de se lier à ce type de récepteur (Suzuki, 2005). Les virus influenza A et B adhérent
essentiellement aux trisaccharides monosialo-lactosamine de types I et II (SAα2-3(6)Galβ1-
3(4)GlcNAcβ1-) sur les glycoprotéines et gangliosides de l’hôte. Différents types de liaison
entre le Neu5Ac et le résidu galactose sous-jacent existent, les deux principaux étant :
« Neu5Ac-α (2,3) Gal » et « Neu5Ac-α (2,6) Gal » (Masuda et al., 1999; Suzuki, 2005). La
capacité de l’HA virale à se lier à un type particulier d’acide sialique détermine en grande
partie la spécificité d’hôte de la souche virale. Ainsi, les hémagglutinines des souches aviaires
et équines reconnaissent principalement les liaisons en α2,3 (prédominantes chez ces
espèces), alors que les souches humaines adhérent plus efficacement aux récepteurs liés en
α2,6 (majoritaires dans l’arbre respiratoire humain) et les souches d’origine porcine sont
capables de lier les deux types de récepteurs, les deux types de liaisons étant exprimées dans
le tractus respiratoire du porc. Cette caractéristique du porc est à l’origine de l’hypothèse du
« mixing vessel », selon laquelle le porc serait l’hôte idéal pour abriter des co-infections entre
des souches de virus influenza aviaires et humaines et favoriser ainsi le réassortiment
génétique entre souches et potentiellement l’apparition de souches hautement pathogènes et
adaptées à l’homme (Rogers et Paulson, 1983; Suzuki et al., 1997; Crisci et al., 2013). Mais il
a été démontré que l’intestin des volailles et des cailles exprimait également massivement les
récepteurs liés en α2,6 et pourrait donc tout à fait jouer le rôle de « mixing vessel »
traditionnellement attribué au porc (Guo et al. (2007). Figure 3
1.1.4.2 Entrée, fusion et décapsidation
Après liaison entre l’hémagglutinine virale et les acides sialiques de l’hôte, le virus entre dans
la cellule par endocytose. Le modèle traditionnellement accepté est celui de l'endocytose
dépendant de la clathrine, mais il a été démontré que le virus pouvait également entrer dans la
cellule par voie caveolae-dépendante, voire même par des voies indépendantes des deux
26
précédentes ou par macropinocytose (Lakadamyali et al., 2004). Dans le compartiment
endosomal, la diminution du pH induit un changement conformationnel de HA et la fusion de
la membrane virale avec la membrane endosomale. Un préalable indispensable à l’activation
de HA est le clivage du précurseur HA0 par des protéases cellulaires en deux sous-unités,
HA1 et HA2. L’activation concerne surtout la sous-unité HA2 qui subit un changement de
conformation, permettant l’exposition du peptide de fusion et l’interaction avec la membrane
de l’endosome (Stegmann, 2000). Parallèlement, le canal à protons M2 permet l'acidification
interne de la particule virale et la séparation des ribonucléoprotéines virales (vRNPs) de la
protéine de matrice 1 (M1) à laquelle elles sont liées. Les vRNPs, parvenues ainsi dans le
cytoplasme, rejoignent ensuite le noyau cellulaire (Whittaker et Helenius, 1998). Figure 2(B)
1.1.4.3 Import nucléaire des ribonucléoprotéines virales
Les virus influenza constituent une exception parmi les virus ARN puisque toutes les étapes
de synthèse de leur ARN (transcription et réplication) se passent dans le noyau cellulaire.
Deux types d’ARN de polarité positive sont produits à partir de l'ARN génomique de polarité
négative : les ARN messagers (ARNm) et les ARN complémentaires (ARNc), ces derniers
étant des copies positives des segments génomiques viraux, servant à leur tour de matrice
pour la production de nouveaux segments génomiques par la polymérase virale (Luo et al.,
1991). Le processus de transcription en ARNm nécessite une amorce, sous la forme de
l'extrémité 5' d'un ARNm cellulaire, que la polymérase virale obtient par liaison de la coiffe et
clivage d’un ARNm cellulaire, 10 à 13 nucléotides en aval de cette coiffe, selon un processus
appelé « cap-snatching » (Fujimura et Esteban, 2011). C'est par élongation de cette amorce
que la polymérase virale transcrit un ARNm viral. Les ARN messagers sont ensuite exportés
dans le cytoplasme où ils sont traduits en protéines virales. Les protéines HA, NA et M2
rejoignent la membrane plasmique cellulaire et les protéines NP, PB1, PB2, PA, M1, NS1 et
27
NEP sont transportées dans le noyau. Dans le noyau, les ribonucléoprotéines natives se
forment par assemblage de nucléoprotéines, de l'ARN génomique viral et des protéines du
« complexe polymérase ». Les vRNPs natives sont exportées du noyau grâce aux protéines
M1 et NEP. Elles rejoignent la surface de la cellule où, grâce à la protéine M1, se produit le
bourgeonnement des nouvelles particules virales au cours duquel elles acquièrent leur
enveloppe (Wright et al., 2007).
Ensuite, l’action enzymatique de la neuraminidase va permettre la libération des virions
attachés aux acides sialiques des glycoprotéines membranaires par leur hémagglutinines.
Cette hydrolyse catalyse le clivage des jonctions entre les acides sialiques terminaux et les
résidus de D-galactose ou D-galactosamine sous-jacents. Sans cet effet de la NA, les
particules virales resteraient attachées à la surface des cellules de l’hôte et au mucus du
système respiratoire riche en acide sialique (Palese et al., 1974; Griffin et al., 1983). C’est le
principe d’action de plusieurs molécules anti-influenza comme l’oseltamivir (Kubo et al.,
2015).
28
Figure 2 : Structure du virus influenza A. Les protéines HA, NA et M2 sont insérées au
niveau de l’enveloppe virale. La protéine de matrice 1 (M1) constitue le lien entre l’enveloppe
et les ribonucléoprotéines. Les ribonucléoprotéines sont constituées chacune d’une hélice de
nucléoprotéines, d’un segment génomique viral et du complexe des polymérases (A). Le cycle
réplicatif du virus influenza A (B). (D’après Shi et al. (2014)).
29
Tableau 1. Fonction des principales protéines du virus influenza A.
Segment
génomique
Protéines
encodées
Fonction
1 PB2
Reconnaissance de la coiffe. Appartient au complexe
de transcription/réplication. PB2 se lie à la coiffe des
pré-ARNm de l’hôte.
2 PB1
Activité ARN polymérase essentielle aux activités de
transcription et réplication.
PB1-F2
Augmente la perméabilité de la mitochondrie et
forme des pores. Induit l’apoptose, principalement
des leucocytes.
3 PA
Appartient au complexe transcription-réplication.
Activité endonucléase nécessaire au « cap-
snatching ».
PA-X
Contribue à la multiplication virale et inhibe la
réponse immunitaire de l’hôte.
4 HA
Médiateur de l’attachement aux acides sialiques et de
l’entrée dans les cellules de l’hôte. Déterminant
majeur de la spécificité d’espèce et du tropisme
cellulaire.
5 NP
Lie l’ARN viral pour former les ribonucléoprotéines.
Impliqué dans la synthèse de l’ARN viral.
6 NA
Activité sialidase permettant la libération des virions
par clivage des résidus acide sialique des cellules de
l’hôte.
7
M1
Export nucléaire des ribonucléoprotéines virales.
Essentielle à la formation des particules virales et à
l’encapsidation.
M2
Activité de canal ionique (protons). Régulation du pH
interne des particules virales dans le compartiment
endosomal.
M3
Non décrite.
8 NS1
Antagoniste de la réponse immunitaire innée.
Inhibition pré- et post-transcriptionnelle et post-
traductionnelle des IFN de type I.
NEP (NS2)
Export nucléaire des ribonucléoprotéines.
30
Figure 3 : Les deux types principaux de liaisons des acides sialiques avec le résidu galactose
sous-jacent en surface des cellules-cibles du virus influenza. A : Dans la liaison α2,3
(majoritaire au niveau digestif dans l’espèce aviaire), l’acide sialique est lié par son carbone 2
avec le carbone en position 3 du galactose. B : Pour la liaison α2,6 (type principal au niveau
de l’arbre respiratoire humain), l’acide sialique est attaché au carbone 6 du galactose par son
carbone en position 2 (Wright et al., 2007).
31
1.1.5 Epidémiologie et pathogénie
L’Organisation Mondiale de la Santé estime qu’entre 5 et 10% des adultes et entre 20 et 30%
des enfants de la population mondiale sont infectés tous les ans par une souche saisonnière de
virus influenza A, dont les principaux sous-types sont H1N1 et H3N2 (Afilalo et al., 2012).
Entre trois et cinq millions de ces cas développent une maladie sévère, qui résulte en la
mortalité d’environ 500.000 personnes annuellement dans le monde (WHO,
www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/). L’impact financier annuel des grippes
saisonnières s’élève selon les estimations à entre 6 et 14 milliards d’euros pour l’Europe et
jusqu’à 87 milliards de dollars pour les Etats-Unis. Ces coûts reprennent les frais de
vaccination, d’hospitalisations, des consultations médicales et traitements médicamenteux
(Klepser, 2014; Preaud et al., 2014). Les personnes infectées par des souches saisonnières de
virus influenza A présentent généralement un tableau clinique bénin souvent limité à des
épisodes fébriles légers à modérés. L’infection peut être beaucoup plus sévère chez les
nouveau-nés, les personnes âgées, les femmes enceintes et les personnes immunodéprimées,
et être caractérisée par une pneumonie virale le plus souvent associée à des surinfections
bactériennes. Ces infections bactériennes secondaires sont la complication la plus commune
de la grippe saisonnière (Afilalo et al., 2012). Les souches pandémiques peuvent induire des
taux de morbidité et mortalité beaucoup plus élevés comme lors de la pandémie de 1918, « la
grippe espagnole » responsable du décès d’environ 50 millions de personnes. Les lésions
touchent alors l’ensemble de l’arbre respiratoire et du tissu pulmonaire, menant à un
syndrome de détresse respiratoire aigüe (Jordan et al., 1958; Glezen, 1982; Reid et al., 1999).
Les caractéristiques génétiques du virus influenza (génome segmenté d’ARN simple brin
négatif) font de ce virus une entité très variable, avec la capacité d’évoluer rapidement par
accumulation des substitutions au niveau génétique et protéique (« antigenic drift »), mais
aussi par des réassortiments des segments génomiques en cas de co-infection d’un hôte
32
(cellules) par deux virus différents (« antigenic shift ») (Nakajima, 2003). Historiquement, ce
sont ces deux phénomènes, et principalement l’antigenic shift, qui ont permis l’apparition de
nouvelles souches virales avec des propriétés antigéniques et de virulence particulières,
responsables des pandémies qui se sont succédées dans la population humaine comme celles
de 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2), 1977 et 2009 (H1N1) (Webster et al., 1992).
Des souches spécifiques ont été décrites pour plusieurs espèces, dont l’être humain, les
oiseaux, le porc, le cheval, le chien et même chez les mammifères marins (Webster et al.,
1992).
Les oiseaux aquatiques sauvages de l'ordre des ansériformes (canards, cygnes, oies) et des
charadriiformes (mouettes) représentent le réservoir naturel des virus influenza A. Bien que
l’infection soit généralement asymptomatique, une abondante excrétion virale par voie fécale
est présente, raison pour laquelle le virus influenza A a été isolé à partir d’échantillons d’eau
provenant de lacs où des oiseaux migratoires ont niché (Webster et al., 1978). Chez le canard,
le tropisme est principalement digestif, alors que chez les oiseaux domestiques (animaux de
production) il est plutôt respiratoire voire même systémique pour les souches virales
hautement pathogènes (Spackman et al., 2010). Les virus influenza aviaires sont classés en
faiblement pathogènes ou « LPAI » (low pathogenic avian influenza) et hautement
pathogènes ou « HPAI » (highly pathogenic avian influenza) selon le degré de sévérité de la
maladie produite chez le poulet dans des conditions standardisées (WHO 2012). Il a été
démontré que la séquence du site de clivage de l’HA était déterminante pour l’acquisition
d’un phénotype hautement pathogène (WHO 2005). Les variantes faiblement pathogènes,
originaires des oiseaux sauvages, sont généralement peu adaptées aux gallinacés et sont
associées à des symptômes variables qui peuvent aller d’infections asymptomatiques à des
maladies graves avec une mortalité parfois élevée (Franca et Brown, 2014). La circulation de
ces virus chez les oiseaux domestiques peut entrainer une adaptation et une réplication plus
33
efficace chez ces oiseaux. Cette adaptation des souches LPAI chez les volailles gallinacées
peut conduire à l’acquisition de mutations menant à l’accumulation d’acides aminés basiques
au niveau du site de clivage de la protéine HA0, ce qui va augmenter la sensibilité de ce site
de clivage à des protéases ubiquistes et par là-même diversifier le tropisme tissulaire du virus.
Ces modifications sont à la base du caractère hautement pathogène (HPAI) acquis par
certaines souches de virus influenza A de sous-types 5 et 7. Ces souches induisent chez les
espèces cibles une maladie fulminante avec dissémination systémique et une grande mortalité
(Perdue et Suarez, 2000 ; Horimoto et al., 2001 ; WHO 2005). Outre le caractère systémique
de l’infection, la pathogénicité des souches HPAI passe également par l’altération de la
barrière endothéliale, menant à de l’œdème, des hémorragies et de la coagulation
intravasculaire disséminée (Perkins et Swayne, 2001; Swayne, 2007). L’infection par des
souches HPAI chez les mammifères, dont l’homme, peut mener à un taux de mortalité
important, comme pour la souche H5N1 par exemple (Chan, 2002).
1.2 La souris comme modèle d’infection par le virus influenza A
1.2.1 Avantages pratiques
La souris est le modèle animal le plus utilisé pour étudier le virus influenza A. De par sa
faible taille, sa facilité d’hébergement et de reproduction, la possibilité d’utiliser des modèles
génétiquement modifiés, la reproductibilité des résultats (souris consanguines), la
disponibilité de réactifs commerciaux espèce-spécifiques et un coût moindre que d’autres
modèles, la souris est un modèle extrêmement pratique. Ces caractéristiques biologiques et
pratiques font de la souris un modèle idéal pour étudier la pathogénie de la maladie et la
réponse immunitaire, l’action de certains médicaments et l’efficacité des vaccins.
34
Il reste néanmoins qu’il s’agit d’un modèle et que toutes les conclusions ne peuvent être
extrapolées à l’homme et aux grands mammifères (Bouvier et Lowen, 2010; Margine et
Krammer, 2014).
1.2.2 Limites du modèle murin
Malgré ses indéniables avantages comme modèle mammifère de la maladie, la souris présente
quelques limitations. A la différence des espèces-cibles du virus, la souris développe des
signes cliniques distincts, elle ne présente pas de secrétions nasales ni de fièvre mais, par
contre, elle développe de l’hypothermie (Carey et al., 2010). Quant à la transmission du virus
influenza A, les recherches chez la souris ont montré des résultats contradictoires, ce qui a
orienté les études relatives à la transmissibilité des souches du virus vers le cochon d’Inde et
le furet (Schulman et Kilbourne, 1963; Lowen et al., 2006; Munster et al., 2009). Il existe
plusieurs exemples de souches de virus influenza A considérées comme peu pathogènes chez
l’homme et qui, chez la souris, induisent une maladie très sévère et plus profonde. Ce manque
de corrélation en termes de virulence pourrait être expliqué par la différence de tropisme
(Belser et al., 2007; Joseph et al., 2007). Il faut également tenir compte du fait que, dans la
plupart des infections expérimentales, l’inoculation intranasale du virus se fait à l’aide d’un
volume ~30-50μl permettant un accès direct du virus aux voies respiratoires profondes et aux
alvéoles pulmonaires de la souris. De plus, le système respiratoire des souris possède moins
de générations bronchiques que celui de l’homme (13-17 vs. 17-21, respectivement) (Irvin et
Bates, 2003). Enfin, l’arbre respiratoire des souris présente une série de particularités
histologiques. Par exemple, les cellules de Clara représentent chez la souris de l’ordre de 50 à
60% des cellules épithéliales de la trachée, alors que pour la plupart des autres espèces de
mammifères on ne les trouve que dans les bronchioles terminales (Herbert et., al 1999). Le
poumon murin possède cinq lobes pulmonaires et son parenchyme représente 18% du
35
poumon total (contre 12% chez l’homme). La proportion des pneumocytes de type I et II est
similaire à celle observée chez l’homme, soit ~ 95 et 5%, respectivement (Dixon et al., 1999).
1.2.3 Sensibilité et signes cliniques
Le degré de sensibilité des souris ne dépend pas seulement de l’adaptation du virus à cette
espèce mais aussi du fond génétique des différentes lignées de souris (Bouvier et Lowen,
2010; Liu et al., 2014). Un exemple marquant est l’effet protecteur du gène Mx1, intact chez
les souris Mus musculus sauvages et quelques lignées de laboratoire, mais dont l’expression
est absente chez la plupart des lignées de laboratoire, les rendant par là même beaucoup plus
sensibles à l’infection par le virus influenza (Staeheli et al., 1988; Grimm et al., 2007). Par
ailleurs, parmi les lignées de souris Mx-négatives, certaines se sont montrées particulièrement
sensibles, comme les souris DBA/2J et A/J par exemple, et ce y compris après infection par
des isolats de virus non murinisés (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009). Les signes
cliniques apparaissent généralement vers les jours 2 ou 3 après infection et varient
considérablement entre les différentes lignées de souris, le type de virus et la dose. Les
symptômes sont la léthargie, l’anorexie et la perte de poids vif, les poils hirsutes, la dyspnée
et, finalement, la mortalité. La perte de poids vif est le signe clinique quantitatif le plus précis
pour étudier l’infection et la protection induite par les vaccins par exemple (Thangavel et
Bouvier, 2014).
1.2.4 Les récepteurs au virus influenza A chez la souris
Bien que les deux types de récepteurs soient exprimés dans la plupart des organes chez la
souris (Ning et al., 2007), ce sont les acides sialiques liés en α2,3 qui sont prédominants dans
l’arbre respiratoire. Certaines études tendent même à démontrer la quasi-absence de résidus
36
acides sialiques liés en α2,6 dans l’arbre respiratoire des souris (Ibricevic et al., 2006). En
conséquence, les souches murinisées (adaptées à la souris par passages multiples en
laboratoire) du virus présentent généralement une plus forte affinité pour les récepteurs de
type α2,3 (Ibricevic et al., 2006). L’étude de l’expression des récepteurs acides sialiques liés
en α2,3 ou α2,6 fait appel à des lectines d’origine végétale : la lectine extraite de Sambuccus
nigra (SNA), spécifique des liaisons en α2,6, et la lectine provenant de Maackia amurensis
(MAA), spécifique des liaisons en α2,3 (Ibricevic et al., 2006).
1.2.5 Adaptation du virus à la souris
La souris n’étant pas un hôte naturel du virus, les virus influenza A doivent, dans la plus part
des cas, subir un processus de « murinisation » (adaptation à la souris) par des passages
pulmonaires en série pour parvenir à se multiplier efficacement et devenir virulents. Parmi les
mutations qui apparaissent classiquement au cours du processus de murinisation, on retrouve
des modifications au niveau du site de liaison de l’hémagglutinine à son récepteur. Cette
adaptation reflète la distribution des acides sialiques dans les voies respiratoires des souris, où
les acides sialiques liés en α2,3 prédominent (Ibricevic et al., 2006). Plusieurs études ont par
ailleurs démontré l’importance de la protéine « polymerase basic 2 » (PB2) virale,
principalement pour l’adaptation de virus aviaires à des hôtes mammifères, dont la souris,
chez lesquels ces virus aviaires présentent normalement une réplication restreinte. Après
plusieurs passages d’un virus influenza aviaire dans des cellules de mammifères, un variant
hautement réplicatif est sélectionné, généralement associé à une substitution
glutamatelysine en position 627 de la protéine PB2 (Subbarao et al., 1993). Cette mutation
a également été associée à une exacerbation de la dissémination d’une souche aviaire (H5N1
hautement pathogène) dans les voies respiratoires et poumons des souris (Hatta et al., 2007;
Munster et al., 2007; Shinya et al., 2007). Bien que cette substitution ne soit pas considérée
37
comme un marqueur d’adaptation en tant que tel, elle représente un déterminant de
pathogénicité chez les mammifères. La lysine en position 627 dans PB2 confère au virus
influenza la capacité de se multiplier dans les voies respiratoires des mammifères, c’est-à-dire
à une température d’environ 33ºC, alors qu’un résidu glutamate à la même position se traduit
par une activité optimale de la polymérase à une température supérieure à 37°C, soit celle
rencontrée dans les systèmes digestif et respiratoire des oiseaux (Hatta et al., 2007).
1.2.6 Les souris DBA/2J et C57BL/6J comme extrêmes de sensibilité/résistance au
virus influenza parmi les souches Mx-négatives
Les lignées consanguines DBA/2J et C57BL/6J ont été comparées pour leur sensibilité
respective à toute une série d’agents pathogènes, notamment grâce à la disponibilité de
nombreuses « recombinant inbred lines », dûment caractérisées sur le plan génétique, entre
ces deux lignées. Elles ont ainsi été utilisées comme modèles d’infections bactériennes
(Mycobacterium sp., Helicobacter sp., Pseudomonas sp., etc.), fungiques (dont Candida
albicans notamment) et virales ainsi que pour des maladies auto-immunes et des tumeurs
(Ashman et al., 2003; Kerton et Warden, 2006; Black et Waxman, 2008). De grandes
différences de susceptibilité ont été décrites entre les souris DBA/2J et C57BL/6J lorsqu’elles
ont été infectées par Candida albicans, DBA/2J étant de loin plus sensible. La déficience en
facteur C5 du complément jouerait un rôle majeur dans la sensibilité de DBA/2J à Candida
albicans (Ashman et al., 2003). Un défaut génétique empêche en effet la souris DBA/2J de
produire la protéine Hc (Hemolytic complement) sous sa forme active, ce qui a été associé à
une susceptibilité accrue à certains agents infectieux, dont potentiellement le virus
influenza A (Nilsson et Muller-Eberhard, 1967; Ooi et Colten, 1979; Boon et al., 2009). Par
ailleurs, une activité bactéricide moindre des macrophages alvéolaires de DBA/2J a été
démontrée dans un modèle d’infection par Pseudomonas aeruginosa (Wilson et al., 2007).
38
Le modèle murin a été largement utilisé pour comprendre en détail les facteurs de virulence
de différentes souches de virus influenza A et de sensibilité/résistance des lignées de souris de
laboratoire (Srivastava et al., 2009; Garigliany et al., 2010). Les souris DBA/2J et C57BL/6J
constituent également deux extrêmes en termes de sensibilité et de résistance pour le virus
influenza A. Lorsque différentes lignées de souris ont été infectées par des virus influenza A
murinisés de souches A/Puerto Rico/8/34 (H1N1 ; PR8) ou A/Seal/Massachussetts/1/80
(H7N7), la souris DBA/2J s’est montrée beaucoup plus sensible que C57BL/6J (Srivastava et
al., 2009). Les souris DBA/2J présentaient une perte de poids vif et une chute du taux de
survie rapides et importantes, avec une mortalité intervenant vers le jour 7 après infection.
Dans les mêmes conditions, les souris C57BL/6J ont présenté une perte de poids légère et
transitoire, avec une amélioration clinique dès le septième jour post-infection et un taux de
survie de 100% au terme de l’expérience (14 jours post-infection). Les souris hybrides F1,
résultat du croisement entre DBA/2J et C57BL/6J, ont montré une sensibilité intermédiaire,
avec une perte de poids rapide, mais moins dramatique que celle présentée par DBA/2J, et
une récupération progressive à partir du jour 7, avec un léger retard par rapport à C57BL/6J
(Srivastava et al., 2009). La dose létale 50 pour le virus influenza de souche PR8 pour la
souris DBA/2J était 1000 fois plus faible que celle de C57BL/6J (Srivastava et al., 2009).
Après infection in vivo, les titres viraux pulmonaires analysés par « Focus Forming Assay »
(FFA) et par mesure des concentrations d’ARNm de l’HA virale par PCR en temps réel
étaient entre 80 et 100 fois plus importants chez la souris DBA/2J que pour C57BL/6J, la
différence se marquant dès le deuxième jour post-infection (Srivastava et al., 2009) Les
analyses des coupes histologiques des poumons infectés ont mis en évidence des lésions plus
sévères chez la souris DBA/2J avec des larges zones de consolidation pulmonaire. Pour les
deux lignées de souris, les cellules épithéliales des bronches et bronchioles présentaient de la
dégénérescence hydropique (gonflement et vacuolisation du cytoplasme) et de la nécrose
39
(noyaux pycnotiques et en processus de caryolyse) avec desquamation et présence de
neutrophiles dégénérés dans la lumière des voies respiratoires et alvéoles, mais là encore de
façon beaucoup plus prononcée chez DBA/2J. Par contre, chez C57BL/6J les lésions
pulmonaires étaient caractérisées par une infiltration péri-vasculaire et péri-bronchique de
lymphocytes dès le jour 4 après infection (Srivastava et al., 2009). La présence de
macrophages a été décrite de façon similaire chez les deux lignées de souris entre les jours 2
et 4 après infection. Quand les paramètres hématologiques ont été comparés suite à l’infection
par le virus de souche PR8, la souris DBA/2J présentait une lymphopénie et une
granulocytose caractéristiques par rapport à C57BL/6J, dès le tout début de l’infection, en
corrélation directe avec l’apparition de lésions pulmonaires, ce qui a été utilisé comme
marqueur prédictif de la sévérité de l’infection (Dengler et al., 2014; Preusse et al., 2015).
La mesure des niveaux d’expression des ARNm d’un panel de cytokines/chimiokines par
PCR en temps réel sur les poumons des souris infectées a montré une expression globalement
beaucoup plus importante chez la souris DBA/2J. Ainsi, les ARNm des cytokines IL-1β, IL-5,
IL-6, IL-12 et G-CSF, ainsi que des chimiokines KC, MIP-2, RANTES, MCP-1, entre autres,
présentaient une expression significativement supérieure dans les poumons des souris DBA/2J
(Srivastava et al., 2009). Des résultats similaires ont été obtenus à partir de lavages broncho-
alvéolaires provenant des deux lignées des souris (Srivastava et al., 2009). Tableau 2
Ces données démontrent clairement l’influence du fond génétique dans la différence de
sensibilité au virus influenza A entre les deux lignées de souris. De façon intéressante, quand
DBA/2J et C57BL/6J ont été immunisées par injection intramusculaire avec un variant
murinisée du virus influenza A H1N1 PR8, les titres spécifiques en immunoglobulines G
(IgG) n’ont pas montré de différences entre les deux lignées de souris, ce qui suggère une
immunité adaptative intacte chez DBA/2J (Dengler et al., 2012). De plus, cette immunisation
rendait les souris DBA/2J complètement résistantes à l’infection respiratoire ultérieure par un
40
virus homologue. Des résultats similaires ont été obtenus après infection de souris DBA/2J
préalablement immunisées avec la souche virale H1N1 A/Hamburg/04/2009, toutes les souris
DBA/2J immunisées ayant survécu et ayant seulement présenté une légère perte de poids vif
(Dengler et al., 2012). Ces résultats confirment l’immunocompétence et l’intégrité de
l’immunité acquise chez les souris DBA/2J, ce qui fait de cette lignée un très bon modèle
pour étudier les réponses adaptatives aux vaccins contre les virus influenza A de diverses
origines (Dengler et al., 2012).
Plusieurs équipes se sont par ailleurs attelées à étudier les facteurs qui pourraient expliquer
ces différences de sensibilité entre souches de souris par des approches génétiques en utilisant
des Recombinant Inbred Lines et par analyse des locus de caractères quantitatifs (QTL) (Boon
et al., 2009; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Wang et al., 2014). Plusieurs
familles de gènes ont été proposées pour expliquer les différences de sensibilité, surtout des
gènes liés à l’activation de la réponse immunitaire innée et qui sont exprimés très
différemment entre les souris DBA/2J et C57BL/6J après infection. Chez la souris DBA/2J,
on observe ainsi une surexpression de gènes comme Cxcl11 (Interferon-inducible T-cell alpha
chemoattractant), Il6 (interleukine 6), Cxcl10 (Interferon gamma-induced protein 10) et toute
une série de récepteurs spécifiques de cytokines/chimiokines comme Ccr1, Csf3r, Il1r2 et
Ccr2, dès 24 heures après infection par le virus influenza A (Boon et al., 2009). Ces résultats
semblent corrélés avec la réponse inflammatoire exacerbée, notamment
neutrophilique, observée dans les poumons des souris DBA/2J infectées. En comparaison, on
observe chez la souris C57BL/6J une surexpression des gènes activateurs du cycle cellulaire,
ce qui pourrait être lié à une réparation tissulaire plus rapide et efficace, mais aussi à une
prolifération et infiltration péri-vasculaire et péri-bronchique des lymphocytes dans le tissu
pulmonaire, typique chez cette lignée (Alberts et al., 2010).
41
Le gène Irf7 était fortement exprimé pour les deux lignées de souris et les gènes Ifnb1 et Ifng
l’étaient chez la souris DBA/2J mais pas chez C57BL/6J (Alberts et al., 2010). Par ailleurs,
une différence d’expression du gène α2,6 sialyltransferase (St6galnac4), significativement
supérieure chez DBA/2J, suggérait une plus grande abondance de récepteurs acides sialiques
liés en α2,6 dans les voies respiratoires des souris DBA/2J et donc une permissivité épithéliale
plus grande, mais aussi potentiellement une variation du tropisme et des capacités de
transmission (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010).
Au terme de ces différentes études, de longues listes de gènes-candidats ont été proposées
pour expliquer la sensibilité de DBA/2J et la résistance de C57BL/6J, ce qui confirme le
caractère complexe et multigénique de la résistance à l’infection par le virus influenza A
(Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012;
Trammell et al., 2012; Boon et al., 2014; Dengler et al., 2014). Quelques exemples sont repris
dans le Tableau 3, mais l’importance relative de ces nombreux gènes-candidats sur la
sensibilité/résistance de l’hôte n’a pas pu être déterminée. De plus, de nouvelles recherches
tendent à remettre en question la fiabilité des cartographies de QTL à l’aide des lignées
recombinantes de souris DBA/2J et C57BL/6J, ce qui réduit le crédit que l’on peut apporter à
ces études génétiques (Wang et al., 2014).
42
Tableau 2. Résumé des données de littérature relatives aux différences de sensibilité entre les
lignées murines DBA/2J et C57BL/6J à l’infection par le virus influenza A.
DBA/2J C57BL/6J
Sensibilité extrême aux ≠ souches de virus
influenza A, adaptées ou non
Résistance à différentes souches de virus
influenza A, murinisées ou non
Perte de poids vif sévère et rapide
Perte de poids vif légère et transitoire
Taux de mortalité élevés. Mortalité dès le
jour 7 après infection
Taux de survie de 100%, sur 14 jours de
suivi, aux doses virales usuelles
Doses létales faibles Doses létales très élevées
Apparition rapide de titres viraux
pulmonaires élevés
Titres viraux pulmonaires moindres et
indétectables après le jour 8 post-infection
Lésions pulmonaires très sévères. Larges
zones de consolidation, pneumonie, infiltrat
neutrophilique, nécrose des bronches et
bronchioles
Même patron lésionnel mais beaucoup plus
modéré. Résolution des lésions avant la fin
de l’expérience
Niveau significativement supérieur
d’activité myéloperoxidase dans les
poumons
Niveaux pulmonaires de myéloperoxidase
faibles
Niveaux d’expression de cytokines pro-
inflammatoires et chimiokines dans les
poumons significativement supérieurs
Expression de cytokines pro-inflammatoires
et chimiokines significativement moindre
Lymphopénie et granulocytose marquées
dès 18 h après infection. En corrélation avec
l’aggravation des signes cliniques
Leucogramme : variations moins
importantes et plus tardives. Sans
corrélation avec les signes cliniques
Tableau 2 : Descriptions des principales différences décrites entre les lignées DBA/2J et
C57BL/6J suite à l’infection par des souches de virus influenza A d’origines et degrés
d’adaptation à la souris variables (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Nedelko et al.,
2012; Trammell et al., 2012; Dengler et al., 2014; Casanova et al., 2015; Preusse et al.,
2015).
43
Tableau 3. Exemples de gènes candidats associés à la sensibilité / résistance au virus
influenza A chez les souris DBA/2J et C57BL/6J
Symbole du gène Description Référence
St6galnac4
GalNAc-alpha-2,6-sialyltransferase
Boon et al., 2009
Hc Hemolytic complement Boon et al., 2009 ;
Trammell et al., 2012
Trim12-30-34 Tripartite motif families 12-30-34 Boon et al., 2009
Gvin1 Very large interferon-inducible GTPase Boon et al., 2009
Ifi35 IFN-induced, double-stranded RNA-
activated protein kinase
Boon et al., 2009 ;
Nedelko et al., 2012
Irf7
Interferon regulatory factor 7 Alberts et al., 2010
Ifnb1
Interferon β-1 Alberts et al., 2010
Il1α-6
Interleukine 1α- 6 Alberts et al., 2010
Cxcl10
Interferon gamma-induced protein 10 Alberts et al., 2010
Cxcr1-3-5
Chemokine receptors Alberts et al., 2010
Ptge-r
Prostaglandines-recepteurs Alberts et al., 2010
Pla2
Phospholipase A2 Alberts et al., 2010
Ifih1 Interferon induced with helicase C Nedelko et al., 2012
Nrip1 Nuclear receptor interacting protein 1 Nedelko et al., 2012
Lst1 Leukocyte specific
transcript 1
Nedelko et al., 2012
44
Exemples de gènes-candidats proposés après analyse des loci de caractères quantitatifs (QTL)
basée sur l'utilisation de Recombinant Inbred Lines des souris de souches DBA/2J et
C57BL/6J.
1.3 Immunité innée et virus influenza
Les virus influenza A peuvent infecter de nombreuses espèces dont le porc, les oiseaux et
l’homme (Wright et al., 2007). Chez les mammifères, l’infection se limite dans la plupart des
cas au système respiratoire. Les mécanismes de défense de l’immunité innée sont divers et
constituent une barrière contre le virus influenza A. Le virus entre par la cavité orale ou nasale
où il est d’abord confronté au mucus qui tapisse l’épithélium respiratoire. Dans les voies
respiratoires inférieures, la mucine est remplacée par des lectines, protéines qui peuvent se lier
avec certains hydrates de carbone de façon hautement spécifique, dont ceux en surface de
l’HA et de la NA virales, ayant pour effet de neutraliser le virus (Iwasaki et Pillai, 2014).
Lorsque le virus parvient à traverser la couche de mucus avec succès, il peut adhérer à et
infecter l’épithélium des voies respiratoires. Au départ de ce premier foyer, le virus peut
ensuite se propager dans le système respiratoire, notamment par l’intermédiaire de cellules de
la lignée blanche comme les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques
(Manicassamy et al., 2010). L’ARN viral présent dans les cellules infectées est reconnu
comme « étranger » par plusieurs récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires
(PRRs ; voir plus loin), ce qui mène à l’expression d’interférons (IFNs) de type I et d’autres
cytokines pro-inflammatoires et chimiokines. Les INFs type I sont produits par les
macrophages alvéolaires, les pneumocytes et les cellules dendritiques et vont induire
l’expression de plusieurs gènes regroupés sous le vocable « IFN-stimulated genes » (ISGs), ce
qui aura pour conséquence de rendre ces cellules ainsi que les cellules adjacentes réfractaires
45
à l’infection : ce mécanisme est appelé l’ « interférence » (Jewell et al., 2007; Hogner et al.,
2013).
Bien que protectrice, la réponse innée peut, dans certaines conditions, se révéler néfaste pour
l’hôte. L’infection de nombreuses espèces de mammifères et de l’homme par certaines
souches virulentes de virus influenza A se traduit par un emballement de la réponse
cytokinique appelé « tempête cytokinique » (La Gruta et al., 2007). Ainsi, il a été démontré
qu’une réponse immunitaire aberrante était inefficace en termes de protection contre le virus
et contribuait à la formation et à la sévérité des lésions pulmonaires et finalement à la
mortalité suite à l’infection par le virus influenza (Kobasa et al., 2007). De même, une
réponse cytokinique aberrante a été décrite chez des patients présentant une maladie sévère
suite à l’infection par la souche H1N1 de la pandémie récente de 2009 (Arankalle et al.,
2010). Bien qu’il soit reconnu que la réponse cytokinique soit essentielle dans le contrôle de
la réplication virale et permette de réduire la morbidité au cours de l’infection (Strutt et al.,
2010; Maelfait et al., 2012), de nombreuses études appuient l’hypothèse du rôle délétère de la
réponse immunitaire innée dans le développement des lésions et signes cliniques en cas
d’infection par le virus influenza A (La Gruta et al., 2007; Salomon et al., 2007; Tisoncik et
al., 2012).
1.3.1 Mécanismes de détection du virus influenza A
Le système immunitaire inné détecte les infections virales par identification spécifique de
motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) via les récepteurs de reconnaissance de
motifs moléculaires (PRRs). Les PAMPs sont des composants structurels des agents
pathogènes ou sont générés pendant l’infection (Janeway, 1989; Medzhitov, 2001). Il existe
différents types de PRRs qui peuvent se classer selon leur emplacement ou leur fonction.
Selon leur fonction biologique, ils peuvent se diviser en PRRs endocytiques et PRRs de
46
signalisation. Les PRRs endocytiques vont promouvoir l’attachement, l’endocytose et
destruction des pathogènes et des cellules en processus d’apoptose par les phagocytes. Dans
ce groupe de PRRs se trouvent notamment les « C-type lectin receptors » (CLRs), qui furent
décrits pendant longtemps comme des récepteurs effecteurs, qui n’induisent pas de
signalisation intracellulaire, ce qui a depuis été réfuté (Iborra et Sancho, 2015). Comme leur
nom l’indique, ce sont des récepteurs qui reconnaissent des groupes de glucides (comme le
mannose) présents en surface de cellules et de certains agents pathogènes (Tanne et al., 2009;
Ritter et al., 2010). Les PRRs de signalisation comprennent la grande famille des Toll-like
receptors » (TLR), qui sont liés aux membranes (plasmatique et endosomale) et les récepteurs
cytoplasmiques (cytosol) « retinoic acid-inducible gene I » (RIG-1) et « NOD-like
receptor familly pyrin domain-containing 3 » (NLRP3). Le virus influenza est reconnu par ces
trois types de récepteurs : les TLR, dont le TLR3 qui reconnait l’ARN double
brin (intermédiaire réplicatif dans le cycle du virus influenza) et les TLR7 et TRL8 qui
reconnaissent l’ARN simple brin ; RIG-1 qui reconnait l’ARN 5′ triphosphate ; et NLRP3 qui
stimule les caspases après son activation par la protéine virale M2 (Pang et Iwasaki, 2012).
RIG-I et NLRP3 détectent le virus présent au niveau du cytosol des cellules infectées ; TLR3,
TLR7 et TLR8 détectent les ARN viraux dans le compartiment endosomal (Guillot et al.,
2005; Pang et Iwasaki, 2012; Iwasaki et Pillai, 2014). L’activation du TLR3, par
l’intermédiaire du facteur TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β),
induit la production de cytokines/chimiokines pro-inflammatoires qui auront pour effet de
restreindre l’amplification virale, mais également de favoriser le recrutement de cellules
inflammatoires qui peuvent potentiellement aggraver les dommages tissulaires causés par le
virus (Alexopoulou et al., 2001; Schulz et al., 2005; Iwasaki et Pillai, 2014). Le TLR7
détecte l’ARN simple brin, c'est-à-dire même sans qu’il n’y ait de réplication virale, et va
activer le « Nuclear Factor-κB » (NF-κB) et des « IFN regulatory factor » (IRF5 et IRF7),
47
qui eux-mêmes induisent la production et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et des
interférons, lesquels auront pour effet de bloquer la réplication virale et de promouvoir la
réponse immune acquise (Lund et al., 2004). Seo et al. (2010) ont montré que des souris
déficientes en TLR3 et TLR7 étaient incapables de contrôler la réplication virale et mouraient
après infection par le virus influenza. RIG-1 permet la détection de particules virales dans le
cytosol des cellules infectées après réplication et il est déterminant dans la production
d’interférons par les macrophages alvéolaires, cellules dendritiques et cellules épithéliales
infectées (Kato et al., 2005). Après la détection de l’ARN, le domaine hélicase de RIG-I se lie
à l’ATP, ce qui provoque un changement de conformation de ses domaines recruteurs des
caspases et permet la liaison au facteur « mitochondrial antiviral signalling protein »
(MAVS), qui va conduire à l’expression de cytokines et IFNs de type I (Hornung et al., 2006;
Luo et al., 2011). Les NLRPs font partie du complexe multi-protéique « inflammasome »
avec l’adaptateur « apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy-terminal
CARD » (ASC : deuxième messager) et la pro-caspase 1. L’activation de l’inflammasome
résulte en une réaction auto-catalytique (pyroptose) par induction de la caspase 1 (forme
active) et le clivage des pro-interleukines qui seront ensuite secrétées. Cette activation des
NLRPs est moins spécifique et peut être induite par infection, stress ou lyse de la membrane
cellulaire (Bergsbaken et al., 2009).
Les IFNs de type I agissent de façon autocrine et paracrine par activation des protéines STAT
(signal transducers and activators of transcription), via phosphorylation par les kinases JAK
(Janus kinases). Ces IFNs jouent un rôle critique dans le contrôle précoce de la réplication
virale par activation de la transcription de plusieurs facteurs antiviraux. Lorsque le virus
influenza est détecté par les macrophages alvéolaires, une cascade inflammatoire est activée,
les membres de la famille régulatrice des interférons (IRF), IRF3, IRF5 et IRF7 activent la
48
transcription des gènes et induisent une première « vague » de sécrétion d’interférons de type
I (Jewell et al., 2007; Iwasaki et Pillai, 2014). Figure 4
1.3.2 Les médiateurs de l’inflammation
Les cytokines et chimiokines sont des médiateurs de l’inflammation. Parmi celles-ci, les
interférons de type I jouent un rôle central dans la protection contre l’infection par le virus
influenza A. L’histoire des interférons est intimement liée au virus influenza. En effet, c’est
suite au traitement de cellules de la membrane chorio-allantoïque de poulet avec des
particules virales inactivées que Isaacs et Lindenmann (1957) ont découvert la sécrétion de
cette cytokine aux propriétés antivirales. Et seulement trois ans plus tard, Lindenmann (1960)
a également décrit la capacité de certains virus influenza à induire une « interférence inverse »
et inhiber la sécrétion des IFNs, phénomène attribué plus tard à la protéine NS1 du virus (voir
point 1.1.3) (Egorov et al., 1998; Garcia-Sastre et al., 1998). Les interférons de type I sont en
effet connus comme de puissants inhibiteurs de la réplication et de la dissémination du virus
influenza A (Garcia-Sastre et Biron, 2006). Les IFNs de type I limitent la propagation virale
par induction de l’apoptose des cellules infectées, ainsi que par augmentation de la résistance
des cellules à l’infection et par activation des cellules Natural Killer (NK) et des lymphocytes
T cytotoxiques, ce qui les situe comme des éléments-clefs non seulement de l’immunité
innée, mais aussi de l’immunité adaptative (Stetson et Medzhitov, 2006). Il n’est pas
surprenant que les virus Influenza A aient développé un système spécifique pour évader cet
effet des IFNs, de là, que la principale fonction de la protéine virale NS1 soit celle d’inhiber
la production et la signalisation des interférons de type I. En cas de mutation ou de délétion du
gène codant pour la protéine NS1 du virus, les niveaux d’interférons produits par les cellules
infectées subissent des augmentations significatives et les titres viraux chutent drastiquement,
tant in vitro qu’in vivo (Garcia-Sastre et al., 1998; Kochs et al., 2007; Jiao et al., 2008).
49
L’action des interférons de type I est médiée principalement par leur capacité à induire
l’expression des « interferons stimulated genes » (ISGs), qui codent pour des agents
effecteurs antiviraux. Le premier « gène stimulé par les interférons » conférant une protection
contre l’infection in vivo par le virus influenza A fut nommé « Mx » pour « myxovirus
resistance » (Lindenmann, 1962; Horisberger et al., 1983). Il est important d’insister sur le
fait que les deux lignées de souris en question dans le présent manuscrit, à savoir DBA/2J et
C57Bl/6J, sont des souris Mx-négatives. Un autre ISG qui a fait l’objet de nombreuses études
est la PKR, dont l’activité est également inhibée pendant l’infection par le virus influenza A
(Katze et al., 1986), et qui a été le premier lien entre la protéine NS1 et la réponse interféron
(Lu et al., 1995). La PKR est exprimée constitutivement dans une conformation inactive.
Quand elle est activée par de l’ARN double brin (notamment), elle phosphoryle un grand
nombre de substrats, dont la sous-unité alpha du facteur initiateur de traduction eIF2, et
bloque ainsi la synthèse des protéines cellulaires (Garcia et al., 2006). L’« oligo 2’-5’A
synthétase » OAS, est un autre ISG dont le produit catalyse la formation de chaines de 2’-
5’poly(A). La fonction principale de l’OAS est d’activer l’enzyme « ARNaseL » latente, un
puissant inhibiteur du cycle viral, de par sa capacité à dégrader l’ARN simple brin
(Silverman, 2007). A ce jour, plus de 400 ISGs ont été décrits, dont les effets in vivo
dépendent du virus infectant, de la cellule infectée et du tissu (Schoggins, 2014).
Le rôle majeur des interférons de type I est clairement renforcé par les expériences mettant en
jeu des souris dépourvues de récepteur à ces interférons (IFNAR1-/-
). Quand des souris
IFNAR1-/-
ont été infectées avec la souche PR8 du virus, une surproduction de la chémokine
attractante des neutrophiles KC (CXCL8) induit un infiltrat de neutrophiles ainsi qu’une
augmentation de la morbidité et mortalité par rapport à des souris contrôles (Seo et al., 2011).
Malgré les propriétés antivirales indéniables des interférons de type I, plusieurs études leur
attribuent également un rôle dans la pathogénie de la pneumonie à influenza, principalement
50
via la production de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines. Ainsi, le développement
des signes cliniques est corrélé avec l’apparition d’IFN-α dans les lavages broncho-alvéolaires
des patients malades (Hayden et al., 1998; Van Reeth, 2000). Une étude plus récente dans le
modèle murin met également en avant l’implication directe des IFNs de type I dans le
développement de lésions pulmonaires et la mortalité de souris infectées par le virus influenza
A (Davidson et al., 2014). De même, l’IFN-β produit par les macrophages alvéolaires
participe activement à l’apoptose des cellules épithéliales alvéolaires en cas de pneumonie
sévère à influenza (Hogner et al., 2013). Les interférons de type I joueraient donc un double
jeu, celui du contrôle de l’infection virale d’une part, de l’exacerbation de la maladie d’autre
part. Les interférons de type II ont comme seul représentant l’IFN-γ, produit tout au long de
l’infection par le virus influenza A. Dans les premiers jours de l’infection (~ jusqu’à j3), la
production d’IFN-γ est majoritairement assurée par les macrophages et les cellules NK, alors
que durant les jours 5-10 après infection, elle l’est principalement par les lymphocytes T CD4
et CD8, au niveau du poumon et des ganglions lymphatiques. Il a été démontré que
l’expression d’IFN-γ au début de l’infection par le virus influenza A avait des propriétés
protectrices et antivirales (Khoufache et al., 2009). Ce rôle protecteur est médié par le
récepteur agoniste « proteinase-activated receptor 2 » (PAR2) qui augmente la production
d’IFN-γ et fait diminuer les titres viraux, améliorant ainsi la survie des souris infectées
(Khoufache et al., 2009). De façon paradoxale, certaines études ont montré qu’une absence ou
une inhibition du récepteur PAR2 résultait en une maladie moins sévère, avec diminution des
titres viraux et de mortalité (Nhu et al., 2010). En plus des interférons de type I et type II,
l’interféron lambda (IFN-λ), un interféron de type III, a été détecté en plus grande quantité
dans les cellules épithéliales des voies respiratoires et des poumons de souris après infection
par le virus influenza A (Jewell et al., 2010; Crotta et al., 2013). L’administration d’IFN-λ
avant infection par le virus influenza A protège les souris IFNAR-/-
contre l’infection.
51
Cependant, l’absence du récepteur de l’IFN-λ (IL-28Rα) ne rendrait les souris que
partiellement plus sensibles à l’infection (Mahlakoiv et al., 2012). Il semble que l’IFN-λ ait
une fonction antivirale similaire à celle des interférons de type I.
Le virus influenza A active aussi le facteur NLRP3 de l’inflammasome (Ichinohe et al.,
2009), ce qui a comme résultat le clivage des pro-IL-1β et pro-IL-18 en leur forme active.
L’IL-1β ainsi produite active le récepteur IL-1R pour induire l’expression de gènes pro-
inflammatoires par la voie MyD88-dépendante (Pirhonen et al., 1999). Il a été démontré que
la signalisation dépendant du récepteur IL-1R contribue à la protection de l’hôte, mais est
également responsable de l’immuno-pathologie présentée suite à l’infection par le virus
influenza A (Schmitz et al., 2005). Schmitz et al. (2005) a démontré que les souris IL-1R-/-
ne
présentaient ni la pathologie inflammatoire pulmonaire, ni le recrutement excessif de
neutrophiles typiques des pneumonies à influenza ; cependant, ces souris présentaient une
moindre production d’IgM anti-influenza, un retard dans l’élimination des particules virales et
une mortalité accrue. Une autre étude chez de souris IL-1R-/-
a mis en évidence une
diminution de la morbidité et un déplacement de la mortalité dans le temps après infection par
une souche H5N1 HPAI (Perrone et al., 2010). Ces souris présentaient une diminution de la
production de cytokines et du recrutement de macrophages alvéolaires et de neutrophiles dans
les poumons (Perrone et al., 2010). Des niveaux élevés en IL-1β conduisent par ailleurs à des
réponses pro-inflammatoires plus importantes chez des patients atteints du syndrome de
détresse respiratoire aigüe (Pugin et al., 1996). De même, des niveaux élevés en TNF-α sont
associés à de plus grandes morbidité et mortalité après infection par des souches HPAI chez
l’homme et les modèles animaux (Szretter et al., 2007). Chez la souris, un traitement avec un
anticorps anti-TNF-α résulte en une diminution du recrutement de cellules inflammatoires, de
la production de cytokines et de la morbidité suite à l’infection par le virus influenza A
(Hussell et al., 2001). Des résultats paradoxaux ont été rapportés chez des souris TNFR-/-
suite
52
à l’infection par un virus H5N1, aucune différence n’ayant été observée dans la sévérité de la
maladie (Salomon et al., 2007). Fait intéressant, les souris dépourvues à la fois d’IL-1β et de
TNF-α présentaient une plus faible mortalité, une moindre production de cytokines et
chimiokines et une réduction du nombre de neutrophiles et macrophages alvéolaires dans les
poumons, par rapport aux souris intactes (Perrone et al., 2010).
Des niveaux élevés en IL-6 ont été retrouvés dans le sérum de patients atteints d’infections
provoquées par des virus H5N1 et H1N1 et mis en corrélation directe avec la progression des
symptômes (Van Reeth, 2000; Kaiser et al., 2001). Les niveaux élevés détectés dans le sérum
de macaques infectés avec la souche pandémique H1N1 de 1918 ont été interprétés comme
une réponse inflammatoire aberrante (Kobasa et al., 2007). Par contre, la suppression de
l’expression d’IL-6 n’a pas modifié le taux de survie de souris infectées avec une souche de
virus H5N1 (Salomon et al., 2007), ce qui suggère un rôle moindre d’IL-6 dans le
développement des lésions pulmonaires après infection par le virus influenza. D’un autre côté,
Dienz et al. (2012) ont montré que la déficience en IL-6 ou en son récepteur IL-6R provoque
la persistance du virus dans le poumon et par conséquent des lésions pulmonaires plus sévères
et une mortalité accrue. L’IL-6 semble par ailleurs essentielle dans la mise en place d’une
immunité adaptative efficace contre le virus influenza A (Dienz et Rincon, 2009).
En plus des cytokines, plusieurs molécules chimio-taxiques sont exprimées après infection par
le virus influenza A chez l’homme et les modèles animaux. De façon similaire, la production
locale et systémique de chimiokines a été corrélée avec le développement de lésions associées
à l’infection par le virus influenza A (Van Reeth, 2000; De Jong et al., 2006; Kobasa et al.,
2007). Ainsi, des niveaux plus élevés en MCP-1 (CCL2) et IP-10 (CXCL10) ont été retrouvés
dans le sérum de patients infectés par un virus H5N1 hautement pathogène, en comparaison
avec des patients infectés par des souches moins pathogènes (De Jong et al., 2006). De même,
l’ARNm de RANTES (CCL5) est davantage exprimé dans des cultures primaires de
53
macrophages humains infectés par le virus H5N1 que dans ceux infectés par des souches
H1N1 ou H3N2 (Cheung et al., 2002). Bien qu’il existe une corrélation entre la surproduction
de chimiokines et la sévérité de l’infection par le virus influenza A, la responsabilité
individuelle de chaque chémokine dans la pathogenèse est à ce jour difficile à prouver. A titre
d’exemple, l’infection de souris dépourvues de récepteurs CCR2 et CCR5 a donné des
résultats paradoxaux. Les souris déficientes en CCR5 ont développé une pneumonie sévère et
ont succombé rapidement à l’infection. Au contraire, les souris déficientes en récepteur CCR2
ont développé une maladie bien plus légère, avec réduction de l’infiltrat inflammatoire et des
lésions pulmonaires, et une amélioration du taux de survie. Par contre, les titres viraux
pulmonaires étaient plus importants chez ces souris dépourvues de CCR2 (Dawson et al.,
2000). Cependant, il a été déterminé plus tard que des souris CCL2-/-
succombaient à
l’infection par une souche de virus H5N1 en présentant des taux de survie similaires à ceux
des souris CCL2+/+
(Salomon et al., 2007). Les apparentes contradictions entre les résultats de
ces études peuvent être liées aux différences quant aux souches virales utilisées ou aux
protocoles employés ou par l’effet d’autres chimiokines qui ont les mêmes actions
biologiques. Certaines cytokines, aux propriétés anti-inflammatoires, ont pour effet de
prévenir ou de limiter les lésions associées à l’activation du système immunitaire. Ainsi,
l’IL-10 constitue un élément central dans la régulation de la réponse immunitaire contre les
infections virales, bactériennes et parasitaires (Couper et al., 2008). Des niveaux élevés en
IL-10 ont été décrits chez des patients atteints par le virus influenza A (De Jong et al., 2006).
Cette surexpression d’IL-10 a été interprétée comme une réponse secondaire à l’inflammation
excessive. Une autre étude a montré qu’en inhibant le récepteur IL-10R, une infection
sublétale devenait une maladie sévère avec un haut taux de mortalité (Sun et al., 2009). Les
principales sources d’IL-10 sont les lymphocytes T CD8 et CD4 infiltrant le poumon après
infection par le virus influenza A (Sun et al., 2009; Mckinstry et al., 2012). Figure 4
54
Figure 4 : Exemple de cascades d’activation de l’expression des IFNs de type I après
détection d’ARN viral par différents récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires
PRRs et cascade d’activation de l’expression des gènes stimulés par les interférons.
Un autre médiateur de l’inflammation est le système du complément (C’). Il consiste en un
groupe complexe des protéines sériques, glycoprotéines et des récepteurs solubles ou unis aux
membranes, qu’ensemble jouent un rôle centrale dans l’immunité contre des pathogènes. Le
complément est un component phylogénétiquement très conservé de l’immunité innée
(Sunyer et Lambris, 1998). Le complément interagit aussi dans la réponse immunitaire
adaptative comme médiateur inflammatoire de l’interaction antigène-anticorps et comme pont
55
entre l’immunité innée et adaptative (Dempsey et al., 1996; Carroll, 2004). Le système du
complément peut être activé par la voie classique, la voie alternative et par la voie des
lectines. Les réactions antigène-anticorps activent la voie classique, lorsque les voies
alternative et des lectines sont activées indépendamment des anticorps par interactions entre
des components spécifiques du complément avec des groupes glucidiques et des
polysaccharides présentes dans les membranes des pathogènes (Lambris, 1988; Muller-
Eberhard, 1988; Mastellos et al., 2003). L’activation du complément se passe par des
cascades d’activation séquentielles à travers des clivages protéolytiques des protéines du C’
qui conduisent à la génération des produits actives d’action médiatrice sur plusieurs effets,
dont l’inflammation, la chimiotaxie de leucocytes et la phagocytose des particules et cellules
opsonisées (Muller-Eberhard, 1988). Un résultat directe de ces événements est la lyse des
cellules et microorganismes cible du complexe d’attaque des membranes du complément. A
l’heure actuelle, plus de 30 protéines ont été identifiées, et la déficience particulière d’un des
component est souvent associée à une déficience dans l’établissement d’une réponse
immunitaire efficace (Hicks et al., 1978; Wetsel et al., 1990; Brummer et Stevens, 1994;
Ashman et al., 2003). Des protéines du complément, le component C3 est le plus
multifonctionnel, c’es le plus abondant dans le sérum, il peut interagir avec plus de 20
protéines et il est commun pour les trois voies d’activation (Wetsel, 1995; Mastellos et al.,
2003). Le clivage de C3 par les conversasses hautement spécifiques conduit à la génération de
C3a et C3b, de propriétés anaphylactiques et multi-activatrices, respectivement (Alsenz et al.,
1992; Lambris et al., 1994; Mastellos et al., 2003; Markiewski et Lambris, 2007). Le facteur
C5 du complément est activé par action du C3b et est clivé en C5a et C5b (Discipio et al.,
1983). Des études plus récentes suggèrent que le facteur C5 du complément pourrait être aussi
activé en absence du C3, par voie de la trombine (Huber-Lang et al., 2006). Le C5a est une
puissante anaphylatoxine chimiotactique, d’effet médiée par l’activation des cellules voie
56
leur récepteur C5aR ; et C5b fait partie du « complexe d’assemblement C5b9 » qui induit la
lyse des cellules ciblées par le complément (Morgan, 1999). L’activation du complément face
à une infection virale peut être mise en place avec et sans interaction des anticorps et peut
mener à la neutralisation du virus, à la phagocytose des particules virales enrobées du
complément, à la lyse des cellules infectées par le virus et aussi à la génération d’un processus
inflammatoire antivirale (Mastellos et al., 2003; Dunkelberger et Song, 2010). La souris
DBA/2J possède une déficience du facteur C5 du complément, qui a été liée à sa sensibilité
accrue présentée face aux pathogènes Candida albicans, Cryptococcus neoformans et à un
virus influenza A (Hicks et al., 1978; Wetsel et al., 1990; Brummer et Stevens, 1994; Ashman
et al., 2003)
1.3.3 Rôle du macrophage alvéolaire
L’infection expérimentale à l’aide d’un virus influenza A provoque un recrutement de
macrophages/monocytes dans les poumons infectés. Ces cellules peuvent être infectées et
contribuer à la réplication et à la dissémination virale (Van Riel et al., 2011; Pang et al.,
2013), mais peuvent aussi se protéger de l’infection par l’intermédiaire des interférons de type
I (Hermesh et al., 2010). L’infiltration de macrophages peut contribuer à la pathologie
pulmonaire et augmenter la morbidité et la mortalité. Mais, ce sont les macrophages
alvéolaires résidents qui jouent le rôle primordial dans le contrôle de la dissémination et
l’élimination des particules virales (Tumpey et al., 2005b). Dans un modèle murin d’infection
par le virus H1N1 de 1918, la déplétion des macrophages alvéolaires par instillation intra-
nasale de liposomes de clodronate s’est traduite par une diminution de la production de
cytokines et chimiokines, avec une augmentation du taux de mortalité par rapport aux groupes
contrôles clodronate-négatifs. De plus, cette déplétion chimique des macrophages alvéolaires
avant infection a transformé une infection sublétale en une maladie mortelle avec des titres
57
viraux très élevés. Paradoxalement, dans les mêmes conditions et suite à l’infection par la
souche PR8 du virus (faiblement pathogène), la sévérité de la maladie et la mortalité n’ont pas
montré de différences avec ou sans traitement au clodronate (Tate et al., 2010). Dans le
modèle porcin, les macrophages alvéolaires sont indispensables pour contrôler l’infection par
le virus influenza A (Kim et al., 2008). Suite à la déplétion de leurs macrophages alvéolaires,
les porcs ont montré une augmentation du taux de mortalité et une aggravation des lésions
pulmonaires par rapport aux porcs non déplétés. Il existe trois types de macrophages résidents
dans le tissu pulmonaire, les macrophages bronchiques, les macrophages interstitiels et les
macrophages alvéolaires. Les macrophages alvéolaires se trouvent dans la lumière alvéolaire,
où ils constituent ~95% du contenu cellulaire en conditions physiologiques (Reynolds, 1987).
Les macrophages alvéolaires occupent un espace unique de l’organisme, une position extra-
épithéliale dans l’interface entre le poumon et l’atmosphère externe, d’où ils stimulent une
réponse immunitaire innée non spécifique contre divers agents étrangers (Tate et al., 2010;
Balhara et Gounni, 2012). Dans le poumon de la souris, on considère que la proportion des
macrophages alvéolaires par alvéole est de 1 sur 3, respectivement ; et que la population totale
des macrophages alvéolaires dans le poumon varie entre 1 et 2 millions (Westphalen et al.,
2014).
Ces dernières années, plusieurs travaux sur l’origine des macrophages tissulaires ont remis en
cause le dogme qui soutenait que les monocytes circulants et originaires de la moelle osseuse
pénétraient constamment les tissus pour reconstituer directement les stocks de macrophages
résidents (Epelman et al., 2014; Ginhoux et Jung, 2014; Kopf et al., 2015). La théorie la plus
communément admise aujourd’hui est que plusieurs groupes de macrophages tissulaires, dont
les macrophages alvéolaires, ont pour origine des cellules embryonnaires qui migrent dans les
organes pendant le développement fœtal. Le maintien tout au long de la vie des populations
58
de macrophages alvéolaires se ferait par auto-renouvèlement autonome (Epelman et al., 2014;
Ginhoux et Jung, 2014; Kopf et al., 2015).
Le macrophage alvéolaire est équipé d’une grande quantité de récepteurs spécifiques de
reconnaissance des pathogènes, dont la famille des TLR et NLRP, mais aussi des CLRs et des
récepteurs « scavengers », qui vont favoriser la phagocytose/endocytose des agents
pathogènes, des débris cellulaires et des corps étrangers. Toutes ces caractéristiques font du
macrophage alvéolaire une cellule de « première ligne de défense » (Lohmann-Matthes et al.,
1994; Mosser, 1994; Thoma-Uszynski et al., 2001; Taylor et al., 2005; Kumagai et al., 2007).
Les macrophages alvéolaires, comme les macrophages en général, sont classés d’après leur
profil de sécrétion de cytokines en deux sous-populations, décrites comme les polarisations
« classique » M1 et « alternative » M2 (Mantovani et al., 2009). Les macrophages M1 sont
connus principalement pour être impliqués dans les réponses inflammatoires dirigées contre
des pathogènes intracellulaires (Cassol et al., 2009; Moreira et al., 2010), tandis que les
macrophages M2 sont impliqués dans la défense contre des pathogènes extracellulaires, dont
certains parasites, et la phagocytose des cellules en apoptose (Mills et al., 2000). L’interféron-
γ produit par les lymphocytes T auxiliaires 1 (Th1) et le lipopolysaccharide bactérien
induisent une polarisation des macrophages en type M1, tandis que les cytokines produites par
les lymphocytes T auxiliaires 2 (Th2), dont IL-4 et Il-13, induisent une polarisation en M2
(Mills et al., 2000; Cassol et al., 2009). Le statut de polarisation M1 inclut donc les
macrophages activés par des cytokines de type Th1 ou des médiateurs pro-inflammatoires
dont le « facteur stimulateur des colonies granulocytes-monocytes » (GM-CSF), TNF-α, IL-6,
IL-1β, IL-12 et plusieurs PAMPs, tandis qu’une signalisation plutôt anti-inflammatoire
provoque la polarisation M2, où interviennent des molécules telles que le « facteur stimulant
des macrophages » (M-CSF), IL-10, Il-4, des glucocorticoïdes et la sérotonine (Mills et al.,
59
2000; Cassol et al., 2009; Balhara et Gounni, 2012; Murray et al., 2014). Ces caractéristiques
sont résumées dans la figure 5.
Figure 5 : Polarisation des macrophages. Différents stimuli activent le développement des
différentes populations fonctionnelles des monocytes/macrophages. L’activation classique M1
est induite par des produits microbiens et des cytokines inflammatoires, principalement l’IFN-
γ. Les macrophages M1 possèdent une activité microbicide et pro-inflammatoire. L’activation
alternative M2 des macrophages est induite par les IL-4 et IL-13 produites par les
lymphocytes auxiliaires Th2 et sont impliqués plutôt dans la réparation tissulaire et la fibrose
(Mitchell, 2012).
60
Ces deux types d’activation ont initialement été décrits respectivement pour les infections
bactériennes et parasitaires. A ce jour, une série d’observations démontrent que le processus
de polarisation est bien plus complexe et répond à plusieurs médiateurs endogènes et à des
stimuli exogènes. Il a ainsi été démontré que IL-4 peut induire la production d’IL-6, IL-12p70
et TNF-α par les macrophages M1, par exemple (Varin et al., 2010).
Des données récentes mettent en question ce spectre bipolaire d’activation et indiquent par
contre un spectre multipolaire et continu d’activation des macrophages, par des stimuli très
variés (Martinez et Gordon, 2014). Ces nouveaux éléments permettent d’inclure les infections
virales et l’action des interférons dans l’activation des macrophages. Si l’on considère les
divers processus pathogéniques associés à différents virus, on ne peut pas attribuer aux virus
un type précis d’activation des macrophages et il faut donc tenir compte de leur hétérogénéité
et analyser chaque cas d’une façon dynamique (Crespo et al., 2013; Schneider et al., 2014a;
Shirey et al., 2014).
Quoi qu’il en soit, le rôle des macrophages alvéolaires dans la protection contre le virus
influenza est considéré comme essentiel (Schneider et al., 2014a). La réactivité des
macrophages alvéolaires est critique pour la protection des voies respiratoires par la
restriction de la dissémination et par la mise en place d’une immunité innée efficace contre le
virus influenza A. Le succès de l’infection dépend de la capacité du virus influenza à
échapper et même à profiter de la réponse immunitaire de l’hôte. Ainsi, bien que les cellules
épithéliales du système respiratoire soient le site primaire de réplication virale, plusieurs
études ont montré la réplication du virus au sein même des macrophages alvéolaires des
souris après infection in vivo et in vitro (Martinez et al., 2009). Un élément essentiel du rôle
des macrophages alvéolaires dans la lutte contre les infections virales est sans nul doute
l’expression des interférons de type I. La contribution des macrophages alvéolaires au
contrôle précoce de la réplication et de la dissémination virale est telle que, quand ils sont
61
déplétés, l’efficacité de l’élimination des particules virales diminue drastiquement dès 24
heures après infection (Kumagai et al., 2007), mais les macrophages alvéolaires participent
également activement au contrôle de l’infection par phagocytose des cellules infectées et des
particules virales elles-mêmes, action qui est partagée avec les neutrophiles (Hashimoto et al.,
2007). La sécrétion des IFNs de type I a également un impact sur le recrutement des cellules
myéloïdes vers le site d’infection. Après la détection du virus influenza A, les interférons de
type I produits par les macrophages alvéolaires induisent une différentiation et une
prolifération des cellules souches hématopoïétiques ainsi qu’une augmentation de
l’expression de la chémokine MCP-1 (CCL2), qui va recruter les monocytes «CCR2-
dependants Ly6Chi » provenant de la moelle osseuse. Cependant, en l’absence d’interférons
de type I, ce sont les monocytes de type « CCR2-Ly6Cint » qui seront recrutés dans les
poumons infectés où ils vont produire de grandes quantités d’interleukine 8 (IL-8), chémokine
agissant sur les neutrophiles ; ce phénotype est associé à une pneumonie sévère et à une haute
mortalité (Tumpey et al., 2005a; Serbina et Pamer, 2006; Essers et al., 2009; Sato et al., 2009;
Seo et al., 2011; Divangahi et al., 2015).
1.3.4 Rôle d’autres types cellulaires
La pathologie provoquée par différentes souches virales d’origine humaine, aviaire ou porcine
hautement virulentes est caractérisée par une pneumonie sévère, avec un infiltrat
inflammatoire neutrophilique important (Perrone et al., 2008; Garigliany et al., 2010). Après
infection par une souche de sous-type H5N1, les patients gravement malades ont présenté une
expression plasmatique d’interleukine 8 (IL-8) beaucoup plus importante, associée à un
recrutement accru de neutrophiles, par rapport à des patients infectés par des souches
saisonnières moins pathogènes (De Jong et al., 2006). Par ailleurs, la déplétion complète des
neutrophiles chez la souris résulte en une moindre élimination des particules virales et en une
62
augmentation de la morbidité et de la mortalité après infection par différentes souches de
virus influenza A (Tumpey et al., 2005b; Brandes et al., 2013). Par contre, une atténuation de
la réponse neutrophilique a permis d’augmenter le taux de survie des souris après infection
par la souche PR8 du virus (Brandes et al., 2013). Ces différentes études suggèrent que
l’infiltrat neutrophilique, bien que nécessaire au contrôle de l’infection par le virus influenza,
participe s’il est excessif aux lésions pulmonaires et à leurs conséquences cliniques.
Pendant l’infection par le virus influenza A, les cellules dendritiques résidentes dans le
poumon jouent un rôle essentiel dans l’activation des lymphocytes T au niveau des ganglions
lymphatiques médiastinaux (Lambrecht et Hammad, 2012). Différentes sous-populations de
cellules dendritiques sont identifiées grâce aux analyses immunophénotypiques par
cytométrie en flux, avec chacune des capacités variables à activer les lymphocytes T dans la
lutte contre le virus (Lambrecht et Hammad, 2012). Des études ont mis en évidence un lien
entre la réponse des cellules dendritiques et la sévérité de la pathologie présentée suite à
l’infection, la morbidité et la mortalité (Dawson et al., 2000). Une autre étude a établi une
corrélation entre l’infection par des virus influenza hautement pathogènes avec une
augmentation des cellules dendritiques productrices de TNF-α et d’oxyde nitrique (TipDcs),
phénomène qui n’est pas apparu suite à l’infection par des virus influenza faiblement
pathogènes (Aldridge et al., 2009). Il est par ailleurs apparu qu’une réduction de l’infiltration
de TipDCs et la production de chimiokines MCP-1 et MCP-3 augmentait la survie suite à
l’infection (Aldridge et al., 2009). Dans leur ensemble, ces études suggèrent qu’il existe une
« petite fenêtre » d’équilibre entre les effets protecteurs et les effets néfastes des cellules
dendritiques pendant l’infection contre le virus influenza A.
63
1.4 Résultats préliminaires
Des expériences préliminaires menées au sein du laboratoire de Pathologie Systémique de la
Faculté de Médecine Vétérinaire de l’Université de Liège ont confirmé les différences de
sensibilité entre les souris DBA/2J et C57BL/6J à l’infection par le virus influenza et ouvert
de nouvelles pistes de recherche.
Le modèle mis en œuvre est basé sur un virus H1N1 d’origine porcine
(A/Swine/Iowa/4/1976(H1N1)) adapté à la souris par 32 passages pulmonaires successifs. Ces
passages pulmonaires ont été effectués sur différentes lignées de souris de laboratoire en
partant des plus sensibles au virus influenza jusqu’aux plus résistantes. Ces lignées de souris
furent : 129Sv, C3H/HeN, BALB/c puis FVB, respectivement (Habyarimana et Desmecht,
résultats non publiés).
Après la murinisation, le virus est devenu hautement virulent pour les souris de laboratoire
(Garigliany et al., 2010). Au terme du processus d’adaptation, quatre substitutions seulement
ont été détectées : E219W et L544S dans l’HA ; A542S dans la PB1 et S145F dans la NA
(résultats non publiés).
Pour mesurer objectivement la létalité du virus P32, nous avons déterminé la dose létale 50
(LD50) pour différentes lignées murines. Le Tableau 4 reprend les données concernant les
lignées DBA/2J et C57BL/6J.
64
Tableau 4. Determination de la dose létale 50
Lignée de
souris
Titre de l’inoculum
(PFUs/souris)
Souris
mortes
Souris
survivantes
Taux de
Mortalité (%)
DBA/2J 9000 4 0 100
900 5 0 100
90 5 0 100
9 5 0 100
1 2 3 40
C57BL/6J 9000 4 1 80
900 5 0 100
90 5 0 100
9 0 5 0
1 0 5 0
Tableau 4 : Taux de mortalité des souris DBA/2J et C57BL/6J au jour 14 après infection par
des dilutions sériées de virus influenza H1N1 P32.
L’analyse du Tableau 4 nous a permis de déterminer une dose infectieuse (environ 9
PFUs/souris) permettant d’obtenir 100% de mortalité chez DBA/2J et 0% de mortalité chez
C57BL/6J. La dose infectieuse standard de ~9 PFUs/souris dans un volume de 50μl de PBS a
été administrée par voie intranasale. Cette méthode a pour objectif d’atteindre les voies
respiratoires profondes du poumon et d’obtenir une infection homogène et reproductible et
pas nécessairement de recréer l’infection naturelle qui est généralement restreinte aux voies
respiratoires supérieures et caractérisée par une maladie bénigne (Salomon et al., 2007;
Perrone et al., 2008).
Après infection in vivo, le taux de mortalité et l’évolution du poids vif ont été concordants
avec les résultats décrits précédemment dans la littérature, confirmant la sensibilité accrue de
DBA/2, c'est-à-dire une perte de poids vif rapide à partir du jour 3 après infection avec
dyspnée sévère puis mortalité aux jours 7 à 8 après infection (ou l’euthanasie en cas de perte
de poids supérieure à 20% du poids vif initial). (Figure 6(A)). En comparaison, les souris
65
C57BL/6J ne perdaient au maximum que 8% de leur poids vif (au jour 8 pi) avec retour au
poids de départ avant la fin de l’expérience (14 jours) et un taux de survie de 100%.
Figure 6(B)
Figure 6 : Perte de poids vif des souris DBA/2J et C57BL/6J mesurée pendant 8 jours après
inoculation intra-nasale de 9 PFUs (plaque-forming unit) par souris de virus influenza A P32
(A). Taux de survie durant les 14 jours suivant l’infection (B).
La mesure des titres viraux pulmonaires a révélé des écarts significatifs à partir du jour 3
après infection, avec un nombre de PFUs (plaque-forming unit) par gramme de poumon
significativement supérieur chez DBA/2J (Figure 7). Les titres viraux atteignaient un pic au
jour 6 pi (post-infection) pour les deux lignées de souris, mais ceux chez DBA/2J étaient
encore environ deux fois supérieurs à ceux mesurés dans les poumons des souris C57BL/6J.
Au jour 3 pi, le ratio entre les titres mesurés pour les deux lignées de souris était de 7. Une
fois encore, ces données démontrent que la différence de sensibilité entre DBA/2J et
C57BL/6J intervient très tôt dans le processus infectieux, bien avant la mise en place d’une
immunité adaptative.
66
Figure 7 : Titres viraux pulmonaires mesurés chez des souris DBA/2J et C57BL/6J durant les
huit jours suivant l’inoculation intranasale de 9 PFUs/souris de virus A/swine/Iowa/4/1976
(H1N1), variant murinisé P32. Student t-test : *P < 0.05, et ***P < 0.001.
Parallèlement, l’évaluation histopathologique a mis en évidence des lésions pulmonaires plus
sévères et étendues dans les poumons de la souris DBA/2J (Figure 8). Durant les trois
premiers jours après infection, l’exsudat inflammatoire se focalisait majoritairement dans et
autour des bronches et bronchioles pour les deux lignées de souris. Aux jours 6-7 après
infection, une progression des lésions chez la souris DBA/2J se traduisait par une sévère
pneumonie caractérisée par un abondant infiltrat des neutrophiles, avec parallèlement une
nécrose de l’épithélium des bronches et bronchioles, des dommages alvéolaires diffus avec
des dépôts fibrineux (membranes hyalines) et une vasculite. Chez la souris C57BL/6J, la
pneumonie était moins sévère et les lésions circonscrites principalement autour des voies
respiratoires (Figure 8). Ces résultats sont concordants avec ceux obtenus par d’autres
équipes (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009). Les différences entre les deux lignées de
souris semblent donc se manifester très tôt au cours de l’infection, ce qui, à nouveau, suggère
67
l’importance de l’immunité innée et tend à limiter voire à exclure le rôle de l’immunité
acquise pour expliquer les différences de sensibilité entre les souris DBA/2J et C57BL/6J.
Figure 8 : Lésions microscopiques dans les poumons des souris DBA/2J et C57BL/6J au
cours de l’infection in vivo par le virus influenza A/swine/Iowa/4/1976 (H1N1), variant
murinisé P32. La coloration à l’hématoxyline/éosine montre de grandes différences au niveau
de l’infiltrat de neutrophiles et de macrophages, beaucoup plus sévère chez DBA/2J.
L’épithélium des bronchioles est à différents stades de nécrose, avec desquamation, présence
de neutrophiles et sécrétion fibrineuse dans la lumière des bronchioles des poumons
principalement chez DBA/2J.
Par ailleurs, le marquage de la nucléoprotéine virale par immunohistochimie sur des coupes
de poumons à différents temps post-infection a montré que les particules virales sont
68
principalement présentes au niveau des voies respiratoires jusqu’au troisième jour après
infection, avant d’atteindre les alvéoles pulmonaires, pour les deux lignées de souris (Figure
9). Le marquage était néanmoins nettement plus prononcé chez DBA/2J, ce qui confirme les
titres viraux pulmonaires plus importants mesurés chez cette lignée.
Figure 9 : Marquage par immunohistochimie de la nucléoprotéine virale sur coupes
histologiques de poumon de souris DBA/2J et C57BL/6J, trois jours après infection à l’aide
du virus influenza A/swine/Iowa/4/1976 (H1N1), variant murinisé P32.
Dans leur ensemble, ces observations suggèrent que soit l’épithélium des voies respiratoires
de DBA/2J amplifie la population virale de façon plus importante, soit les macrophages
alvéolaires de C57BL/6J phagocytent et éliminent les particules virales ou limitent la
réplication virale plus efficacement, soit une conjonction de ces deux phénomènes. Par
69
ailleurs, la déficience en facteur C5 du complément jouant un rôle majeur dans la sensibilité
de DBA/2J à Candida albicans (Ashman et al., 2003), l’effet de cette déficience sur la
sensibilité de DBA/2J au virus influenza doit être déterminé.
1.5 Objectifs
D’après les données disponibles dans la littérature et les résultats préliminaires obtenus dans
le laboratoire, il apparaît clairement que trois axes de recherche se dégagent en vue de
préciser l’origine de la sensibilité extrême au virus influenza A, axes qui se traduisent par les
trois objectifs suivants :
Comparaison de la permissivité des cellules de l’arbre respiratoire de DBA/2J et
C57BL/6J au virus influenza A ;
Pour mener cette étude, nous allons extraire, isoler et mettre en culture primaire différents
types cellulaires de l’arbre respiratoire des deux lignées des souris, à savoir les cellules
épithéliales de la trachée, les pneumocytes de type II et les macrophages alvéolaires. Suite à
l’infection de ces cultures cellulaires, le nombre de particules virales produites et présentes
dans les surnageants sera mesuré. L’expression des récepteurs spécifiques du virus influenza
présents en surface des membranes plasmiques de ces cellules sera également analysée et
mise en relation avec les différents degrés de permissivité obtenus.
Etude du rôle des macrophages alvéolaires dans la sensibilité/résistance des souris
DBA/2J et C57BL/6J à l’infection ;
L’influence directe des macrophages alvéolaires dans le différentiel de susceptibilité à
l’infection va être déterminée par des expériences de déplétion et de transfert adoptif des
70
macrophages alvéolaires sur les souris. Les macrophages alvéolaires des deux lignées de
souris seront comparés en termes de capacité de phagocytose des virions, de niveau
d’expression de cytokines/chimiokines et d’aptitude à conditionner les épithéliums
respiratoires contre l’infection virale.
Etude de l’impact de la déficience en facteur C5 du complément sur la sensibilité
des souris DBA/2J à l’infection.
Une expérience de complémentation de souris DBA/2J avec du sérum riche en facteur C5 du
complément avant leur infection in vivo sera mise en place. Cette approche nous permettra
d’évaluer l’importance de la déficience en ce facteur dans la sensibilité extrême des souris
DBA/2j à l’infection par le virus influenza A.
71
2 RESULTATS
2.1 Hyporeactivity of alveolar macrophages and higher respiratory cell
permissivity characterize DBA/2J mice infected by influenza A virus
Résumé
Le virus influenza constitue un problème majeur de santé publique. On estime que chaque
année entre le 10 et 15% de la population mondiale est affectée par une souche saisonnière du
virus influenza A. Dans la plupart des cas, l’infection est limitée à un syndrome fébrile léger
mais, dans les groupes à risque, la maladie peut évoluer gravement en une pneumonie virale,
souvent compliquée par une infection bactérienne secondaire, voire entrainer la mort. Le
modèle murin a été largement utilisé pour étudier l’infection par le virus influenza chez les
mammifères. Parmi le grand éventail de lignées de souris Mx-négatives utilisées, les lignées
DBA/2J et C57BL/6J se sont révélées comme deux extrêmes en termes de
sensibilité/résistance à l’infection par le virus influenza A, quelle que soit la souche virale
employée. Plusieurs équipes ont tenté d’expliquer les raisons de ces différences,
principalement par des approches génétiques ayant eu recours à des analyses QTL des
« Recombinant inbred lines » entre ces deux lignées de souris, ce qui a mené à de très longues
listes de gènes candidats, mais dont leur influence respective n’a malheureusement pas pu être
déterminée. Nous avons choisi une approche phénotypique, en analysant chaque étape de
l’infection, de manière à identifier les facteurs directement liés aux différences de
susceptibilité entre les deux lignées de souris. Les résultats de ces analyses comparatives
menées in vivo et ex vivo suggèrent que la dysfonction des macrophages alvéolaires ainsi que
la permissivité accrue présentée par les cellules des voies respiratoires et du parenchyme
pulmonaire des souris DBA/2J rendraient cette lignée de souris plus sensible à l’infection par
le virus influenza A. Il apparaît également que le facteur C5 du complément, absent chez
72
DBA/2J, ne jouait pas de rôle significatif dans la sensibilité de cette lignée murine au virus
influenza A, dans nos conditions expérimentales.
74
Hyporeactivity of alveolar macrophages and higher respiratory cell permissivity
characterize DBA/2J mice infected by influenza A virus
Tomás Casanova*, Els Van de Paar*, Daniel Desmecht†, and Mutien Garigliany
†.
*, † : contributed equally
Author affiliation
Department of Veterinary Pathology, University of Liège, Boulevard de Colonster 20 (B43),
4000 Liège (Belgium).
Corresponding author
Mutien Garigliany, Department of Veterinary Pathology, University of Liège, Boulevard de
Colonster 20 (B43), 4000 Liège (Belgium). Phone: +3243664074. E-
mail: mmgarigliany@ulg.ac.be
Keywords
Mouse; influenza; alveolar macrophage; cell permissivity
75
Abstract
Influenza A virus remains a major public health problem. Mouse models have been widely
used to study influenza infection in mammals. DBA/2J and C57BL/6J represent extremes in
terms of susceptibility to influenza A infection among inbred laboratory mouse strains.
Several studies focused specifically on the factors responsible for the susceptibility of
DBA/2J or the resistance of C57BL/6J and resulted in impressive lists of candidate genes or
factors over- or under-expressed in one of the strains. We adopted a different, phenotypical,
approach to identify the critical steps of the infection process accounting for the differences
between DBA/2J and C57BL/6J strains. We concluded that both a dysfunction of alveolar
macrophages and an increased permissivity of respiratory cells rendered DBA/2J more
susceptible to influenza infection.
Introduction
It is estimated that seasonal influenza globally affects between 5 and 10% of adults and
between 20 and 30% of children every year (WHO 2012). Besides, 3-5 million cases of
severe influenza are recorded yearly, resulting in up to 500,000 deaths worldwide (WHO,
www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/). The annual financial burden of seasonal
influenza (vaccination, general practitioner visits, pharmaceuticals, hospitalizations) is
estimated to 6 to 14 billion euros for the sole Europe and up to ~87 billion US dollars in the
United States (Klepser, 2014; Preaud et al., 2014). Besides, several outbreaks of pandemic
influenza were responsible for a heavier burden in terms of fatalities, among which the most
famous was the 1918 H1N1 influenza pandemic, accounting for up to 50 million deaths
(Murray et al., 2006). The impressive impact influenza virus has on public health resulted in a
tremendous research effort aiming to understand the pathogenesis of influenza infection in
humans. Mouse models of influenza pneumonia have been widely used to describe the disease
76
and to apprehend the virulence factors of different influenza strains or the factors responsible
for variations in the resistance to infection of several mouse strains (Srivastava et al., 2009;
Garigliany et al., 2010). In particular, the DBA/2J and C57BL/6J mouse strains, the former
extremely susceptible, the latter much more resistant to influenza infection, have been widely
used thanks to the availability of large numbers of genetically characterized recombinant lines
of these two parental strains, which greatly helped the QTL analyses of the susceptible or
resistant phenotypes (Boon et al., 2009; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012).
Together with studies on the parental strains, these experiments resulted in long lists of
candidate genes proposed to be responsible for the susceptibility of DBA/2J and for the
resistance of C57BL/6J to influenza infection (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009;
Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon et al., 2014; Dengler et
al., 2014). While it became evident that the susceptibility/resistance traits were multigenic in
origin (Boon et al., 2009; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon et al., 2014),
genes effectively involved in these phenotypes still remain unknown. In addition, a recent
study challenged the reliability of QTL mapping using DBA/2J and C57BL/6J recombinant
inbred lines (Wang et al., 2014).
To help to define the factors involved in the susceptibility of DBA/2J mice to influenza
infection, we adopted a phenotypic approach to identify the critical steps of the infection
process accounting for this extreme susceptibility.
Overall, the data presented here support the role of a dysfunction of alveolar macrophages,
together with an increased permissivity of several cell types of the airways and lung
parenchyma to influenza infection in the higher susceptibility of the DBA/2J strain to this
virus. In our conditions, the C5 complement deficiency in DBA/2J plays little or no role in the
process.
77
Materials and Methods
1. Virus, mouse strains, infection procedures
The mouse-adapted variant of A/Swine/Iowa/4/1976 (H1N1) has been described previously
(Garigliany et al., 2010). Eight-week-old female DBA/2J and C57BL/6J mice were obtained
from Charles River Laboratories (France). Challenge studies were conducted in biosafety
level 2 facilities accredited by the Belgian Council for Laboratory Animal Science, under the
guidance of the Institutional Animal Care and Use Committees of the University of Liège
(No: 13-1503). Mice were housed in microisolator cages ventilated under negative pressure
with HEPA-filtered air. The light/dark cycle was 12/12 h, and the animals were allowed free
access to food and water. Before each inoculation or euthanasia procedure, the animals were
anesthetized by intraperitoneal injection of a mixture of ketamine (50 mg/kg) and xylazine
(30 mg/kg).
Groups of 10 DBA/2J and C57BL/6J mice were intranasally inoculated with 9 PFUs of
mouse-adapted swine H1N1 influenza A virus, as previously described (Garigliany et al.,
2010). Mice were monitored daily for changes in body weight, signs of illness and mortality.
2. Viral titration, histopathology, virus-specific immunohistochemistry and myeloperoxydase
activity
Groups of 4 DBA/2J and C57BL/6J mice were infected as previously described and
euthanized daily by pentobarbital overdosing and exsanguinated by cutting the brachial artery
from day 0 (before infection, negative control) to day 8 post-infection (pi). Lungs were
harvested and, after wet weight was recorded, were homogenized in 1ml of sterile phosphate-
buffered saline (PBS; Lonza, Belgium). Homogenates were centrifuged at 3,000g for 10min
and supernatants were stored at -80°C. Viral titration was performed using the ID Screen®
78
Influenza A Antigen Capture ELISA kit (ID-Vet, France), using a reference lung homogenate
titrated by standard plaque assay to establish a calibration curve.
For the evaluation of microscopic lesions, groups of 4 DBA/2J and C57BL/6J mice were
euthanized at day 0 (before infection, negative control), 3, 6 and 7 after standard intranasal
infection, as previously detailed. Lungs were harvested and fixed in 4% paraformaldehyde
(Sigma-Aldrich, Germany) and processed routinely as 5μm sections stained with hematoxylin
and eosin for histopathological evaluation. Virus-specific immunohistochemical analysis was
performed as previously described (Garigliany et al., 2010).
For myeloxperoxydase (MPO) activity measurement, groups of five DBA/2J and C57BL/6J
were infected and euthanized as previously mentioned from day 0 (negative control) to day 7
pi. Lungs were homogenized in 1.5ml of PBS, centrifuged at 300g for 10min and supernatants
were aliquoted and stored at -80°C for cytokine/chemokine analysis (see below). The pellet
was resuspended in 1ml of PBS. Half of the suspension (500μl) was submitted to a
centrifugation at 4,500g for 10min. The resulting pellet was dissolved in 500μl PBS with
5mg/ml hexadecyltrimethyl ammonium bromide (HTAB) and 5mM
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich, Germany). After a new
centrifugation at 4,500g for 10min, 50μl of the supernatant was placed in a tube with 50μl
PBS-HTAB-EDTA, 500μl Hank's Buffered Salt Solution, 25μl of 1.25mg/ml o-dianisidine
dihydrochloride and 25μl of 0.05% hydrogen peroxide (Sigma-Aldrich, Germany). The
solution was incubated at 37°C for 15min. The reaction was stopped by adding 25μl of
10mg/ml sodium azide (Sigma-Aldrich, Germany) and the optical density (O.D.) was
measured at 460nm (Multiskan Spectrum spectrophotometer, Thermo Scientific, USA).
79
3. Primary culture of respiratory cells and in vitro infection, ex vivo infection of tracheal
explants
Alveolar macrophages and type II pneumocytes were isolated during the same procedure.
After euthanasia of mice as previously detailed, trachea was sectioned distal to the larynx and
500μl of calcium- and magnesium-free PBS (Lonza, Belgium) containing 0.2% EDTA
(Sigma-Aldrich, Germany) were instilled intratracheally using a 20g catheter (Terumo,
Japan). The instilled solution was aspirated and submitted to centrifugation at 300g for 5min
to pellet alveolar macrophages. Alveolar macrophages (100,000/well) were transferred to 24-
well plates (Greiner BioOne, Germany) in 1ml per well of RPMI (Roswell Park Memorial
Institute) medium containing 2% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin and
0.6% fungizone (Lonza, Belgium) and were incubated at 37°C and 5% CO2. After alveolar
macrophages isolation, 1ml of PBS containing 0.5% dispase (Gibco, Japan) was instilled into
the trachea to the lungs after what the trachea was tightly closed by ligature. Lungs were
immersed for 30min in 8ml of the PBS-dispase solution and incubated at 37°C for 30min.
Lungs were then homogenized and the homogenate was transferred to 40ml of DMEM
medium (Dulbecco’s modified Eagle's Medium; Lonza, Belgium) and vortexed for 5min. The
digested cells were pelleted by centrifugation at 300g for 5min, resuspended and transferred
(100,000/well) to a 24-well plate in 1ml of complete BEBM (Bronchial Epithelial Cell Basal
Medium; Lonza, Belgium) for 4h. After adherence of fibroblasts, non-adherent cells
(pneumocytes) were transferred to a new 24-well plate coated with 300μl/well of BD Matrigel
(BD Biosciences, USA) and incubated at 37°C and 5% CO2.
Epithelial tracheal cells were isolated separately. After careful dissection, the trachea was
harvested, opened and placed in 3ml PBS-dispase solution for 30min at 37°C. Ten ml of
DMEM medium were then added and the mixture was vortexed for 10min. Cells in
80
suspension were pelleted by centrifugation at 300g for 5 min. Fibroblast elimination and cell
culture were performed as previously described for type II cells.
Infection of primary cultures was performed in triplicate using a multiplicity of infection
(MOI) of 1 of the mouse-adapted swine H1N1 influenza strain in 1ml of serum-free DMEM
containing 0,5μg/ml of TPCK trypsin (Sigma-Aldrich, Germany) and 1% penicillin-
streptomycin and 0.6% fungizone. At 24h and 48h pi, 200μl of culture supernatant were
harvested and stored at -80°C. Viral titers were measured as previously described.
Neuraminidase pre-treatment of tracheal epithelial cells was performed using 160mU/ml of
Vibrio cholerae neuraminidase (Sigma-Aldrich) for 3h at 37°C. Serum-free DMEM was used
as a negative control. After two washing steps in PBS, cells were infected as previously
detailed.
Tracheal explants were obtained after careful dissection and opening of the trachea. Each
trachea was placed in an individual well in a 6-well plate and the infection was performed in
the same conditions as for primary cultures of respiratory cells but with 50PFUs/explant.
Culture supernatants were harvested at 24, 48 and 72h pi and viral titers were obtained as
previously described.
4. Flow cytometry analysis of α2,3 and α2,6-linked sialic acids expression using lectin
cytochemistry
Primary cultures of respiratory cells were prepared as previously described from DBA/2J and
C57BL/6J mice. After 24h of culture, cells were harvested in 500μl of trypsin-EDTA solution
1x (Lonza, Belgium), pelleted and resuspended in 500μl of PBS with 1% BSA (bovine serum
albumin; Sigma-Aldrich, Germany) for 1h at room temperature. After one washing step in
PBS, cells were resuspended in 250μl of 1/250 Sambucus nigra (SNA) or Maackia amurensis
(MAAII) (Vector, USA) solution in PBS-BSA and incubated on ice for 18h. After two
81
washing steps in PBS, cells were resuspended in 250μl of 1/500 streptavidin-FITC (Vector,
USA) solution in PBS-BSA and kept on ice for 1h. After two last washing steps, cells were
resuspended in 500μl of PBS and the mean fluorescence intensity was measured using a BD
FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, USA).
5. In vitro evaluation of the phagocytic properties of alveolar macrophages and in vivo
depletion using clodronate
Alveolar macrophages from DBA/2J and C57BL/6J were harvested as previously. Virus
inactivation was performed by 30min direct exposition to UV-light and verification by
subsequent culture. Alveolar macrophages (500,000/well) were incubated with ~100
inactivated viral particles/macrophage in 6-well plates for 14h at 37°C. Cells were harvested,
stained for viral nucleoprotein and submitted to flow cytometry using the protocol detailed in
Garigliany et al. (2012), with the influenza nucleoprotein polyclonal antibody described in
Garigliany et al. (2010).
For the alveolar macrophages depletion assay, groups of 5 DBA/2J and C57BL/6J mice were
treated using liposome-encapsulated dichloromethylene diphosphonate (clodronate;
ClodronateLiposomes.com) as described in Tate et al. (2010). Briefly, mice were treated
under general anaesthesia (as described for the infection process) with a total of 100µl of
clodronate liposomes, in two steps (50µl each), 24h before infection. Five DBA/2J and 5
C57BL/6J were mock-treated with liposomes/PBS and kept as untreated controls. All mice
were infected as previously described and monitored daily for signs of illness and mortality.
The depletion treatment efficacy was assessed by counting the residual alveolar macrophages
after bronchioalveolar lavage.
82
6. Cytokines/chemokines expression in vivo
Sample collection for the analysis of cytokines/chemokines expression in vivo has been
detailed previously (point 2: “Viral titration...and myeloperoxydase activity”). A commercial
ELISA was used to quantify levels of interleukine 6 (IL-6), interferon gamma (IFN-gamma),
monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) (BD OptEIA™ sets; BD biosciences, USA),
macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP-1alpha) and macrophage inflammatory
protein 2 (MIP-2) (Mouse CCL3/MIP-1 alpha and Mouse CXCL2/MIP-2 DuoSets; R&D
Systems, USA), according to manufacturers’ instructions. The levels of CXCL1 chemokine
(KC), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1 β (IL-1 β) were measured using
BD Bead-based immunossays and a BD FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, USA).
7. Expression of cytokines/chemokines mRNAs by alveolar macrophages in vitro
Alveolar macrophages from DBA/2J and C57BL/6J mice were harvested and infected as
previously but using an MOI of 10, in triplicate. Mock-infected alveolar macrophages were
used a controls. At 0, 3, 6, 12 and 48h pi, alveolar macrophages were harvested and submitted
to total RNA extraction using TRIzol reagent (Life Technologies, USA), according to
manufacturer’s instructions. The expression of several cytokines/chemokines mRNAs was
determined as in Dermine (2013). Briefly, total mRNA was retrotranscribed using TaqMan
reverse transcription reagents (Life Technologies, USA), using oligo (dT) primers, according
to manufacturer’s instructions. Quantitative PCRs were performed using SYBR Green PCR
Master Mix and a StepOnePlus qPCR device (Life Technologies, USA). All primers are
detailed in Table 1 and were described in Dermine (2013). Primers for IFNλ, IL-8, KC and
MIP-2 have been described elsewhere (Patten et al., 2010; Shimizu et al., 2013; Mahmutovic-
Persson et al., 2014). CanX was used as house-keeping gene and fold induction values were
calculated from mock-infected controls.
83
8. Role of complement in DBA/2J mice susceptibility
Five DBA/2J mice were rescued by infusion of C5-sufficient serum as described in Ashman
and others (2003). Five control DBA/2J mice received heat-inactivated (56°C, 30 min)
decomplemented serum. One hour after serum injection, both groups of mice were infected by
influenza A virus as previously described. Mice were monitored daily for changes in body
weight, signs of illness and mortality.
9. Statistical analysis
Means and standard deviations were calculated and data of body weight loss, viral titres,
myeloperoxidase activity, mean fluorescence and cytokines/chemokines levels were analysed
using the Student t-test and the GraphPad prism software (GraphPad Software, San Diego,
California; www.graphpad.com).
Results
1. In vivo infection
After infection with 9 PFUs per mouse (a dose known to cause 100% of mortality in DBA/2J
mice and 0% in C57BL/6J; data not shown), death occurred at day 7 and 8 for DBA/2J mice
(Fig1a). A regular but severe weight loss was observed from day 4 to day 8 pi in DBA/2J
mice, culminating at ~ 20% of loss from initial body weight (Fig1b). Lung viral titer
differences between both strains were marked from day 1 pi and the maximal ratio was
observed at day 3 pi (around 8 times higher titer in DBA/2J; Fig1c). In both strains, lung viral
titers toped at day 6 pi before a sharp drop on days 7 and 8 with an almost complete clearance
of the virus. Lung wet weight only slightly increased in C57BL/6J mice while it increased
from day 3 pi onwards and was about twice its control value at day 8 pi in DBA/2J mice
(Fig1d). In parallel, lesions of pneumonia and consolidation were more intense and more
84
widespread in DBA/2J than in C57BL/6J mice (Fig2a). In the latter, lesions were significantly
less pronounced on day 8 pi than on day 7 pi (Fig2a).
Histopathological evaluation of the lungs mirrored the lesions observed macroscopically on
the lungs. As expected, lesions were more severe and diffuse in DBA/2J mice. Only mild
lesions were observed on day 3 pi for both strains, mainly focused on bronchi and bronchioles
(Fig2b). Typically, the bronchial/bronchiolar epithelial necrosis was much more severe for
DBA/2J (Fig2b). On days 6 and 7 pi, a severe diffuse mixed inflammatory infiltrate (with
abundant polymorphonuclear neutrophils) was observed in DBA/2J with a severe necrotizing
bronchitis/bronchiolitis and interstitial pneumonia accompanied by diffuse alveolar damage
and hyaline membranes (Fig2b). Vasculitis was obvious. In C57BL/6J, lesions of pneumonia
were milder and mainly centred around bronchioles and mainly consisted of mononuclear
cells with much fewer neutrophils. Peri-bronchial and peri-vascular cuffing was prominent
(Fig2b).
Immunohistochemical staining of the viral nucleoprotein revealed a more diffuse and more
intense viral replication in the lungs of DBA/2J. In contrast, viral replication was mainly
centred on bronchi, bronchioles and surrounding lung parenchyma in C57BL/6J (Fig2c).
To better define the differences in neutrophilic infiltrates observed on histopatholgy, a
measure of myeloperoxydase activity throughout the infection process was undertaken for
both strains (Fig3a). While the myeloperoxydase activity remained fairly stable in C57BL/6J
from day 0 to day 7 pi, it increased in DBA/2J from day 3 pi to day 7 pi where it attained
more than thrice its control value (Fig3a). To assess if this neutrophilic influx was an intrinsic
property of the DBA/2J mouse strain or simply a reflect of the higher viral lung titers
observed in this strain, we repeated this experiment and included a group of C57BL/6J
infected with about 100 times more viral particles than in the standard experiment, a dose
known to be lethal for 100% of C57BL/6J mice. In this assay, in spite of the expected death of
85
all C57BL/6J infected with this high viral dose, the myeloperoxydase activity remained stable
and indiscernible from that observed in C57BL/6J infected with the low viral dose (Fig3b).
Viral titrations revealed that titers in lungs from heavily infected C57BL/6J were of the same
magnitude or even higher (significant only for day 3 pi) than lung titers from DBA/2J mice
infected with the standard dose (data not shown).
2. Comparative permissivity of tracheal epithelial cells, type II pneumocytes and alveolar
macrophages in vitro and tracheal explants ex vivo
Since differences in in vivo lung titers were obvious early in the infectious process between
DBA/2J and C57BL/6J mice, we wanted to determine if the permissivity of individual cell
types of the airways and lung could account for part or all of this difference. Primary cultures
of alveolar macrophages, type II alveolar cells and tracheal epithelial cells were prepared
from DBA/2J and C57BL/6J mice. After in vitro infection, viral lung titers were significantly
higher for DBA/2J for all three cell types at 48h pi (Fig4a). At 24h pi the difference was
significant only for alveolar macrophages and tracheal epithelial cells (Fig4a). Besides, viral
amplification was much more efficient in tracheal epithelial cells than in type II pneumocytes
and was intermediate in alveolar macrophages, for both mouse strains (Fig4a).
The ex vivo infection of tracheal explants from both mouse strains yielded similar results with
a significantly higher viral titer measured at 72h pi for DBA/2J (Fig4b).
3. Sialic acids expression on respiratory cell types in vitro
Using α2,3- and α2,6-specific lectins, we assessed the expression of both sialic acids linkages
types on the surface of alveolar macrophages, type II alveolar cells and tracheal epithelial
cells from both mouse strains. Both linkage types were expressed on all cell types from
DBA/2J and C57BL/6J mice (Fig5). No difference was observed for the expression of α2,6-
86
linked sialic acids, but there were significantly more α2,3 sialic acids on the alveolar
macrophages and epithelial tracheal cells from susceptible DBA/2J than from resistant
C57BL/6J mice (Fig5).
To assess the impact of this increased α2,3 receptors expression in DBA/2J on the previously
observed greater permissivity of respiratory cells from this strain to influenza virus, we pre-
treated primary cultures of tracheal cells from DBA/2J and C57BL/6J with a neuraminidase
before standard infection. The neuraminidase pre-treatment completely abolished differences
in viral amplification between both mouse strains but did not completely impede the infection
(Fig6).
4. Evaluation of the role played by alveolar macrophages in susceptibility/resistance
We then assessed the in vitro phagocytic activity of inactivated viral particles by alveolar
macrophages from DBA/2J and C57BL/6J. After 14h of incubation of alveolar macrophages
cultures with inactivated virus, the viral uptake was significantly higher for DBA/2J
macrophages compared to that of C57BL/6J (Fig7).
Besides, in vivo depletion of alveolar macrophages was achieved using clodronate treatment
before challenge with standard dose of influenza virus. All mice died from influenza virus
inoculation when they were pretreated with clodronate (Fig8). Clodronate-treated DBA/2J
mice died 2 to 3 days earlier than untreated ones (Fig8).
5. Cytokines/chemokines expression in vivo
Given the role played by alveolar macrophages in the resistance to influenza infection and the
potential involvement of innate immunity in the higher viral amplification properties observed
in vitro and in vivo for DBA/2J, we measured the expression of a set of cytokines and
chemokines during the infection process in vivo. Lung levels of IL-6, TNFα, IFNγ, MCP-1,
87
MIP-1α, MIP-2, KC and IL-1β were compared from D0 to D7 pi for DBA/2J and C57BL/6J
mice (Fig9). The expression of all measured cytokines/chemokines was significantly higher in
DBA/2J mice than in C57BL/6J, after day 3 pi for most cytokines/chemokines and only after
day 6 for MIP-1α and IFNγ (Fig9). The difference was particularly pronounced and marked
from the beginning of the infection for KC and MIP-2 (Fig9). The levels of GCP-2 were not
significantly modified (data not shown).
To test the hypothesis that enhanced KC and MIP2 levels in the DBA/2J might be responsible
for the increased influx of neutrophils in the lungs of this strain, we assessed the effect of
pharmacological inhibition of CXCR2 inhibition, using the SB225002 compound, on DBA/2J
mice susceptibility after influenza infection. SB225002 treatment of mice did not affect the
survival rate, body weight loss, myeloperoxidase activity and MCP-1 and MIP-1α expression,
even if mortality occurred slightly later in treated DBA/2J mice (data not shown).
6. Cytokines/chemokines mRNA expression by alveolar macrophages in vitro
The mRNA expression (fold induction) was measured for a series of cytokines/chemokines
during the first 48h after in vitro infection of DBA/2J and C57BL/6J alveolar macrophages by
influenza virus. Unexpectedly, with the relative exception of KC and IFNλ, the expression of
all measured mRNAs was higher for C57BL/6J macrophages (Fig10).
7. Effect of complement on DBA/2J mice susceptibility
The infusion of complement-sufficient serum in DBA/2J mice before infection by influenza A
virus did not affect the survival rate or body weight loss (Figure 11).
88
Discussion
The extreme susceptibility of the DBA/2J mouse strain to influenza infection has been
demonstrated by several studies for different virus subtypes (Boon et al., 2009; Srivastava et
al., 2009; Alberts et al., 2010; Blazejewska et al., 2011; Trammell et Toth, 2011; Dengler et
al., 2012; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Liberati et al., 2013; Preusse et al.,
2013; Zaraket et al., 2013; Dengler et al., 2014). Most of the studies which addressed the
question adopted a genetic or transcriptomic strategy to identify genes differently expressed
during the course of the infection or which segregated with resistance or susceptibility in
recombinant inbred lines from parental C57BL/6J and DBA/2J mice (Boon et al., 2009;
Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon
et al., 2014; Dengler et al., 2014). These studies resulted in an impressive list of candidate
genes which were differently expressed in DBA/2J and C57BL/6J to potentially explain their
susceptibility or resistance, respectively, but it is still unknown so far if the higher mortality
rate in DBA/2J results from a higher amplification of the virus and/or from differences in
innate or adaptative immunity. Besides, the reliability of QTL mapping using recombinant
inbred lines has been recently challenged, raising some doubts about the results proposed by
these previous studies (Wang et al., 2014). In order to bring new elements of response, we
adopted a phenotypic approach, aiming to describe and compare the different steps of the
infection process which are most likely to explain the differences between both mouse strains.
We used a highly virulent murinized variant of a swine H1N1 influenza A strain for which a
mouse model had been previously described in detail (Garigliany et al., 2010).
First, we described the mortality, lung weight, body weight, lung titers, macroscopic and
microscopic lesions during the course of a standardized infection procedure in DBA/2J and
C57BL/6J, using a viral dose known to cause 100% of mortality in the former and 0% in the
latter. All data converged to confirm a severe, necrotizing and extensive bronchitis,
89
bronchiolitis and pneumonia in DBA/2J mice, with a striking abundance of
polymorphonuclear neutrophils. The more “necrotizing” and neutrophilic character of the
lesions had been previously observed using human PR8 H1N1 strain (Srivastava et al., 2009).
Besides, the importance of neutrophils in the pathogenicity of influenza pneumonia is
consistent with the higher granulocytes/lymphocytes ratio observed in the blood of
susceptible DBA/2J mice during the course of infection (Dengler et al., 2014). To confirm the
predominance of neutrophils in DBA/2J infected lungs, we measured the myeloperoxydase
(MPO) activity throughout the infection (Bradley et al., 1982). While stable for C57BL/6J,
the MPO activity level in DBA/2J mice at day 7 was more than thrice that of day 0,
confirming the massive influx of neutrophils in the lungs of these mice during the infection.
In our model as in other studies (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al.,
2010; Blazejewska et al., 2011; Trammell et al., 2012), the early (from day 1 post-infection)
and strong viral amplification is a hallmark of susceptible DBA/2J mice. It has been
previously suggested that this increased viral load might account for an enhanced level of
cytokines and chemokines (Alberts et al., 2010), which could be responsible for the
neutrophilic influx we and others (Srivastava et al., 2009) observed in DBA/2J. To
specifically address this hypothesis, we infected C57BL/6J mice with a ~ 100 higher dose of
virus than in the standard procedure, leading to 100% of mortality in this “resistant” strain.
We observed that the level of myeloperoxydase activity remained unchanged while lung titers
reached those observed in DBA/2J mice, showing that the higher neutrophilic influx is a
characterisitic of DBA/2J mice independent of the mortality rate and the viral load, since
heavily infected C57BL/6J mice died without this influx. As a consequence, it seems unlikely
that the differences in cytokines and chemokines expression between DBA/2J and C57BL/6J
mice are only due to the higher viral load in the former, as previously suggested (Alberts et
90
al., 2010). Our findings clearly indicate that the higher neutrophilic influx should be regarded
as a feature of DBA/2J influenza pneumonia.
In most studies, including ours, mortality occurred within the 7 or 8 days post-infection,
suggesting that a defective adaptative immunity is not involved in the greater susceptibility of
DBA/2J (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Blazejewska et al.,
2011; Trammell et al., 2012). Further, intramuscular immunization of DBA/2J mice with live
H1N1 virus, even after a single vaccine shot, has been shown to be protective after
subsequent viral challenges, yielding the same level of resistance as in C57BL/6J mice,
showing that DBA/2J mice are fully immunocompetent in terms of adaptative immunity
(Dengler et al., 2012). The higher viral amplification observed in DBA/2J might thus be the
result of defects in the innate immunity and/or of a higher permissivity of the cell populations
of the airways and lung parenchyma of DBA/2J. To answer this question, we prepared
primary cultures of alveolar macrophages, type II pneumocytes and tracheal epithelial cells
from DBA/2J and C57BL/6J mice. We showed that in vitro amplification of influenza virus
by these three cell types was higher for DBA/2J, particularly for alveolar macrophages and
epithelial tracheal cells, than for C57BL/6J. This higher permissivity of DBA/2J respiratory
cells could be the consequence of a defective type I interferon response but it has been
previously shown that DBA/2J mice expressed high levels of IFNβ1 and IFNγ after infection
and that IFN-dependent genes are rather up-regulated in DBA/2J mice, suggesting an intact
interferon response (Alberts et al., 2010). A second hypothesis could be the relative
abundance of the main two types of influenza A receptors, α2,3- and α2,6-linked sialic acids
on the surface of airways and lung cells of DBA/2J. The type and amount of receptors are
well-known elements of the species barrier for influenza A viruses (De Graaf et Fouchier,
2014) and such differences would easily explain the higher replication rate of influenza virus
in respiratory cells of DBA/2J mice. Further, among the numerous candidate genes suggested
91
in previous studies, a difference of expression of the GalNAc-alpha-2,6-sialyltransferase has
been noted between susceptible and resistant mice (Boon et al., 2009). We thus measured the
level of expression of both receptor types on the surface of alveolar macrophages, type II
pneumocytes and tracheal epithelial cells using specific lectins and flow cytometry.
Unexpectedly, there was no difference in α2,6-linked receptors expression between DBA/2J
and C57BL/6J respiratory cells, but there was a clear overexpression of α2,3-linked sialic
acids on the alveolar macrophages and tracheal epithelial cells. Since, in our previous
challenges, tracheal cells were the most permissive of the three cell types we studied, we
wanted to assess the effect of a neuraminidase pre-treatment on the permissivity of tracheal
DBA/2J and C57BL/6J cells to influenza A virus. The neuraminidase pre-treatment abolished
the differences in viral titers between DBA/2J and C57BL/6J, suggesting that the higher
number of α2,3-linked sialic acid receptors accounted, at least for a part, for the higher viral
titers measured in vitro after infection of respiratory cells from DBA/2J and it is likely to be
an important factor in vivo, too. Interestingly, the neuraminidase pre-treatment did not
completely impede the viral replication, suggesting incomplete treatment or alternative route
of entry for the virus, which has been described before (Edinger et al., 2014). Further, the
α2,3 linkage has been shown to predominate in the lower airways of mice (Glaser and others
2007; Ning and others 2009) and mouse-adaptation of human influenza strains is often
associated with a switch to α2,3 specificity (Hensley and others 2009; Keleta and others 2008;
Smeenk and others 1996). In this context, the overexpression of α2,3-linked sialic acids in
DBA/2J airways is consistent with its increased susceptibility to influenza infection.
In addition to the higher amplification of influenza virus by individual cell types of the
DBA/2J respiratory tree, we investigated the phagocytic properties of alveolar macrophages
which, if defective, could have a cumulative effect on the higher viral lung titers measured in
DBA/2J. We measured the uptake of UV-inactivated H1N1 influenza virus particles at 14h
92
post-incubation. Unexpectedly, the uptake was much higher in DBA/2J macrophages,
suggesting that phagocytosis in itself is not defective in this mouse strain. Given the high
amplification of live influenza virus observed in vitro in DBA/2J alveolar macrophages, it is
tempting to suggest that the killing of phagocytosed viral particles is less effective in this
strain and rather results in a productive infection than in viral clearance. This view is
consistent with findings regarding the susceptibility of DBA/2J to Mycobacterium
tuberculosis infection compared to C57BL/6J (Marquis et al., 2009). The transfer of the
chromosome 7 Trl3 (tuberculosis resistance locus 3) region, one of the QTL associated with
resistance in C57BL/6J for this infection, in the DBA/2J genome rendered the congenic mice
much more resistant to the infection, their macrophages becoming able to restrict the infection
(Marquis et al., 2009). These data are likely transposable to influenza virus infection and
alveolar macrophages probably play a central role in DBA/2J susceptibility to influenza. The
role of Trl3 has not been directly assessed for influenza resistance, but some of the genes
proposed in the previous studies on influenza susceptibility of DBA/2J mice belong to this
locus, notably Ifih1 and CXCL11 (Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012). In addition, the
C5 complement factor, for which DBA/2J are deficient (Wetsel et al., 1990), might play a
role since mouse peritoneal macrophages were shown to be inefficient in terms of fungistasis
in the case of absence of C5 in a model using C. neoformans (Brummer et Stevens, 1994). To
evaluate the impact of C5 deficiency on influenza susceptibility, we supplemented DBA/2J
mice with complement-sufficient serum before standard infection procedure. No differences
could be detected in terms of body weight loss, clinical signs or survival rate between
complement-supplemented and unsupplemented DBA/2J mice, suggesting that C5 factor
deficiency is not critical to explain the extreme susceptibility of DBA/2J mice to influenza in
our experimental conditions, while it has been shown to be important with other pathogens
(Ashman and others 2003; Brummer and Stevens 1994) and was associated with prolonged
93
disease, more severe lung lesions and lower survival after H3N2 influenza infection in one
study (Hicks and others 1978). The reasons for these discrepancies regarding the impact on
resistance to influenza infection are unclear, but the procedure we used to supplement
DBA/2J mice for C5 complement factor was successful in increasing their resistance to
Candida albicans (Ashman and others 2003). Besides, the effect of C5 complement on
influenza resistance was demonstrated by others using Balb/c mice, thus with a different
genetic background (Hicks and others 1978). Further, these previous results could only be
observed on a relatively narrow range of infectious doses (Hicks and others 1978) and it is
possible that the infectious dose in our challenges was too high (or the strain too virulent) to
allow these observations. Since this last infectious dose was associated with mild disease and
no mortality in C57BL/6J mice, C5 deficiency is unlikely to explain the gap in
susceptibility/resistance to influenza virus infection between DBA/2J and C57BL/6J mice.
To further determine the role played by alveolar macrophages in the mouse in vivo resistance
to influenza virus, we treated DBA/2J and C57BL/6J mice with clodronate before standard
influenza challenge. Clodronate (dichloromethylene diphosphonate) is selectively taken up by
phagocytic macrophages and accumulates in the cytosol, resulting in macrophages death and
depletion (Tate et al., 2010). Alveolar macrophages depletion abolished the resistance of
C57BL/6J mice. Further, death occurred about two days earlier in clodronate-treated DBA/2J
mice than in untreated ones, suggesting that the relatively deficient DBA/2J alveolar
macrophages still have some protective effects. This experiment reinforces the critical role
played by alveolar macrophages in the resistance to influenza pneumonia in mice.
Besides, we investigated the expression of cytokines and chemokines after influenza infection
by DBA/2J and C57BL/6J in the lungs in vivo and by their alveolar macrophages in vitro. In
agreement with previous studies, all measured cytokines and chemokines were overexpressed
by DBA/2J after influenza infection compared to C57BL/6J, especially after day 3 pi (Boon et
94
al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al.,
2012; Boon et al., 2014). Remarkably, KC and MIP-2 were markedly overexpressed in
DBA/2J and this from the very beginning of the infection. This finding, together with the
prominent neutrophilic infiltrate observed in DBA/2J lungs after influenza infection, suggest a
link of cause and effect between overexpression of these potent neutrophil chemo-attractants
and the neutrophilic influx to the lung. Since CXCR2 seems to be the main chemotactic
receptor involved in the acute inflammation of the lung (Konrad et Reutershan, 2012), we
assessed the effect of its specific pharmacologic inhibition using SB225002 (Herbold et al.,
2010) on the neutrophilic influx, survival rate, body weight, MPO activity, MCP-1 and MIP-
1α expression in DBA/2J mice after influenza A infection. The SB225002 treatment did not
affect any of the parameters at pharmacologically active dosages, suggesting either a role of
CXCR1 receptor in the pathogenesis or the involvement of other chemokines.
Next, we measured by real time PCR the expression of the mRNA of several cytokines and
chemokines by alveolar macrophages from both strains during the first 48h after infection.
Strikingly, with the exception of KC and IFNλ, the expression of all mRNAs was much lower
in DBA/2J macrophages. This apparent hyporeactivity, although at first sight conflicting with
results obtained in vivo, is in agreement with the previous observation that levels of cytokines
in the culture medium of lung slices ex vivo were lower after influenza infection in DBA/2J
than in C57BL/6J (Trammell et al., 2012). The authors suggested that systemic host
inflammatory response was important to explain the cytokines/chemokines burst observed in
vivo in DBA/2J. In addition, the higher granulocytes/lymphocytes ratio described in infected
DBA/2J mice compared to C57BL/6J confirms that there is a systemic cytokinic/chemokinic
reaction (Dengler et al., 2014). Taken together, these observations suggest that cells from the
airways and lung parenchyma, including alveolar macrophages, are probably not directly
responsible for the cytokines/chemokines overexpression measured in vivo in infected
95
DBA/2J when compared to C57BL/6J mice. This lack of specific reactivity of alveolar
macrophages in DBA/2J together with the dramatic effect of clodronate treatment on
C57BL/6J mice suggest a model in which alveolar macrophages are key players in the first
times of the influenza infection process and are largely responsible for the extreme
susceptibility of DBA/2J to influenza pneumonia.
Overall, the results presented in this study show for the first time the involvement of the
permissivity of respiratory cell populations and of a lack of reactivity of alveolar
macrophages in the very low resistance level of DBA/2J to influenza virus. We confirm that
the susceptibility of DBA/2J is multigenic in origin. Individual cell types of the respiratory
tree of DBA/2J show an enhanced in vitro amplification of influenza A virus and this while
the interferon response seems conserved. Epithelial tracheal cells and alveolar macrophages
of DBA/2J express higher amounts of α2,3-linked sialic acid receptors than their C57BL/6J
counterparts, which probably explains, at least in part, their higher permissivity. Alveolar
macrophages of DBA/2J seem to present conserved phagocytic abilities, but our observations
together with those from others suggest that their capacity to kill the virus after phagocytosis
might be deficient. In spite of a general overexpression of cytokines and chemokines in the
lungs of influenza infected DBA/2J mice compared to C57BL/6J, the alveolar macrophages
infected in vitro show the opposite phenotype, with a marked hyporeactivity of DBA/2J
macrophages which suggests that the cytokine/chemokine burst observed in vivo in DBA/2J is
rather systemic in origin. Restoration of complement sufficiency in DBA/2J mice did not
improve their resistance to influenza infection in our hands. The central role played by
alveolar macrophages in influenza resistance is confirmed by the dramatic effect of alveolar
macrophage depletion using clodronate in resistant C57BL/6J mice. Adoptive transfer of
alveolar macrophages will help to define the role played by alveolar macrophages in the
extreme susceptibility of DBA/2J mice to influenza virus. On a molecular point of view,
96
future research should address the question of the replacement of genes included in the Trl3
locus of chromosome 7 on the susceptibility of DBA/2J mice to influenza A virus and other
respiratory pathogens.
Acknowledgments
We thank Wallonie-Bruxelles International and CONICYT PAI/INDUSTRIA 79090016 for
support this PhD project.
97
References
Alberts R, Srivastava B, Wu H, Viegas N, Geffers R, Klawonn F, Novoselova N, do Valle
TZ, Panthier JJ, Schughart K. 2010. Gene expression changes in the host response
between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection.
Microbes Infect 12(4):309-18.
Ashman RB, Papadimitrioub JM, Fulurija A, Drysdale KE, Farah CS, Naidoo O, Gotjamanos
T. 2003. Role of complement C5 and T lymphocytes in pathogenesis of disseminated
and mucosal candidiasis in susceptible DBA/2 mice. Microb Pathog 34(2):103–113
Blazejewska P, Koscinski L, Viegas N, Anhlan D, Ludwig S, Schughart K. 2011.
Pathogenicity of different PR8 influenza A virus variants in mice is determined by
both viral and host factors. Virology 412(1):36-45.
Boon AC, deBeauchamp J, Hollmann A, Luke J, Kotb M, Rowe S, Finkelstein D, Neale G,
Lu L, Williams RW, Webby RJ. 2009. Host genetic variation affects resistance to
infection with a highly pathogenic H5N1 influenza A virus in mice. J Virol
83(20):10417-26.
Boon AC, Williams RW, Sinasac DS, Webby RJ. 2014. A novel genetic locus linked to pro-
inflammatory cytokines after virulent H5N1 virus infection in mice. BMC Genomics
15(1):1017.
Bradley PP, Christensen RD, Rothstein G. 1982. Cellular and extracellular myeloperoxidase
in pyogenic inflammation. Blood 60(3):618-22.
Brummer E, Stevens DA. 1994. Anticryptococcal activity of macrophages: role of mouse
strain, C5, contact, phagocytosis, and L-arginine. Cell Immunol 157(1):1-10.
de Graaf M, Fouchier RA. 2014. Role of receptor binding specificity in influenza A virus
transmission and pathogenesis. EMBO J 33(8):823-41.
98
Dengler L, Kuhn N, Shin DL, Hatesuer B, Schughart K, Wilk E. 2014. Cellular changes in
blood indicate severe respiratory disease during influenza infections in mice. PLoS
One 9(7):e103149.
Dengler L, May M, Wilk E, Bahgat MM, Schughart K. 2012. Immunization with live virus
vaccine protects highly susceptible DBA/2J mice from lethal influenza A H1N1
infection. Virol J 9:212.
Dermine M. 2013. Testing candidate effectors contributing to resistance to pneumoviruses. In
Department of Morphology and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine.
University of Liege 160:104-105.
Edinger TO, Pohl MO, Stertz S. 2014. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral
targets. J Gen Virol 95(Pt 2):263-77.
Garigliany MM, Cornet A, Desmecht D. 2012. Human/bovine chimeric MxA-like GTPases
reveal a contribution of N-terminal domains to the magnitude of anti-influenza A
activity. J Interferon Cytokine Res 32(7):326-31.
Garigliany MM, Habyarimana A, Lambrecht B, Van de Paar E, Cornet A, van den Berg T,
Desmecht D. 2010. Influenza A strain-dependent pathogenesis in fatal H1N1 and
H5N1 subtype infections of mice. Emerg Infect Dis 16(4):595-603.
Glaser L, Conenello G, Paulson J, Palese P. 2007. Effective replication of human influenza
viruses in mice lacking a major alpha2,6 sialyltransferase. Virus Res 126(1-2):9-18.
Hensley SE, Das SR, Bailey AL, Schmidt LM, Hickman HD, Jayaraman A, Viswanathan K,
Raman R, Sasisekharan R, Bennink JR, Yewdell JW. 2009. Hemagglutinin receptor
binding avidity drives influenza A virus antigenic drift. Science 326(5953):734-6.
Herbold W, Maus R, Hahn I, Ding N, Srivastava M, Christman JW, Mack M, Reutershan J,
Briles DE, Paton JC, Winter C, Welte T, Maus UA. 2010. Importance of CXC
99
chemokine receptor 2 in alveolar neutrophil and exudate macrophage recruitment in
response to pneumococcal lung infection. Infect Immun 78(6):2620-30.
Hicks JT, Ennis FA, Kim E, Verbonitz M. 1978. The importance of an intact complement
pathway in recovery from a primary viral infection: influenza in decomplemented and
in C5-deficient mice. J Immunol 121(4):1437-45.
Keleta L, Ibricevic A, Bovin NV, Brody SL, Brown EG. 2008. Experimental evolution of
human influenza virus H3 hemagglutinin in the mouse lung identifies adaptative
regions in HA1 and HA2. J Virol 82(23):11599-608.
Klepser ME. 2014. Socioeconomic impact of seasonal (epidemic) influenza and the role of
over-the-counter medicines. Drugs 74(13):1467-79.
Konrad FM, Reutershan J. 2012. CXCR2 in acute lung injury. Mediators Inflamm
2012:740987.
Liberati TA, Trammell RA, Randle M, Barrett S, Toth LA. 2013. Cytokine and chemokine
responses of lung exposed to surrogate viral and bacterial infections. Comp Med
63(2):114-26.
Mahmutovic-Persson I, Akbarshahi H, Bartlett NW, Glanville N, Johnston SL, Brandelius A,
Uller L. 2014. Inhaled dsRNA and rhinovirus evoke neutrophilic exacerbation and
lung expression of thymic stromal lymphopoietin in allergic mice with established
experimental asthma. Allergy 69(3):348-58.
Marquis JF, Lacourse R, Ryan L, North RJ, Gros P. 2009. Genetic and functional
characterization of the mouse Trl3 locus in defense against tuberculosis. J Immunol
182(6):3757-67.
Murray CJ, Lopez AD, Chin B, Feehan D, Hill KH. 2006. Estimation of potential global
pandemic influenza mortality on the basis of vital registry data from the 1918-20
pandemic: a quantitative analysis. Lancet 368(9554):2211-8.
100
Nedelko T, Kollmus H, Klawonn F, Spijker S, Lu L, Hessman M, Alberts R, Williams RW,
Schughart K. 2012. Distinct gene loci control the host response to influenza H1N1
virus infection in a time-dependent manner. BMC Genomics 13:411.
Ning ZY, Ning ZY, Luo MY, Qi WB, Yu B, Jiao PR, Liao M. 2007. Detection of expression
of influenza virus receptors in tissues of BALB/c mice by histochemistry. 2009. Vet
Res Commun 33(8): 895-903.
Patten CC, Jr., Myles MH, Franklin CL, Livingston RS. 2010. Perturbations in cytokine gene
expression after inoculation of C57BL/6 mice with Pasteurella pneumotropica. Comp
Med 60(1):18-24.
Preaud E, Durand L, Macabeo B, Farkas N, Sloesen B, Palache A, Shupo F, Samson SI,
Vaccines Europe influenza working g. 2014. Annual public health and economic
benefits of seasonal influenza vaccination: a European estimate. BMC Public Health
14:813.
Preusse M, Tantawy MA, Klawonn F, Schughart K, Pessler F. 2013. Infection- and
procedure-dependent effects on pulmonary gene expression in the early phase of
influenza A virus infection in mice. BMC Microbiol 13:293.
Shimizu M, Yamaguchi M, Fujita S, Utsunomiya T, Yamamoto H, Kasai K. 2013.
Interleukin-17/T-helper 17 cells in an atopic dermatitis mouse model aggravate
orthodontic root resorption in dental pulp. Eur J Oral Sci 121(2):101-10.
Smeenk CA, Wright KE, Burns BF, Thaker AJ, Brown EG. 1996. Mutations in the
hemagglutinin and matrix genes of a virulent influenza virus variant, A/FM/1/47-MA,
control different stages in pathogenesis. Virus Res 44(2):79-95.
Srivastava B, Blazejewska P, Hessmann M, Bruder D, Geffers R, Mauel S, Gruber AD,
Schughart K. 2009. Host genetic background strongly influences the response to
influenza a virus infections. PLoS One 4(3):e4857.
101
Tate MD, Pickett DL, van Rooijen N, Brooks AG, Reading PC. 2010. Critical role of airway
macrophages in modulating disease severity during influenza virus infection of mice. J
Virol 84(15):7569-80.
Trammell RA, Liberati TA, Toth LA. 2012. Host genetic background and the innate
inflammatory response of lung to influenza virus. Microbes Infect 14(1):50-8.
Trammell RA, Toth LA. 2011. Markers for predicting death as an outcome for mice used in
infectious disease research. Comp Med 61(6):492-8.
Wang L, Jiao Y, Cao Y, Liu G, Wang Y, Gu W. 2014. Limitation of number of strains and
persistence of false positive loci in QTL mapping using recombinant inbred strains.
PLoS One 9(7):e102307.
Wetsel RA, Fleischer DT, Haviland DL. 1990. Deficiency of the murine fifth complement
component (C5). A 2-base pair gene deletion in a 5'-exon. J Biol Chem 265(5):2435-
40.
World Health Organization: Vaccines against influenza WHO position paper – November
2012. Wkly Epidemiol Rec 2012, 47:461-476.
Zaraket H, Bridges OA, Russell CJ. 2013. The pH of activation of the hemagglutinin protein
regulates H5N1 influenza virus replication and pathogenesis in mice. J Virol
87(9):4826-34.
102
Table 1. Primers Used for Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction Evaluation of Cytokine/Chemokine mRNA Expression
Gene name Direction Primer sequence Amplicon size (bp) Accession No.
IL-1β Forward 5' – GCAACTGTTCCTGAACTCAAC – 3' 89 NM_008361.3
Reverse 5' – ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT – 3'
IL-6 Forward 5' – AGTGTGAGGCAGAGAGCCAGCAT – 3' 121 M20572.1
Reverse 5' – TGGATGGAAGTCTCCTGCGTGGA – 3'
IL-10 Forward 5' – CACATGCTCCTAGAGCTGCGGACT – 3' 94 M84340.1
Reverse 5' – TCAGGTGATGGCAGGAAGAAAGGCT – 3'
IL-12p35 Forward 5' – CCAAGGTCAGCGTTCCAACA – 3' 90 M86672.1
Reverse 5' – AGAGGAGGTAGCGTGATTGACA – 3'
IL-12/23p40 Forward 5' – CATCTACCGAAGTCCAATGCAAAG – 3' 68 M86671.1
Reverse 5' – GGAATTGTAATAGCGATCCTGAGCTT – 3'
IL-17
Forward 5'– CTCAGACTACCTCAACCGTTC – 3' 180 BC119303.1
Reverse 5' – TTCAGGACCAGGATCTCTTGC – 3'
IL-23p19
Forward 5'– CCGGGAGACCCAACAGATG – 3' 78 NM_031252.2
Reverse 5'– CGAAGGATCTTGGAACGGAGAAG – 3'
IFNα
Forward 5' – GACTTTGGATTTCCCCTGGAG – 3' 115 M68944.1
Reverse 5' – AAGCCTTTGATGTGAAGAGGTTC – 3'
IFNβ
Forward 5' – GTTACACTGCCTTTGCCATCC – 3' 96 X14455.1
Reverse 5' – CAACAATAGTCTCATTCCACCCAG – 3'
IFN λ
Forward 5' – ACCAGGCTCCCAGTGGAA – 3' 83 XM_006540121.1
Reverse 5' – TTTTTGAAGGCCTGCAGCTCT – 3'
TNF-α
Forward 5' – ACCCTCACACTCAGATCATC – 3' 188 BC117057.1
Reverse 5' – GAGTAGACAAGGTACAACCC – 3'
103
MIP-1α
Forward 5' – CCTCTGTCACCTGCTCAACA – 3' 163 NM_011337.2
Reverse 5' – GATGAATTGGCGTGGAATC – 3'
MIP-2
Forward 5' – CCGTCATGGATGTCTACGTG – 3' 170 NM_178241.4
Reverse 5' – CAGCAGCAGGATACCACTGA – 3'
MCP-1
Forward 5' – AGTGTGAGGCAGAGAGCCAGCAT – 3' 120 M20572.1
Reverse 5' – TGGATGGAAGTCTCCTGCGTGGA – 3'
KC Forward 5' – GCTGGGATTCACCTCAAGAAC – 3' 196 NM_008176.3
Reverse 5' – AGCAGTCTGTCTTCTTTCTCC – 3'
RANTES Forward 5' – ACAGCACATGCATCTCCCACAGC – 3' 128 U02298.1
Reverse 5' – ACCCTCGACTTACATGGTGAGGCA – 3'
104
FIG. 1. Survival rates (A) of DBA/2J and C57BL/6J mice after intranasal inoculation with 9
PFUs per mouse of influenza A over a 14-day experimental period. Body weight loss (B) and
lung viral titers (C) were measured over eight days. The lung wet weight (D) was studied over
one week. Five mice were used in each group. All values are mean ± s.d. Student t-test. *P <
0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.
105
FIG. 2. Gross (A) and microscopic (B) appearance of lungs from DBA/2J (A, B, E, F) and
C57BL/6J (C, D, G, H) mice during the course of influenza A infection in vivo. Foci of
consolidation are observed with the evolution of the infection in C57BL/6J and DBA/2J mice
lungs, more obvious in the latter (B). Lung histology (H&E) from both mouse strains shows
the various levels of inflammatory infiltrate consisting predominantly of neutrophils, admixed
with macrophages. Bronchiolar epithelium is damaged and the airspaces contain numerous
neutrophils and fibrin. Expression and distribution of the viral nucleoprotein in the lung tissue
was determined by immunohistochemistry (C, A-H).
106
FIG. 3. Myeloxperoxydase activity determination in lungs from DBA/2J and C57BL/6J mice
after infection with ~9 PFUs (A) or ~9 PFUs and ~877 PFUs H1N1 (B). Student t-test. *P <
0.05 and ***P < 0.001.
107
FIG. 4. Viral titers in the culture supernatant after primary cell cultures (A) and tracheal
explants (B) infection in vitro. The alveolar macrophages (AM), type II alveolar cells (T II P)
and tracheal epithelial cells (TEC) isolated from DBA/2J and C57BL/6J mice were infected
with an MOI of 1 and each tracheal explant was infected with 50 PFUs. Titers are expressed
as PFU/ml. Student t-test. *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.
108
FIG. 5. Expression of alpha 2,3 (MAAII) and alpha 2,6 (SNA) sialic acid receptors on
alveolar macrophages (AM), type II penumocytes (T II P) and tracheal epithelial cells (TEC)
isolated from DBA/2J and C57BL/6J mice. The receptor expression is expressed as mean
fluorescence intensity ± s.d. Student t-test. *P < 0.05, **P < 0.01.
109
FIG. 6. Viral titers in the culture supernatant after pretreatment with neuraminidase (NA) of
tracheal epithelial cells (TEC) in vitro. Titers are expressed as PFU/ml ± s.d. Student t-test.
**P < 0.01
110
FIG. 7. Comparison of alveolar macrophage phagocytic activity from DBA/2J and C57BL/6J
in vitro. The uptake of U.V. inactivated influenza virus particles was assessed after 14h of
incubation by measurement of the intracellular viral nucleoprotein (NP) content by flow
cytometry. Results are expressed as mean fluorescence intensity ± s.d. Student t-test. *P <
0.05.
111
FIG. 8. : Survival rates of clodronate-treated or untreated DBA/2J and C57BL/6J mice during
the course of influenza A infection in vitro. Five mice were used in each group.
112
FIG. 9. Cytokines/chemokines production in the lungs of DBA/2J and C57BL/6J mice during
the course of influenza A infection. Results are expressed as pg/ml ± s.d. Student t-test. *P <
0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.
113
FIG. 10. Cytokines/chemokines mRNA expression (fold induction) by alveolar macrophages
from DBA/2J and C57BL/6J mice after in vitro infection by influenza A virus (MOI of 10).
The mRNA expression of these cytokines/chemokines were assessed by RT-qPCR at different
times post-infection and comparative CT method using CanX as house-keeping gene. Student
t-test. *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.
114
FIG. 11. Survival rates (A) and body weight follow-up (B) of influenza A infected DBA/2J
mice after infusion of complement-sufficient or heat-inactivated serum.
115
2.2 The critical role played by alveolar macrophages in the resistance to
influenza pneumonia is mediated by type I interferons
Résumé
Le virus influenza constitue un problème majeur de santé publique. Tous les ans, pendant les
épidémies saisonnières, un pourcentage important de la population mondiale (~10%) est
infecté par le virus influenza A. L’impact épidémiologique du virus est encore aggravé par les
épisodes pandémiques dont certains, comme la grippe espagnole de 1918, ont abouti à la mort
de plusieurs dizaines de millions de personnes à travers le monde. Des efforts intenses de
recherche ont eu pour but de mieux comprendre la pathogenèse de cette infection en ayant
recours au modèle murin. Parmi les lignées de souris Mx-négatives étudiées, les souris
DBA/2J et C57BL/6J constituent respectivement deux extrêmes en termes de sensibilité et de
résistance au virus influenza A. Ces différences de susceptibilité ont fait l’objet de
nombreuses études, principalement par des approches génétiques grâce aux analyses des QTL
de croisements entre ces deux lignées de souris. Ces études ont abouti à de grandes listes de
gènes candidats mais permettre de démontrer l’implication directe d’un de ces gènes. Par une
approche phénotypique, nous avons précédemment décrit le rôle majeur joué par les
macrophages alvéolaires dans la sensibilité des souris DBA/2J à l’infection. En particulier, il
apparaissait que les macrophages alvéolaires de DBA/2J présentaient une expression de
cytokines et chimiokines très limitée après leur infection in vitro par le virus influenza, en
comparaison avec ceux de C57BL/6J. Dans la présente étude, nous démontrons par des
expériences de transferts adoptifs que les macrophages alvéolaires conditionnent la résistance
au virus influenza A in vivo chez la souris. De plus, nous montrons que la permissivité accrue
de l’arbre respiratoire de DBA/2J à l’infection virale est la conséquence, au moins en partie,
de l’expression trop faible d’interférons de type I par ses macrophages alvéolaires.
116
The critical role played by alveolar macrophages in the resistance to influenza
pneumonia is mediated by type I interferons
T Casanova, E Van de Paar, E Levy, D Desmecht, M Garigliany
Department of Veterinary Pathology, Fundamental and Applied Research for Animals and
Health (FARAH), University of Liège, Liège, Belgium.
Correspondence: M Garigliany or D Desmecht (mmgarigliany@ulg.ac.be or
daniel.desmecht@ulg.ac.be); phone: +32 4 366 4075; Fax: +32 4 366 4565
The authors declare no conflict of interest.
117
ABSTRACT
Influenza A virus is a major threat to public health. Among mouse models used to study the
pathogenesis of influenza pneumonia, DBA/2J and C57BL/6J are extremes in terms of
susceptibility and resistance, respectively. In spite of intense research activity on the topic, the
reasons explaining the differences in resistance between these two mouse strains remain
unclear. We recently showed that alveolar macrophages of the susceptible DBA/2J strain
present a reduced expression activity of cytokines and chemokines after in vitro infection by
the virus. Here we show that alveolar macrophages conditions the resistance to influenza A
pneumonia, with a critical role of the levels of type I interferons produced by these
macrophages.
INTRODUCTION
Influenza A virus typically infects 5-10% of the global human population each year during
seasonal epidemics (WHO, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/). Several
pandemics, due to the emergence of highly virulent strains, were observed in the recent
history, among which the 1918 H1N1 pandemic, responsible for an estimated 50 million
casualties worldwide.1 The economic burden of influenza is extremely high in terms of
medical care, loss of work time and reduced productivity, letting alone the associated
mortality.2,3
These facts justify the tremendous research effort that has been made to
understand the pathogenesis of influenza pneumonia.
Mice represent the most widely used animal model of influenza infection.4 Laboratory mice,
most of which are devoid of the protective Mx1 gene,5 vary in their resistance to influenza
pneumonia. Among the Mx-negative strains, DBA/2J and C57BL/6J were extensively studied
as models of susceptible and resistant strains, respectively.6–13
These studies, many of which
118
used recombinant inbred lines between these two parental strains and Quantitative Trait Loci
(QTL) mapping, resulted in large lists of candidate genes proposed to explain the
susceptibility of DBA/2J or the resistance of C57BL/6J to influenza.6–12
But the relevance of
all this genes in the pathogenesis of influenza pneumonia in DBA/2J has never been
confirmed while a recent study challenged the reliability of QTL mapping using recombinant
inbred lines from DBA/2J and C57BL/6J.14
We previously showed that a reduced expression
of several cytokines/chemokines characterized alveolar macrophages (AMs) from DBA/2J
infected by influenza A virus and that depletion of alveolar macrophages abolished the
resistance of C57BL/6J mice.13
The potential link between this reduced cytokinic/chemokinic
reactivity of DBA/2J AMs and their inability to protect mice during influenza infection
remains unclear.
In this study, we show by experiments of adoptive transfers that alveolar macrophages
condition the outcome of influenza infection in mice, since DBA/2J macrophages confer
susceptibility and those from C57BL/6J make recipient mice resistant. We further
demonstrate that a soluble factor expressed by C57BL/6J AMs upon infection is able to
restrict viral replication in mouse pneumocytes. By specific blockade of type I interferons
(IFNs) receptors, we show that this protection is mediated by type I IFNs. Taken together, our
results indicate that the levels of type I IFNs produced by alveolar macrophages in the early
course of influenza lung infection are determinant for the severity of the disease and the
survival rate.
RESULTS
Alveolar macrophages determine the outcome of influenza infection in vivo
To evaluate the role played by alveolar macrophages in the in vivo resistance to influenza
pneumonia, we studied the effect of adoptive transfer of AMs from susceptible DBA/2J or
119
resistant C57BL/6J mice on (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice susceptibility to infection. While
F1 mice showed an intermediate but high level of resistance to influenza infection in terms of
body weight loss, survival rate (80%) and lung lesions, the depletion of their alveolar
macrophages rendered them highly susceptible, resulting in 100% mortality at day 8 post-
infection (Figure 1, 2 and 3). Adoptive transfer of AM from DBA/2J in (DBA/2J X
C57BL/6J) F1 mice was associated with 100% mortality at day 8 post-infection and dramatic
weight loss (Figure 1 and 2). Lung lesions in F1 mice transferred with DBA/2J AM were
characterized by an intense neutrophilic influx, necrotizing bronchiolitis and widespread
diffuse alveolar damage (Figure 3). Similar lesions were observed in AM-depleted F1 mice
(Figure 3). (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice transferred with C57BL/6J AM showed no
mortality, no significant body weight loss after infection and lung lesions restricted to the
peribronchiolar areas (Figure 1, 2 and 3).
Immunohistochemical staining for influenza nucleoprotein showed a stronger and more
widespread presence of viral antigens in bronchioles and alveolae of F1 mice treated with
clodronate or transferred with DBA/2J AMs at day 8 post-infection (Figure 4). PBS-treated
(DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice and those transferred with C57BL/6J showed minimal
infection at this time of the infection (Figure 4).
A soluble factor expressed by infected alveolar macrophages conditions the permissivity
of mouse pneumocytes to infection
Given the high viral titers observed in DBA/2J mice in the early phase of infection, we aimed
to assess the impact of alveolar macrophages on the permissivity of alveolar epithelial cells to
influenza infection. To address this question, we pre-incubated MLE-12 mouse pneumocytes
with UV-sterilized supernatants from infected DBA/2J or C57BL/6J AMs before in vitro
infection of these MLE-12 cells with influenza virus. Lung titers in the supernatants of
120
infected MLE-12 cells were significantly (24 hours post-infection) to highly significantly (48
hours post-infection) decreased by pre-conditioning of the cells by C57BL/6J AMs
supernatant, while supernatant from DBA/2J mice had no significant effect (Figure 5).
Decreased expression of type I interferons by DBA/2J alveolar macrophages is
responsible for the inability of this mouse strain to control influenza infection
It is known that DBA/2J AMs express less type I interferons after in vitro influenza
infection,13
but the cause-to-effect link between this lower expression and the higher
permissivity to influenza virus of alveolar epithelial cells in this mouse strain is still missing.
To specifically answer this question, we repeated the in vitro infection of MLE-12 after pre-
incubation with supernatants from infected DBA/2J or C57BL/6J AMs but this time after
blockade of IFNAR1 receptors by a specific antibody on the surface of MLE-12 cells. The
blockade of IFNAR1 receptors annihilated the inhibitory effect conferred by C57BL/6J AMs
supernatant on influenza replication in MLE-12 cells at 24h and 48h post-infection (Figure
6). Comparatively, IFNAR1 receptors blockade also slightly increased virus yield in MLE-12
cells pre-conditioned by DBA/2J AMs supernatant, but this was significant only at 24h post-
infection (Figure 6).
DISCUSSION
Mouse models have long been used to study influenza pneumonia in mammals. DBA/2J and
C57BL/6J strains are extremes in terms of susceptibility to influenza A infection, the former
highly susceptible, the latter resistant.6,8–12,15–20
Several studies specifically addressed the
question of the extreme susceptibility of DBA/2J to influenza A virus by different approaches
including the use of QTL mapping and recombinant inbred lines, yielding impressive lists of
candidate genes, whose respective role has so far not been confirmed.6–12
Furthermore, the
121
reliability of QTL mapping based on recombinant inbred lines from DBA/2J and C57BL/6J
parental strains has recently been challenged.14
Using a phenotypic approach, we previously
showed that alveolar macrophages from DBA/2J express much less cytokines and
chemokines after in vitro infection by influenza A virus than those from C57BL/6J.13
Together with the higher viral amplification observed soon after infection in DBA/2J mouse
lungs and the high susceptibility conferred to C57BL/6J mice upon depletion of their alveolar
macrophages by clodronate, this result suggests that AMs play a critical role in the
susceptibility to influenza A infection in DBA/2J mice.13
Similar observations in ferrets,21
pigs22
and mouse23–26
confirm the importance of AMs in the innate immune response to
influenza virus. To define the involvement of alveolar macrophages in the respective
susceptibility of DBA/2J and/or the resistance of C57BL/6J to influenza, we performed
adoptive transfer experiments in recipient (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice. The use of F1
mice as recipients was necessary given the fact that DBA/2J and C57BL/6J express different
MHC H2 molecules.27
F1 mice with their own alveolar macrophages showed a high level of
resistance to influenza, but slightly lower than that of C57BL/6J mice. Clodronate treatment
to deplete alveolar macrophages in F1 mice rendered them highly susceptible, with 100%
mortality at day 8 post-infection. Adoptive transfer of DBA/2J alveolar macrophages in
depleted F1 recipient mice did not increase their resistance, while the transfer of C57BL/6J
alveolar macrophages conferred a complete resistance, similar to that of wild-type C57BL/6J
mice in the same conditions.13
One or several functions of alveolar macrophages are thus
essential in the protection against influenza pneumonia. A deficiency in such functions in
DBA/2J mouse alveolar macrophages is responsible for the extreme susceptibility of this
mouse strain to influenza A virus.
DBA/2J are able to mount a protective adaptive immunity against influenza virus after
vaccination.17
Similarly, another model of depletion of alveolar macrophages in mice
122
permitted to conclude that alveolar macrophages are not necessary to the development of an
efficient adaptive immunity.25
We previously showed that influenza infection in DBA/2J mice
results in an earlier (from day 2 post-infection) and much higher viral amplification than in
resistant C57BL/6J, once again ruling out the involvement of adaptive immunity.13
Besides,
depletion of alveolar macrophages in mice is associated with higher viral replication and
higher lung levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, TNF-α and IL-6,24
which is
typically what is observed in DBA/2J mice after influenza infection.6–11,13
The deficient
functions of DBA/2J alveolar macrophages which result in this higher viral amplification
might be related to the central role played by AM in the innate immune response, especially
type I interferons production, and/or to the clearance of viral particles and infected cells via
the phagocytic activity of these macrophages. Since alveolar macrophages from DBA/2J
express much less cytokines and chemokines, including type I IFNs, after in vitro infection
than those from C57BL/6J,13
it is tempting to suggest that the decreased levels of type I IFNs
fail to restrict viral replication in DBA/2J lung tissues. This view is consistent with the fact
that IFNβ1 has been shown to be the most upregulated gene after infection of human alveolar
macrophages by influenza A virus.28
To investigate this hypothesis, we measured the effect of
a pre-conditioning of mouse MLE-12 pneumocytes by UV-inactivated supernatant from
infected DBA/2J or C57BL/6J alveolar macrophages on the virus yield after infection of the
pre-conditioned cells. The supernatant from infected C57BL/6J alveolar macrophages had a
strong antiviral activity, decreasing the viral titer at 48h post-infection by a ~2.7 ratio. Thus,
one or several soluble factors expressed in higher amounts by infected C57BL/6J alveolar
macrophages were able to make MLE-12 cells less permissive to influenza infection. As type
I interferons come first as candidates and since DBA/2J alveolar macrophages show a lower
expression of a broad spectrum of cytokines and chemokines after in vitro influenza
infection,13
we assessed the impact of the specific blockade of IFNAR1 receptors on the
123
protection conferred to MLE-12 cells by supernatant from C57BL/6J AMs. Blocking IFNAR1
receptors annihilated the protective effect of C57BL/6J AMs supernatant, showing that this
effect is mostly mediated by type I IFNs. This observation is consistent with the fact that
alveolar macrophages are the main producers of type I IFNs in the lung upon infection.29
Besides, since type I IFNs limit the expression of pro-inflammatory cytokines and the severity
of lung pathology,30–32
the hypothesis of insufficient type I IFNs production by AMs in
DBA/2J mice is concordant with the cytokinic storm and exacerbated lung lesions observed in
this mouse strain after influenza A infection.6–11,13
This view is reinforced by the high
susceptibility, the higher lung cytokines/chemokines levels and the strong neutrophilic influx
observed in IFNAR-/-
mice infected by influenza A virus.33
Regarding the mechanisms involved in the deficient expression of type I IFNs by DBA/2J
alveolar macrophages, hypotheses can only be speculative. Factors involved in the activation
pathway of IFNα and IFNβ expression might be limiting, due to lower expression or to
affected function linked to mutations. As an example, interferon regulatory factor 7 (IRF7),
essential for type I IFNs expression,34
is part of the trl3 susceptibility/resistance locus on
chromosome 7, thought to be involved in the increased susceptibility of DBA/2J mice to
Mycobacterium tuberculosis.35
Similarly, Ifih1 (or MDA-5, Melanoma Differentiation-
Associated protein 5) is a cytoplasmic sensor of viral RNA which has been suggested to be
linked to DBA/2J susceptibility to influenza A infection.10
It has to be noted here that Ifih1
protein from DBA/2J mouse (GenBank accession number: ABO33314) presents a K to E
substitution at position 368 when compared to that from C57BL/6J36
but this there is currently
no report about a potential dysfunction of this factor in DBA/2J mice. C5 complement factor-
and CD94-deficiencies have been ruled out to explain the high susceptibility of DBA/2J to
influenza A virus.13,37
Another factor, Gpnmb or DC-HIL or osteoactivin, is known to be
absent in DBA/2J mice due to the presence of a premature stop codon, which is thought to
124
induce a high incidence of glaucoma in this mouse strain.38
DC-HIL/gpnmb is a
transmembrane protein expressed on different cell types, including macrophages. It has been
shown that antigen presenting cells from DBA/2J, devoid of DC-HIL/gpnmb, fail to induce
antigen induced immune tolerance when treated with TGFβ2.39
In macrophages, DC-
HIL/gpnmb acts as a feedback regulator of inflammation,40
which would also be a plausible
explanation for the cytokinic storm observed in DBA/2J after influenza A infection, since it is
not expressed in this strain. To our knowledge, a link between the lack of DC-HIL/gpnmb and
a lower type I IFN response in macrophages has never been established, but the availability of
DBA/2J.gpnmb+ mice, which are homozygous for the wild-type version of the protein, would
be helpful to address this question. Additional research is clearly needed to enlighten this
point.
There remains that in addition to the deficient type I interferons response, DBA/2J alveolar
macrophages could also be inefficient in the phagocytosis and destruction of viral particles or
infected cells. We previously showed that the uptake of viral particles by DBA/2J alveolar
macrophages was not affected and that the inactivation of infectious viral particles was likely
deficient.13
A model of Mycobacterium tuberculosis infection showed that DBA/2J alveolar
macrophages were insufficiently activated and unable to control bacterial infection, in spite of
higher levels of inducible nitric oxide synthase than in C57BL/6J macrophages.41
On the same
way, DBA/2J macrophages showed a reduced bactericidal activity in a model of
Pseudomonas aeruginosa infection while phagocytosis in itself was conserved.42
Whether the
reduced microbicidal activity of DBA/2J macrophages is intrinsic or results from a deficient
activation which could be linked to the altered interferon activation remains to be determined.
Overall the results presented in this study demonstrate that alveolar macrophages are
responsible for the high susceptibility of DBA/2J mouse strain to influenza pneumonia. In
particular, DBA/2J alveolar macrophages present a deficient type I interferons response,
125
which fail to protect adjacent lung epithelial cells and results in higher viral lung titers.
Further research should focus on the pathways of activation of type I IFNs expression and on
the deficient microbicidal activity of DBA/2J macrophages.
METHODS
Mice and virus
Eight-week-old DBA/2J and C57BL/6J mice were obtained from Charles River Laboratories
(Saint Germain sur l'Arbresle, France). (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice were obtained by
crossing female DBA/2J and male C57BL/6J mice. Challenge studies were conducted under
biosafety level 2 facilities accredited by the Belgian Council for Laboratory Animal Science
under the guidance of the Institutional Animal Care and Use Committees of the University of
Liège (No: 13-1499).
The mouse-adapted swine H1N1 influenza A virus strain and the in vivo infection procedure
have been described previously.13,43
Adoptive transfer of alveolar macrophages
Depletion of alveolar macrophages was performed on groups of five female (DBA/2J X
C57BL/6J) F1 mice by instillation of 100µl of liposome encapsulated dichloromethylene
diphosphonate (clodronate; ClodronateLiposomes.org, Amsterdam, The Netherlands) as
described in 23
and 13
. Control mice were mock-treated with 100µl liposomes/PBS
(Phosphate-Buffered Saline, Lonza, Verviers, Belgium). Transfer of alveolar macrophages
was performed 24h after clodronate depletion. Depletion efficacy was assessed by counting
residual alveolar macrophages 24h after treatment in bronchoalveolar lavage fluids.
Isolation of alveolar macrophages was performed on groups of five female DBA/2J or
C57BL/6J mice per recipient F1 mouse using the method described in 13
and 44
. Briefly,
126
isolated AMs from five donor mice were pooled (2,5 106 AMs), pelleted by centrifugation at
300g for 5min and resuspended in 100µl of PBS before intranasal instillation of each depleted
(DBA/2J X C57BL/6J) F1 mouse. Standard influenza inoculation of (DBA/2J X C57BL/6J)
F1 mice (PBS-treated, depleted, transferred with DBA/2J or with C57BL/6J macrophages)
was realized 24h after the transfer. Mice were monitored daily for clinical signs, mortality and
body weight changes. Lung samples were harvested on day 8 post-infection from each group
for histopathological and immunohistochemical (targeting influenza nucleoprotein)
evaluation, as described previously.13,43
Assessment of the antiviral activity of supernatants from DBA/2J or C57BL/6J infected
alveolar macrophages
Alveolar macrophages from eight-week-old female DBA/2J and C57BL/6J mice were
isolated as previously. Alveolar macrophages (100,000/well) were transferred to 6-well plates
(Greiner BioOne, Wemmel, Belgium) in 1 mL/well of RPMI (Roswell Park Memorial
Institute) medium containing 2% fetal bovine serum, 1% penicillin–streptomycin and 0.6%
fungizone (Lonza, Verviers, Belgium) and were incubated at 37°C and 5% CO2. Alveolar
macrophages were infected using a multiplicity of infection (MOI) of 10 of the mouse
adapted swine H1N1 influenza strain in 1mL of serum-free RPMI medium for 24h. Culture
supernatant was harvested at 24h post-infection, centrifuged at 300g for 5min to eliminate cell
debris, and UV-inactivated for 30min as described in 13
. MLE-12 mouse pneumocytes (ATCC
CRL-2110) were cultured in 6-well plates (Greiner BioOne, Wemmel, Belgium) in 3ml of
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Lonza, Verviers, Belgium) containing 10%
fetal bovine serum, 1% penicillin–streptomycin, and 0.6% fungizone (Lonza, Verviers,
Belgium). Supernatant from infected DBA/2J or C57BL/6J alveolar macrophages was diluted
1/20 in 2ml serum-free DMEM and transferred to each well of MLE-12 cells, for 14h. Control
127
MLE-12 cells received serum-free DMEM alone. Infection of MLE-12 cells was performed in
triplicate at a MOI of 0.01 of the mouse adapted swine H1N1 influenza strain in 2mL of
serum-free DMEM. Culture supernatants were collected at 24h and 48h post-infection and
stored at -80°C. Viral titers were measured as described in 13
.
For the blockade of IFNAR1 receptors, anti-IFNAR1 antibody clone MAR1–5A3 (Santa Cruz
Biotechnology, Dallas, USA) was diluted at 10µg/ml in 2ml DMEM with 10% fetal bovine
serum, 1% penicillin–streptomycin, and 0.6% fungizone (Lonza, Verviers, Belgium) and
added to MLE-12 cells for 3h at 37°C and 5% CO2. Supernatant from infected alveolar
macrophages from DBA/2J or C57BL/6J was then added to MLE-12 cells 3h after the
addition of anti-IFNAR1 antibody. The infection was performed as previously.
Statistical analysis
Means and standard deviations were calculated and data for body weight loss and viral titers
were analysed by the two-way ANOVA and the post Bonferroni test; and the Student t-test,
respectively, using the GraphPad prism software (GraphPad Software, San Diego, California;
www.graphpad.com).
DISCLOSURE
The authors declare no conflict of interest.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank Jérôme Wayet and Michaël Sarlet for excellent technical support. This work was
supported by Wallonie-Bruxelles International and CONICYT PAI/INDUSTRIA 79090016.
128
REFERENCES
1. Taubenberger, J. K. et al. Reconstruction of the 1918 influenza virus: Unexpected
rewards from the past. MBio 3, (2012).
2. McLaughlin, J. M., McGinnis, J. J., Tan, L., Mercatante, A. & Fortuna, J. Estimated
Human and Economic Burden of Four Major Adult Vaccine-Preventable Diseases in
the United States, 2013. J. Prim. Prev. 36, 259–273 (2015).
3. Klepser, M. E. Socioeconomic impact of seasonal (epidemic) influenza and the role of
over-the-counter medicines. Drugs 74, 1467–1479 (2014).
4. Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical
perspective. Curr. Opin. Virol. 13, 101–108 (2015).
5. Staeheli, P., Grob, R., Meier, E., Sutcliffe, J. G. & Haller, O. Influenza virus-
susceptible mice carry Mx genes with a large deletion or a nonsense mutation. Mol.
Cell. Biol. 8, 4518–4523 (1988).
6. Boon, A. C. M. et al. Host genetic variation affects resistance to infection with a highly
pathogenic H5N1 influenza A virus in mice. J. Virol. 83, 10417–10426 (2009).
7. Boon, A. C. M., Williams, R. W., Sinasac, D. S. & Webby, R. J. A novel genetic locus
linked to pro-inflammatory cytokines after virulent H5N1 virus infection in mice. BMC
Genomics 15, 1017 (2014).
8. Srivastava, B. et al. Host genetic background strongly influences the response to
influenza a virus infections. PLoS One 4, e4857 (2009).
129
9. Alberts, R. et al. Gene expression changes in the host response between resistant and
susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12, 309–
318 (2010).
10. Nedelko, T. et al. Distinct gene loci control the host response to influenza H1N1 virus
infection in a time-dependent manner. BMC Genomics 13, 411 (2012).
11. Trammell, R. A., Liberati, T. A. & Toth, L. A. Host genetic background and the innate
inflammatory response of lung to influenza virus. Microbes Infect. 14, 50–58 (2012).
12. Dengler, L. et al. Cellular changes in blood indicate severe respiratory disease during
influenza infections in mice. PLoS One 9, e103149 (2014).
13. Casanova, T., Paar, E. Van de, Desmecht, D. & Garigliany, M. Hyporeactivity of
alveolar macrophages and higher respiratory cell permissivity characterize DBA/2J
mice infected by influenza A virus. J. Interferon Cytokine Res.
(2015).doi:10.1089/jir.2014.0237
14. Wang, L. et al. Limitation of number of strains and persistence of false positive loci in
QTL mapping using recombinant inbred strains. PLoS One 9, e102307 (2014).
15. Blazejewska, P. et al. Pathogenicity of different PR8 influenza A virus variants in mice
is determined by both viral and host factors. Virology 412, 36–45 (2011).
16. Trammell, R. A. & Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice
used in infectious disease research. Comp. Med. 61, 492–498 (2011).
17. Dengler, L., May, M., Wilk, E., Bahgat, M. M. & Schughart, K. Immunization with
live virus vaccine protects highly susceptible DBA/2J mice from lethal influenza A
H1N1 infection. Virol. J. 9, 212 (2012).
130
18. Liberati, T. A., Trammell, R. A., Randle, M., Barrett, S. & Toth, L. A. Cytokine and
chemokine responses of lung exposed to surrogate viral and bacterial infections. Comp.
Med. 63, 114–126 (2013).
19. Preusse, M., Tantawy, M. A., Klawonn, F., Schughart, K. & Pessler, F. Infection- and
procedure-dependent effects on pulmonary gene expression in the early phase of
influenza A virus infection in mice. BMC Microbiol. 13, 293 (2013).
20. Zaraket, H., Bridges, O. A. & Russell, C. J. The pH of activation of the hemagglutinin
protein regulates H5N1 influenza virus replication and pathogenesis in mice. J. Virol.
87, 4826–4834 (2013).
21. Kim, H. M. et al. The severe pathogenicity of alveolar macrophage-depleted ferrets
infected with 2009 pandemic H1N1 influenza virus. Virology 444, 394–403 (2013).
22. Kim, H. M. et al. Alveolar macrophages are indispensable for controlling influenza
viruses in lungs of pigs. J. Virol. 82, 4265–4274 (2008).
23. Tate, M. D., Pickett, D. L., Rooijen, N. van, Brooks, A. G. & Reading, P. C. Critical
role of airway macrophages in modulating disease severity during influenza virus
infection of mice. J. Virol. 84, 7569–7580 (2010).
24. Murphy, E. A. et al. Susceptibility to infection and inflammatory response following
influenza virus (H1N1, A/PR/8/34) challenge: role of macrophages. J. Interferon
Cytokine Res. 31, 501–508 (2011).
25. Purnama, C. et al. Transient ablation of alveolar macrophages leads to massive
pathology of influenza infection without affecting cellular adaptive immunity. Eur. J.
Immunol. 44, 2003–2012 (2014).
131
26. Schneider, C. et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory
failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10,
e1004053 (2014).
27. Fischer Lindahl, K. On naming H2 haplotypes: functional significance of MHC class Ib
alleles. Immunogenetics 46, 53–62 (1997).
28. Wang, J. et al. Innate immune response of human alveolar macrophages during
influenza A infection. PLoS One 7, e29879 (2012).
29. Kumagai, Y. et al. Alveolar macrophages are the primary interferon-alpha producer in
pulmonary infection with RNA viruses. Immunity 27, 240–252 (2007).
30. Mayer-Barber, K. D. et al. Innate and adaptive interferons suppress IL-1alpha and IL-
1beta production by distinct pulmonary myeloid subsets during Mycobacterium
tuberculosis infection. Immunity 35, 1023–1034 (2011).
31. Durbin, J. E. et al. Type I IFN modulates innate and specific antiviral immunity. J.
Immunol. 164, 4220–4228 (2000).
32. Guarda, G. et al. Type I interferon inhibits interleukin-1 production and inflammasome
activation. Immunity 34, 213–223 (2011).
33. Seo, S.-U. et al. Type I interferon signaling regulates Ly6C(hi) monocytes and
neutrophils during acute viral pneumonia in mice. PLoS Pathog. 7, e1001304 (2011).
34. Honda, K. et al. IRF-7 is the master regulator of type-I interferon-dependent immune
responses. Nature 434, 772–777 (2005).
132
35. Marquis, J.-F., Lacourse, R., Ryan, L., North, R. J. & Gros, P. Genetic and functional
characterization of the mouse Trl3 locus in defense against tuberculosis. J. Immunol.
182, 3757–3767 (2009).
36. Kim, W.-K. et al. Deficiency of melanoma differentiation-associated protein 5 results
in exacerbated chronic postviral lung inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med.
189, 437–448 (2014).
37. Shin, D.-L. et al. Segregation of a spontaneous Klrd1 (CD94) mutation in DBA/2
mouse substrains. G3 (Bethesda). 5, 235–239 (2015).
38. Anderson, M. G. et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause
pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81–85 (2002).
39. Anderson, M. G. et al. GpnmbR150X allele must be present in bone marrow derived
cells to mediate DBA/2J glaucoma. BMC Genet. 9, 30 (2008).
40. Ripoll, V. M., Irvine, K. M., Ravasi, T., Sweet, M. J. & Hume, D. A. Gpnmb is
induced in macrophages by IFN-gamma and lipopolysaccharide and acts as a feedback
regulator of proinflammatory responses. J. Immunol. 178, 6557–6566 (2007).
41. Cardona, P.-J. et al. Widespread bronchogenic dissemination makes DBA/2 mice more
susceptible than C57BL/6 mice to experimental aerosol infection with Mycobacterium
tuberculosis. Infect. Immun. 71, 5845–5854 (2003).
42. Wilson, K. R., Napper, J. M., Denvir, J., Sollars, V. E. & Yu, H. D. Defect in early
lung defence against Pseudomonas aeruginosa in DBA/2 mice is associated with acute
inflammatory lung injury and reduced bactericidal activity in naive macrophages.
Microbiology 153, 968–979 (2007).
133
43. Garigliany, M. M. et al. Influenza A strain-dependent pathogenesis in fatal H1N1 and
H5N1 subtype infections of mice. Emerg. Infect. Dis. 16, 595–603 (2010).
44. Bang, B. R. et al. Alveolar macrophages modulate allergic inflammation in a murine
model of asthma. Exp. Mol. Med. 43, 275–280 (2011).
134
FIGURE LEGENDS
Figure 1
Body weight follow-up of (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice (PBS-treated, clodronate depleted,
transferred with DBA/2J or with C57BL/6J macrophages) after intranasal inoculation with 9
PFUs per mouse of H1N1 influenza A virus over a 14-day experimental period.
The p-values for significance were calculated in all pairs between groups/strains for all days
shown in the figure 1 using a two-way ANOVA and Bonferroni test. F1 mice transferred with
alveolar macrophages from DBA/2J susceptible strain showed significant differences in
weight loss compared to F1+C57BL/6J A.M. mice (P < 0.01 for days 5-6 and P < 0.001 for
days 7-8). The F1+clodr+C57BL/6J A.M. mice showed significant differences with
F1+clodronate mice (P < 0.01 for days 5-6-8 and P < 0.001 for day 7) and with F1+PBS mice
(P < 0.1 for day 5).
135
Figure 2
Survival rate of (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice (PBS-treated, clodronate depleted,
transferred with DBA/2J or with C57BL/6J macrophages) after intranasal inoculation with 9
PFUs per mouse of H1N1 influenza A virus over a 14-day experimental period.
136
Figure 3
Microscopic appearance (hematoxylin and eosin) of lungs from (DBA/2J X C57BL/6J) F1
mice (A: PBS-treated; B: clodronate depleted; C: transferred with C57BL/6J alveolar
macrophages; D: transferred with DBA/2J alveolar macrophages) at day 8 after intranasal
inoculation with 9 PFUs per mouse of H1N1 influenza A virus. Foci of lung consolidation,
suppurative to lymphocytic infiltration and diffuse alveolar damage are obvious in F1 mice
treated with clodronate (B) and F1 mice transferred with DBA/2J alveolar macrophages (D).
Original magnification x200.
137
Figure 4
Immunohistochemical staining showing the distribution of influenza antigens (nucleoprotein;
bright red precipitate) in the lung tissues of (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice (A: PBS-treated;
B: clodronate depleted; C: transferred with C57BL/6J alveolar macrophages; D: transferred
with DBA/2J alveolar macrophages) at day 8 after intranasal inoculation with 9 PFUs per
mouse of H1N1 influenza A virus.
138
Figure 5
Viral titers in the culture supernatant of MLE-12 mouse pneumocytes infected by H1N1
influenza A virus. MLE-12 cells were pre-treated with culture supernatants from infected
DBA/2J or C57BL/6J alveolar macrophages during 14h before infection. Titers are expressed
as PFU/mL. Student’s t-test. *P < 0.05, **P < 0.01.
139
Figure 6
Effect of the blockade of IFNAR1 receptors on the viral titers in the culture supernatant at 24h
(A) and 48h (B) after infection of MLE-12 mouse pneumocytes by H1N1 influenza A virus.
MLE-12 cells were pre-treated with culture supernatants from infected DBA/2J or C57BL/6J
alveolar macrophages during 14h before infection. Titers are expressed as PFU/mL. Student’s
t-test. ***P < 0.001.
140
3 DISCUSSION GENERALE
Le virus influenza A constitue un problème majeur tant pour la santé publique que pour la
santé animale. L’Organisation Mondiale de la Santé estime qu’environ 500.000 cas de
mortalité par an dans la population humaine sont associées aux souches saisonnières du virus
de la grippe. Les virus influenza A ont également été responsables de plusieurs épisodes
pandémiques depuis le début du 20ème
siècle, au cours desquels des souches hautement
pathogènes et transmissibles du virus ont causé des millions de décès, la pandémie la plus
célèbre étant la « grippe espagnole » de 1918 avec ~50 millions de morts (Morens et al.,
2010). Face à l’ampleur de cette problématique, de très nombreuses études ont été menées
pour mieux appréhender les caractéristiques, la structure, les facteurs de virulence, les
variations antigéniques et la pathogénie du virus ainsi que l’élaboration et l’étude de
l’efficacité de vaccins. A ce jour, le virus influenza est l’un des virus les plus étudiés.
Néanmoins, les facteurs de résistance de l’hôte à l’infection restent largement méconnus.
Différents modèles animaux ont été utilisés pour étudier la pathogénie de l’infection, la
transmission et le développement de vaccins contre le virus influenza A. Les animaux le plus
souvent utilisés sont le furet, le porc, le cochon d’inde, le hamster, les primates non humains
et, surtout, la souris (Bouvier et Lowen, 2010; Thangavel et Bouvier, 2014). Le modèle murin
présente l’avantage d’une grande reproductibilité des résultats grâce à la disponibilité de
nombreuses lignées consanguines (« inbred lines ») (Bouvier et Lowen, 2010). Parmi les
souches Mx-négatives de souris de laboratoire, plusieurs études ont démontré que les souris
DBA/2J et C57BL/6J constituent deux extrêmes en termes de sensibilité et de résistance à
l’infection par le virus influenza A. Lorsque les souris DBA/ 2J et C57BL/6J ont été infectées
par différentes souches de virus, quelles soient d’origine humaine, aviaire, hautement ou
faiblement pathogènes, murinisées ou pas, la souris DBA/2J s’est systématiquement montrée
141
plus sensible à l’infection (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Nedelko et al., 2012;
Trammell et al., 2012; Dengler et al., 2014). La souris DBA/2J présente des taux de morbidité
et mortalité à l’infection bien plus importants que ceux de C57BL/6J. De plus, les doses
virales nécessaires pour atteindre la maladie sont beaucoup plus faibles chez la souris
DBA/2J. Les lésions pulmonaires, beaucoup plus sévères chez DBA/2J, sont caractérisées
principalement par un infiltrat massif de neutrophiles et macrophages et par la présence d’un
exsudat fibrineux et par la nécrose de l’épithélium des bronches et bronchioles (Boon et al.,
2009; Srivastava et al., 2009; Dengler et al., 2014). Pour essayer d’expliquer les facteurs
responsables de cette différence de sensibilité à l’infection, plusieurs études ont eu recours à
des Recombinant Inbred Lines entre ces deux lignées. Cependant, ces études ont abouti à de
très longues listes de gènes candidats dont l’influence respective n’a pas pu être déterminée
(Boon et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon et
al., 2014; Wang et al., 2014). De plus, ces études se sont focalisées exclusivement sur la
réponse à l’infection par DBA/ 2J et C57BL/6J et pas aux caractéristiques intrinsèques
propres de chaque lignée qui pourraient favoriser (ou non) l’infection par le virus influenza A.
Pour apporter de nouveaux éléments de réponse quant aux facteurs responsables de l’extrême
sensibilité de la souche DBA/2J, nous avons opté pour une approche phénotypique, visant à
identifier les étapes de l’infection virale où se maximisent les différences entres les souches
murines sensible et résistante. Notre modèle d’infection s’est basé sur un variant adapté à la
souris, par 32 passages pulmonaires, du virus « A/Swine/Iowa/4/1976 (H1N1) » (P32). Ce
modèle expérimental a recours à deux lignées de souris qui se comportent d’une façon
extrêmement différente suite à une infection par la même dose infectieuse virale. Nous
croyons que c’est la manière la plus objective d’étudier les facteurs associés à la résistance à
l’infection.
142
Une autre manière de procéder aurait pu être d’augmenter la dose infectieuse chez C57BL/6J
de manière à atteindre une morbidité et une mortalité comparables dans les deux lignées de
souris. Cette approche aurait permis de comparer la pathogénie virale dans les deux modèles
de souris avec une symptomatologie comparable. Ainsi, s’il est bien admis que la pathogénie
des virus influenza A varie notablement selon la souche de virus utilisée (Garigliany et al.,
2010), il ne serait pas surprenant de retrouver un phénomène similaire entre deux lignées de
souris différentes infectées par le même virus.
Les résultats préliminaires obtenus par des infections in vivo menées au sein du laboratoire de
Pathologie Systémique de la Faculté de Médecine Vétérinaire de l’Université de Liège ont
confirmé les différences de susceptibilité entre DBA/2J et C57BL/6J. Ces résultats ont mis en
évidence le fait que les poumons de DBA/2J amplifiaient le virus influenza de façon
significativement plus importante que ceux de la souris C57/BL/6J dès les jours 2 et 3 après
infection in vivo et que cette amplification des particules virales provenait principalement des
cellules épithéliales des voies respiratoires, tel que démontré par marquage de la
nucléoprotéine virale par immunohistochimie.
De plus, les lésions microscopiques ont montré une sévère pneumonie caractérisée par un
abondant infiltrat de neutrophiles, accompagnée de bronchite et bronchiolite nécrosantes,
similaires aux caractéristiques histopathologiques décrites après l’infection de souris par
d’autres souches virales, dont le virus PR8 (Srivastava et al., 2009). L’infiltrat pulmonaire de
neutrophiles semble en accord avec les modifications des paramètres sanguins décrites par
Dengler et al. (2014) qui ont mis en évidence une sévère neutrophilie chez DBA/2J,
neutrophilie qui a de plus été proposée comme marqueur de pathogénicité de l’infection
virale. Pour confirmer la sévérité de l’infiltrat neutrophilique, nous avons mesuré l’activité de
la myéloperoxidase (MPO) au niveau des poumons au cours de l’infection. Chez C57BL/6J,
cette activité est restée stable, alors que chez DBA/2J l’afflux massif de neutrophiles se
143
marque rapidement par une augmentation de l’activité MPO dès le jour 3 après infection.
D’autres études ont suggéré que cet afflux de neutrophiles dans les poumons de DBA/2J
pouvait être lié à de hautes concentrations en cytokines pro-inflammatoires et chimiokines
dans le tissu pulmonaire (Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010). Pour déterminer si
l’afflux de neutrophiles était une caractéristique propre à DBA/2J ou le simple reflet d’une
charge virale supérieure chez cette lignée, nous avons infecté des souris C57BL/6J à l’aide
d’une dose virale 100 fois supérieure, de manière à obtenir 100% de mortalité dans cette
lignée résistante. Dans ces conditions, les titres viraux pulmonaires sont proches de ceux
obtenus chez DBA/2J avec la dose « standard », mais il n’y a pas d’afflux de neutrophiles ni
d’augmentation importante de l’activité MPO. Ces données démontrent que l’infiltrat
neutrophilique est une caractéristique intrinsèque à la souche DBA/2J (Casanova et al., 2015).
Par ailleurs, si l’on tient compte du fait que dans la plupart des études la mortalité des souris
DBA/2J intervient aux jours 7-8 après infection virale (Boon et al., 2009; Srivastava et al.,
2009; Alberts et al., 2010; Blazejewska et al., 2011; Trammell et al., 2012) et que
l’immunisation préalable protège efficacement les souris DBA/2J contre l’infection avec des
virus homologues (Dengler et al., 2012), on peut affirmer que DBA/2J est compétente du
point de vue de l’immunité acquise et que son extrême sensibilité est associée à un déficit au
niveau de l’immunité innée. En particulier, DBA/2J semble incapable de contrôler l’infection
virale, avec une amplification massive du virus dès le jour 3 post-infection. Pour expliquer ces
observations, plusieurs hypothèses sont envisageables : soit les cellules des voies respiratoires
de DBA/2J présentent une permissivité accrue au virus influenza A, soit les macrophages
alvéolaires sont déficients en termes de phagocytose ou autres fonctions antivirales, soit une
conjonction de ces phénomènes. Enfin, le rôle du facteur C5 du complément, pour lequel
DBA/2J est déficient, dans la sensibilité au virus influenza A doit être étudié.
144
Pour répondre à ces questions, nous avons tout d’abord entrepris d’isoler plusieurs types
cellulaires de l’arbre respiratoire des souris DBA/2J et C57BL/6J pour en comparer la
permissivité in vitro. La dissection du système respiratoire des souris nous a permis d’obtenir
des cultures primaires de cellules épithéliales de la trachée, de pneumocytes et de
macrophages alvéolaires, ainsi que des explants de trachée. L’infection in vitro de ces cellules
nous a permis de démontrer que, dans nos conditions expérimentales, toutes les cellules
extraites de l’arbre respiratoire de la souris DBA/2J amplifient le virus de façon plus
importante que celles extraites de C57BL/6J (Casanova et al., 2015).
L’évaluation des titres viraux dans les surnageants de culture cellulaire a été effectuée par
mesure des protéines virales produites (nucléoprotéine), avec un kit ELISA commercial que
nous avons validé par rapport à une droite standard déterminée par dilution d’un surnageant
dûment titré par « plaque assay ». Le choix de l’ELISA a été fait pour sa grande
reproductibilité et au vu de la difficulté à obtenir des plages de lyse en « plaque assay » à
l’aide de la souche de virus P32. En effet, la lecture des « plaque assays » nécessite de
marquer par immunocytochimie les antigènes viraux dans chaque puits pour pouvoir
identifier et compter les plages de lyse sous microscope, ce qui en pratique était infaisable à
grande échelle. De plus, même dans ces conditions, le « plaque assay » a démontré un
manque de sensibilité et sous-estime probablement les titres viraux réels. En effet, les
dilutions utilisées pour la mesure des doses létales 50 ont montré que l’infection des souris
par « 1 particule virale » induisait la mort d’un pourcentage significatif des souris (voir
tableau 4 : dose létale), ce qui est évidemment aberrant. Une autre méthode possible aurait
été la PCR en temps réel, basée sur la détection d’un segment du génome viral, mais cette
méthode présente le même désavantage que l’ELISA, à savoir de ne pas distinguer les
particules virales infectieuses des non-infectieuses. Notre objectif étant la mise en évidence de
différences de production de nouvelles particules virales dans différentes conditions, la
145
méthode ELISA employée nous a apporté une évaluation de cette production à la fois fiable,
reproductible et insensible à la dégradation de l’ARN viral ou à l’inactivation du virus.
Ces différences de permissivité au virus sont tout à fait cohérentes avec nos observations in
vivo et renforcent les résultats des titres viraux pulmonaires obtenus dans les travaux de Boon
et al. (2009) et Srivastava et al. (2009), avec les souches virales H1N1 (PR8), H7N7
(SC35M) et H5N1 (HK213). Tant pour DBA/2J que pour C57BL/6J, les macrophages
alvéolaires et surtout les cellules trachéales, sont apparus comme de meilleurs amplificateurs
du virus par rapport aux pneumocytes. Nous avons également confirmé le fait que notre
souche virale murinisée se situe dans le groupe des souches de virus influenza capables de se
répliquer efficacement dans les macrophages alvéolaires (Van Riel et al., 2011). Cette
permissivité augmentée chez DBA/2J pourrait découler d’une réponse interféron déficiente
dans cette lignée, mais il a été démontré que l’expression d’IFNβ1 et d’IFNγ était intacte
(Alberts et al., 2010). Une autre hypothèse serait l’abondance et le type de récepteurs présents
en surface des cellules des voies respiratoires des souris DBA/2J, en comparaison avec
C57BL/6J. Donc, pour tenter d’expliquer cette permissivité accrue présentée par les cellules
épithéliales de la trachée, les pneumocytes et les macrophages alvéolaires de DBA/2J, nous
avons étudié l’expression des acides sialiques liés en α2,6 et en α2,3, les principaux récepteurs
au virus influenza A présents en surface des cellules cibles de la souris (Ning et al., 2009).
Les types de liaison et le niveau d’expression des acides sialiques constituent des facteurs
essentiels dans la barrière d’espèce pour les virus influenza A (Suzuki, 2005). Le cas le plus
étudié est celui de l’expression relative des acides sialiques liés en α2,3 et en α2,6,
prédominants largement dans les cellules des espèces aviaires et chez l’homme,
respectivement ; en conséquence, l’hémagglutinine des souches virales aviaires présente une
affinité accrue pour les acides sialiques en α2,3, alors que les souches humaines sont plus
spécifiques des récepteurs liés en α2,6 (Suzuki, 2005). Pour traverser cette barrière d’espèce,
146
les virus aviaires doivent adapter leur HA de façon à générer une affinité suffisante pour
adhérer efficacement aux cellules humaines exprimant les récepteurs liés en α2,6. Dans le cas
des cellules épithéliales respiratoires du porc, elles expriment les deux types de récepteurs et
sont donc également sensibles aux souches virales aviaires et humaines, ce qui a valu à cette
espèce le surnom de « mixing vessel » de par sa capacité à abriter des co-infections entre
souches aviaires et humaines et à favoriser ainsi leur réassortiment génétique (Crisci et al.,
2013). Pour étudier l’expression des acides sialiques en surface des cellules de DBA/2J et
C57BL/6J, nous avons eu recours aux lectines MAAII pour le marquage des liaisons en α2,3
et SNA pour les liaisons en α2,6. Par analyse en cytométrie en flux, nous avons démontré que
l’expression des acides sialiques liés en α2,3 était significativement plus importante en
surface des cellules épithéliales de la trachée et des macrophages alvéolaires provenant de la
souris DBA/2J (Casanova et al., 2015). Aucune différence significative n’a été identifiée pour
les pneumocytes. Les acides sialiques liés en α2,6 étaient quant à eux également exprimés,
sans présenter de différences significatives entre les deux lignées de souris. Ces résultats sont
cohérents avec ceux décris par Ning et al. (2009) qui ont mis en évidence l’expression des
deux types de récepteurs dans plusieurs organes, dont la trachée et les poumons des souris
BALB/c, mais ils sont en relative contradiction avec les résultats obtenus précédemment par
Ibricevic et al. (2006) qui concluaient à l’absence d’acides sialiques liés en α2,6 dans les
poumons des souris. L’expression accrue des récepteurs liés en α2,3 en surface des cellules de
DBA/2J pourrait avoir un impact direct sur leur permissivité et expliquer au moins en partie la
différence d’amplification des particules virales produites entre les cellules de DBA/2J et
celles de C57BL/6J. Pour étudier spécifiquement ce point, nous avons prétraité des cultures
primaires de cellules épithéliales de la trachée, les plus permissives des trois types cellulaires
étudiés, à l’aide d’une neuraminidase, de manière à éliminer la majeure partie des récepteurs
acides sialiques liés en α2,3 et en α2,6 en surface des cellules. Après infection virale, nous
147
avons constaté que ce prétraitement enzymatique abolissait complètement les différences de
titres viraux entre DBA/2J et C57BL/6J (Casanova et al., 2015). Ces résultats suggèrent que
l’excès de récepteurs acides sialiques liés en α2,3 chez DBA/2J serait au moins en partie
responsable de sa plus grande permissivité au virus influenza A. Ce prétraitement à la
neuraminidase n’as pas empêché complètement la réplication virale, ce qui peut s’expliquer
soit par un traitement incomplet soit par une voie d’entrée alternative pour le virus, comme
cela a déjà été décrit (Edinger et al., 2014). Si l’on considère que les d’acides sialiques liés en
α2,3 sont prédominants dans les voies respiratoires des souris (Glaser et al., 2007; Ning et al.,
2009) et que le processus de murinisation des souches virales d’origine humaine est associé à
des changements au niveau du site de liaison au récepteur de l’HA, se traduisant par une
affinité accrue pour les liaisons en α2,3 (Keleta et al., 2008; Hensley et al., 2009), il apparaît
d’autant plus probable que la surexpression des récepteurs acides sialiques liés en α2,3 joue
un rôle direct dans la sensibilité majeure des souris DBA/2J.
Les titres viraux plus élevés observés chez DBA/2J pourraient, en plus d’une permissivité
augmentée, être la conséquence d’un déficit au niveau de la capacité de phagocytose et
d’élimination des particules virales des macrophages alvéolaires. Nous avons ainsi mesuré
l’absorption de particules virales inactivées aux UV par les macrophages alvéolaires après 14
heures d’incubation, par marquage de la nucléoprotéine virale intracellulaire. De façon
inattendue, les macrophages alvéolaires de DBA/2J ont montré un marquage intracellulaire
trois fois supérieur à celui de C67BL/6J, ce qui démontre que les macrophages alvéolaires de
DBA/2J ne sont pas déficients en termes de phagocytose sensu stricto (Casanova et al., 2015).
Néanmoins, les résultats des infections in vitro réalisées précédemment ayant montré que ces
macrophages amplifiaient le virus de façon exacerbée, en comparaison avec ceux de
C57BL/6J, il est probable que les macrophages alvéolaires de DBA/2J soient incapables de
détruire efficacement les particules virales phagocytées mais, il est aussi probable qu’avec la
148
technique que nous avons employée pour comparer l’efficacité de la phagocytose,
l’internalisation des certaines particules virales inactivées aux UV dans les macrophages
alvéolaires se soit également produite par endocytose comme dans le cycle viral naturel (et
pas seulement pas phagocytose). Il est donc possible que la fluorescence moyenne mesurée
soit en fait l’addition de ces deux phénomènes.
Des observations similaires ont été faites pour les macrophages alvéolaires de DBA/2J après
infection par Pseudomonas aeruginosa, montrant clairement une phagocytose intacte, mais une
activité bactéricide inferieure à celle des macrophages alvéolaires de C57BL/6J (Wilson et al., 2007).
Ces résultats rejoignent également les données obtenues par Marquis et al. (2009) à l’aide
d’un modèle de tuberculose chez DBA/2J, souche très sensible mais qui devient plus
résistante après le transfert de la région Trl3 du chromosome 7 (« tuberculosis resistance
locus 3 »), associé à la résistance de C57BL/6J et identifié par QTL. Cette acquisition de
résistance chez DBA/2J se traduit par la capacité de ses macrophages à contrôler et détruire
les mycobactéries intracellulaires.
Une autre hypothèse à envisager pour expliquer la sensibilité extrême de DBA/2J au virus
influenza A est sa déficience en facteur C5 du complément (Wetsel et al., 1990). Il a ainsi par
exemple été démontré que l’absence de facteur C5 jouait un rôle déterminant dans l’incapacité
des macrophages péritonéaux de DBA/2J à détruire Cryptococcus neoformans (Brummer et
Stevens, 1994). Pour étudier l’impact du facteur C5 sur la sensibilité de DBA/2J au virus
influenza, nous avons supplémenté des souris DBA/2J en facteur C5 par transfert passif de
sérum compétent riche en facteur C5 provenant de souris SJL/J, comme décrit précédemment
dans un modèle d’infection de DBA/2J par Candida albicans (Ashman et al., 2003). Nous
n’avons pas trouvé de différence significative entre les souris DBA/2J complément-
compétentes et les DBA/2J contrôles (supplémentées avec du sérum décomplémenté), ni au
niveau de la perte de poids vif après infection, ni au niveau des signes cliniques ou des taux
149
de survie à l’infection, ce qui suggère que la déficience en facteur C5 du complément chez la
souris DBA/2J n’explique pas, dans nos conditions expérimentales, sa sensibilité au virus
influenza A (Casanova et al., 2015). Une autre étude a permis d’associer la présence du
facteur C5 à une maladie plus légère et à une amélioration des taux de survie après infection
par de faibles doses d’un virus influenza H3N2, effet qui disparaissait suite à l’augmentation
des doses virales (Hicks et al., 1978). Il est donc possible que le facteur C5 du complément
joue un rôle dans la protection contre le virus influenza chez la souris, mais cet effet semble
mineur et non déterminant.
Pour déterminer le rôle des macrophages alvéolaires dans la résistance au virus influenza A,
nous avons étudié l’effet d’une déplétion de ces macrophages par instillation de liposomes de
clodronate avant infection in vivo de souris DBA/2J et C57BL/6J. Le clodronate
(dichloromethylene diphosphonate) est une molécule spécifiquement captée par les
macrophages et qui provoque l’apoptose et la déplétion sélective de ce type cellulaire, dans le
cas présent les macrophages alvéolaires (Tate et al., 2010). Les liposomes constituent un
véhicule permettant d’améliorer la captation par le macrophage et la libération intracellulaire
du clodronate. La déplétion des macrophages alvéolaires a aboli la résistance des souris
C57BL/6J et les a fait succomber à l’infection entre les jours 6-9 après infection, ce que
démontre le rôle central joué par les macrophages alvéolaires dans le développement de la
maladie (Casanova et al., 2015). Les souris DBA/2J traitées au clodronate ont également
présenté une aggravation de la maladie et leur mortalité est intervenue ~1 à 2 jours avant celle
des DBA/2J contrôles, ce qui suggère que les macrophages alvéolaires de DBA/2J, bien que
déficients, confèrent malgré tout un certain degré de protection.
Pour mieux appréhender le développement de la réponse immune innée chez les souris
DBA/2J et C57BL/6J, nous avons étudié l’expression de cytokines et chimiokines produites
dans les poumons de ces souris après infection in vivo. A l’aide d’ELISAs quantitatifs
150
spécifiques, nous avons déterminé les cinétiques d’expression au cours des sept premiers
jours après infection. Nous avons ainsi mis en évidence une surexpression significative de la
plupart des cytokines/chimiokines mesurées chez DBA/2J dès le troisième jour post-infection,
en comparaison avec C57BL/6J. Ces résultats rejoignent les observations faites par d’autres
équipes précédemment, qui ont décrit des patterns d’expression similaires après infection par
d’autres souches de virus influenza et d’autres méthodes de détection (Boon et al., 2009;
Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Trammell et Toth, 2011; Nedelko et al., 2012;
Boon et al., 2014). Ces résultats confirment donc la mise en place d’une « tempête
cytokinique » chez DBA/2J. L’apparition de cette tempête coïncide avec l’explosion des titres
viraux pulmonaires typiquement observée chez cette souche. De façon remarquable, les
chimiokines KC et MIP-2 étaient fortement surexprimées chez DBA/2J, ce qui suggère un
lien de cause à effet avec l’afflux massif de neutrophiles observé concomitamment dans le
poumon de ces souris. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons mesuré l’effet du blocage
du récepteur CXCR2, décrit comme le principal récepteur impliqué dans les désordres
inflammatoires des pneumonies aigues (neutrophiles) et commun aux chimiokines KC et
MIP-2 (Konrad et Reutershan, 2012), sur l’afflux de neutrophiles dans le poumon au cours de
l’infection des souris DBA/2J. Ce blocage pharmacologique a été décrit dans un modèle
murin d’infection à pneumocoque (Herbold et al., 2010), où un traitement à l’aide du
composé « SB225002 » (antagoniste du CXCR2) permettait de diminuer considérablement
l’afflux de neutrophiles et de macrophages dans le poumon. Suite au blocage du récepteur et
après infection par le virus P32, nous avons suivi l’afflux de neutrophiles de façon qualitative
(histopathologie) et quantitative par mesure de l’activité de la MPO, ainsi que le taux de
survie, la perte de poids vif et l’expression des chimiokines MCP-1 et MIP-1α, chez les souris
DBA/2J. Le traitement n’a été associé à aucune variation dans les paramètres analysés, ce qui
151
suggère soit l’implication d’au moins un autre récepteur des chimiokines (par exemple
CXCR1), soit l’influence d’autres cytokines et chimiokines dans la pathogénie de la maladie.
Les macrophages alvéolaires jouant un rôle majeur dans l’induction de la réponse immune
innée, nous avons mesuré par PCR en temps réel l’expression des ARNm d’une série de
cytokines et chimiokines par les macrophages alvéolaires de DBA/2J et C57BL/6J au cours
de l’infection in vitro par le virus influenza.
De façon inattendue, à l’exception de KC et IFNλ, tous les ARNm des cytokines, étaient
largement sous-exprimés par les macrophages alvéolaires de DBA/2J (Casanova et al., 2015).
Dans ces macrophages alvéolaires, l’expression des molécules comme IFN-α, IFN-β, IL-1β,
MIP-1α, MIP-2α, MCP-1 a été pratiquement nulle dans les premières heures après infection,
en comparaison avec les macrophages alvéolaires de la souris résistante, C57BL/6J.
Si l’on regarde plus en détail l’expression des cytokines par les macrophages alvéolaires de
DBA/2J entre une heure et trois heures après infection, on peut observer que l’expression
relative des IFN-β, IFN-λ, IL-10 et IL-23 diminue significativement après une forte hausse
après une heure. Une hypothèse pour expliquer ce « shut off » des macrophages de DBA/2J
serait que la « contre-attaque » du virus, notamment par la production de protéine virale NS1,
et qui cible notamment l’expression d’interférons, serait beaucoup plus efficace dans cette
lignée murine que chez C57BL/6J. Ce phénomène correspondrait à l’effet d’« interférence
inverse » décrit par Lindenmann (1960) et qui a été expliqué principalement par l’action
inhibitrice de la protéine virale NS1 sur l’activation des interférons, grâce à plusieurs
mécanismes de suppression (Egorov et al., 1998; Ayllon et Garcia-Sastre, 2015). Dans une
expérience future, nous pourrions étudier l’effet de la protéine NS1 (et d’autres protéines
virales inhibitrices des IFNs, dont PB1-F2 et PA-X) par modification (mutation, déplétion) du
gène NS1 avant d’infecter les macrophages alvéolaires de DBA/2J pour étudier l’impact des
altérations sur l’expression de cytokines par les macrophages de DBA/2J. Une autre option
152
envisageable pour étudier la capacité intrinsèque des macrophages alvéolaires de DBA/2J
dans la production de cytokines serait de mesurer leur réponse (ex vivo) à un traitement au
Poly I:C, de façon à éviter l’effet potentiel de « shut off » de l’expression de protéines
cellulaires par le virus.
A première vue, ces résultats montrant une quasi-absence d’expression de
cytokines/chimiokines par les macrophages de DBA/2J semblent contradictoires avec la
tempête cytokinique observée dans les poumons après infection in vivo de cette lignée de
souris. Cependant, une autre étude a montré des résultats similaires suite à l’infection ex vivo
par un virus influenza A sur des coupes de poumon, les explants infectés de DBA/2J
exprimant significativement moins de cytokines/chimiokines que ceux de C57BL/6J
(Trammell et al., 2012). Il en ressort donc que la tempête cytokinique observée chez DBA/2J
est probablement d’origine systémique et non pulmonaire. Cette même hypothèse pourrait
expliquer l’abondant infiltrat neutrophilique présent dans les poumons de DBA/2J (Dengler et
al., 2014). De plus, le rôle central des endothéliums dans la « tempête cytokinique » et la
mortalité a aussi été démontré suite à l’infection par le virus influenza A dans le modèle
murin (Teijaro et al., 2011).
Il est à noter ici qu’il aurait également été possible de quantifier directement les cytokines du
surnageant de culture cellulaire à l’aide de la technique ELISA mais vu que cette expérience
visait à étudier très spécifiquement la réponse des macrophages alvéolaires à travers les
cytokines et au début de l’infection dans des moments très précis, l’ELISA aurait eu comme
limitation celle de mesurer une accumulation progressive des cytokines dans les surnageants
au fil des heures. A l’opposé, la PCR en temps réel nous a permis de mettre en évidence de
façon dynamique les variations de concentrations en ARN messagers de ces cytokines avec
un effet cumulatif beaucoup plus limité. Cet avantage nous a ainsi permis de mettre en
évidence de façon très claire une chute de l’expression de certaines cytokines chez les
153
macrophages alvéolaires de DBA/2J entre la première et troisième heure après infection,
résultats qui n’aurait probablement pas été détecté avec l’ELISA.
Il apparaît suite à cette expérience que les macrophages alvéolaires de DBA/2J présentent une
certaine hyporéactivité en termes de production de cytokines/chimiokines dans les poumons
des souris DBA/2J infectées (Casanova et al., 2015). Cette production insuffisante de
cytokines, dont les interférons, pourrait être en partie responsable de l’amplification virale
accrue observée chez DBA/2J, puisque le phénomène d’interférence virale y serait faible
voire inexistant en comparaison avec la situation chez C57BL/6J. Pour définir dans quelle
mesure les macrophages alvéolaires contribuent aux phénotypes « sensible/résistant »
observés chez DBA/2J et C57BL/6J, nous avons mis en œuvre une expérience de transfert
adoptif de macrophages alvéolaires de DBA/2J et C57BL/6J à des souris F1 issues de
croisements entre ces deux lignées de souris. Le recours à des individus F1 était indispensable
pour une question de compatibilité des complexes majeurs d’histocompatibilité. Les souris F1
(4 groupes) ont été d’abord déplétées de leurs macrophages alvéolaires par traitement au
clodronate, avant instillation de macrophages alvéolaires après 48 heures. Deux groupes ont
reçu les macrophages alvéolaires soit de DBA/2J, soit de C57BL/6J, un groupe contrôle a subi
la déplétion de ses macrophages sans transfert et un dernier groupe contrôle a conservé ses
propres macrophages alvéolaires. Suite à l’infection par le virus P32, nous avons suivi
l’évolution du poids vifs et les taux de survie pendant 14 jours. De façon intéressante, le
phénotype de résistance à l’infection par le virus influenza était entièrement associé aux
macrophages alvéolaires de C57BL/6J, alors que les macrophages de DBA/2J augmentaient la
sensibilité des souris F1 à l’infection. Les F1 déplétées de leurs macrophages alvéolaires
étaient également très sensibles et les F1 avec leurs propres macrophages présentaient une
résistance intermédiaire. Il apparaît donc clairement que le macrophage alvéolaire détermine
le devenir de l’infection dans ce modèle de pneumonie à influenza.
154
Il est tentant, au vu de ces résultats, de suggérer que la sensibilité accrue de DBA/2J soit
associée à l’hyporéactivité cytokinique/chimiokinique de ses macrophages alvéolaires et
notamment à leur incapacité à exprimer des concentrations adéquates en molécules antivirales
comme les interférons de type I, IFN-α et IFN-β, dans les premiers temps de l’infection, ce
qui conduirait à une réplication virale incontrôlée dans les voies respiratoires de DBA/2J.
L’excès de cellules inflammatoires et la tempête cytokinique n’apparaissent que dans un
second temps et ne seraient que la conséquence de l’incapacité de DBA/2J à contrôler les
premiers temps de l’infection virale.
Pour tenter de démontrer que l’effet protecteur des macrophages alvéolaires de C57BL/6J
passe par un facteur soluble, nous avons incubé des cultures de cellules MLE-12
(pneumocytes de souris) pendant 14 heures avec les surnageants issus de cultures de
macrophages alvéolaires de DBA/2J et C57BL/6J infectés par le virus P32. Les virions
présents dans ces surnageants ont préalablement été inactivés aux UV pour ne pas provoquer
une infection productive. Suite aux 14 heures d’incubation, les cultures de cellules MLE-12
ont été infectées et les titres viraux ont été mesurés à 24 heures et 48 heures après infection.
Les cellules MLE-12 exposées au surnageant des macrophages de DBA/2J ont amplifié les
particules virales de façon significativement plus importante que celles exposées au
surnageant des macrophages alvéolaires de C57BL/6J. Ce résultat démontre que des facteurs
solubles interviennent dans la protection conférée par les macrophages alvéolaires de
C57BL/6J contre le virus influenza A. Parmi les molécules candidates, les interférons de type
I figurent évidemment au premier plan. Comme les macrophages alvéolaires de DBA/2J
expriment de plus faibles quantités de toute une série de cytokines et chimiokines après
infection in vitro, la seule manière de démontrer l’implication des interférons de type I dans la
protection conférée par les macrophages de C57BL/6J était de bloquer l’effet de ces
interférons à l’aide d’un anticorps spécifique de leur récepteur (IFNAR1). En reproduisant
155
l’expérience de conditionnement des cellules MLE-12 par le surnageant de culture des
macrophages alvéolaires infectés des deux lignées de souris, mais cette fois en bloquant
l’effet des IFNs de type I à l’aide d’un anticorps anti-IFNAR1, nous avons aboli l’effet
protecteur du surnageant provenant des macrophages alvéolaires de C57BL/6J. Ce résultat
démontre que les interférons de type I produits par les macrophages alvéolaires de C57BL/6J
au début de l’infection jouent un rôle majeur dans la permissivité moindre de l’arbre
respiratoire de cette lignée de souris résistante à l’infection par le virus influenza A. Nous
avons choisi les cellules MLE-12 parce qu’elles s’ajustaient le mieux à notre modèle
d’infection ; ce sont, avant tout, des pneumocytes de souris, elles sont permissives au virus
influenza A et, de plus, elles proviennent de la lignée de souris FVB/N, qui est Mx-négative et
qui présente une résistance intermédiaire (entre DBA/2J et C57BL/6J) à l’infection par notre
virus P32 (résultats non publiés).
Ce modèle, qui place le macrophage alvéolaire au centre de la résistance à l’infection par un
virus influenza A, notamment par son niveau d’expression d’IFNs de type I, mériterait de plus
d’être testé pour d’autres modèles animaux de la maladie. En effet, les macrophages
alvéolaires ont été décrits comme indispensables au contrôle de l’infection par le virus
influenza chez le porc et dans d’autres modèles murins, ce qui a été mis en évidence suite à
des expériences de déplétion des macrophages alvéolaires, avec des résultats et dans des
conditions similaires aux nôtres (Kim et al., 2008; Tate et al., 2010). Il est essentiel de
déterminer si nos observations sont seulement valables dans les limites des lignées de souris
et de la souche virale utilisée ou constituent un élément conservé de la pathogénie de la
pneumonie à influenza chez les mammifères. De même, il serait intéressant de tester notre
modèle chez l’homme, espèce dans laquelle une susceptibilité accrue à l’infection a aussi été
décrite dans certains groupes ethniques, comme les habitants des îles polynésiennes,
principalement les îles Samoa, où les épisodes pandémiques se présentent avec des taux de
156
morbidité et mortalité bien supérieurs à la moyenne mondiale (1919; Kool et al., 2013;
Shanks et Brundage, 2013). Les causes de la sensibilité accrue de ces communautés
autochtones au virus influenza restent inconnues à ce jour. Il est tentant, au vu de nos
observations chez la souris, de proposer qu’un mécanisme similaire soit à l’œuvre chez ces
populations, avec une moindre activité des macrophages alvéolaires. Cette hypothèse mérite
d’être spécifiquement envisagée.
D’un autre coté, il a été démontré que le pré-conditionnement de souris par exposition à des
probiotiques comme Lactobacillus sp. conférait une protection contre l’infection par le virus
influenza A par activation de l’immunité innée, en particulier des macrophages alvéolaires
(Park et al., 2013; Nakayama et al., 2014; Zelaya et al., 2015). De plus, des expériences
similaires menées avec des probiotiques chez des personnes volontaires suggèrent que la
protection conférée par la « pré-activation » du système immunitaire est modulée par la
stimulation de la voie des IFNs de type I des macrophages (Sugimura et al., 2015). Cette
observation est tout à fait cohérente avec nos résultats qui démontrent, eux, qu’une lignée de
souris dont les macrophages alvéolaires présentent une plus grande réactivité en termes de
réponse interféron est plus résistante à l’infection par le virus influenza A. Ces évidences
renforcent non seulement l’hypothèse selon laquelle une stimulation rapide des macrophages
alvéolaires dans les premiers temps de l’infection protégeraient contre le virus influenza A,
mais aussi que ce phénomène serait médié principalement par les interférons de type I. Il
ressort aussi de ces recherches que la stimulation précoce de la voie des IFNs de type I dans
les macrophages alvéolaires des mammifères, par des molécules exogènes, pourrait être
utilisée de façon préventive/prophylactique dans les populations sensibles au virus
influenza A.
Certaines études (Van Reeth, 2000; Davidson et al., 2014) mettent en évidence un effet
délétère des IFNs de type I dans la pathogénie et la progression de l’infection par le virus
157
influenza A, notamment par leur implication dans la « tempête cytokinique ». Bien qu’a priori
ces résultats semblent opposés aux nôtres, ils sont en fait très difficiles à comparer car ils ont
été obtenus dans des modèles différents, avec des lignées de souris de fond génétique
différent, ainsi que des souches de virus et des doses infectieuses différentes et, surtout, les
paramètres étudiés ne sont pas les mêmes. En effet, dans le modèle DBA/2J, il y a là aussi des
concentrations en interférons nettement supérieures dans les broyats de poumons au cours de
l’infection et ils participent très certainement à la tempête cytokinique, la morbidité et les
lésions (Casanova et al., 2015). En dépit de cela, nous avons montré qu’une expression locale
et rapide (dans les premiers instants du cycle viral) d’interférons de type I par les
macrophages alvéolaires de C57BL/6J (les souris résistantes) avait un effet protecteur sur
l’épithélium respiratoire. Ce qui est évident, c’est que si l’infection virale est rapidement
maitrisée, il n’y a pas de tempête cytokinique et moins de lésions. Tout est donc une question
de timing et microenvironnement.
D’un autre coté et bien que nous ayons démontré un rôle majeur des interférons de type I
produits pas les macrophages alvéolaires dans la résistance à l’infection, il est aussi possible
qu’un autre produit des macrophages alvéolaires puisse conférer un certain degré de
résistance antivirale aux épithéliums. Il est également envisageable que les épithéliums de
C57BL/6J soient capables de produire des quantités protectrices d’IFNs, ce qui paraît
cependant moins évident, vu la sensibilité extrême à l’infection présentée par les souris
C57BL/6J suite à la déplétion de leurs macrophages alvéolaires. Il serait néanmoins
intéressant d’étudier ces deux possibilités.
158
4 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Les souris DBA/2J et C57BL/6J ont été largement utilisées dans la littérature comme modèles
d’infection par le virus influenza A. Un nombre considérable de gènes-candidats et de
mécanismes divers ont été proposés pour expliquer les phénotypes extrêmes de
sensibilité/résistance de ces deux lignées de souris, sans démonstration irréfutable.
Au terme de cette étude phénotypique, au cours de laquelle nous avons décortiqué les
différentes phases de l’infection pour identifier les étapes où se marquent les différences entre
DBA/2J et C57BL/6J, nous sommes en mesure de placer le macrophage alvéolaire, et en
particulier sa capacité à induire une résistance à l’infection des cellules environnantes par
l’intermédiaire des interférons de type I, en élément central de la résistance à l’infection par le
virus influenza.
Bien que nous ne puissions exclure une capacité moindre des macrophages alvéolaires de
DBA/2J à inactiver les particules virales, il apparaît clairement que le manque d’expression de
cytokines dans les premiers temps de l’infection, en particulier des interférons de type I, ne
permet pas à la souris DBA/2J de contrôler l’infection virale. La déplétion des macrophages
alvéolaires de C57BL/6J abolit sa résistance et le transfert adoptif de macrophages alvéolaires
de C57BL/6J à des souris F1 les rend résistantes à l’infection. Les lésions exacerbées et la
tempête cytokinique observée chez DBA/2J dans les dernières phases de l’infection ne
seraient que la conséquence de l’incapacité de cette lignée de souris à contrôler
l’amplification virale dans les premiers temps de l’infection.
Par ailleurs, nos résultats ont également montré que différents types cellulaires de l’arbre
respiratoire de DBA/2J étaient plus permissifs à l’infection in vitro, ce qui pourrait en partie
être lié à une plus grande expression de récepteurs de type α2,3 en surface de ces cellules mais
aussi également à une réponse interféron inefficace.
159
Enfin, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’effet de la déficience en facteur C5 du
complément sur la sensibilité des souris DBA/2J à l’infection par le virus influenza dans nos
conditions expérimentales.
La suite logique de notre travail semble être l’étude moléculaire de la cascade intracellulaire
d’activation de la réponse interféron dans les macrophages alvéolaires de DBA/2J de façon à
identifier le ou les facteur(s) limitant(s). En parallèle, l’influence possible du virus sur cette
« réactivité moindre » chez DBA/2J devrait également être examinée, notamment par analyse
de l’expression de la protéine NS1 du virus, le principal effecteur viral dans les phénomènes
d’ « interférence inverse » et de « shut off » des fonctions cellulaires.
Des expériences de complémentation au cours desquelles la réponse interféron des souris
DBA/2J serait restaurée permettraient de démontrer de façon irréfutable le rôle central joué
par cette déficience dans la sensibilité extrême de cette lignée murine au virus influenza. Par
ailleurs, au vu de la grande diversité des mécanismes impliqués dans la pathogénie des
pneumonies à virus influenza en fonction de la souche infectante, il serait intéressant de
reproduire les expériences mises en œuvre ici de manière à déterminer si les conclusions que
nous en avons tirées sont applicables à tous les virus influenza A ou seulement à certaines
souches.
Il serait aussi intéressant d’étudier le phénotype des macrophages alvéolaires provenant des
personnes issues de groupes et populations historiquement connus comme plus sensibles à
l’infection par le virus influenza A. Il est en effet envisageable que cette sensibilité accrue soit
également liée à une réponse moins efficace de leurs macrophages alvéolaires en termes de
production d’interférons de type I notamment suite à l’infection virale. Les populations
originaires des Iles de la Polynésie, dont les îles Samoa, seraient des groupes cibles pour
mener ce type d’études. De la même façon, au sein de la population générale, il paraît
160
essentiel d’étudier le lien possible entre le phénotype des macrophages alvéolaires et la
sévérité des symptômes associés à l’infection par le virus influenza A.
On pourrait également imaginer que ce travail puisse signifier le début d’un nouveau champ
de recherche pharmacologique visant à augmenter ou améliorer la réponse interféron des
macrophages alvéolaires des individus particulièrement sensibles au virus influenza A (voire
d’autres virus). La protection conférée grâce à la « pré-activation » des macrophages
alvéolaires par exposition à des probiotiques, démontrée dans d’autres études, confirme que
ce type cellulaire est essentiel à la résistance contre l’infection par le virus influenza A, mais
aussi que cet effet protecteur peut être modulé et optimisé par des stimuli exogènes.
Enfin, si ce mécanisme s’applique à d’autres espèces, il serait possible de sélectionner des
lignées d’animaux domestiques (porc, cheval voire poulet) plus résistantes au virus influenza,
en relation avec la réactivité de leurs macrophages alvéolaires. Cette sélection serait effectuée
suite à une analyse des macrophages alvéolaires récoltés et phénotypés systématiquement
avec nos conditions expérimentales. L’objectif serait d’améliorer le degré de résistance à
l’infection de la descendance.
161
5 BIBLIOGRAPHIE
AFILALO M., STERN E., OUGHTON M. Evaluation and management of seasonal
influenza in the emergency department. Emergency medicine clinics of North America, 2012,
30, 271-305, viii.
AKARSU H., BURMEISTER W.P., PETOSA C., PETIT I., MULLER C.W., RUIGROK
R.W., BAUDIN F. Crystal structure of the M1 protein-binding domain of the influenza A
virus nuclear export protein (NEP/NS2). The EMBO journal, 2003, 22, 4646-4655.
ALBERTS R., SRIVASTAVA B., WU H., VIEGAS N., GEFFERS R., KLAWONN F.,
NOVOSELOVA N., DO VALLE T.Z., PANTHIER J.J., SCHUGHART K. Gene expression
changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after
influenza A infection. Microbes and infection / Institut Pasteur, 2010, 12, 309-318.
ALDRIDGE J.R., JR., MOSELEY C.E., BOLTZ D.A., NEGOVETICH N.J., REYNOLDS
C., FRANKS J., BROWN S.A., DOHERTY P.C., WEBSTER R.G., THOMAS P.G.
TNF/iNOS-producing dendritic cells are the necessary evil of lethal influenza virus infection.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106,
5306-5311.
ALEXOPOULOU L., HOLT A.C., MEDZHITOV R., FLAVELL R.A. Recognition of
double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature, 2001,
413, 732-738.
162
ALSENZ J., AVILA D., HUEMER H.P., ESPARZA I., BECHERER J.D., KINOSHITA T.,
WANG Y., OPPERMANN S., LAMBRIS J.D. Phylogeny of the third component of
complement, C3: analysis of the conservation of human CR1, CR2, H, and B binding sites,
concanavalin A binding sites, and thiolester bond in the C3 from different species. Dev Comp
Immunol, 1992, 16, 63-76.
ARANKALLE V.A., LOLE K.S., ARYA R.P., TRIPATHY A.S., RAMDASI A.Y.,
CHADHA M.S., SANGLE S.A., KADAM D.B. Role of host immune response and viral load
in the differential outcome of pandemic H1N1 (2009) influenza virus infection in Indian
patients. PloS one, 2010, 5.
ASHMAN R.B., PAPADIMITRIOU J.M., FULURIJA A., DRYSDALE K.E., FARAH C.S.,
NAIDOO O., GOTJAMANOS T. Role of complement C5 and T lymphocytes in
pathogenesis of disseminated and mucosal candidiasis in susceptible DBA/2 mice. Microbial
pathogenesis, 2003, 34, 103-113.
AYLLON J., GARCIA-SASTRE A. The NS1 protein: a multitasking virulence factor. Curr
Top Microbiol Immunol, 2015, 386, 73-107.
BALHARA J., GOUNNI A.S. The alveolar macrophages in asthma: a double-edged sword.
Mucosal Immunol, 2012, 5, 605-609.
BALTIMORE D. Expression of animal virus genomes. Bacteriological reviews, 1971, 35,
235-241.
163
BARABINO S.M., HUBNER W., JENNY A., MINVIELLE-SEBASTIA L., KELLER W.
The 30-kD subunit of mammalian cleavage and polyadenylation specificity factor and its
yeast homolog are RNA-binding zinc finger proteins. Genes Dev, 1997, 11, 1703-1716.
BELSER J.A., LU X., MAINES T.R., SMITH C., LI Y., DONIS R.O., KATZ J.M.,
TUMPEY T.M. Pathogenesis of avian influenza (H7) virus infection in mice and ferrets:
enhanced virulence of Eurasian H7N7 viruses isolated from humans. Journal of virology,
2007, 81, 11139-11147.
BERGSBAKEN T., FINK S.L., COOKSON B.T. Pyroptosis: host cell death and
inflammation. Nat Rev Microbiol, 2009, 7, 99-109.
BLACK J.A., WAXMAN S.G. Phenytoin protects central axons in experimental autoimmune
encephalomyelitis. J Neurol Sci, 2008, 274, 57-63.
BLAZEJEWSKA P., KOSCINSKI L., VIEGAS N., ANHLAN D., LUDWIG S.,
SCHUGHART K. Pathogenicity of different PR8 influenza A virus variants in mice is
determined by both viral and host factors. Virology, 2011, 412, 36-45.
BOON A.C., DEBEAUCHAMP J., HOLLMANN A., LUKE J., KOTB M., ROWE S.,
FINKELSTEIN D., NEALE G., LU L., WILLIAMS R.W., WEBBY R.J. Host genetic
variation affects resistance to infection with a highly pathogenic H5N1 influenza A virus in
mice. Journal of virology, 2009, 83, 10417-10426.
164
BOON A.C., WILLIAMS R.W., SINASAC D.S., WEBBY R.J. A novel genetic locus linked
to pro-inflammatory cytokines after virulent H5N1 virus infection in mice. BMC genomics,
2014, 15, 1017.
BOUVIER N.M., LOWEN A.C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and
Transmission. Viruses, 2010, 2, 1530-1563.
BRADLEY P.P., CHRISTENSEN R.D., ROTHSTEIN G. Cellular and extracellular
myeloperoxidase in pyogenic inflammation. Blood, 1982, 60, 618-622.
BRANDES M., KLAUSCHEN F., KUCHEN S., GERMAIN R.N. A systems analysis
identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell, 2013,
154, 197-212.
BRUMMER E., STEVENS D.A. Anticryptococcal activity of macrophages: role of mouse
strain, C5, contact, phagocytosis, and L-arginine. Cellular immunology, 1994, 157, 1-10.
CAREY M.A., BRADBURY J.A., REBOLLOSO Y.D., GRAVES J.P., ZELDIN D.C.,
GERMOLEC D.R. Pharmacologic inhibition of COX-1 and COX-2 in influenza A viral
infection in mice. PloS one, 2010, 5, e11610.
CARROLL M.C. The complement system in regulation of adaptive immunity. Nat Immunol,
2004, 5, 981-986.
165
CASANOVA T., VAN DE PAAR E., DESMECHT D., GARIGLIANY M.M.
Hyporeactivity of Alveolar Macrophages and Higher Respiratory Cell Permissivity
Characterize DBA/2J Mice Infected by Influenza A Virus. Journal of interferon & cytokine
research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine
Research, 2015.
CASSOL E., CASSETTA L., RIZZI C., ALFANO M., POLI G. M1 and M2a polarization of
human monocyte-derived macrophages inhibits HIV-1 replication by distinct mechanisms.
Journal of immunology, 2009, 182, 6237-6246.
COLGAN D.F., MANLEY J.L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.
Genes Dev, 1997, 11, 2755-2766.
COUPER K.N., BLOUNT D.G., RILEY E.M. IL-10: the master regulator of immunity to
infection. Journal of immunology, 2008, 180, 5771-5777.
CRESPO H., BERTOLOTTI L., JUGANARU M., GLARIA I., DE ANDRES D.,
AMORENA B., ROSATI S., REINA R. Small ruminant macrophage polarization may play a
pivotal role on lentiviral infection. Vet Res, 2013, 44, 83.
CRISCI E., MUSSA T., FRAILE L., MONTOYA M. Review: influenza virus in pigs. Mol
Immunol, 2013, 55, 200-211.
CROTTA S., DAVIDSON S., MAHLAKOIV T., DESMET C.J., BUCKWALTER M.R.,
ALBERT M.L., STAEHELI P., WACK A. Type I and type III interferons drive redundant
166
amplification loops to induce a transcriptional signature in influenza-infected airway
epithelia. PLoS pathogens, 2013, 9, e1003773.
CHAKRABARTI A.K., PASRICHA G. An insight into the PB1F2 protein and its
multifunctional role in enhancing the pathogenicity of the influenza A viruses. Virology,
2013, 440, 97-104.
CHAN P.K. Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997.
Clin Infect Dis, 2002, 34 Suppl 2, S58-64.
CHANTURIYA A.N., BASANEZ G., SCHUBERT U., HENKLEIN P., YEWDELL J.W.,
ZIMMERBERG J. PB1-F2, an influenza A virus-encoded proapoptotic mitochondrial
protein, creates variably sized pores in planar lipid membranes. Journal of virology, 2004,
78, 6304-6312.
CHEN W., CALVO P.A., MALIDE D., GIBBS J., SCHUBERT U., BACIK I., BASTA S.,
O'NEILL R., SCHICKLI J., PALESE P., HENKLEIN P., BENNINK J.R., YEWDELL J.W.
A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nature medicine,
2001, 7, 1306-1312.
CHEUNG C.Y., POON L.L., LAU A.S., LUK W., LAU Y.L., SHORTRIDGE K.F.,
GORDON S., GUAN Y., PEIRIS J.S. Induction of proinflammatory cytokines in human
macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human
disease? Lancet, 2002, 360, 1831-1837.
167
DAS K., MA L.C., XIAO R., RADVANSKY B., ARAMINI J., ZHAO L., MARKLUND J.,
KUO R.L., TWU K.Y., ARNOLD E., KRUG R.M., MONTELIONE G.T. Structural basis
for suppression of a host antiviral response by influenza A virus. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105, 13093-13098.
DAVIDSON S., CROTTA S., MCCABE T.M., WACK A. Pathogenic potential of interferon
alphabeta in acute influenza infection. Nat Commun, 2014, 5, 3864.
DAWSON T.C., BECK M.A., KUZIEL W.A., HENDERSON F., MAEDA N. Contrasting
effects of CCR5 and CCR2 deficiency in the pulmonary inflammatory response to influenza
A virus. The American journal of pathology, 2000, 156, 1951-1959.
DE GRAAF M., FOUCHIER R.A. Role of receptor binding specificity in influenza A virus
transmission and pathogenesis. The EMBO journal, 2014, 33, 823-841.
DE JONG M.D., SIMMONS C.P., THANH T.T., HIEN V.M., SMITH G.J., CHAU T.N.,
HOANG D.M., CHAU N.V., KHANH T.H., DONG V.C., QUI P.T., CAM B.V., HA DO Q.,
GUAN Y., PEIRIS J.S., CHINH N.T., HIEN T.T., FARRAR J. Fatal outcome of human
influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia. Nature
medicine, 2006, 12, 1203-1207.
DEMPSEY P.W., ALLISON M.E., AKKARAJU S., GOODNOW C.C., FEARON D.T. C3d
of complement as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. Science,
1996, 271, 348-350.
168
DENGLER L., MAY M., WILK E., BAHGAT M.M., SCHUGHART K. Immunization with
live virus vaccine protects highly susceptible DBA/2J mice from lethal influenza A H1N1
infection. Virology journal, 2012, 9, 212.
DENGLER L., KUHN N., SHIN D.L., HATESUER B., SCHUGHART K., WILK E.
Cellular changes in blood indicate severe respiratory disease during influenza infections in
mice. PloS one, 2014, 9, e103149.
DERMINE M. Testing candidate effectors contributing to resistance to pneumoviruses.
University of Liege: 2013, 160:104-105 p.
DIENZ O., RINCON M. The effects of IL-6 on CD4 T cell responses. Clin Immunol, 2009,
130, 27-33.
DIENZ O., RUD J.G., EATON S.M., LANTHIER P.A., BURG E., DREW A., BUNN J.,
SURATT B.T., HAYNES L., RINCON M. Essential role of IL-6 in protection against H1N1
influenza virus by promoting neutrophil survival in the lung. Mucosal Immunol, 2012, 5,
258-266.
DISCIPIO R.G., SMITH C.A., MULLER-EBERHARD H.J., HUGLI T.E. The activation of
human complement component C5 by a fluid phase C5 convertase. The Journal of biological
chemistry, 1983, 258, 10629-10636.
DIVANGAHI M., KING I.L., PERNET E. Alveolar macrophages and type I IFN in airway
homeostasis and immunity. Trends Immunol, 2015, 36, 307-314.
169
DIXON, D., HERBERT, R.A., SILLS, R.C., BOORMAN, G.A., Lungs, pleura, and
mediastinum. In: R.R. Maronpot, G.A. Boorman, B.W. Gaul (eds), Pathology of the mouse.
Cache River Press: Vienna, 2006; 293-332.
DUNKELBERGER J.R., SONG W.C. Complement and its role in innate and adaptive
immune responses. Cell Res, 2010, 20, 34-50.
EDINGER T.O., POHL M.O., STERTZ S. Entry of influenza A virus: host factors and
antiviral targets. The Journal of general virology, 2014, 95, 263-277.
EGOROV A., BRANDT S., SEREINIG S., ROMANOVA J., FERKO B., KATINGER D.,
GRASSAUER A., ALEXANDROVA G., KATINGER H., MUSTER T. Transfectant
influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells.
Journal of virology, 1998, 72, 6437-6441.
EPELMAN S., LAVINE K.J., RANDOLPH G.J. Origin and functions of tissue
macrophages. Immunity, 2014, 41, 21-35.
ESSERS M.A., OFFNER S., BLANCO-BOSE W.E., WAIBLER Z., KALINKE U.,
DUCHOSAL M.A., TRUMPP A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in
vivo. Nature, 2009, 458, 904-908.
170
FORTES P., BELOSO A., ORTIN J. Influenza virus NS1 protein inhibits pre-mRNA
splicing and blocks mRNA nucleocytoplasmic transport. The EMBO journal, 1994, 13, 704-
712.
FOUCHIER R.A., MUNSTER V., WALLENSTEN A., BESTEBROER T.M., HERFST S.,
SMITH D., RIMMELZWAAN G.F., OLSEN B., OSTERHAUS A.D. Characterization of a
novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls.
Journal of virology, 2005, 79, 2814-2822.
FRANCA M.S., BROWN J.D. Influenza pathobiology and pathogenesis in avian species.
Curr Top Microbiol Immunol, 2014, 385, 221-242.
FUJIMURA T., ESTEBAN R. Cap-snatching mechanism in yeast L-A double-stranded RNA
virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
2011, 108, 17667-17671.
GACK M.U., ALBRECHT R.A., URANO T., INN K.S., HUANG I.C., CARNERO E.,
FARZAN M., INOUE S., JUNG J.U., GARCIA-SASTRE A. Influenza A virus NS1 targets
the ubiquitin ligase TRIM25 to evade recognition by the host viral RNA sensor RIG-I. Cell
Host Microbe, 2009, 5, 439-449.
GARCIA-SASTRE A., EGOROV A., MATASSOV D., BRANDT S., LEVY D.E., DURBIN
J.E., PALESE P., MUSTER T. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in
interferon-deficient systems. Virology, 1998, 252, 324-330.
171
GARCIA-SASTRE A., BIRON C.A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a
lesson in detente. Science, 2006, 312, 879-882.
GARCIA-SASTRE A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza
viruses. Virus research, 2011, 162, 12-18.
GARCIA M.A., GIL J., VENTOSO I., GUERRA S., DOMINGO E., RIVAS C., ESTEBAN
M. Impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action.
Microbiol Mol Biol Rev, 2006, 70, 1032-1060.
GARIGLIANY M.M., HABYARIMANA A., LAMBRECHT B., VAN DE PAAR E.,
CORNET A., VAN DEN BERG T., DESMECHT D. Influenza A strain-dependent
pathogenesis in fatal H1N1 and H5N1 subtype infections of mice. Emerging infectious
diseases, 2010, 16, 595-603.
GARIGLIANY M.M., CORNET A., DESMECHT D. Human/bovine chimeric MxA-like
GTPases reveal a contribution of N-terminal domains to the magnitude of anti-influenza A
activity. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International
Society for Interferon and Cytokine Research, 2012, 32, 326-331.
GINHOUX F., JUNG S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue
homeostasis. Nat Rev Immunol, 2014, 14, 392-404.
172
GLASER L., CONENELLO G., PAULSON J., PALESE P. Effective replication of human
influenza viruses in mice lacking a major alpha2,6 sialyltransferase. Virus research, 2007,
126, 9-18.
GLEZEN W.P. Serious morbidity and mortality associated with influenza epidemics.
Epidemiologic reviews, 1982, 4, 25-44.
GOMEZ-PUERTAS P., ALBO C., PEREZ-PASTRANA E., VIVO A., PORTELA A.
Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding. Journal of
virology, 2000, 74, 11538-11547.
GREGORIADES A. Interaction of influenza M protein with viral lipid and
phosphatidylcholine vesicles. Journal of virology, 1980, 36, 470-479.
GRIFFIN J.A., BASAK S., COMPANS R.W. Effects of hexose starvation and the role of
sialic acid in influenza virus release. Virology, 1983, 125, 324-334.
GRIMM D., STAEHELI P., HUFBAUER M., KOERNER I., MARTINEZ-SOBRIDO L.,
SOLORZANO A., GARCIA-SASTRE A., HALLER O., KOCHS G. Replication fitness
determines high virulence of influenza A virus in mice carrying functional Mx1 resistance
gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
2007, 104, 6806-6811.
GUILLOT L., LE GOFFIC R., BLOCH S., ESCRIOU N., AKIRA S., CHIGNARD M., SI-
TAHAR M. Involvement of toll-like receptor 3 in the immune response of lung epithelial
173
cells to double-stranded RNA and influenza A virus. The Journal of biological chemistry,
2005, 280, 5571-5580.
GUO C.T., TAKAHASHI N., YAGI H., KATO K., TAKAHASHI T., YI S.Q., CHEN Y.,
ITO T., OTSUKI K., KIDA H., KAWAOKA Y., HIDARI K.I., MIYAMOTO D., SUZUKI
T., SUZUKI Y. The quail and chicken intestine have sialyl-galactose sugar chains
responsible for the binding of influenza A viruses to human type receptors. Glycobiology,
2007, 17, 713-724.
HARA K., SHIOTA M., KIDO H., OHTSU Y., KASHIWAGI T., IWAHASHI J., HAMADA
N., MIZOUE K., TSUMURA N., KATO H., TOYODA T. Influenza virus RNA polymerase
PA subunit is a novel serine protease with Ser624 at the active site. Genes Cells, 2001, 6, 87-
97.
HASHIMOTO Y., MOKI T., TAKIZAWA T., SHIRATSUCHI A., NAKANISHI Y.
Evidence for phagocytosis of influenza virus-infected, apoptotic cells by neutrophils and
macrophages in mice. Journal of immunology, 2007, 178, 2448-2457.
HATTA M., HATTA Y., KIM J.H., WATANABE S., SHINYA K., NGUYEN T., LIEN P.S.,
LE Q.M., KAWAOKA Y. Growth of H5N1 influenza A viruses in the upper respiratory
tracts of mice. PLoS pathogens, 2007, 3, 1374-1379.
HAYASHI T., MACDONALD L.A., TAKIMOTO T. Influenza A Virus Protein PA-X
Contributes to Viral Growth and Suppression of the Host Antiviral and Immune Responses.
Journal of virology, 2015, 89, 6442-6452.
174
HAYDEN F.G., FRITZ R., LOBO M.C., ALVORD W., STROBER W., STRAUS S.E.
Local and systemic cytokine responses during experimental human influenza A virus
infection. Relation to symptom formation and host defense. J Clin Invest, 1998, 101, 643-
649.
HENLE W., HENLE G. Studies on host-virus interactions in the chick embryo-influenza
virus system; development of infectivity, hemagglutination, and complement fixation
activities during the first infectious cycle. The Journal of experimental medicine, 1949, 90,
23-37.
HENSLEY S.E., DAS S.R., BAILEY A.L., SCHMIDT L.M., HICKMAN H.D.,
JAYARAMAN A., VISWANATHAN K., RAMAN R., SASISEKHARAN R., BENNINK
J.R., YEWDELL J.W. Hemagglutinin receptor binding avidity drives influenza A virus
antigenic drift. Science, 2009, 326, 734-736.
HERBERT R.A., LEININGER J.R., Nose, larynx and trachea. In: R.R. Maronpot, G.A.
Boorman, B.W. Gaul (eds), Pathology of the mouse. Cache River Press: Vienna, 2006; 293-
332.
HERBOLD W., MAUS R., HAHN I., DING N., SRIVASTAVA M., CHRISTMAN J.W.,
MACK M., REUTERSHAN J., BRILES D.E., PATON J.C., WINTER C., WELTE T.,
MAUS U.A. Importance of CXC chemokine receptor 2 in alveolar neutrophil and exudate
macrophage recruitment in response to pneumococcal lung infection. Infection and immunity,
2010, 78, 2620-2630.
175
HERMESH T., MOLTEDO B., MORAN T.M., LOPEZ C.B. Antiviral instruction of bone
marrow leukocytes during respiratory viral infections. Cell Host Microbe, 2010, 7, 343-353.
HICKS J.T., ENNIS F.A., KIM E., VERBONITZ M. The importance of an intact
complement pathway in recovery from a primary viral infection: influenza in
decomplemented and in C5-deficient mice. Journal of immunology, 1978, 121, 1437-1445.
HOGNER K., WOLFF T., PLESCHKA S., PLOG S., GRUBER A.D., KALINKE U.,
WALMRATH H.D., BODNER J., GATTENLOHNER S., LEWE-SCHLOSSER P.,
MATROSOVICH M., SEEGER W., LOHMEYER J., HEROLD S. Macrophage-expressed
IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus
pneumonia. PLoS pathogens, 2013, 9, e1003188.
HORIMOTO, T., AND Y. KAWAOKA. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses.
Clin Microbiol Rev, 2001, 14:129-49.
HORISBERGER M.A., STAEHELI P., HALLER O. Interferon induces a unique protein in
mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 1983, 80, 1910-1914.
HORNUNG V., ELLEGAST J., KIM S., BRZOZKA K., JUNG A., KATO H., POECK H.,
AKIRA S., CONZELMANN K.K., SCHLEE M., ENDRES S., HARTMANN G. 5'-
Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science, 2006, 314, 994-997.
176
HOVANESSIAN A.G. The double stranded RNA-activated protein kinase induced by
interferon: dsRNA-PK. J Interferon Res, 1989, 9, 641-647.
HUANG T.S., PALESE P., KRYSTAL M. Determination of influenza virus proteins
required for genome replication. Journal of virology, 1990, 64, 5669-5673.
HUBER-LANG M., SARMA J.V., ZETOUNE F.S., RITTIRSCH D., NEFF T.A.,
MCGUIRE S.R., LAMBRIS J.D., WARNER R.L., FLIERL M.A., HOESEL L.M.,
GEBHARD F., YOUNGER J.G., DROUIN S.M., WETSEL R.A., WARD P.A. Generation
of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway. Nature medicine, 2006,
12, 682-687.
HUSSELL T., PENNYCOOK A., OPENSHAW P.J. Inhibition of tumor necrosis factor
reduces the severity of virus-specific lung immunopathology. Eur J Immunol, 2001, 31,
2566-2573.
IBORRA S., SANCHO D. Signalling versatility following self and non-self sensing by
myeloid C-type lectin receptors. Immunobiology, 2015, 220, 175-184.
IBRICEVIC A., PEKOSZ A., WALTER M.J., NEWBY C., BATTAILE J.T., BROWN E.G.,
HOLTZMAN M.J., BRODY S.L. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in
mouse and human airway epithelial cells. Journal of virology, 2006, 80, 7469-7480.
177
ICHINOHE T., LEE H.K., OGURA Y., FLAVELL R., IWASAKI A. Inflammasome
recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of
experimental medicine, 2009, 206, 79-87.
INFLUENZA IN SAMOA: Value of Vaccines. Br Med J, 1919, 2, 499-500.
INGLIS S.C., CARROLL A.R., LAMB R.A., MAHY B.W. Polypeptides specified by the
influenza virus genome I. Evidence for eight distinct gene products specified by fowl plague
virus. Virology, 1976, 74, 489-503.
INGLIS S.C., BARRETT T., BROWN C.M., ALMOND J.W. The smallest genome RNA
segment of influenza virus contains two genes that may overlap. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 1979, 76, 3790-3794.
IRVIN C.G., BATES J.H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.
Respir Res, 2003, 4, 4.
ISAACS A., LINDENMANN J. Virus interference. I. The interferon. Proc R Soc Lond B
Biol Sci, 1957, 147, 258-267.
IWASAKI A., MEDZHITOV R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune
system. Science, 2010, 327, 291-295.
IWASAKI A., PILLAI P.S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol,
2014, 14, 315-328.
178
JAGGER B.W., WISE H.M., KASH J.C., WALTERS K.A., WILLS N.M., XIAO Y.L.,
DUNFEE R.L., SCHWARTZMAN L.M., OZINSKY A., BELL G.L., DALTON R.M., LO
A., EFSTATHIOU S., ATKINS J.F., FIRTH A.E., TAUBENBERGER J.K., DIGARD P. An
overlapping protein-coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host
response. Science, 2012, 337, 199-204.
JANEWAY C.A., JR. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology.
Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1989, 54 Pt 1, 1-13.
JEWELL N.A., VAGHEFI N., MERTZ S.E., AKTER P., PEEBLES R.S., JR., BAKALETZ
L.O., DURBIN R.K., FLANO E., DURBIN J.E. Differential type I interferon induction by
respiratory syncytial virus and influenza a virus in vivo. Journal of virology, 2007, 81, 9790-
9800.
JEWELL N.A., CLINE T., MERTZ S.E., SMIRNOV S.V., FLANO E., SCHINDLER C.,
GRIEVES J.L., DURBIN R.K., KOTENKO S.V., DURBIN J.E. Lambda interferon is the
predominant interferon induced by influenza A virus infection in vivo. Journal of virology,
2010, 84, 11515-11522.
JIAO P., TIAN G., LI Y., DENG G., JIANG Y., LIU C., LIU W., BU Z., KAWAOKA Y.,
CHEN H. A single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of
H5N1 avian influenza viruses in mice. Journal of virology, 2008, 82, 1146-1154.
179
JORDAN W.S., JR., DENNY F.W., JR., BADGER G.F., CURTISS C., DINGLE J.H.,
OSEASOHN R., STEVENS D.A. A study of illness in a group of Cleveland families. XVII.
The occurrence of Asian influenza. American journal of hygiene, 1958, 68, 190-212.
JOSEPH T., MCAULIFFE J., LU B., JIN H., KEMBLE G., SUBBARAO K. Evaluation of
replication and pathogenicity of avian influenza a H7 subtype viruses in a mouse model.
Journal of virology, 2007, 81, 10558-10566.
KAISER L., FRITZ R.S., STRAUS S.E., GUBAREVA L., HAYDEN F.G. Symptom
pathogenesis during acute influenza: interleukin-6 and other cytokine responses. J Med Virol,
2001, 64, 262-268.
KATO H., SATO S., YONEYAMA M., YAMAMOTO M., UEMATSU S., MATSUI K.,
TSUJIMURA T., TAKEDA K., FUJITA T., TAKEUCHI O., AKIRA S. Cell type-specific
involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity, 2005, 23, 19-28.
KATZE M.G., DETJEN B.M., SAFER B., KRUG R.M. Translational control by influenza
virus: suppression of the kinase that phosphorylates the alpha subunit of initiation factor eIF-2
and selective translation of influenza viral mRNAs. Mol Cell Biol, 1986, 6, 1741-1750.
KELETA L., IBRICEVIC A., BOVIN N.V., BRODY S.L., BROWN E.G. Experimental
evolution of human influenza virus H3 hemagglutinin in the mouse lung identifies adaptive
regions in HA1 and HA2. Journal of virology, 2008, 82, 11599-11608.
180
KERTON A., WARDEN P. Review of successful treatment for Helicobacter species in
laboratory mice. Lab Anim, 2006, 40, 115-122.
KHOUFACHE K., LEBOUDER F., MORELLO E., LAURENT F., RIFFAULT S.,
ANDRADE-GORDON P., BOULLIER S., ROUSSET P., VERGNOLLE N., RITEAU B.
Protective role for protease-activated receptor-2 against influenza virus pathogenesis via an
IFN-gamma-dependent pathway. Journal of immunology, 2009, 182, 7795-7802.
KIM H.M., LEE Y.W., LEE K.J., KIM H.S., CHO S.W., VAN ROOIJEN N., GUAN Y.,
SEO S.H. Alveolar macrophages are indispensable for controlling influenza viruses in lungs
of pigs. Journal of virology, 2008, 82, 4265-4274.
KLEPSER M.E. Socioeconomic impact of seasonal (epidemic) influenza and the role of
over-the-counter medicines. Drugs, 2014, 74, 1467-1479.
KOBASA D., JONES S.M., SHINYA K., KASH J.C., COPPS J., EBIHARA H., HATTA Y.,
KIM J.H., HALFMANN P., HATTA M., FELDMANN F., ALIMONTI J.B., FERNANDO
L., LI Y., KATZE M.G., FELDMANN H., KAWAOKA Y. Aberrant innate immune
response in lethal infection of macaques with the 1918 influenza virus. Nature, 2007, 445,
319-323.
KOCHS G., GARCIA-SASTRE A., MARTINEZ-SOBRIDO L. Multiple anti-interferon
actions of the influenza A virus NS1 protein. Journal of virology, 2007, 81, 7011-7021.
181
KONRAD F.M., REUTERSHAN J. CXCR2 in acute lung injury. Mediators of
inflammation, 2012, 2012, 740987.
KOOL J.L., PAVLIN B.I., MUSTO J., DAWAINAVESI A. Influenza surveillance in the
Pacific Island countries and territories during the 2009 pandemic: an observational study.
BMC Infect Dis, 2013, 13, 6.
KOPF M., SCHNEIDER C., NOBS S.P. The development and function of lung-resident
macrophages and dendritic cells. Nat Immunol, 2015, 16, 36-44.
KOSHIBA T. Mitochondrial-mediated antiviral immunity. Biochim Biophys Acta, 2013,
1833, 225-232.
KUBO K., OTSU S., KOMIYA N. Oseltamivir for influenza. Lancet, 2015, 386, 1135.
KUMAGAI Y., TAKEUCHI O., KATO H., KUMAR H., MATSUI K., MORII E., AOZASA
K., KAWAI T., AKIRA S. Alveolar macrophages are the primary interferon-alpha producer
in pulmonary infection with RNA viruses. Immunity, 2007, 27, 240-252.
LA GRUTA N.L., KEDZIERSKA K., STAMBAS J., DOHERTY P.C. A question of self-
preservation: immunopathology in influenza virus infection. Immunology and cell biology,
2007, 85, 85-92.
LAKADAMYALI M., RUST M.J., ZHUANG X. Endocytosis of influenza viruses.
Microbes and infection / Institut Pasteur, 2004, 6, 929-936.
182
LAMB R.A., CHOPPIN P.W. Segment 8 of the influenza virus genome is unique in coding
for two polypeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America, 1979, 76, 4908-4912.
LAMB R.A., LAI C.J., CHOPPIN P.W. Sequences of mRNAs derived from genome RNA
segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1981, 78,
4170-4174.
LAMB R.A., KRUG R.M. Orthomyxoviridae: The viruses and their replication. In Fields
Virology, Knipe D.M., Howley P.M., Martin M.A., Griffin DE, Lamb RA (eds). Lippincott
Williams & Wilkins: Boston, 2001; 1487-1531.
LAMBRECHT B.N., HAMMAD H. Lung dendritic cells in respiratory viral infection and
asthma: from protection to immunopathology. Annu Rev Immunol, 2012, 30, 243-270.
LAMBRIS J.D. The multifunctional role of C3, the third component of complement.
Immunol Today, 1988, 9, 387-393.
LAMBRIS J.D., MAVROIDIS M., PAPPAS J., LAO Z., WANG Y. Phylogeny of the third
complement component, C3, and conservation of C3-ligand interactions. Ann N Y Acad Sci,
1994, 712, 354-357.
183
LI M.L., RAO P., KRUG R.M. The active sites of the influenza cap-dependent endonuclease
are on different polymerase subunits. The EMBO journal, 2001, 20, 2078-2086.
LI S., MIN J.Y., KRUG R.M., SEN G.C. Binding of the influenza A virus NS1 protein to
PKR mediates the inhibition of its activation by either PACT or double-stranded RNA.
Virology, 2006, 349, 13-21.
LIBERATI T.A., TRAMMELL R.A., RANDLE M., BARRETT S., TOTH L.A. Cytokine
and chemokine responses of lung exposed to surrogate viral and bacterial infections.
Comparative medicine, 2013, 63, 114-126.
LINDENMANN J. [Interferon and inverse interference]. Z Haut Geschlechtskr, 1960, 28,
287-309.
LINDENMANN J. Resistance of mice to mouse-adapted influenza A virus. Virology, 1962,
16, 203-204.
LIU Q., CHEN H., HUANG J., CHEN Y., GU M., WANG X., HU S., LIU X., LIU X. A
nonpathogenic duck-origin H9N2 influenza A virus adapts to high pathogenicity in mice.
Arch Virol, 2014, 159, 2243-2252.
LOHMANN-MATTHES M.L., STEINMULLER C., FRANKE-ULLMANN G. Pulmonary
macrophages. Eur Respir J, 1994, 7, 1678-1689.
184
LOWEN A.C., MUBAREKA S., TUMPEY T.M., GARCIA-SASTRE A., PALESE P. The
guinea pig as a transmission model for human influenza viruses. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103, 9988-9992.
LU Y., WAMBACH M., KATZE M.G., KRUG R.M. Binding of the influenza virus NS1
protein to double-stranded RNA inhibits the activation of the protein kinase that
phosphorylates the elF-2 translation initiation factor. Virology, 1995, 214, 222-228.
LUND J.M., ALEXOPOULOU L., SATO A., KAROW M., ADAMS N.C., GALE N.W.,
IWASAKI A., FLAVELL R.A. Recognition of single-stranded RNA viruses by Toll-like
receptor 7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
2004, 101, 5598-5603.
LUO D., DING S.C., VELA A., KOHLWAY A., LINDENBACH B.D., PYLE A.M.
Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell, 2011, 147, 409-422.
LUO G.X., LUYTJES W., ENAMI M., PALESE P. The polyadenylation signal of influenza
virus RNA involves a stretch of uridines followed by the RNA duplex of the panhandle
structure. Journal of virology, 1991, 65, 2861-2867.
MAELFAIT J., ROOSE K., BOGAERT P., SZE M., SAELENS X., PASPARAKIS M.,
CARPENTIER I., VAN LOO G., BEYAERT R. A20 (Tnfaip3) deficiency in myeloid cells
protects against influenza A virus infection. PLoS pathogens, 2012, 8, e1002570.
185
MAHLAKOIV T., RITZ D., MORDSTEIN M., DEDIEGO M.L., ENJUANES L., MULLER
M.A., DROSTEN C., STAEHELI P. Combined action of type I and type III interferon
restricts initial replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus in the lung but
fails to inhibit systemic virus spread. The Journal of general virology, 2012, 93, 2601-2605.
MAHMUTOVIC-PERSSON I., AKBARSHAHI H., BARTLETT N.W., GLANVILLE N.,
JOHNSTON S.L., BRANDELIUS A., ULLER L. Inhaled dsRNA and rhinovirus evoke
neutrophilic exacerbation and lung expression of thymic stromal lymphopoietin in allergic
mice with established experimental asthma. Allergy, 2014, 69, 348-358.
MANICASSAMY B., MANICASSAMY S., BELICHA-VILLANUEVA A., PISANELLI G.,
PULENDRAN B., GARCIA-SASTRE A. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus
infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 2010, 107, 11531-11536.
MANTOVANI A., GARLANDA C., LOCATI M. Macrophage diversity and polarization in
atherosclerosis: a question of balance. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2009, 29, 1419-1423.
MARGINE I., KRAMMER F. Animal models for influenza viruses: implications for
universal vaccine development. Pathogens, 2014, 3, 845-874.
MARKIEWSKI M.M., LAMBRIS J.D. The role of complement in inflammatory diseases
from behind the scenes into the spotlight. The American journal of pathology, 2007, 171,
715-727.
186
MARQUIS J.F., LACOURSE R., RYAN L., NORTH R.J., GROS P. Genetic and functional
characterization of the mouse Trl3 locus in defense against tuberculosis. Journal of
immunology, 2009, 182, 3757-3767.
MARTINEZ F.O., HELMING L., GORDON S. Alternative activation of macrophages: an
immunologic functional perspective. Annu Rev Immunol, 2009, 27, 451-483.
MARTINEZ F.O., GORDON S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time
for reassessment. F1000Prime Rep, 2014, 6, 13.
MASTELLOS D., MORIKIS D., ISAACS S.N., HOLLAND M.C., STREY C.W., LAMBRIS
J.D. Complement: structure, functions, evolution, and viral molecular mimicry. Immunol
Res, 2003, 27, 367-386.
MASUDA H., SUZUKI T., SUGIYAMA Y., HORIIKE G., MURAKAMI K., MIYAMOTO
D., JWA HIDARI K.I., ITO T., KIDA H., KISO M., FUKUNAGA K., OHUCHI M.,
TOYODA T., ISHIHAMA A., KAWAOKA Y., SUZUKI Y. Substitution of amino acid
residue in influenza A virus hemagglutinin affects recognition of sialyl-oligosaccharides
containing N-glycolylneuraminic acid. FEBS Lett, 1999, 464, 71-74.
MCAULEY J.L., ZHANG K., MCCULLERS J.A. The effects of influenza A virus PB1-F2
protein on polymerase activity are strain specific and do not impact pathogenesis. Journal of
virology, 2010, 84, 558-564.
187
MCKINSTRY K.K., STRUTT T.M., KUANG Y., BROWN D.M., SELL S., DUTTON R.W.,
SWAIN S.L. Memory CD4+ T cells protect against influenza through multiple synergizing
mechanisms. J Clin Invest, 2012, 122, 2847-2856.
MCWHIRTER S.M., TENOEVER B.R., MANIATIS T. Connecting mitochondria and innate
immunity. Cell, 2005, 122, 645-647.
MEDZHITOV R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat Rev Immunol, 2001, 1, 135-
145.
MENA I., DE LA LUNA S., ALBO C., MARTIN J., NIETO A., ORTIN J., PORTELA A.
Synthesis of biologically active influenza virus core proteins using a vaccinia virus-T7 RNA
polymerase expression system. The Journal of general virology, 1994, 75 ( Pt 8), 2109-2114.
MILLS C.D., KINCAID K., ALT J.M., HEILMAN M.J., HILL A.M. M-1/M-2 macrophages
and the Th1/Th2 paradigm. Journal of immunology, 2000, 164, 6166-6173.
MIN J.Y., KRUG R.M. The primary function of RNA binding by the influenza A virus NS1
protein in infected cells: Inhibiting the 2'-5' oligo (A) synthetase/RNase L pathway.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103,
7100-7105.
MIN J.Y., LI S., SEN G.C., KRUG R.M. A site on the influenza A virus NS1 protein
mediates both inhibition of PKR activation and temporal regulation of viral RNA synthesis.
Virology, 2007, 363, 236-243.
188
MITCHELL R.N. Inflammation and Repair. Robbins Basic Pathology, Kumar V., Abbas
A.K., Aster J.C. (eds). Elsevier: Philadelphia, 2012; 29-73.
MOREIRA A.P., CAVASSANI K.A., HULLINGER R., ROSADA R.S., FONG D.J.,
MURRAY L., HESSON D.P., HOGABOAM C.M. Serum amyloid P attenuates M2
macrophage activation and protects against fungal spore-induced allergic airway disease. J
Allergy Clin Immunol, 2010, 126, 712-721 e717.
MORENS D.M., TAUBENBERGER J.K., FOLKERS G.K., FAUCI A.S. Pandemic
influenza's 500th anniversary. Clin Infect Dis, 2010, 51, 1442-1444.
MORGAN B.P. Regulation of the complement membrane attack pathway. Crit Rev
Immunol, 1999, 19, 173-198.
MOSSER D.M. Receptors on phagocytic cells involved in microbial recognition. Immunol
Ser, 1994, 60, 99-114.
MULLER-EBERHARD H.J. Molecular organization and function of the complement
system. Annu Rev Biochem, 1988, 57, 321-347.
MUNSTER V.J., DE WIT E., VAN RIEL D., BEYER W.E., RIMMELZWAAN G.F.,
OSTERHAUS A.D., KUIKEN T., FOUCHIER R.A. The molecular basis of the
pathogenicity of the Dutch highly pathogenic human influenza A H7N7 viruses. J Infect Dis,
2007, 196, 258-265.
189
MUNSTER V.J., DE WIT E., VAN DEN BRAND J.M., HERFST S., SCHRAUWEN E.J.,
BESTEBROER T.M., VAN DE VIJVER D., BOUCHER C.A., KOOPMANS M.,
RIMMELZWAAN G.F., KUIKEN T., OSTERHAUS A.D., FOUCHIER R.A. Pathogenesis
and transmission of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza virus in ferrets. Science, 2009,
325, 481-483.
MURRAY C.J., LOPEZ A.D., CHIN B., FEEHAN D., HILL K.H. Estimation of potential
global pandemic influenza mortality on the basis of vital registry data from the 1918-20
pandemic: a quantitative analysis. Lancet, 2006, 368, 2211-2218.
MURRAY P.J., ALLEN J.E., BISWAS S.K., FISHER E.A., GILROY D.W., GOERDT S.,
GORDON S., HAMILTON J.A., IVASHKIV L.B., LAWRENCE T., LOCATI M.,
MANTOVANI A., MARTINEZ F.O., MEGE J.L., MOSSER D.M., NATOLI G., SAEIJ J.P.,
SCHULTZE J.L., SHIREY K.A., SICA A., SUTTLES J., UDALOVA I., VAN
GINDERACHTER J.A., VOGEL S.N., WYNN T.A. Macrophage activation and
polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity, 2014, 41, 14-20.
NAIM H.Y., ROTH M.G. Basis for selective incorporation of glycoproteins into the
influenza virus envelope. Journal of virology, 1993, 67, 4831-4841.
NAKAJIMA K. [The mechanism of antigenic shift and drift of human influenza virus].
Nihon rinsho. Japanese journal of clinical medicine, 2003, 61, 1897-1903.
190
NAKAYAMA Y., MORIYA T., SAKAI F., IKEDA N., SHIOZAKI T., HOSOYA T.,
NAKAGAWA H., MIYAZAKI T. Oral administration of Lactobacillus gasseri SBT2055 is
effective for preventing influenza in mice. Sci Rep, 2014, 4, 4638.
NEDELKO T., KOLLMUS H., KLAWONN F., SPIJKER S., LU L., HESSMAN M.,
ALBERTS R., WILLIAMS R.W., SCHUGHART K. Distinct gene loci control the host
response to influenza H1N1 virus infection in a time-dependent manner. BMC genomics,
2012, 13, 411.
NEMEROFF M.E., BARABINO S.M., LI Y., KELLER W., KRUG R.M. Influenza virus
NS1 protein interacts with the cellular 30 kDa subunit of CPSF and inhibits 3'end formation
of cellular pre-mRNAs. Mol Cell, 1998, 1, 991-1000.
NEUMANN G., CASTRUCCI M.R., KAWAOKA Y. Nuclear import and export of
influenza virus nucleoprotein. Journal of virology, 1997, 71, 9690-9700.
NEUMANN G., HUGHES M.T., KAWAOKA Y. Influenza A virus NS2 protein mediates
vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRM1. The EMBO
journal, 2000, 19, 6751-6758.
NHU Q.M., SHIREY K., TEIJARO J.R., FARBER D.L., NETZEL-ARNETT S., ANTALIS
T.M., FASANO A., VOGEL S.N. Novel signaling interactions between proteinase-activated
receptor 2 and Toll-like receptors in vitro and in vivo. Mucosal Immunol, 2010, 3, 29-39.
191
NILSSON U.R., MULLER-EBERHARD H.J. Deficiency of the fifth component of
complement in mice with an inherited complement defect. The Journal of experimental
medicine, 1967, 125, 1-16.
NING Z.Y., LUO M.Y., QI W.B., YU B., JIAO P.R., LIAO M. Detection of expression of
influenza virus receptors in tissues of BALB/c mice by histochemistry. Veterinary research
communications, 2009, 33, 895-903.
NISHIMURA K., KIM S., ZHANG L., CROSS T.A. The closed state of a H+ channel helical
bundle combining precise orientational and distance restraints from solid state NMR.
Biochemistry, 2002, 41, 13170-13177.
OOI Y.M., COLTEN H.R. Genetic defect in secretion of complement C5 in mice. Nature,
1979, 282, 207-208.
OPITZ B., REJAIBI A., DAUBER B., ECKHARD J., VINZING M., SCHMECK B.,
HIPPENSTIEL S., SUTTORP N., WOLFF T. IFNbeta induction by influenza A virus is
mediated by RIG-I which is regulated by the viral NS1 protein. Cell Microbiol, 2007, 9, 930-
938.
PALESE P., TOBITA K., UEDA M., COMPANS R.W. Characterization of temperature
sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. Virology, 1974, 61, 397-410.
PANG I.K., IWASAKI A. Control of antiviral immunity by pattern recognition and the
microbiome. Immunol Rev, 2012, 245, 209-226.
192
PANG I.K., PILLAI P.S., IWASAKI A. Efficient influenza A virus replication in the
respiratory tract requires signals from TLR7 and RIG-I. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110, 13910-13915.
PARK M.K., NGO V., KWON Y.M., LEE Y.T., YOO S., CHO Y.H., HONG S.M., HWANG
H.S., KO E.J., JUNG Y.J., MOON D.W., JEONG E.J., KIM M.C., LEE Y.N., JANG J.H.,
OH J.S., KIM C.H., KANG S.M. Lactobacillus plantarum DK119 as a probiotic confers
protection against influenza virus by modulating innate immunity. PloS one, 2013, 8, e75368.
PASRICHA G., MISHRA A.C., CHAKRABARTI A.K. Comprehensive global amino acid
sequence analysis of PB1F2 protein of influenza A H5N1 viruses and the influenza A virus
subtypes responsible for the 20th-century pandemics. Influenza Other Respir Viruses, 2013,
7, 497-505.
PATTEN C.C., JR., MYLES M.H., FRANKLIN C.L., LIVINGSTON R.S. Perturbations in
cytokine gene expression after inoculation of C57BL/6 mice with Pasteurella pneumotropica.
Comparative medicine, 2010, 60, 18-24.
PERKINS L.E., SWAYNE D.E. Pathobiology of A/chicken/Hong Kong/220/97 (H5N1)
avian influenza virus in seven gallinaceous species. Vet Pathol, 2001, 38, 149-164.
PERRONE L.A., PLOWDEN J.K., GARCIA-SASTRE A., KATZ J.M., TUMPEY T.M.
H5N1 and 1918 pandemic influenza virus infection results in early and excessive infiltration
of macrophages and neutrophils in the lungs of mice. PLoS pathogens, 2008, 4, e1000115.
193
PERRONE L.A., SZRETTER K.J., KATZ J.M., MIZGERD J.P., TUMPEY T.M. Mice
lacking both TNF and IL-1 receptors exhibit reduced lung inflammation and delay in onset of
death following infection with a highly virulent H5N1 virus. J Infect Dis, 2010, 202, 1161-
1170.
PICHLMAIR A., KANDASAMY K., ALVISI G., MULHERN O., SACCO R., HABJAN M.,
BINDER M., STEFANOVIC A., EBERLE C.A., GONCALVES A., BURCKSTUMMER T.,
MULLER A.C., FAUSTER A., HOLZE C., LINDSTEN K., GOODBOURN S., KOCHS G.,
WEBER F., BARTENSCHLAGER R., BOWIE A.G., BENNETT K.L., COLINGE J.,
SUPERTI-FURGA G. Viral immune modulators perturb the human molecular network by
common and unique strategies. Nature, 2012, 487, 486-490.
PIRHONEN J., SARENEVA T., KURIMOTO M., JULKUNEN I., MATIKAINEN S. Virus
infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-
dependent pathway. Journal of immunology, 1999, 162, 7322-7329.
PREAUD E., DURAND L., MACABEO B., FARKAS N., SLOESEN B., PALACHE A.,
SHUPO F., SAMSON S.I., VACCINES EUROPE INFLUENZA WORKING G. Annual
public health and economic benefits of seasonal influenza vaccination: a European estimate.
BMC public health, 2014, 14, 813.
PREUSSE M., TANTAWY M.A., KLAWONN F., SCHUGHART K., PESSLER F.
Infection- and procedure-dependent effects on pulmonary gene expression in the early phase
of influenza A virus infection in mice. BMC microbiology, 2013, 13, 293.
194
PREUSSE M., SCHUGHART K., WILK E., KLAWONN F., PESSLER F. Hematological
parameters in the early phase of influenza A virus infection in differentially susceptible inbred
mouse strains. BMC Res Notes, 2015, 8, 225.
PUGIN J., RICOU B., STEINBERG K.P., SUTER P.M., MARTIN T.R. Proinflammatory
activity in bronchoalveolar lavage fluids from patients with ARDS, a prominent role for
interleukin-1. Am J Respir Crit Care Med, 1996, 153, 1850-1856.
QIU Y., KRUG R.M. The influenza virus NS1 protein is a poly(A)-binding protein that
inhibits nuclear export of mRNAs containing poly(A). Journal of virology, 1994, 68, 2425-
2432.
RAJSBAUM R., ALBRECHT R.A., WANG M.K., MAHARAJ N.P., VERSTEEG G.A.,
NISTAL-VILLAN E., GARCIA-SASTRE A., GACK M.U. Species-specific inhibition of
RIG-I ubiquitination and IFN induction by the influenza A virus NS1 protein. PLoS
pathogens, 2012, 8, e1003059.
REID A.H., FANNING T.G., HULTIN J.V., TAUBENBERGER J.K. Origin and evolution
of the 1918 "Spanish" influenza virus hemagglutinin gene. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96, 1651-1656.
REYNOLDS H.Y. Bronchoalveolar lavage. Am Rev Respir Dis, 1987, 135, 250-263.
195
RITTER M., GROSS O., KAYS S., RULAND J., NIMMERJAHN F., SAIJO S., TSCHOPP
J., LAYLAND L.E., PRAZERES DA COSTA C. Schistosoma mansoni triggers Dectin-2,
which activates the Nlrp3 inflammasome and alters adaptive immune responses. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107, 20459-
20464.
ROBB N.C., FODOR E. The accumulation of influenza A virus segment 7 spliced mRNAs is
regulated by the NS1 protein. The Journal of general virology, 2012, 93, 113-118.
ROGERS G.N., PAULSON J.C. Receptor determinants of human and animal influenza virus
isolates: differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of
origin. Virology, 1983, 127, 361-373.
RUIGROK R.W., BAUDIN F. Structure of influenza virus ribonucleoprotein particles. II.
Purified RNA-free influenza virus ribonucleoprotein forms structures that are
indistinguishable from the intact influenza virus ribonucleoprotein particles. The Journal of
general virology, 1995, 76 ( Pt 4), 1009-1014.
SALOMON R., HOFFMANN E., WEBSTER R.G. Inhibition of the cytokine response does
not protect against lethal H5N1 influenza infection. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 2007, 104, 12479-12481.
SALVATORE M., BASLER C.F., PARISIEN J.P., HORVATH C.M., BOURMAKINA S.,
ZHENG H., MUSTER T., PALESE P., GARCIA-SASTRE A. Effects of influenza A virus
196
NS1 protein on protein expression: the NS1 protein enhances translation and is not required
for shutoff of host protein synthesis. Journal of virology, 2002, 76, 1206-1212.
SANZ-EZQUERRO J.J., DE LA LUNA S., ORTIN J., NIETO A. Individual expression of
influenza virus PA protein induces degradation of coexpressed proteins. Journal of virology,
1995, 69, 2420-2426.
SANZ-EZQUERRO J.J., FERNANDEZ SANTAREN J., SIERRA T., ARAGON T.,
ORTEGA J., ORTIN J., SMITH G.L., NIETO A. The PA influenza virus polymerase subunit
is a phosphorylated protein. The Journal of general virology, 1998, 79 ( Pt 3), 471-478.
SATO T., ONAI N., YOSHIHARA H., ARAI F., SUDA T., OHTEKI T. Interferon
regulatory factor-2 protects quiescent hematopoietic stem cells from type I interferon-
dependent exhaustion. Nature medicine, 2009, 15, 696-700.
SCHMITZ N., KURRER M., BACHMANN M.F., KOPF M. Interleukin-1 is responsible for
acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection.
Journal of virology, 2005, 79, 6441-6448.
SCHNEIDER C., NOBS S.P., HEER A.K., KURRER M., KLINKE G., VAN ROOIJEN N.,
VOGEL J., KOPF M. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory
failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS pathogens, 2014a,
10, e1004053.
197
SCHNEIDER W.M., CHEVILLOTTE M.D., RICE C.M. Interferon-stimulated genes: a
complex web of host defenses. Annu Rev Immunol, 2014c, 32, 513-545.
SCHOGGINS J.W. Interferon-stimulated genes: roles in viral pathogenesis. Curr Opin
Virol, 2014, 6, 40-46.
SCHULMAN J.L., KILBOURNE E.D. Experimental Transmission of Influenza Virus
Infection in Mice. Ii. Some Factors Affecting the Incidence of Transmitted Infection. The
Journal of experimental medicine, 1963, 118, 267-275.
SCHULZ O., DIEBOLD S.S., CHEN M., NASLUND T.I., NOLTE M.A., ALEXOPOULOU
L., AZUMA Y.T., FLAVELL R.A., LILJESTROM P., REIS E SOUSA C. Toll-like receptor
3 promotes cross-priming to virus-infected cells. Nature, 2005, 433, 887-892.
SEO S.U., KWON H.J., SONG J.H., BYUN Y.H., SEONG B.L., KAWAI T., AKIRA S.,
KWEON M.N. MyD88 signaling is indispensable for primary influenza A virus infection but
dispensable for secondary infection. Journal of virology, 2010, 84, 12713-12722.
SEO S.U., KWON H.J., KO H.J., BYUN Y.H., SEONG B.L., UEMATSU S., AKIRA S.,
KWEON M.N. Type I interferon signaling regulates Ly6C(hi) monocytes and neutrophils
during acute viral pneumonia in mice. PLoS pathogens, 2011, 7, e1001304.
SERBINA N.V., PAMER E.G. Monocyte emigration from bone marrow during bacterial
infection requires signals mediated by chemokine receptor CCR2. Nat Immunol, 2006, 7,
311-317.
198
SETH R.B., SUN L., EA C.K., CHEN Z.J. Identification and characterization of MAVS, a
mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell, 2005,
122, 669-682.
SHANKS G.D., BRUNDAGE J.F. Pacific islands which escaped the 1918-1919 influenza
pandemic and their subsequent mortality experiences. Epidemiol Infect, 2013, 141, 353-356.
SHI Y., WU Y., ZHANG W., QI J., GAO G.F. Enabling the 'host jump': structural
determinants of receptor-binding specificity in influenza A viruses. Nat Rev Microbiol, 2014,
12, 822-831.
SHIMIZU M., YAMAGUCHI M., FUJITA S., UTSUNOMIYA T., YAMAMOTO H.,
KASAI K. Interleukin-17/T-helper 17 cells in an atopic dermatitis mouse model aggravate
orthodontic root resorption in dental pulp. European journal of oral sciences, 2013, 121, 101-
110.
SHINYA K., WATANABE S., ITO T., KASAI N., KAWAOKA Y. Adaptation of an H7N7
equine influenza A virus in mice. The Journal of general virology, 2007, 88, 547-553.
SHIREY K.A., LAI W., PLETNEVA L.M., FINKELMAN F.D., FEOLA D.J., BLANCO
J.C., VOGEL S.N. Agents that increase AAM differentiation blunt RSV-mediated lung
pathology. J Leukoc Biol, 2014, 96, 951-955.
199
SILVERMAN R.H. Viral encounters with 2',5'-oligoadenylate synthetase and RNase L
during the interferon antiviral response. Journal of virology, 2007, 81, 12720-12729.
SPACKMAN E., GELB J., JR., PRESKENIS L.A., LADMAN B.S., POPE C.R., PANTIN-
JACKWOOD M.J., MCKINLEY E.T. The pathogenesis of low pathogenicity H7 avian
influenza viruses in chickens, ducks and turkeys. Virology journal, 2010, 7, 331.
SRIVASTAVA B., BLAZEJEWSKA P., HESSMANN M., BRUDER D., GEFFERS R.,
MAUEL S., GRUBER A.D., SCHUGHART K. Host genetic background strongly influences
the response to influenza a virus infections. PloS one, 2009, 4, e4857.
STAEHELI P., GROB R., MEIER E., SUTCLIFFE J.G., HALLER O. Influenza virus-
susceptible mice carry Mx genes with a large deletion or a nonsense mutation. Mol Cell Biol,
1988, 8, 4518-4523.
STEGMANN T. Membrane fusion mechanisms: the influenza hemagglutinin paradigm and
its implications for intracellular fusion. Traffic, 2000, 1, 598-604.
STETSON D.B., MEDZHITOV R. Type I interferons in host defense. Immunity, 2006, 25,
373-381.
STRUTT T.M., MCKINSTRY K.K., DIBBLE J.P., WINCHELL C., KUANG Y., CURTIS
J.D., HUSTON G., DUTTON R.W., SWAIN S.L. Memory CD4+ T cells induce innate
responses independently of pathogen. Nature medicine, 2010, 16, 558-564, 551p following
564.
200
SUBBARAO E.K., LONDON W., MURPHY B.R. A single amino acid in the PB2 gene of
influenza A virus is a determinant of host range. Journal of virology, 1993, 67, 1761-1764.
SUGIMURA T., TAKAHASHI H., JOUNAI K., OHSHIO K., KANAYAMA M., TAZUMI
K., TANIHATA Y., MIURA Y., FUJIWARA D., YAMAMOTO N. Effects of oral intake of
plamacytoid dendritic cells-stimulative lactic acid bacterial strain on pathogenesis of
influenza-like illnes and immunological response to influenza virus. Br J Nutr, 2015, 115,
727-733.
SUN J., MADAN R., KARP C.L., BRACIALE T.J. Effector T cells control lung
inflammation during acute influenza virus infection by producing IL-10. Nature medicine,
2009, 15, 277-284.
SUNYER J.O., LAMBRIS J.D. Evolution and diversity of the complement system of
poikilothermic vertebrates. Immunol Rev, 1998, 166, 39-57.
SUZUKI T., HORIIKE G., YAMAZAKI Y., KAWABE K., MASUDA H., MIYAMOTO D.,
MATSUDA M., NISHIMURA S.I., YAMAGATA T., ITO T., KIDA H., KAWAOKA Y.,
SUZUKI Y. Swine influenza virus strains recognize sialylsugar chains containing the
molecular species of sialic acid predominantly present in the swine tracheal epithelium.
FEBS Lett, 1997, 404, 192-196.
SUZUKI Y. Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of
influenza viruses. Biol Pharm Bull, 2005, 28, 399-408.
201
SWAYNE D.E. Understanding the complex pathobiology of high pathogenicity avian
influenza viruses in birds. Avian Dis, 2007, 51, 242-249.
SZRETTER K.J., GANGAPPA S., LU X., SMITH C., SHIEH W.J., ZAKI S.R.,
SAMBHARA S., TUMPEY T.M., KATZ J.M. Role of host cytokine responses in the
pathogenesis of avian H5N1 influenza viruses in mice. Journal of virology, 2007, 81, 2736-
2744.
TAKEUCHI O., AKIRA S. Innate immunity to virus infection. Immunol Rev, 2009, 227, 75-
86.
TALON J., HORVATH C.M., POLLEY R., BASLER C.F., MUSTER T., PALESE P.,
GARCIA-SASTRE A. Activation of interferon regulatory factor 3 is inhibited by the
influenza A virus NS1 protein. Journal of virology, 2000, 74, 7989-7996.
TANNE A., MA B., BOUDOU F., TAILLEUX L., BOTELLA H., BADELL E.,
LEVILLAIN F., TAYLOR M.E., DRICKAMER K., NIGOU J., DOBOS K.M., PUZO G.,
VESTWEBER D., WILD M.K., MARCINKO M., SOBIESZCZUK P., STEWART L.,
LEBUS D., GICQUEL B., NEYROLLES O. A murine DC-SIGN homologue contributes to
early host defense against Mycobacterium tuberculosis. The Journal of experimental
medicine, 2009, 206, 2205-2220.
202
TATE M.D., PICKETT D.L., VAN ROOIJEN N., BROOKS A.G., READING P.C. Critical
role of airway macrophages in modulating disease severity during influenza virus infection of
mice. Journal of virology, 2010, 84, 7569-7580.
TAYLOR P.R., MARTINEZ-POMARES L., STACEY M., LIN H.H., BROWN G.D.,
GORDON S. Macrophage receptors and immune recognition. Annu Rev Immunol, 2005, 23,
901-944.
TEIJARO J.R., WALSH K.B., CAHALAN S., FREMGEN D.M., ROBERTS E., SCOTT F.,
MARTINBOROUGH E., PEACH R., OLDSTONE M.B., ROSEN H. Endothelial cells are
central orchestrators of cytokine amplification during influenza virus infection. Cell, 2011,
146, 980-991.
THANGAVEL R.R., BOUVIER N.M. Animal models for influenza virus pathogenesis,
transmission, and immunology. J Immunol Methods, 2014, 410, 60-79.
THOMA-USZYNSKI S., STENGER S., TAKEUCHI O., OCHOA M.T., ENGELE M.,
SIELING P.A., BARNES P.F., ROLLINGHOFF M., BOLCSKEI P.L., WAGNER M.,
AKIRA S., NORGARD M.V., BELISLE J.T., GODOWSKI P.J., BLOOM B.R., MODLIN
R.L. Induction of direct antimicrobial activity through mammalian toll-like receptors.
Science, 2001, 291, 1544-1547.
TISONCIK J.R., KORTH M.J., SIMMONS C.P., FARRAR J., MARTIN T.R., KATZE M.G.
Into the eye of the cytokine storm. Microbiol Mol Biol Rev, 2012, 76, 16-32.
203
TONG S., LI Y., RIVAILLER P., CONRARDY C., CASTILLO D.A., CHEN L.M.,
RECUENCO S., ELLISON J.A., DAVIS C.T., YORK I.A., TURMELLE A.S., MORAN D.,
ROGERS S., SHI M., TAO Y., WEIL M.R., TANG K., ROWE L.A., SAMMONS S., XU X.,
FRACE M., LINDBLADE K.A., COX N.J., ANDERSON L.J., RUPPRECHT C.E., DONIS
R.O. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 2012, 109, 4269-4274.
TONG S., ZHU X., LI Y., SHI M., ZHANG J., BOURGEOIS M., YANG H., CHEN X.,
RECUENCO S., GOMEZ J., CHEN L.M., JOHNSON A., TAO Y., DREYFUS C., YU W.,
MCBRIDE R., CARNEY P.J., GILBERT A.T., CHANG J., GUO Z., DAVIS C.T.,
PAULSON J.C., STEVENS J., RUPPRECHT C.E., HOLMES E.C., WILSON I.A., DONIS
R.O. New world bats harbor diverse influenza A viruses. PLoS pathogens, 2013, 9,
e1003657.
TRAMMELL R.A., TOTH L.A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in
infectious disease research. Comparative medicine, 2011, 61, 492-498.
TRAMMELL R.A., LIBERATI T.A., TOTH L.A. Host genetic background and the innate
inflammatory response of lung to influenza virus. Microbes and infection / Institut Pasteur,
2012, 14, 50-58.
TUMPEY T.M., BASLER C.F., AGUILAR P.V., ZENG H., SOLORZANO A., SWAYNE
D.E., COX N.J., KATZ J.M., TAUBENBERGER J.K., PALESE P., GARCIA-SASTRE A.
Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus. Science,
2005a, 310, 77-80.
204
TUMPEY T.M., GARCIA-SASTRE A., TAUBENBERGER J.K., PALESE P., SWAYNE
D.E., PANTIN-JACKWOOD M.J., SCHULTZ-CHERRY S., SOLORZANO A., VAN
ROOIJEN N., KATZ J.M., BASLER C.F. Pathogenicity of influenza viruses with genes from
the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting
virus replication and mortality in mice. Journal of virology, 2005b, 79, 14933-14944.
TWU K.Y., NOAH D.L., RAO P., KUO R.L., KRUG R.M. The CPSF30 binding site on the
NS1A protein of influenza A virus is a potential antiviral target. Journal of virology, 2006,
80, 3957-3965.
VAN REETH K. Cytokines in the pathogenesis of influenza. Vet Microbiol, 2000, 74, 109-
116.
VAN RIEL D., LEIJTEN L.M., VAN DER EERDEN M., HOOGSTEDEN H.C., BOVEN
L.A., LAMBRECHT B.N., OSTERHAUS A.D., KUIKEN T. Highly pathogenic avian
influenza virus H5N1 infects alveolar macrophages without virus production or excessive
TNF-alpha induction. PLoS pathogens, 2011, 7, e1002099.
VARGHESE J.N., COLMAN P.M. Three-dimensional structure of the neuraminidase of
influenza virus A/Tokyo/3/67 at 2.2 A resolution. J Mol Biol, 1991, 221, 473-486.
VARIN A., MUKHOPADHYAY S., HERBEIN G., GORDON S. Alternative activation of
macrophages by IL-4 impairs phagocytosis of pathogens but potentiates microbial-induced
signalling and cytokine secretion. Blood, 2010, 115, 353-362.
205
WAHLE E., KELLER W. The biochemistry of polyadenylation. Trends Biochem Sci, 1996,
21, 247-250.
WANG L., JIAO Y., CAO Y., LIU G., WANG Y., GU W. Limitation of number of strains
and persistence of false positive loci in QTL mapping using recombinant inbred strains. PloS
one, 2014, 9, e102307.
WANG P., PALESE P., O'NEILL R.E. The NPI-1/NPI-3 (karyopherin alpha) binding site on
the influenza a virus nucleoprotein NP is a nonconventional nuclear localization signal.
Journal of virology, 1997, 71, 1850-1856.
WANG X., LI M., ZHENG H., MUSTER T., PALESE P., BEG A.A., GARCIA-SASTRE A.
Influenza A virus NS1 protein prevents activation of NF-kappaB and induction of alpha/beta
interferon. Journal of virology, 2000, 74, 11566-11573.
WARD C.W., GLEESON P.A., DOPHEIDE T.A. Carbohydrate composition of the
oligosaccharide units of the haemagglutinin from the Hong Kong influenza virus
A/Memphis/102/72. Biochem J, 1980, 189, 649-652.
WEBSTER R.G., YAKHNO M., HINSHAW V.S., BEAN W.J., MURTI K.G. Intestinal
influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks. Virology, 1978, 84,
268-278.
206
WEBSTER R.G., BEAN W.J., GORMAN O.T., CHAMBERS T.M., KAWAOKA Y.
Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev, 1992, 56, 152-179.
WEIS W., BROWN J.H., CUSACK S., PAULSON J.C., SKEHEL J.J., WILEY D.C.
Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid.
Nature, 1988, 333, 426-431.
WEST A.P., SHADEL G.S., GHOSH S. Mitochondria in innate immune responses. Nat Rev
Immunol, 2011, 11, 389-402.
WESTPHALEN K., GUSAROVA G.A., ISLAM M.N., SUBRAMANIAN M., COHEN T.S.,
PRINCE A.S., BHATTACHARYA J. Sessile alveolar macrophages communicate with
alveolar epithelium to modulate immunity. Nature, 2014, 506, 503-506.
WETSEL R.A., FLEISCHER D.T., HAVILAND D.L. Deficiency of the murine fifth
complement component (C5). A 2-base pair gene deletion in a 5'-exon. The Journal of
biological chemistry, 1990, 265, 2435-2440.
WETSEL R.A. Structure, function and cellular expression of complement anaphylatoxin
receptors. Curr Opin Immunol, 1995, 7, 48-53.
WHITTAKER G.R., HELENIUS A. Nuclear import and export of viruses and virus
genomes. Virology, 1998, 246, 1-23.
207
WILSON K.R., NAPPER J.M., DENVIR J., SOLLARS V.E., YU H.D. Defect in early lung
defence against Pseudomonas aeruginosa in DBA/2 mice is associated with acute
inflammatory lung injury and reduced bactericidal activity in naive macrophages.
Microbiology, 2007, 153, 968-979.
World Health Organization: Vaccines against influenza WHO position paper – November
2012. Wkly Epidemiol Rec 2012, 47:461-476.
WRIGHT P.F., NEUMANN G., KAWAOKA Y. Orthomyxoviridae. In: Knipe D.
M.,Howley P. M. (Eds), Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins: Boston, 2007,
1648-1732.
YASUDA J., NAKADA S., KATO A., TOYODA T., ISHIHAMA A. Molecular assembly of
influenza virus: association of the NS2 protein with virion matrix. Virology, 1993, 196, 249-
255.
YE Z.P., PAL R., FOX J.W., WAGNER R.R. Functional and antigenic domains of the
matrix (M1) protein of influenza A virus. Journal of virology, 1987, 61, 239-246.
YONEYAMA M., KIKUCHI M., NATSUKAWA T., SHINOBU N., IMAIZUMI T.,
MIYAGISHI M., TAIRA K., AKIRA S., FUJITA T. The RNA helicase RIG-I has an
essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nat Immunol,
2004, 5, 730-737.
208
ZAMARIN D., GARCIA-SASTRE A., XIAO X., WANG R., PALESE P. Influenza virus
PB1-F2 protein induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1. PLoS
pathogens, 2005, 1, e4.
ZARAKET H., BRIDGES O.A., RUSSELL C.J. The pH of activation of the hemagglutinin
protein regulates H5N1 influenza virus replication and pathogenesis in mice. Journal of
virology, 2013, 87, 4826-4834.
ZELAYA H., TADA A., VIZOSO-PINTO M.G., SALVA S., KANMANI P., AGUERO G.,
ALVAREZ S., KITAZAWA H., VILLENA J. Nasal priming with immunobiotic
Lactobacillus rhamnosus modulates inflammation-coagulation interactions and reduces
influenza virus-associated pulmonary damage. Inflamm Res, 2015, 64, 589-602.
ZHOU R., YAZDI A.S., MENU P., TSCHOPP J. A role for mitochondria in NLRP3
inflammasome activation. Nature, 2011, 469, 221-225.
209
Presses de la Faculté de Médecine vétérinaire de l’Université de Liège
4000 Liège (Belgique)
D/2015/0480/14
ISBN 978-2-87543-064-9