ACADEMIE UNIVERSITAIRE WALLONIE-EUROPE UNIVERSITE DE...

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ACADEMIE UNIVERSITAIRE WALLONIE-EUROPE

UNIVERSITE DE LIEGE

FACULTE DE MEDECINE VETERINAIRE

DEPARTEMENT DE MORPHOLOGIE ET PATHOLOGIE

SERVICE DE PATHOLOGIE SYSTEMIQUE ET AUTOPSIES

CARACTÉRISATION DES FACTEURS IMPLIQUÉS DANS LA

RÉSISTANCE/SENSIBILITÉ À L’INFECTION PAR UN VIRUS INFLUENZA A EN

MODÈLES MURINS MX-NÉGATIFS

CHARACTERIZATION OF HOST FACTORS INVOLVED IN

RESISTANCE/SUSCEPTIBILITY TO ONE INFLUENZA A VIRUS INFECTION IN

MX-NEGATIVE MOUSE MODELS

Tomás CASANOVA BUSTOS

THESE PRESENTEE EN VUE DE L’OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR EN

SCIENCES VETERINAIRES

ANNEE ACADEMIQUE 2015-2016

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Remerciements

Je souhaite tout d’abord remercier les professeurs Daniel Desmecht et Freddy Coignoul pour

m’avoir accueilli au sein du laboratoire de Pathologie de la Faculté de Médecine Vétérinaire

de l’Université de Liège.

Merci à Daniel Desmecht pour m’avoir invité à faire partie de son équipe et donné tous les

moyens nécessaires pour développer cette recherche de la meilleure façon possible.

Merci à mon promoteur et ami Mutien Garigliany pour son aide infinie, sa confiance et son

implication dans le travail. Merci de m’avoir transmis des bases scientifiques solides qui

m’ont ainsi permis de progresser en autonomie et en capacité de travail, je lui en serai

toujours reconnaissant.

Aux enseignants, pour avoir partagé avec moi vos précieuses connaissances en pathologie,

merci Daniel, Mutien, Dominique, Thierry, Sandra et Calixte.

Merci à Nathalie, pour son aide administrative, ses conseils, ses corrections de la langue

française et surtout pour son amitié.

Pour votre aide, disponibilité et nos discussions professionnelles et plus généralement sur la

vie, je remercie à Michaël, Etienne, Gautier, Nidal, Fran, Jessy, Annalisa, Deborah, Jérôme,

Michel, Hoang, Thomas, Nathalie C., Adélite, Hussein, Marie-Pierre, Martin, Els, François,

Tam, Phai, Anne-Sophie et Audrey.

A toute l’équipe, aux membres passés et présents, pour m’avoir fait sentir comme chez moi et

m’avoir montré la « chaleur » de la Belgique, je vous dois beaucoup plus que ces petits

paragraphes, merci !

A maman, papa, Romina, ma famille et mes amis.

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Liste des abréviations

ADN / DNA : acide désoxyribonucléique / desoxyribonucleic acid

ADNc / cDNA : ADN complémentaire / complementary DNA

AMs : alveolar macrophages

ARN / RNA : acide ribonucléique / ribonucleic acid

ARNc / cRNA : ARN complémentaire / complementary RNA

ARNm / mRNA : ARN messager / messenger RNA

BEBM : bronchial epithelial cell basal medium

BSA : bovine serum albumin

CanX : calnexin

CD : cluster of differentiation

CPSF : Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor

CRM1 : Chromosome Maintenance Protein 1

Ct : cycle threshold

DC-HIL : dendritic cell-associated heparan sulfate proteoglycan-integrin ligand

DMEM : Dulbecco’s minimal essential medium

dsRNA : double-stranded RNA

EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay

F1 : first filial generation

FACS : fluorescence activated cell sorting

FBS : fetal bovine serum

GCP-2 : granulocyte chemotactic protein 2

G-CSF : granulocyte-colony stimulating factor

http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=dendritic%20cell%2dassociated%20heparan%20sulfate%20proteoglycan%2dintegrin%20ligand

http://www.biology-online.org/dictionary/First_filial_generation

4

Gpnmb : transmembrane glycoprotein NMB

HA : hémagglutinine / hemagglutinin

Hc : hemolytic complement

HE : hematoxylin and eosin

HEPA : high efficiency particulate air filter

HPAI/LPAI : highly/low pathogenic avian influenza

HTAB : hexadecyltrimethyl ammonium bromide

IFN : interféron / interferon

IFNAR : interferon-alpha/beta receptor

Ig : immunoglobuline

IHC: immunohistochimie

IL : interleukine / interleukin

IP-10 : interferon gamma-induced protein 10

IRF3 : interferon regulatory factor 3

IRF3 : IFN-regulatory factor 3

ISGs : IFN-stimulated genes

JAK : Janus kinase

KC : keratinocyte chemoattractant

MAVS : mitochondrial antiviral signaling protein

MCP-1 : monocyte chemoattractant protein-1

MDA-5 : melanoma differentiation-associated protein 5

MHC : major histocompatibility complex

MIP-1α : macrophage inflammatory protein 1α

MIP-2 : macrophage inflammatory protein 2

MOI : multiplicity of infection

5

MPO : myeloxperoxydase

Mx : myxovirus resistance

NA : neuraminidase

NEP : nuclear export protein

Neu5Ac : N-acetylneuraminic acid

Neu5Gc : N-glycolylneuraminic acid

NF-κB : nuclear factor-kappa b

NK : natural killer

NLRP3 : NOD-like receptor familly, pyrin domain-containing 3

NOD : nucleotide-binding oligomerization domain receptors

NP : nucléoprotéine / nucleoprotein

NS1 : non structural protein 1

OD : optic density

OIE : Organisation mondiale de la santé animale

P32 : virus influenza A/swine/Iowa/4/1976 murinisé

PA : polymerase acidic protein

PAMPs : motifs moléculaires associés aux pathogènes

PAR2 : proteinase-activated receptor 2

PB1 : polymerase basic protein 1

PB2 : polymerase basic protein 2

PBS : phosphate buffered saline

PFU : plaque forming unit

pi : post-infection

PKR : protein kinase R

PRRs : pattern recognition receptors

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QTL : quantitative trait loci

RANTES : regulated on activation, normal T cell expressed and secreted

RIG-I : retinoic acid-inducible gene I

RPMI : Roswell park memorial institute

RT-PCR : reverse transcription – polymerase chain reaction

SA : sialic acid

SD : standard deviation

STAT : signal transducer and activator of transcription

T II P : type II alveolar cells

TCID50 : 50% tissue culture infective dose

TEC : tracheal epithelial cells

TLR : toll-like receptors

TNFα : tumor necrosis factor α

TPCK : tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone

TRIF: TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β

Trl3 : tuberculosis resistance locus 3

UV : ultra violet

WHO : World Health Organization

http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.immunol.21.120601.141126

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Résumé

Le virus influenza A constitue un problème majeur de santé publique. On estime que

chaque année entre 10 et 15% de la population mondiale est infectée par une souche

épidémique saisonnière de virus influenza A. Généralement, le syndrome présenté est bénin et

est caractérisé par un épisode fébrile. Par contre, chez les personnes à risque, le tableau

clinique peut être plus sévère voire fatal et consister en une pneumonie virale souvent

aggravée par des infections bactériennes secondaires. Par ailleurs, les souches pandémiques

présentent généralement des taux de morbidité et de mortalité plus élevés. Chez les animaux,

le virus influenza est responsable de pertes économiques importantes dans les élevages de

porcs et de volailles, par diminution des performances de production et par la mise en œuvre

de programmes de contrôle et de prévention. Des souches spécifiques sont décrites chez le

cheval, les mammifères marins et les oiseaux, dont certaines possèdent un potentiel

zoonotique.

Bien que la souris ne soit pas une hôte naturel du virus, elle est largement utilisée comme

modèle pour étudier la pathogénie de la maladie chez les mammifères. Les souris DBA/2J et

C57BL/6J constituent deux extrêmes en termes de sensibilité/résistance au virus influenza A

parmi les lignées de souris Mx-négatives. Lorsque ces deux lignées de souris ont été infectées

par différentes souches de virus influenza A, la souris DBA/2J s'est systématiquement

montrée beaucoup plus sensible. Plusieurs équipes se sont attelées à l’étude des facteurs

expliquant cette différence par des approches génétiques, ayant eu recours à des Recombinant

Inbred Lines entre ces deux lignées. Ces études ont résulté en de longues listes de gènes-

candidats, dont l’importance relative n’a pas pu être déterminée. Nous avons de notre côté

choisi une approche phénotypique, en disséquant chaque étape de l’infection, de manière à

identifier directement les facteurs liés aux différences de sensibilité entre les lignées. Des

observations préliminaires menées au sein de notre laboratoire suggéraient que soit les voies

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respiratoires de DBA/2J amplifient le virus de façon plus importante, soit les macrophages

alvéolaires de C57BL/6J phagocytent les particules virales et/ou limitent la réplication virale

plus efficacement, soit une conjonction de ces phénomènes. Par ailleurs, l’impact de la

déficience des souris DBA/2J en facteur C5 du complément sur leur sensibilité exacerbée au

virus influenza devait être analysé.

Sur cette base, nous avons étudié la permissivité in vitro de différents types cellulaires de

l’arbre respiratoire des souris DBA/2J et C57BL/6J à l’infection par le virus et l’influence des

récepteurs membranaires de type acides sialiques sur cette permissivité. Cela nous a permis de

montrer que l’amplification des particules virales était plus efficace dans les cellules des voies

respiratoires de DBA/2J, en corrélation avec une expression accrue de récepteurs au virus en

surface des cellules de cette lignée. Ensuite, nous avons comparé les capacités de phagocytose

des macrophages alvéolaires des deux lignées de souris, ainsi que leur expression de

cytokines et chimiokines après infection, ce qui a mis en évidence des capacités de

phagocytose conservées mais une activité d’expression de cytokines et chimiokines très

diminuée chez les macrophages de DBA/2J. Par ailleurs, nous n’avons pas identifié d’effet de

l’absence de facteur C5 du complément sur la sensibilité des souris DBA/2J au virus influenza

A. Enfin, nos expériences de déplétion et de transfert adoptif des macrophages alvéolaires ont

clairement démontré le rôle central joué par les macrophages alvéolaires, et notamment leur

taux d’expression des interférons de type I, sur la résistance des souris à l’infection par le

virus influenza.

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Summary

Influenza A virus represents a major threat to public health. It is estimated that about 10 to

15% of the global population is annually infected by a seasonal influenza A strain. In most

cases, symptoms are mild and characterized by transient fever. But in high-risk patients the

clinical picture can be much more severe or even lethal and consists of a viral pneumonia

often followed by bacterial superinfection. Besides, pandemic strains of the virus are

generally associated with higher levels of morbidity and mortality. In animals, influenza virus

is responsible for significant economic losses in pig and poultry sectors, due to decreased

performance in production and to the cost of prevention and control plans. Specific influenza

strains have been described in horses, marine mammals and birds, some of which are

potentially zoonotic.

Although mouse is not a natural host for the virus, it has been widely used as a model to study

the pathogenesis of influenza pneumonia in mammals. DBA/2J and C57BL/6J laboratory

mice are extremes in terms of susceptibility and resistance, respectively, to influenza A virus

infection among Mx-negative inbred lines. After infection by a series of influenza A virus

strains, DBA/2J mouse was systematically much more susceptible. Several research teams

specifically addressed the question of the factors involved in such differences in susceptibility

using genetic methods based on recombinant inbred lines between the two parental mouse

strains. These studies resulted in large lists of candidate genes whose individual contribution

has not been confirmed so far. We chose a phenotypic approach, aiming at analyzing every

single step of the infection process, to put the finger on the factors associated to susceptibility

or resistance. Preliminary observations in the laboratory suggested that either DBA/2J airways

are more permissive to the virus or alveolar macrophages of this mouse line are inefficient in

terms of phagocytosis and/or control of the viral infection, or a mix of these two mechanisms.

10

Beside this, the role played by the absence of C5 complement factor in DBA/2J on the

increased susceptibility of this mouse strain to influenza infection remains to be determined.

To answer these questions, we assessed the in vitro permissivity to influenza of several cell

types from the airways of DBA/2J and C57BL/6J and the impact of the relative amounts of

sialic acid receptors on cells from both mouse strains. We observed that the infection of

respiratory cells from the susceptible DBA/2J mice resulted in higher viral titers, together

with an increased expression of viral receptors on cells from this mouse strain. Next, we

compared the phagocytic activity of alveolar macrophages from both mouse lines and the

expression of cytokines and chemokines by this cell type upon infection. It appeared that

alveolar macrophages from DBA/2J were not deficient in terms of phagocytosis but showed a

dramatically lower expression of cytokines and chemokines when infected by the virus

compared to those from C5BL/6J mice. Besides, we showed that the absence of C5

complement factor in DBA/2J mice was not responsible for its high susceptibility to influenza

A virus. Finally, experiments of depletion and adoptive transfer of alveolar macrophages

allowed us to conclude to the critical role played by this cell type in the resistance to influenza

A virus, at least in part thanks to its ability to produce type I interferons.

11

Table de matières

Remerciements……………………………………………………………………………….. 2

Liste des abréviations………………………………………………………………………… 3

Résumé……………………………………………………………………………………….. 7

Summary……………………………………………………………………………………….8

Table des matières…………………………………………………………………………… 11

1 INTRODUCTION ............................................................................................................ 13

1.1 Le virus influenza A .................................................................................................. 13

1.1.1 Classification .......................................................................................................... 13

1.1.2 Structure virale ....................................................................................................... 13

1.1.3 Les protéines du virus influenza ............................................................................ 14

1.1.4 Le cycle viral .......................................................................................................... 24

1.1.5 Epidémiologie et pathogénie .................................................................................. 31

1.2 La souris comme modèle d’infection par le virus influenza A .................................. 33

1.2.1 Avantages pratiques ............................................................................................... 33

1.2.2 Limites du modèle murin ....................................................................................... 34

1.2.3 Sensibilité et signes cliniques ................................................................................ 35

1.2.4 Les récepteurs au virus influenza A chez la souris ................................................ 35

1.2.5 Adaptation du virus à la souris ............................................................................... 36

1.2.6 Les souris DBA/2J et C57BL/6J comme extrêmes de sensibilité/résistance au virus

influenza parmi les souches Mx-négatives ........................................................................ 37

1.3 Immunité innée et virus influenza ............................................................................. 44

1.3.1 Mécanismes de détection du virus influenza A ..................................................... 45

1.3.2 Les médiateurs de l’inflammation ......................................................................... 48

1.3.3 Rôle du macrophage alvéolaire .............................................................................. 56

12

1.3.4 Rôle d’autres types cellulaires ............................................................................... 61

1.4 Résultats préliminaires .............................................................................................. 63

1.5 Objectifs..................................................................................................................... 69

2 RESULTATS .................................................................................................................... 71

2.1 Hyporeactivity of alveolar macrophages and higher respiratory cell permissivity

characterize DBA/2J mice infected by influenza A virus ..................................................... 71

2.2 The critical role played by alveolar macrophages in the resistance to influenza

pneumonia is mediated by type I interferons ...................................................................... 115

3 DISCUSSION GENERALE ........................................................................................... 140

4 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ......................................................................... 158

5 BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................... 161

13

1 INTRODUCTION

1.1 Le virus influenza A

1.1.1 Classification

Le virus influenza A est un virus enveloppé, composé d’ARN monocaténaire, segmenté et de

polarité négative ; il fait partie de la famille des Orthomyxoviridae. Dans cette famille, cinq

genres sont décrits : influenza de type A, B, et C, thogotovirus et isavirus (Baltimore, 1971).

On distingue plusieurs sous-types de virus influenza A, selon les propriétés antigéniques de

leur hémagglutinine (HA) et de leur neuraminidase (NA), deux glycoprotéines de l’enveloppe

virale. A ce jour, dix-huit sous-types d’HA et 11 sous-types de NA ont été décrits, avec

plusieurs combinaisons possibles (Webster et al., 1992; Fouchier et al., 2005). Les deux

derniers sous-types d’HA et de NA identifiés à ce jour, correspondant aux souches H17N10 et

H18N11, ont été isolés à partir de chauves-souris au Guatemala (Tong et al., 2012; Tong et

al., 2013).

L’International Committee on Taxonomy of Viruses a défini un format standard pour la

dénomination des souches de virus influenza A : type/espèce animale de laquelle a été isolée

la souche virale (sauf si isolé chez l’homme)/lieu d’isolement/année/numéro de la souche

(sous-type). Par exemple, l’isolat 15 d’une souche de sous-type H1N1 isolée d’un porc en

Iowa en 1930 est désigné « A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1) ».

1.1.2 Structure virale

Les virus influenza de type A possèdent huit segments d’ARN génomique, codant chacun

pour une ou deux (jusqu’à quatre potentiellement pour le segment 7) protéines/peptides

(Wright et al., 2007). Les protéines du virus sont l’hémagglutinine (HA), la neuraminidase

14

(NA), les protéines de la matrice M1 et M2, la protéine non structurale (NS1), la protéine

d’export nucléaire (NEP, anciennement appelée NS2), la nucléoprotéine (NP) et les trois

composants de la polymérase virale, PB1 (polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) et

PA (polymerase acidic) (Webster et al., 1992). Pour certains sous-types, le segment

génomique 2 (PB1) code pour une seconde protéine, appelée PB1-F2 (Chen et al., 2001). Les

protéines M2, le peptide M3 (pour certaines souches, le peptide M4), ainsi que la protéine

NEP sont générés par « splicing » (épissage) des ARN messagers de M1 et NS1,

respectivement (Inglis et al., 1979; Lamb et Choppin, 1979; Lamb et al., 1981; Robb et

Fodor, 2012). La PB1-F2 est transcrite au départ d’un cadre de lecture alternatif du gène PB1

(Chen et al., 2001). L’enveloppe virale est composée d’une membrane lipidique provenant de

la cellule de l’hôte et comprend trois types de protéines de surface, HA, NA et M2, un canal à

ions. Les proportions de HA et NA vont respectivement de 4:1 à 5:1 et on compte environ dix

protéines M2 par 100 HA (Wright et al., 2007). La protéine M1 est la plus abondante (3000

par virion). Le complexe « ribonucléoprotéine » (RNP) est composé de l’ARN génomique et

de la polymérase virale (30 à 60 unités par virion) comprenant les sous-unités PB1, PB2 et

PA, ainsi que de la NP (Inglis et al., 1976; Wright et al., 2007). Figure 2(A)-Tableau 1

1.1.3 Les protéines du virus influenza

Les protéines du virus influenza A peuvent être classées selon leur localisation dans le virion

en protéines externes et internes. L’HA, NA et le canal ionique M2 sont les protéines externes

incrustées dans l’enveloppe du virus provenant de la membrane plasmique (figure 2), elles

sont synthétisées dans les ribosomes liés au réticulum endoplasmique et insérées dans la

membrane via l’appareil de Golgi. Les protéines internes sont synthétisées dans les ribosomes

libres du cytoplasme, ce sont : NP, les polymérases, NS1, M1 et NEP. Les principales

fonctions des protéines du virus sont décrites dans le tableau 1. Ci-dessous, nous détaillons

15

brièvement les protéines du virus influenza A et leurs fonctions, en insistant sur les protéines

virales impliquées dans l’inhibition de la réponse immunitaire et dans l’induction du « shut

off » (extinction) des fonctions cellulaires.

1.1.3.1 L’hémagglutinine

Encodée par le segment 4 du génome viral, l’HA forme des homotrimères dans lesquels

chaque sous-unité a une taille de 74 kDa dans sa conformation HA0 (non clivée). Son nom

vient des propriétés d’agglutination des globules rouges qu’elle confère aux particules de

virus influenza (Henle et Henle, 1949). Ses fonctions principales sont l’attachement à la

cellule-hôte et la fusion de la membrane plasmique cellulaire (endosomale) avec l’enveloppe

virale. L’HA est l’antigène majeur du virus influenza A. Au cours de sa synthèse et du

transport dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi, elle subit une série de

glycosylations (Ward et al., 1980; Naim et Roth, 1993).

1.1.3.2 La neuraminidase

La NA est une protéine tétramérique, présente à la surface du virion et encodée par le segment

6 du génome viral. Elle est exprimée en phase tardive du cycle viral et est, comme l’HA,

glycosylée. La neuraminidase est le deuxième déterminant antigénique (après l’HA) et elle

possède une action enzymatique de type « sialidase » qui permet par clivage des acides

sialiques de la membrane plasmique de l’hôte de libérer les particules virales néoformées. La

neuraminidase est la cible moléculaire des drogues antivirales oseltamivir (Tamiflu, Roche) et

zanamivir (Relenza, GlaxoSmithKline) (Palese et al., 1974; Varghese et Colman, 1991).

16

1.1.3.3 Le canal à protons M2

La protéine M2 est encodée par le segment 7 du génome viral par épissage alternatif du

transcrit de la protéine M1 (Lamb et al., 1981). La protéine M2 possède un poids moléculaire

de 11 kDa (97 résidus) et forme des homotétramères. La protéine M2 forme des canaux à

protons qui assurent l’acidification interne du virion au sein de l’endosome, action

primordiale pour la libération des ribonucléoprotéines de la protéine de matrice M1

(Stegmann, 2000; Nishimura et al., 2002).

1.1.3.4 La protéine de matrice M1

La protéine M1 constitue l’élément le plus abondant du virion. C’est une protéine de 28 kDa

(252 acides aminés), également encodée par le segment 7 du génome viral (Lamb et Krug,

2001). C’est la protéine structurale principale du virus, elle tapisse l’intérieur de l’enveloppe

viral et détermine la forme des virions. La protéine M1 interagit à la fois avec la membrane

lipidique et avec les segments du génome viral et joue à ce titre un rôle crucial durant la phase

d’encapsidation (Gregoriades, 1980; Ye et al., 1987). De plus, l’expression ectopique de la

protéine M1 provenant d’un plasmide recombinant induit la formation des structures

tubulaires et des particules « pseudo-virales », ce qui fait supposer leur rôle central dans le

processus de libération du virion (Gomez-Puertas et al., 2000).

1.1.3.5 La nucléoprotéine NP

La NP est une protéine de 58 kDa (498 acides aminés) encodée par le segment 5 du génome

viral. Cette protéine se lie à l’ARN du virus et est un facteur indispensable à la transcription et

la réplication virale (Huang et al., 1990; Mena et al., 1994). La protéine NP constitue la base

structurelle des ribonucléoprotéines virales et, grâce à la présence de signaux de localisation

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nucléaire, elle permet l’import nucléaire des RNPs entrantes (Ruigrok et Baudin, 1995;

Neumann et al., 1997; Wang et al., 1997).

1.1.3.6 Le complexe polymérase

La polymérase virale est composée de trois sous-unités, les polymérases basiques PB1 et PB2

et la polymérase acide PA. Les trois sous-unités sont indispensables à l’accomplissement du

cycle complet de transcription et réplication du génome viral.

Brièvement, l’activité « polymérase » au sens strict est assurée par la sous-unité PB1, encodée

par le segment 2. PB2 est encodée par le premier segment du génome viral , elle reconnait les

coiffes 5’ m7 Gppp des ARN messagers cellulaires, partie essentielle du phénomène de « cap

snatching » par le virus (Li et al., 2001). La sous-unité polymérase acide (PA) est une

phosphoprotéine encodée par le segment génomique 3, elle appartient à la famille des serines

protéases de type chimiotrypsine. Elle est impliquée dans la dégradation de certaines

protéines et possède également l’activité endonucléase permettant le clivage des ARN

messagers cellulaires 10 à 13 nucléotides en aval de leur coiffe au cours du « cap snatching »

(Sanz-Ezquerro et al., 1995; Sanz-Ezquerro et al., 1998; Hara et al., 2001).

1.1.3.7 Protéine PB1-F2

Cette protéine est encodée par le segment 2 du génome viral, dans un cadre de lecture

alternatif (ORF2) du gène PB1 pour certaines souches de virus influenza (Chen et al., 2001).

Cette protéine se localise principalement dans les mitochondries des cellules infectées et peut

induire l’apoptose et la mort cellulaire (Chen et al., 2001). PB1-F2 forme des canaux ioniques

non sélectifs, induit de l’inflammation et stimule la réponse en anticorps ; quand elle est liée à

la PB1, elle augmente son activité polymérase (Mcauley et al., 2010). Bien que PB1-F2

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puisse être considérée comme un facteur de virulence, le mécanisme n’est pas tout à fait

compris. La version active de PB1-F2 est présente chez la plupart des virus d’origine aviaire

mais elle devient tronquée au cours du processus d’adaptation aux hôtes mammifères. Il en

résulte une perte du signal de localisation mitochondriale, ce qui induit une baisse de

virulence (Chakrabarti et Pasricha, 2013; Pasricha et al., 2013).

La capacité de PB1-F2 à induire l’apoptose des cellules de l’hôte est liée la formation de

pores dans la membrane mitochondriale. Cette action est menée grâce à l’hélice alpha de

PB1-F2 qui déstabilise et perméabilise la membrane interne de la mitochondrie, provoquant

ainsi sa fragmentation (Chanturiya et al., 2004; Zamarin et al., 2005). L’exposition de cellules

à une protéine PB1-F2 recombinante induit leur apoptose. A l’opposé, la suppression de

l’expression de PB1-F2 par le virus diminue considérablement sa capacité à induire

l’apoptose dans des cellules immunitaires, probablement les principales cibles de PB1-F2

(Chen et al., 2001). De plus, un lien a été établi entre la mitochondrie et l’activation de

l’immunité innée via activation des interférons de type I par voie des récepteurs

intracellulaires RIG-1, MAVS et NLRP3 (voir point 1.3.1 : Mécanismes de détection du

virus). Ainsi, PB1-F2 serait impliquée dans l’inhibition de la réponse des IFNs de type I par

suppression des signalisations RIG-1 et NLRP3 (Seth et al., 2005; West et al., 2011; Zhou et

al., 2011; Koshiba, 2013).

1.1.3.8 La protéine PA-X

La protéine PA-X est encodée par le segment 3 du génome viral par un cadre de lecture

alternatif du gène PA (Jagger et al., 2012). Parmi les fonctions décrites pour PA-X figurent la

diminution de la réponse immunitaire et l’induction du « shut off » de la cellule infectée. Des

expériences in vitro ont mis en évidence que PA-X diminuait l’expression des gènes

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cellulaires dont l’expression des ARNm d’IFN-β et de β-actine, qu’elle inhibait l’apoptose et

qu’elle modulait la virulence des virus influenza A (Jagger et al., 2012; Hayashi et al., 2015).

1.1.3.9 La protéine non structurale NS1

NS1 est encodée par le segment 8 du génome viral (Inglis et al., 1979; Lamb et Choppin,

1979). Cette protéine est exprimée dans la cellule infectée, mais pas dans le virion, d’où son

nom. C’est une protéine de 27 kDa et 230 résidus. NS1 possède plusieurs fonctions, dont la

plus importante est l’inhibition de la réponse immunitaire innée (Ayllon et Garcia-Sastre,

2015), mais aussi l’inhibition de l’export nucléaire des ARNm cellulaires par liaison du

facteur CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) (Nemeroff et al., 1998) et la

stimulation de la traduction des ARNm viraux (Salvatore et al., 2002).

La protéine NS1 constitue le principal antagoniste de la réponse immunitaire innée au cours

de l’infection par le virus influenza, notamment par sa capacité à inhiber le système des IFNs

de type I, phénomène qui se passe à différents niveaux. De par l’effet antiviral majeur des

interférons, cette fonction de NS1 est critique pour l’efficacité de la réplication virale. Ainsi,

l’histoire de la protéine NS1 se croise avec celle des interférons. En effet, trois ans seulement

après la découverte des IFNs, Lindenmann (1960) décrit l’ « interférence inverse », qui faisait

référence à la capacité du virus influenza infectant à bloquer la production des IFNs par la

cellule, phénomène principalement médié par la protéine NS1 (Egorov et al., 1998; Garcia-

Sastre et al., 1998).

Les cellules des mammifères ont développé un système défensif sophistiqué, basé

principalement sur la reconnaissance de l’intrusion des agents pathogènes et le déclenchement

de cascades de signalisation visant principalement la production des IFNs de type I. Ces IFNs

sont des cytokines à action autocrine et paracrine, avec pour objectif d’alerter les cellules

adjacentes de la présence d’un pathogène et promouvoir un état antiviral efficace, à travers

20

l’expression de toute une série de gènes stimulés par les interférons (ISG) (Garcia-Sastre,

2011; Schneider et al., 2014c). Ce système non seulement limite la réplication et la

propagation virale, mais va également stimuler la réponse immunitaire adaptative (Iwasaki et

Medzhitov, 2010). Il n’est pas surprenant que les souches de virus influenza aient développé

des moyens de contrôle de la réponse IFN, dont la protéine NS1 est le principal protagoniste

(Ayllon et Garcia-Sastre, 2015). Cet effet, variable selon les souches du virus, est médié par

une action de NS1 à plusieurs niveaux.

Inhibition pré-transcriptionelle : l’activation des IFNs est déclenchée suite à la reconnaissance

de patrons moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) par des détecteurs spécialisés, les

récepteurs PRRs, qui se classent selon leur localisation intracellulaire (voir 1.3.1 Mécanismes

de détection du virus) (Takeuchi et Akira, 2009). RIG-1 (retinoic acid-inductible gene 1) est

un récepteur PRRs cytosolique qui détecte le groupement « 5’-triphosphate » présent à

l’extrémité des ARN non coiffés, groupement absent de la grande majorité des ARN

cellulaires et relativement spécifique des ARN viraux, bien que certains ARN bactériens et

synthétiques puissent également activer cette voie (Yoneyama et al., 2004). Suite à cette

liaison, RIG-1 subit un changement de conformation qui va lui permettre de se lier à

l’adaptateur mitochondrial MAVS (mitochondrial antiviral signaling). Celui-ci va activer un

système de « multi kinase » qui conduit à la translocation nucléaire des facteurs de

transcription IRF3 et NF-κB, lequels, une fois dans le noyau, vont déclencher l’expression des

gènes des IFNs (Mcwhirter et al., 2005). La protéine NS1 est capable de bloquer l’activation

de IRF3 et NF-κB, et donc de provoquer la suppression pré-transcriptionnelle des IFNs (Talon

et al., 2000; Wang et al., 2000). Cette inhibition va se produire tout au début de la voie de

signalisation, la protéine NS1 se liant à RIG-1 et formant un complexe, détectable par co-

immunoprécipitation (Opitz et al., 2007; Pichlmair et al., 2012) mais l’action de NS1 sur la

voie RIG-1 se fait aussi par liaison à des molécules nécessaires à son oligomérisation et son

21

activation par ubiquitination, dont les ligases TRIM25 et Riplet ubiquitin E3 (Gack et al.,

2009; Rajsbaum et al., 2012). Figure 1

Inhibition co- et post-transcriptionnelle : la protéine NS1 de plusieurs souches de virus

influenza A peut aussi supprimer de façon efficace l’expression des gènes cellulaires en

interférant directement avec le processus d’export nucléaire des pré-ARNm de l’hôte. Dans

les cellules eucaryotes, les extrémités 3’ des transcrits sont clivées et polyadénylées suite à la

reconnaissance de la séquence conservée « AAUAAA », près du site de clivage. Le

« Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor » (CPSF) est un complexe protéique,

constitué de quatre sous-unités, qui reconnait la séquence « AAUAAA », se lie à l’ARNm

naissant et va permettre l’addition d’une queue Poly(A) (Wahle et Keller, 1996; Colgan et

Manley, 1997). La protéine NS1 se lie à la sous-unité « CPSF30 » et va inhiber la liaison du

complexe CPSF avec les pré-ARNm et par là-même le clivage et la polyadénylation de ces

derniers (Barabino et al., 1997; Twu et al., 2006; Das et al., 2008). Le blocage du CPSF

entraîne l’inhibition du processus d’export nucléaire des ARNm cellulaires et l’expression des

gènes cellulaires, dont les « gènes stimulés par les interférons » (ISGs) (Fortes et al., 1994;

Qiu et Krug, 1994). Figure 1

Inhibition post-traductionnelle des ISGs : la protéine NS1 est de plus capable de bloquer les

effets antiviraux des certains ISGs par action directe. Les mieux connus sont les effets sur la

protéine kinase R « PKR » et sur l’OAS (2’-5’-oligo(A) synthetase). La PKR est une protéine-

kinase se liant à l’ARN exprimée constitutivement dans une conformation inactive et qui est

activée par changement de conformation suite, entre autres, à la liaison à de l’ARN double

brin (Hovanessian, 1989). En bref, la PKR suite à son activation, va phosphoryler plusieurs

substrats menant à l’activation de plusieurs voies et mécanismes de contrôle de l’infection.

L’activité antivirale la mieux décrite est celle médiée par la phosphorylation par la PKR du

« Facteur Initiateur de la Traduction Eucaryote » (eIF2) qui induit le blocage de la synthèse

22

des protéines dans la cellule par conséquent un « avortement » du cycle viral (Garcia et al.,

2006). Il a été démontré que la protéine virale NS1 était capable de lier à l’extrémité N-

terminale de la PKR et d’empêcher le changement de conformation de PKR nécessaire à son

activation (Li et al., 2006; Min et al., 2007). De son côté, l’OAS est une protéine dont

l’expression est stimulée par les interférons et qui a comme fonction l’activation de l’enzyme

« ARNase L », un puissant inhibiteur du cycle viral de par sa capacité à dégrader l’ARN viral

(Silverman, 2007). Le mécanisme par lequel la protéine NS1 est capable d’inhiber l’OAS et

l’action enzymatique de l’ARNase L n’est pas encore complètement connu et pourrait

impliquer la séquestration des ARN viraux, les rendant ainsi inaccessibles à ces enzymes

(Min et Krug, 2006). Figure 1

23

Figure 1 : Vue générale des principales fonctions de la protéine NS1 du virus influenza A

dans le cytoplasme et noyau cellulaire des cellules infectées. La protéine NS1 est le principal

antagoniste viral des IFNs cellulaires et joue également un rôle critique dans le contrôle viral

de la machinerie d’expression des gènes cellulaires. NS1 inhibe la voie des IFNs au niveau

pré-transcriptionnel el par blocage de la plateforme de détection et de signalisation RIG-1,

mais aussi au niveau post-traductionnel par suppression de l’activation des gènes antiviraux

PKR et OAS. Dans le noyau, la NSI inhibe le processus d’export des ARNm cellulaires,

24

empêchant ainsi l’expression des gènes cellulaires, dont les ISGs (Ayllon et García-Sastre,

2015).

1.1.3.10 La protéine d’export nucléaire NEP (ex NS2)

La NEP est une petite protéine de 14 kDa, constituée de 121 acides aminés, produite par

l’épissage de l’ARNm de la protéine NS1, encodée par le segment génomique 8 du virus

(Inglis et al., 1979; Lamb et Choppin, 1979). Bien que son ancien nom était « protéine non

structurale 2 », elle est en réalité présente dans le virion (Yasuda et al., 1993). Comme son

nouveau nom l’indique, NEP va se lier à l’exportine cellulaire CRM1 (Chromosome

Maintenance Protein 1), permettant ainsi l’export nucléaire des ribonucléoprotéines virales

natives (Neumann et al., 2000; Akarsu et al., 2003).

1.1.4 Le cycle viral

1.1.4.1 Attachement

Pour entamer le cycle réplicatif, le virus influenza A doit adhérer à la surface des cellules de

l’hôte, plus spécifiquement aux acides sialiques terminaux des glycoprotéines des membranes

cellulaires. Ce contact entre le virus et les acides sialiques membranaires cellulaires de l’hôte

se fait au travers de l’hémagglutinine (Weis et al., 1988; Wright et al., 2007). Ces acides

sialiques se trouvent au niveau de l’extrémité des N-glycans, O-glycans et

glycospohingolipides en surface des cellules-cibles (Suzuki, 2005). Il existe plus de 40 types

différents d’acides sialiques dans la nature, mais les principaux sont l’acide 5-N-

acétylneuraminique (Neu5Ac) et l’acide 5-N-glycolylneuraminique (Neu5Gc), qui diffèrent

au niveau du groupe fonctionnel en position C-5 (Masuda et al., 1999). Le Neu5Gc a été

décrit dans la trachée du cheval et du porc, dans l’intestin du canard mais pas dans

l’épithélium des voies respiratoires de l’homme. Les souches équines de virus influenza sont

25

capables de se lier à ce type de récepteur (Suzuki, 2005). Les virus influenza A et B adhérent

essentiellement aux trisaccharides monosialo-lactosamine de types I et II (SAα2-3(6)Galβ1-

3(4)GlcNAcβ1-) sur les glycoprotéines et gangliosides de l’hôte. Différents types de liaison

entre le Neu5Ac et le résidu galactose sous-jacent existent, les deux principaux étant :

« Neu5Ac-α (2,3) Gal » et « Neu5Ac-α (2,6) Gal » (Masuda et al., 1999; Suzuki, 2005). La

capacité de l’HA virale à se lier à un type particulier d’acide sialique détermine en grande

partie la spécificité d’hôte de la souche virale. Ainsi, les hémagglutinines des souches aviaires

et équines reconnaissent principalement les liaisons en α2,3 (prédominantes chez ces

espèces), alors que les souches humaines adhérent plus efficacement aux récepteurs liés en

α2,6 (majoritaires dans l’arbre respiratoire humain) et les souches d’origine porcine sont

capables de lier les deux types de récepteurs, les deux types de liaisons étant exprimées dans

le tractus respiratoire du porc. Cette caractéristique du porc est à l’origine de l’hypothèse du

« mixing vessel », selon laquelle le porc serait l’hôte idéal pour abriter des co-infections entre

des souches de virus influenza aviaires et humaines et favoriser ainsi le réassortiment

génétique entre souches et potentiellement l’apparition de souches hautement pathogènes et

adaptées à l’homme (Rogers et Paulson, 1983; Suzuki et al., 1997; Crisci et al., 2013). Mais il

a été démontré que l’intestin des volailles et des cailles exprimait également massivement les

récepteurs liés en α2,6 et pourrait donc tout à fait jouer le rôle de « mixing vessel »

traditionnellement attribué au porc (Guo et al. (2007). Figure 3

1.1.4.2 Entrée, fusion et décapsidation

Après liaison entre l’hémagglutinine virale et les acides sialiques de l’hôte, le virus entre dans

la cellule par endocytose. Le modèle traditionnellement accepté est celui de l'endocytose

dépendant de la clathrine, mais il a été démontré que le virus pouvait également entrer dans la

cellule par voie caveolae-dépendante, voire même par des voies indépendantes des deux

26

précédentes ou par macropinocytose (Lakadamyali et al., 2004). Dans le compartiment

endosomal, la diminution du pH induit un changement conformationnel de HA et la fusion de

la membrane virale avec la membrane endosomale. Un préalable indispensable à l’activation

de HA est le clivage du précurseur HA0 par des protéases cellulaires en deux sous-unités,

HA1 et HA2. L’activation concerne surtout la sous-unité HA2 qui subit un changement de

conformation, permettant l’exposition du peptide de fusion et l’interaction avec la membrane

de l’endosome (Stegmann, 2000). Parallèlement, le canal à protons M2 permet l'acidification

interne de la particule virale et la séparation des ribonucléoprotéines virales (vRNPs) de la

protéine de matrice 1 (M1) à laquelle elles sont liées. Les vRNPs, parvenues ainsi dans le

cytoplasme, rejoignent ensuite le noyau cellulaire (Whittaker et Helenius, 1998). Figure 2(B)

1.1.4.3 Import nucléaire des ribonucléoprotéines virales

Les virus influenza constituent une exception parmi les virus ARN puisque toutes les étapes

de synthèse de leur ARN (transcription et réplication) se passent dans le noyau cellulaire.

Deux types d’ARN de polarité positive sont produits à partir de l'ARN génomique de polarité

négative : les ARN messagers (ARNm) et les ARN complémentaires (ARNc), ces derniers

étant des copies positives des segments génomiques viraux, servant à leur tour de matrice

pour la production de nouveaux segments génomiques par la polymérase virale (Luo et al.,

1991). Le processus de transcription en ARNm nécessite une amorce, sous la forme de

l'extrémité 5' d'un ARNm cellulaire, que la polymérase virale obtient par liaison de la coiffe et

clivage d’un ARNm cellulaire, 10 à 13 nucléotides en aval de cette coiffe, selon un processus

appelé « cap-snatching » (Fujimura et Esteban, 2011). C'est par élongation de cette amorce

que la polymérase virale transcrit un ARNm viral. Les ARN messagers sont ensuite exportés

dans le cytoplasme où ils sont traduits en protéines virales. Les protéines HA, NA et M2

rejoignent la membrane plasmique cellulaire et les protéines NP, PB1, PB2, PA, M1, NS1 et

27

NEP sont transportées dans le noyau. Dans le noyau, les ribonucléoprotéines natives se

forment par assemblage de nucléoprotéines, de l'ARN génomique viral et des protéines du

« complexe polymérase ». Les vRNPs natives sont exportées du noyau grâce aux protéines

M1 et NEP. Elles rejoignent la surface de la cellule où, grâce à la protéine M1, se produit le

bourgeonnement des nouvelles particules virales au cours duquel elles acquièrent leur

enveloppe (Wright et al., 2007).

Ensuite, l’action enzymatique de la neuraminidase va permettre la libération des virions

attachés aux acides sialiques des glycoprotéines membranaires par leur hémagglutinines.

Cette hydrolyse catalyse le clivage des jonctions entre les acides sialiques terminaux et les

résidus de D-galactose ou D-galactosamine sous-jacents. Sans cet effet de la NA, les

particules virales resteraient attachées à la surface des cellules de l’hôte et au mucus du

système respiratoire riche en acide sialique (Palese et al., 1974; Griffin et al., 1983). C’est le

principe d’action de plusieurs molécules anti-influenza comme l’oseltamivir (Kubo et al.,

2015).

28

Figure 2 : Structure du virus influenza A. Les protéines HA, NA et M2 sont insérées au

niveau de l’enveloppe virale. La protéine de matrice 1 (M1) constitue le lien entre l’enveloppe

et les ribonucléoprotéines. Les ribonucléoprotéines sont constituées chacune d’une hélice de

nucléoprotéines, d’un segment génomique viral et du complexe des polymérases (A). Le cycle

réplicatif du virus influenza A (B). (D’après Shi et al. (2014)).

29

Tableau 1. Fonction des principales protéines du virus influenza A.

Segment

génomique

Protéines

encodées

Fonction

1 PB2

Reconnaissance de la coiffe. Appartient au complexe

de transcription/réplication. PB2 se lie à la coiffe des

pré-ARNm de l’hôte.

2 PB1

Activité ARN polymérase essentielle aux activités de

transcription et réplication.

PB1-F2

Augmente la perméabilité de la mitochondrie et

forme des pores. Induit l’apoptose, principalement

des leucocytes.

3 PA

Appartient au complexe transcription-réplication.

Activité endonucléase nécessaire au « cap-

snatching ».

PA-X

Contribue à la multiplication virale et inhibe la

réponse immunitaire de l’hôte.

4 HA

Médiateur de l’attachement aux acides sialiques et de

l’entrée dans les cellules de l’hôte. Déterminant

majeur de la spécificité d’espèce et du tropisme

cellulaire.

5 NP

Lie l’ARN viral pour former les ribonucléoprotéines.

Impliqué dans la synthèse de l’ARN viral.

6 NA

Activité sialidase permettant la libération des virions

par clivage des résidus acide sialique des cellules de

l’hôte.

7

M1

Export nucléaire des ribonucléoprotéines virales.

Essentielle à la formation des particules virales et à

l’encapsidation.

M2

Activité de canal ionique (protons). Régulation du pH

interne des particules virales dans le compartiment

endosomal.

M3

Non décrite.

8 NS1

Antagoniste de la réponse immunitaire innée.

Inhibition pré- et post-transcriptionnelle et post-

traductionnelle des IFN de type I.

NEP (NS2)

Export nucléaire des ribonucléoprotéines.

30

Figure 3 : Les deux types principaux de liaisons des acides sialiques avec le résidu galactose

sous-jacent en surface des cellules-cibles du virus influenza. A : Dans la liaison α2,3

(majoritaire au niveau digestif dans l’espèce aviaire), l’acide sialique est lié par son carbone 2

avec le carbone en position 3 du galactose. B : Pour la liaison α2,6 (type principal au niveau

de l’arbre respiratoire humain), l’acide sialique est attaché au carbone 6 du galactose par son

carbone en position 2 (Wright et al., 2007).

31

1.1.5 Epidémiologie et pathogénie

L’Organisation Mondiale de la Santé estime qu’entre 5 et 10% des adultes et entre 20 et 30%

des enfants de la population mondiale sont infectés tous les ans par une souche saisonnière de

virus influenza A, dont les principaux sous-types sont H1N1 et H3N2 (Afilalo et al., 2012).

Entre trois et cinq millions de ces cas développent une maladie sévère, qui résulte en la

mortalité d’environ 500.000 personnes annuellement dans le monde (WHO,

www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/). L’impact financier annuel des grippes

saisonnières s’élève selon les estimations à entre 6 et 14 milliards d’euros pour l’Europe et

jusqu’à 87 milliards de dollars pour les Etats-Unis. Ces coûts reprennent les frais de

vaccination, d’hospitalisations, des consultations médicales et traitements médicamenteux

(Klepser, 2014; Preaud et al., 2014). Les personnes infectées par des souches saisonnières de

virus influenza A présentent généralement un tableau clinique bénin souvent limité à des

épisodes fébriles légers à modérés. L’infection peut être beaucoup plus sévère chez les

nouveau-nés, les personnes âgées, les femmes enceintes et les personnes immunodéprimées,

et être caractérisée par une pneumonie virale le plus souvent associée à des surinfections

bactériennes. Ces infections bactériennes secondaires sont la complication la plus commune

de la grippe saisonnière (Afilalo et al., 2012). Les souches pandémiques peuvent induire des

taux de morbidité et mortalité beaucoup plus élevés comme lors de la pandémie de 1918, « la

grippe espagnole » responsable du décès d’environ 50 millions de personnes. Les lésions

touchent alors l’ensemble de l’arbre respiratoire et du tissu pulmonaire, menant à un

syndrome de détresse respiratoire aigüe (Jordan et al., 1958; Glezen, 1982; Reid et al., 1999).

Les caractéristiques génétiques du virus influenza (génome segmenté d’ARN simple brin

négatif) font de ce virus une entité très variable, avec la capacité d’évoluer rapidement par

accumulation des substitutions au niveau génétique et protéique (« antigenic drift »), mais

aussi par des réassortiments des segments génomiques en cas de co-infection d’un hôte

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/

32

(cellules) par deux virus différents (« antigenic shift ») (Nakajima, 2003). Historiquement, ce

sont ces deux phénomènes, et principalement l’antigenic shift, qui ont permis l’apparition de

nouvelles souches virales avec des propriétés antigéniques et de virulence particulières,

responsables des pandémies qui se sont succédées dans la population humaine comme celles

de 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2), 1977 et 2009 (H1N1) (Webster et al., 1992).

Des souches spécifiques ont été décrites pour plusieurs espèces, dont l’être humain, les

oiseaux, le porc, le cheval, le chien et même chez les mammifères marins (Webster et al.,

1992).

Les oiseaux aquatiques sauvages de l'ordre des ansériformes (canards, cygnes, oies) et des

charadriiformes (mouettes) représentent le réservoir naturel des virus influenza A. Bien que

l’infection soit généralement asymptomatique, une abondante excrétion virale par voie fécale

est présente, raison pour laquelle le virus influenza A a été isolé à partir d’échantillons d’eau

provenant de lacs où des oiseaux migratoires ont niché (Webster et al., 1978). Chez le canard,

le tropisme est principalement digestif, alors que chez les oiseaux domestiques (animaux de

production) il est plutôt respiratoire voire même systémique pour les souches virales

hautement pathogènes (Spackman et al., 2010). Les virus influenza aviaires sont classés en

faiblement pathogènes ou « LPAI » (low pathogenic avian influenza) et hautement

pathogènes ou « HPAI » (highly pathogenic avian influenza) selon le degré de sévérité de la

maladie produite chez le poulet dans des conditions standardisées (WHO 2012). Il a été

démontré que la séquence du site de clivage de l’HA était déterminante pour l’acquisition

d’un phénotype hautement pathogène (WHO 2005). Les variantes faiblement pathogènes,

originaires des oiseaux sauvages, sont généralement peu adaptées aux gallinacés et sont

associées à des symptômes variables qui peuvent aller d’infections asymptomatiques à des

maladies graves avec une mortalité parfois élevée (Franca et Brown, 2014). La circulation de

ces virus chez les oiseaux domestiques peut entrainer une adaptation et une réplication plus

33

efficace chez ces oiseaux. Cette adaptation des souches LPAI chez les volailles gallinacées

peut conduire à l’acquisition de mutations menant à l’accumulation d’acides aminés basiques

au niveau du site de clivage de la protéine HA0, ce qui va augmenter la sensibilité de ce site

de clivage à des protéases ubiquistes et par là-même diversifier le tropisme tissulaire du virus.

Ces modifications sont à la base du caractère hautement pathogène (HPAI) acquis par

certaines souches de virus influenza A de sous-types 5 et 7. Ces souches induisent chez les

espèces cibles une maladie fulminante avec dissémination systémique et une grande mortalité

(Perdue et Suarez, 2000 ; Horimoto et al., 2001 ; WHO 2005). Outre le caractère systémique

de l’infection, la pathogénicité des souches HPAI passe également par l’altération de la

barrière endothéliale, menant à de l’œdème, des hémorragies et de la coagulation

intravasculaire disséminée (Perkins et Swayne, 2001; Swayne, 2007). L’infection par des

souches HPAI chez les mammifères, dont l’homme, peut mener à un taux de mortalité

important, comme pour la souche H5N1 par exemple (Chan, 2002).

1.2 La souris comme modèle d’infection par le virus influenza A

1.2.1 Avantages pratiques

La souris est le modèle animal le plus utilisé pour étudier le virus influenza A. De par sa

faible taille, sa facilité d’hébergement et de reproduction, la possibilité d’utiliser des modèles

génétiquement modifiés, la reproductibilité des résultats (souris consanguines), la

disponibilité de réactifs commerciaux espèce-spécifiques et un coût moindre que d’autres

modèles, la souris est un modèle extrêmement pratique. Ces caractéristiques biologiques et

pratiques font de la souris un modèle idéal pour étudier la pathogénie de la maladie et la

réponse immunitaire, l’action de certains médicaments et l’efficacité des vaccins.

34

Il reste néanmoins qu’il s’agit d’un modèle et que toutes les conclusions ne peuvent être

extrapolées à l’homme et aux grands mammifères (Bouvier et Lowen, 2010; Margine et

Krammer, 2014).

1.2.2 Limites du modèle murin

Malgré ses indéniables avantages comme modèle mammifère de la maladie, la souris présente

quelques limitations. A la différence des espèces-cibles du virus, la souris développe des

signes cliniques distincts, elle ne présente pas de secrétions nasales ni de fièvre mais, par

contre, elle développe de l’hypothermie (Carey et al., 2010). Quant à la transmission du virus

influenza A, les recherches chez la souris ont montré des résultats contradictoires, ce qui a

orienté les études relatives à la transmissibilité des souches du virus vers le cochon d’Inde et

le furet (Schulman et Kilbourne, 1963; Lowen et al., 2006; Munster et al., 2009). Il existe

plusieurs exemples de souches de virus influenza A considérées comme peu pathogènes chez

l’homme et qui, chez la souris, induisent une maladie très sévère et plus profonde. Ce manque

de corrélation en termes de virulence pourrait être expliqué par la différence de tropisme

(Belser et al., 2007; Joseph et al., 2007). Il faut également tenir compte du fait que, dans la

plupart des infections expérimentales, l’inoculation intranasale du virus se fait à l’aide d’un

volume ~30-50μl permettant un accès direct du virus aux voies respiratoires profondes et aux

alvéoles pulmonaires de la souris. De plus, le système respiratoire des souris possède moins

de générations bronchiques que celui de l’homme (13-17 vs. 17-21, respectivement) (Irvin et

Bates, 2003). Enfin, l’arbre respiratoire des souris présente une série de particularités

histologiques. Par exemple, les cellules de Clara représentent chez la souris de l’ordre de 50 à

60% des cellules épithéliales de la trachée, alors que pour la plupart des autres espèces de

mammifères on ne les trouve que dans les bronchioles terminales (Herbert et., al 1999). Le

poumon murin possède cinq lobes pulmonaires et son parenchyme représente 18% du

35

poumon total (contre 12% chez l’homme). La proportion des pneumocytes de type I et II est

similaire à celle observée chez l’homme, soit ~ 95 et 5%, respectivement (Dixon et al., 1999).

1.2.3 Sensibilité et signes cliniques

Le degré de sensibilité des souris ne dépend pas seulement de l’adaptation du virus à cette

espèce mais aussi du fond génétique des différentes lignées de souris (Bouvier et Lowen,

2010; Liu et al., 2014). Un exemple marquant est l’effet protecteur du gène Mx1, intact chez

les souris Mus musculus sauvages et quelques lignées de laboratoire, mais dont l’expression

est absente chez la plupart des lignées de laboratoire, les rendant par là même beaucoup plus

sensibles à l’infection par le virus influenza (Staeheli et al., 1988; Grimm et al., 2007). Par

ailleurs, parmi les lignées de souris Mx-négatives, certaines se sont montrées particulièrement

sensibles, comme les souris DBA/2J et A/J par exemple, et ce y compris après infection par

des isolats de virus non murinisés (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009). Les signes

cliniques apparaissent généralement vers les jours 2 ou 3 après infection et varient

considérablement entre les différentes lignées de souris, le type de virus et la dose. Les

symptômes sont la léthargie, l’anorexie et la perte de poids vif, les poils hirsutes, la dyspnée

et, finalement, la mortalité. La perte de poids vif est le signe clinique quantitatif le plus précis

pour étudier l’infection et la protection induite par les vaccins par exemple (Thangavel et

Bouvier, 2014).

1.2.4 Les récepteurs au virus influenza A chez la souris

Bien que les deux types de récepteurs soient exprimés dans la plupart des organes chez la

souris (Ning et al., 2007), ce sont les acides sialiques liés en α2,3 qui sont prédominants dans

l’arbre respiratoire. Certaines études tendent même à démontrer la quasi-absence de résidus

36

acides sialiques liés en α2,6 dans l’arbre respiratoire des souris (Ibricevic et al., 2006). En

conséquence, les souches murinisées (adaptées à la souris par passages multiples en

laboratoire) du virus présentent généralement une plus forte affinité pour les récepteurs de

type α2,3 (Ibricevic et al., 2006). L’étude de l’expression des récepteurs acides sialiques liés

en α2,3 ou α2,6 fait appel à des lectines d’origine végétale : la lectine extraite de Sambuccus

nigra (SNA), spécifique des liaisons en α2,6, et la lectine provenant de Maackia amurensis

(MAA), spécifique des liaisons en α2,3 (Ibricevic et al., 2006).

1.2.5 Adaptation du virus à la souris

La souris n’étant pas un hôte naturel du virus, les virus influenza A doivent, dans la plus part

des cas, subir un processus de « murinisation » (adaptation à la souris) par des passages

pulmonaires en série pour parvenir à se multiplier efficacement et devenir virulents. Parmi les

mutations qui apparaissent classiquement au cours du processus de murinisation, on retrouve

des modifications au niveau du site de liaison de l’hémagglutinine à son récepteur. Cette

adaptation reflète la distribution des acides sialiques dans les voies respiratoires des souris, où

les acides sialiques liés en α2,3 prédominent (Ibricevic et al., 2006). Plusieurs études ont par

ailleurs démontré l’importance de la protéine « polymerase basic 2 » (PB2) virale,

principalement pour l’adaptation de virus aviaires à des hôtes mammifères, dont la souris,

chez lesquels ces virus aviaires présentent normalement une réplication restreinte. Après

plusieurs passages d’un virus influenza aviaire dans des cellules de mammifères, un variant

hautement réplicatif est sélectionné, généralement associé à une substitution

glutamatelysine en position 627 de la protéine PB2 (Subbarao et al., 1993). Cette mutation

a également été associée à une exacerbation de la dissémination d’une souche aviaire (H5N1

hautement pathogène) dans les voies respiratoires et poumons des souris (Hatta et al., 2007;

Munster et al., 2007; Shinya et al., 2007). Bien que cette substitution ne soit pas considérée

37

comme un marqueur d’adaptation en tant que tel, elle représente un déterminant de

pathogénicité chez les mammifères. La lysine en position 627 dans PB2 confère au virus

influenza la capacité de se multiplier dans les voies respiratoires des mammifères, c’est-à-dire

à une température d’environ 33ºC, alors qu’un résidu glutamate à la même position se traduit

par une activité optimale de la polymérase à une température supérieure à 37°C, soit celle

rencontrée dans les systèmes digestif et respiratoire des oiseaux (Hatta et al., 2007).

1.2.6 Les souris DBA/2J et C57BL/6J comme extrêmes de sensibilité/résistance au

virus influenza parmi les souches Mx-négatives

Les lignées consanguines DBA/2J et C57BL/6J ont été comparées pour leur sensibilité

respective à toute une série d’agents pathogènes, notamment grâce à la disponibilité de

nombreuses « recombinant inbred lines », dûment caractérisées sur le plan génétique, entre

ces deux lignées. Elles ont ainsi été utilisées comme modèles d’infections bactériennes

(Mycobacterium sp., Helicobacter sp., Pseudomonas sp., etc.), fungiques (dont Candida

albicans notamment) et virales ainsi que pour des maladies auto-immunes et des tumeurs

(Ashman et al., 2003; Kerton et Warden, 2006; Black et Waxman, 2008). De grandes

différences de susceptibilité ont été décrites entre les souris DBA/2J et C57BL/6J lorsqu’elles

ont été infectées par Candida albicans, DBA/2J étant de loin plus sensible. La déficience en

facteur C5 du complément jouerait un rôle majeur dans la sensibilité de DBA/2J à Candida

albicans (Ashman et al., 2003). Un défaut génétique empêche en effet la souris DBA/2J de

produire la protéine Hc (Hemolytic complement) sous sa forme active, ce qui a été associé à

une susceptibilité accrue à certains agents infectieux, dont potentiellement le virus

influenza A (Nilsson et Muller-Eberhard, 1967; Ooi et Colten, 1979; Boon et al., 2009). Par

ailleurs, une activité bactéricide moindre des macrophages alvéolaires de DBA/2J a été

démontrée dans un modèle d’infection par Pseudomonas aeruginosa (Wilson et al., 2007).

38

Le modèle murin a été largement utilisé pour comprendre en détail les facteurs de virulence

de différentes souches de virus influenza A et de sensibilité/résistance des lignées de souris de

laboratoire (Srivastava et al., 2009; Garigliany et al., 2010). Les souris DBA/2J et C57BL/6J

constituent également deux extrêmes en termes de sensibilité et de résistance pour le virus

influenza A. Lorsque différentes lignées de souris ont été infectées par des virus influenza A

murinisés de souches A/Puerto Rico/8/34 (H1N1 ; PR8) ou A/Seal/Massachussetts/1/80

(H7N7), la souris DBA/2J s’est montrée beaucoup plus sensible que C57BL/6J (Srivastava et

al., 2009). Les souris DBA/2J présentaient une perte de poids vif et une chute du taux de

survie rapides et importantes, avec une mortalité intervenant vers le jour 7 après infection.

Dans les mêmes conditions, les souris C57BL/6J ont présenté une perte de poids légère et

transitoire, avec une amélioration clinique dès le septième jour post-infection et un taux de

survie de 100% au terme de l’expérience (14 jours post-infection). Les souris hybrides F1,

résultat du croisement entre DBA/2J et C57BL/6J, ont montré une sensibilité intermédiaire,

avec une perte de poids rapide, mais moins dramatique que celle présentée par DBA/2J, et

une récupération progressive à partir du jour 7, avec un léger retard par rapport à C57BL/6J

(Srivastava et al., 2009). La dose létale 50 pour le virus influenza de souche PR8 pour la

souris DBA/2J était 1000 fois plus faible que celle de C57BL/6J (Srivastava et al., 2009).

Après infection in vivo, les titres viraux pulmonaires analysés par « Focus Forming Assay »

(FFA) et par mesure des concentrations d’ARNm de l’HA virale par PCR en temps réel

étaient entre 80 et 100 fois plus importants chez la souris DBA/2J que pour C57BL/6J, la

différence se marquant dès le deuxième jour post-infection (Srivastava et al., 2009) Les

analyses des coupes histologiques des poumons infectés ont mis en évidence des lésions plus

sévères chez la souris DBA/2J avec des larges zones de consolidation pulmonaire. Pour les

deux lignées de souris, les cellules épithéliales des bronches et bronchioles présentaient de la

dégénérescence hydropique (gonflement et vacuolisation du cytoplasme) et de la nécrose

39

(noyaux pycnotiques et en processus de caryolyse) avec desquamation et présence de

neutrophiles dégénérés dans la lumière des voies respiratoires et alvéoles, mais là encore de

façon beaucoup plus prononcée chez DBA/2J. Par contre, chez C57BL/6J les lésions

pulmonaires étaient caractérisées par une infiltration péri-vasculaire et péri-bronchique de

lymphocytes dès le jour 4 après infection (Srivastava et al., 2009). La présence de

macrophages a été décrite de façon similaire chez les deux lignées de souris entre les jours 2

et 4 après infection. Quand les paramètres hématologiques ont été comparés suite à l’infection

par le virus de souche PR8, la souris DBA/2J présentait une lymphopénie et une

granulocytose caractéristiques par rapport à C57BL/6J, dès le tout début de l’infection, en

corrélation directe avec l’apparition de lésions pulmonaires, ce qui a été utilisé comme

marqueur prédictif de la sévérité de l’infection (Dengler et al., 2014; Preusse et al., 2015).

La mesure des niveaux d’expression des ARNm d’un panel de cytokines/chimiokines par

PCR en temps réel sur les poumons des souris infectées a montré une expression globalement

beaucoup plus importante chez la souris DBA/2J. Ainsi, les ARNm des cytokines IL-1β, IL-5,

IL-6, IL-12 et G-CSF, ainsi que des chimiokines KC, MIP-2, RANTES, MCP-1, entre autres,

présentaient une expression significativement supérieure dans les poumons des souris DBA/2J

(Srivastava et al., 2009). Des résultats similaires ont été obtenus à partir de lavages broncho-

alvéolaires provenant des deux lignées des souris (Srivastava et al., 2009). Tableau 2

Ces données démontrent clairement l’influence du fond génétique dans la différence de

sensibilité au virus influenza A entre les deux lignées de souris. De façon intéressante, quand

DBA/2J et C57BL/6J ont été immunisées par injection intramusculaire avec un variant

murinisée du virus influenza A H1N1 PR8, les titres spécifiques en immunoglobulines G

(IgG) n’ont pas montré de différences entre les deux lignées de souris, ce qui suggère une

immunité adaptative intacte chez DBA/2J (Dengler et al., 2012). De plus, cette immunisation

rendait les souris DBA/2J complètement résistantes à l’infection respiratoire ultérieure par un

40

virus homologue. Des résultats similaires ont été obtenus après infection de souris DBA/2J

préalablement immunisées avec la souche virale H1N1 A/Hamburg/04/2009, toutes les souris

DBA/2J immunisées ayant survécu et ayant seulement présenté une légère perte de poids vif

(Dengler et al., 2012). Ces résultats confirment l’immunocompétence et l’intégrité de

l’immunité acquise chez les souris DBA/2J, ce qui fait de cette lignée un très bon modèle

pour étudier les réponses adaptatives aux vaccins contre les virus influenza A de diverses

origines (Dengler et al., 2012).

Plusieurs équipes se sont par ailleurs attelées à étudier les facteurs qui pourraient expliquer

ces différences de sensibilité entre souches de souris par des approches génétiques en utilisant

des Recombinant Inbred Lines et par analyse des locus de caractères quantitatifs (QTL) (Boon

et al., 2009; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Wang et al., 2014). Plusieurs

familles de gènes ont été proposées pour expliquer les différences de sensibilité, surtout des

gènes liés à l’activation de la réponse immunitaire innée et qui sont exprimés très

différemment entre les souris DBA/2J et C57BL/6J après infection. Chez la souris DBA/2J,

on observe ainsi une surexpression de gènes comme Cxcl11 (Interferon-inducible T-cell alpha

chemoattractant), Il6 (interleukine 6), Cxcl10 (Interferon gamma-induced protein 10) et toute

une série de récepteurs spécifiques de cytokines/chimiokines comme Ccr1, Csf3r, Il1r2 et

Ccr2, dès 24 heures après infection par le virus influenza A (Boon et al., 2009). Ces résultats

semblent corrélés avec la réponse inflammatoire exacerbée, notamment

neutrophilique, observée dans les poumons des souris DBA/2J infectées. En comparaison, on

observe chez la souris C57BL/6J une surexpression des gènes activateurs du cycle cellulaire,

ce qui pourrait être lié à une réparation tissulaire plus rapide et efficace, mais aussi à une

prolifération et infiltration péri-vasculaire et péri-bronchique des lymphocytes dans le tissu

pulmonaire, typique chez cette lignée (Alberts et al., 2010).

http://en.wikipedia.org/wiki/Chemoattractant

41

Le gène Irf7 était fortement exprimé pour les deux lignées de souris et les gènes Ifnb1 et Ifng

l’étaient chez la souris DBA/2J mais pas chez C57BL/6J (Alberts et al., 2010). Par ailleurs,

une différence d’expression du gène α2,6 sialyltransferase (St6galnac4), significativement

supérieure chez DBA/2J, suggérait une plus grande abondance de récepteurs acides sialiques

liés en α2,6 dans les voies respiratoires des souris DBA/2J et donc une permissivité épithéliale

plus grande, mais aussi potentiellement une variation du tropisme et des capacités de

transmission (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010).

Au terme de ces différentes études, de longues listes de gènes-candidats ont été proposées

pour expliquer la sensibilité de DBA/2J et la résistance de C57BL/6J, ce qui confirme le

caractère complexe et multigénique de la résistance à l’infection par le virus influenza A

(Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012;

Trammell et al., 2012; Boon et al., 2014; Dengler et al., 2014). Quelques exemples sont repris

dans le Tableau 3, mais l’importance relative de ces nombreux gènes-candidats sur la

sensibilité/résistance de l’hôte n’a pas pu être déterminée. De plus, de nouvelles recherches

tendent à remettre en question la fiabilité des cartographies de QTL à l’aide des lignées

recombinantes de souris DBA/2J et C57BL/6J, ce qui réduit le crédit que l’on peut apporter à

ces études génétiques (Wang et al., 2014).

42

Tableau 2. Résumé des données de littérature relatives aux différences de sensibilité entre les

lignées murines DBA/2J et C57BL/6J à l’infection par le virus influenza A.

DBA/2J C57BL/6J

Sensibilité extrême aux ≠ souches de virus

influenza A, adaptées ou non

Résistance à différentes souches de virus

influenza A, murinisées ou non

Perte de poids vif sévère et rapide

Perte de poids vif légère et transitoire

Taux de mortalité élevés. Mortalité dès le

jour 7 après infection

Taux de survie de 100%, sur 14 jours de

suivi, aux doses virales usuelles

Doses létales faibles Doses létales très élevées

Apparition rapide de titres viraux

pulmonaires élevés

Titres viraux pulmonaires moindres et

indétectables après le jour 8 post-infection

Lésions pulmonaires très sévères. Larges

zones de consolidation, pneumonie, infiltrat

neutrophilique, nécrose des bronches et

bronchioles

Même patron lésionnel mais beaucoup plus

modéré. Résolution des lésions avant la fin

de l’expérience

Niveau significativement supérieur

d’activité myéloperoxidase dans les

poumons

Niveaux pulmonaires de myéloperoxidase

faibles

Niveaux d’expression de cytokines pro-

inflammatoires et chimiokines dans les

poumons significativement supérieurs

Expression de cytokines pro-inflammatoires

et chimiokines significativement moindre

Lymphopénie et granulocytose marquées

dès 18 h après infection. En corrélation avec

l’aggravation des signes cliniques

Leucogramme : variations moins

importantes et plus tardives. Sans

corrélation avec les signes cliniques

Tableau 2 : Descriptions des principales différences décrites entre les lignées DBA/2J et

C57BL/6J suite à l’infection par des souches de virus influenza A d’origines et degrés

d’adaptation à la souris variables (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Nedelko et al.,

2012; Trammell et al., 2012; Dengler et al., 2014; Casanova et al., 2015; Preusse et al.,

2015).

43

Tableau 3. Exemples de gènes candidats associés à la sensibilité / résistance au virus

influenza A chez les souris DBA/2J et C57BL/6J

Symbole du gène Description Référence

St6galnac4

GalNAc-alpha-2,6-sialyltransferase

Boon et al., 2009

Hc Hemolytic complement Boon et al., 2009 ;

Trammell et al., 2012

Trim12-30-34 Tripartite motif families 12-30-34 Boon et al., 2009

Gvin1 Very large interferon-inducible GTPase Boon et al., 2009

Ifi35 IFN-induced, double-stranded RNA-

activated protein kinase

Boon et al., 2009 ;

Nedelko et al., 2012

Irf7

Interferon regulatory factor 7 Alberts et al., 2010

Ifnb1

Interferon β-1 Alberts et al., 2010

Il1α-6

Interleukine 1α- 6 Alberts et al., 2010

Cxcl10

Interferon gamma-induced protein 10 Alberts et al., 2010

Cxcr1-3-5

Chemokine receptors Alberts et al., 2010

Ptge-r

Prostaglandines-recepteurs Alberts et al., 2010

Pla2

Phospholipase A2 Alberts et al., 2010

Ifih1 Interferon induced with helicase C Nedelko et al., 2012

Nrip1 Nuclear receptor interacting protein 1 Nedelko et al., 2012

Lst1 Leukocyte specific

transcript 1

Nedelko et al., 2012

44

Exemples de gènes-candidats proposés après analyse des loci de caractères quantitatifs (QTL)

basée sur l'utilisation de Recombinant Inbred Lines des souris de souches DBA/2J et

C57BL/6J.

1.3 Immunité innée et virus influenza

Les virus influenza A peuvent infecter de nombreuses espèces dont le porc, les oiseaux et

l’homme (Wright et al., 2007). Chez les mammifères, l’infection se limite dans la plupart des

cas au système respiratoire. Les mécanismes de défense de l’immunité innée sont divers et

constituent une barrière contre le virus influenza A. Le virus entre par la cavité orale ou nasale

où il est d’abord confronté au mucus qui tapisse l’épithélium respiratoire. Dans les voies

respiratoires inférieures, la mucine est remplacée par des lectines, protéines qui peuvent se lier

avec certains hydrates de carbone de façon hautement spécifique, dont ceux en surface de

l’HA et de la NA virales, ayant pour effet de neutraliser le virus (Iwasaki et Pillai, 2014).

Lorsque le virus parvient à traverser la couche de mucus avec succès, il peut adhérer à et

infecter l’épithélium des voies respiratoires. Au départ de ce premier foyer, le virus peut

ensuite se propager dans le système respiratoire, notamment par l’intermédiaire de cellules de

la lignée blanche comme les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques

(Manicassamy et al., 2010). L’ARN viral présent dans les cellules infectées est reconnu

comme « étranger » par plusieurs récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires

(PRRs ; voir plus loin), ce qui mène à l’expression d’interférons (IFNs) de type I et d’autres

cytokines pro-inflammatoires et chimiokines. Les INFs type I sont produits par les

macrophages alvéolaires, les pneumocytes et les cellules dendritiques et vont induire

l’expression de plusieurs gènes regroupés sous le vocable « IFN-stimulated genes » (ISGs), ce

qui aura pour conséquence de rendre ces cellules ainsi que les cellules adjacentes réfractaires

45

à l’infection : ce mécanisme est appelé l’ « interférence » (Jewell et al., 2007; Hogner et al.,

2013).

Bien que protectrice, la réponse innée peut, dans certaines conditions, se révéler néfaste pour

l’hôte. L’infection de nombreuses espèces de mammifères et de l’homme par certaines

souches virulentes de virus influenza A se traduit par un emballement de la réponse

cytokinique appelé « tempête cytokinique » (La Gruta et al., 2007). Ainsi, il a été démontré

qu’une réponse immunitaire aberrante était inefficace en termes de protection contre le virus

et contribuait à la formation et à la sévérité des lésions pulmonaires et finalement à la

mortalité suite à l’infection par le virus influenza (Kobasa et al., 2007). De même, une

réponse cytokinique aberrante a été décrite chez des patients présentant une maladie sévère

suite à l’infection par la souche H1N1 de la pandémie récente de 2009 (Arankalle et al.,

2010). Bien qu’il soit reconnu que la réponse cytokinique soit essentielle dans le contrôle de

la réplication virale et permette de réduire la morbidité au cours de l’infection (Strutt et al.,

2010; Maelfait et al., 2012), de nombreuses études appuient l’hypothèse du rôle délétère de la

réponse immunitaire innée dans le développement des lésions et signes cliniques en cas

d’infection par le virus influenza A (La Gruta et al., 2007; Salomon et al., 2007; Tisoncik et

al., 2012).

1.3.1 Mécanismes de détection du virus influenza A

Le système immunitaire inné détecte les infections virales par identification spécifique de

motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) via les récepteurs de reconnaissance de

motifs moléculaires (PRRs). Les PAMPs sont des composants structurels des agents

pathogènes ou sont générés pendant l’infection (Janeway, 1989; Medzhitov, 2001). Il existe

différents types de PRRs qui peuvent se classer selon leur emplacement ou leur fonction.

Selon leur fonction biologique, ils peuvent se diviser en PRRs endocytiques et PRRs de

46

signalisation. Les PRRs endocytiques vont promouvoir l’attachement, l’endocytose et

destruction des pathogènes et des cellules en processus d’apoptose par les phagocytes. Dans

ce groupe de PRRs se trouvent notamment les « C-type lectin receptors » (CLRs), qui furent

décrits pendant longtemps comme des récepteurs effecteurs, qui n’induisent pas de

signalisation intracellulaire, ce qui a depuis été réfuté (Iborra et Sancho, 2015). Comme leur

nom l’indique, ce sont des récepteurs qui reconnaissent des groupes de glucides (comme le

mannose) présents en surface de cellules et de certains agents pathogènes (Tanne et al., 2009;

Ritter et al., 2010). Les PRRs de signalisation comprennent la grande famille des Toll-like

receptors » (TLR), qui sont liés aux membranes (plasmatique et endosomale) et les récepteurs

cytoplasmiques (cytosol) « retinoic acid-inducible gene I » (RIG-1) et « NOD-like

receptor familly pyrin domain-containing 3 » (NLRP3). Le virus influenza est reconnu par ces

trois types de récepteurs : les TLR, dont le TLR3 qui reconnait l’ARN double

brin (intermédiaire réplicatif dans le cycle du virus influenza) et les TLR7 et TRL8 qui

reconnaissent l’ARN simple brin ; RIG-1 qui reconnait l’ARN 5′ triphosphate ; et NLRP3 qui

stimule les caspases après son activation par la protéine virale M2 (Pang et Iwasaki, 2012).

RIG-I et NLRP3 détectent le virus présent au niveau du cytosol des cellules infectées ; TLR3,

TLR7 et TLR8 détectent les ARN viraux dans le compartiment endosomal (Guillot et al.,

2005; Pang et Iwasaki, 2012; Iwasaki et Pillai, 2014). L’activation du TLR3, par

l’intermédiaire du facteur TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β),

induit la production de cytokines/chimiokines pro-inflammatoires qui auront pour effet de

restreindre l’amplification virale, mais également de favoriser le recrutement de cellules

inflammatoires qui peuvent potentiellement aggraver les dommages tissulaires causés par le

virus (Alexopoulou et al., 2001; Schulz et al., 2005; Iwasaki et Pillai, 2014). Le TLR7

détecte l’ARN simple brin, c'est-à-dire même sans qu’il n’y ait de réplication virale, et va

activer le « Nuclear Factor-κB » (NF-κB) et des « IFN regulatory factor » (IRF5 et IRF7),

47

qui eux-mêmes induisent la production et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et des

interférons, lesquels auront pour effet de bloquer la réplication virale et de promouvoir la

réponse immune acquise (Lund et al., 2004). Seo et al. (2010) ont montré que des souris

déficientes en TLR3 et TLR7 étaient incapables de contrôler la réplication virale et mouraient

après infection par le virus influenza. RIG-1 permet la détection de particules virales dans le

cytosol des cellules infectées après réplication et il est déterminant dans la production

d’interférons par les macrophages alvéolaires, cellules dendritiques et cellules épithéliales

infectées (Kato et al., 2005). Après la détection de l’ARN, le domaine hélicase de RIG-I se lie

à l’ATP, ce qui provoque un changement de conformation de ses domaines recruteurs des

caspases et permet la liaison au facteur « mitochondrial antiviral signalling protein »

(MAVS), qui va conduire à l’expression de cytokines et IFNs de type I (Hornung et al., 2006;

Luo et al., 2011). Les NLRPs font partie du complexe multi-protéique « inflammasome »

avec l’adaptateur « apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy-terminal

CARD » (ASC : deuxième messager) et la pro-caspase 1. L’activation de l’inflammasome

résulte en une réaction auto-catalytique (pyroptose) par induction de la caspase 1 (forme

active) et le clivage des pro-interleukines qui seront ensuite secrétées. Cette activation des

NLRPs est moins spécifique et peut être induite par infection, stress ou lyse de la membrane

cellulaire (Bergsbaken et al., 2009).

Les IFNs de type I agissent de façon autocrine et paracrine par activation des protéines STAT

(signal transducers and activators of transcription), via phosphorylation par les kinases JAK

(Janus kinases). Ces IFNs jouent un rôle critique dans le contrôle précoce de la réplication

virale par activation de la transcription de plusieurs facteurs antiviraux. Lorsque le virus

influenza est détecté par les macrophages alvéolaires, une cascade inflammatoire est activée,

les membres de la famille régulatrice des interférons (IRF), IRF3, IRF5 et IRF7 activent la

48

transcription des gènes et induisent une première « vague » de sécrétion d’interférons de type

I (Jewell et al., 2007; Iwasaki et Pillai, 2014). Figure 4

1.3.2 Les médiateurs de l’inflammation

Les cytokines et chimiokines sont des médiateurs de l’inflammation. Parmi celles-ci, les

interférons de type I jouent un rôle central dans la protection contre l’infection par le virus

influenza A. L’histoire des interférons est intimement liée au virus influenza. En effet, c’est

suite au traitement de cellules de la membrane chorio-allantoïque de poulet avec des

particules virales inactivées que Isaacs et Lindenmann (1957) ont découvert la sécrétion de

cette cytokine aux propriétés antivirales. Et seulement trois ans plus tard, Lindenmann (1960)

a également décrit la capacité de certains virus influenza à induire une « interférence inverse »

et inhiber la sécrétion des IFNs, phénomène attribué plus tard à la protéine NS1 du virus (voir

point 1.1.3) (Egorov et al., 1998; Garcia-Sastre et al., 1998). Les interférons de type I sont en

effet connus comme de puissants inhibiteurs de la réplication et de la dissémination du virus

influenza A (Garcia-Sastre et Biron, 2006). Les IFNs de type I limitent la propagation virale

par induction de l’apoptose des cellules infectées, ainsi que par augmentation de la résistance

des cellules à l’infection et par activation des cellules Natural Killer (NK) et des lymphocytes

T cytotoxiques, ce qui les situe comme des éléments-clefs non seulement de l’immunité

innée, mais aussi de l’immunité adaptative (Stetson et Medzhitov, 2006). Il n’est pas

surprenant que les virus Influenza A aient développé un système spécifique pour évader cet

effet des IFNs, de là, que la principale fonction de la protéine virale NS1 soit celle d’inhiber

la production et la signalisation des interférons de type I. En cas de mutation ou de délétion du

gène codant pour la protéine NS1 du virus, les niveaux d’interférons produits par les cellules

infectées subissent des augmentations significatives et les titres viraux chutent drastiquement,

tant in vitro qu’in vivo (Garcia-Sastre et al., 1998; Kochs et al., 2007; Jiao et al., 2008).

49

L’action des interférons de type I est médiée principalement par leur capacité à induire

l’expression des « interferons stimulated genes » (ISGs), qui codent pour des agents

effecteurs antiviraux. Le premier « gène stimulé par les interférons » conférant une protection

contre l’infection in vivo par le virus influenza A fut nommé « Mx » pour « myxovirus

resistance » (Lindenmann, 1962; Horisberger et al., 1983). Il est important d’insister sur le

fait que les deux lignées de souris en question dans le présent manuscrit, à savoir DBA/2J et

C57Bl/6J, sont des souris Mx-négatives. Un autre ISG qui a fait l’objet de nombreuses études

est la PKR, dont l’activité est également inhibée pendant l’infection par le virus influenza A

(Katze et al., 1986), et qui a été le premier lien entre la protéine NS1 et la réponse interféron

(Lu et al., 1995). La PKR est exprimée constitutivement dans une conformation inactive.

Quand elle est activée par de l’ARN double brin (notamment), elle phosphoryle un grand

nombre de substrats, dont la sous-unité alpha du facteur initiateur de traduction eIF2, et

bloque ainsi la synthèse des protéines cellulaires (Garcia et al., 2006). L’« oligo 2’-5’A

synthétase » OAS, est un autre ISG dont le produit catalyse la formation de chaines de 2’-

5’poly(A). La fonction principale de l’OAS est d’activer l’enzyme « ARNaseL » latente, un

puissant inhibiteur du cycle viral, de par sa capacité à dégrader l’ARN simple brin

(Silverman, 2007). A ce jour, plus de 400 ISGs ont été décrits, dont les effets in vivo

dépendent du virus infectant, de la cellule infectée et du tissu (Schoggins, 2014).

Le rôle majeur des interférons de type I est clairement renforcé par les expériences mettant en

jeu des souris dépourvues de récepteur à ces interférons (IFNAR1-/-

). Quand des souris

IFNAR1-/-

ont été infectées avec la souche PR8 du virus, une surproduction de la chémokine

attractante des neutrophiles KC (CXCL8) induit un infiltrat de neutrophiles ainsi qu’une

augmentation de la morbidité et mortalité par rapport à des souris contrôles (Seo et al., 2011).

Malgré les propriétés antivirales indéniables des interférons de type I, plusieurs études leur

attribuent également un rôle dans la pathogénie de la pneumonie à influenza, principalement

50

via la production de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines. Ainsi, le développement

des signes cliniques est corrélé avec l’apparition d’IFN-α dans les lavages broncho-alvéolaires

des patients malades (Hayden et al., 1998; Van Reeth, 2000). Une étude plus récente dans le

modèle murin met également en avant l’implication directe des IFNs de type I dans le

développement de lésions pulmonaires et la mortalité de souris infectées par le virus influenza

A (Davidson et al., 2014). De même, l’IFN-β produit par les macrophages alvéolaires

participe activement à l’apoptose des cellules épithéliales alvéolaires en cas de pneumonie

sévère à influenza (Hogner et al., 2013). Les interférons de type I joueraient donc un double

jeu, celui du contrôle de l’infection virale d’une part, de l’exacerbation de la maladie d’autre

part. Les interférons de type II ont comme seul représentant l’IFN-γ, produit tout au long de

l’infection par le virus influenza A. Dans les premiers jours de l’infection (~ jusqu’à j3), la

production d’IFN-γ est majoritairement assurée par les macrophages et les cellules NK, alors

que durant les jours 5-10 après infection, elle l’est principalement par les lymphocytes T CD4

et CD8, au niveau du poumon et des ganglions lymphatiques. Il a été démontré que

l’expression d’IFN-γ au début de l’infection par le virus influenza A avait des propriétés

protectrices et antivirales (Khoufache et al., 2009). Ce rôle protecteur est médié par le

récepteur agoniste « proteinase-activated receptor 2 » (PAR2) qui augmente la production

d’IFN-γ et fait diminuer les titres viraux, améliorant ainsi la survie des souris infectées

(Khoufache et al., 2009). De façon paradoxale, certaines études ont montré qu’une absence ou

une inhibition du récepteur PAR2 résultait en une maladie moins sévère, avec diminution des

titres viraux et de mortalité (Nhu et al., 2010). En plus des interférons de type I et type II,

l’interféron lambda (IFN-λ), un interféron de type III, a été détecté en plus grande quantité

dans les cellules épithéliales des voies respiratoires et des poumons de souris après infection

par le virus influenza A (Jewell et al., 2010; Crotta et al., 2013). L’administration d’IFN-λ

avant infection par le virus influenza A protège les souris IFNAR-/-

contre l’infection.

51

Cependant, l’absence du récepteur de l’IFN-λ (IL-28Rα) ne rendrait les souris que

partiellement plus sensibles à l’infection (Mahlakoiv et al., 2012). Il semble que l’IFN-λ ait

une fonction antivirale similaire à celle des interférons de type I.

Le virus influenza A active aussi le facteur NLRP3 de l’inflammasome (Ichinohe et al.,

2009), ce qui a comme résultat le clivage des pro-IL-1β et pro-IL-18 en leur forme active.

L’IL-1β ainsi produite active le récepteur IL-1R pour induire l’expression de gènes pro-

inflammatoires par la voie MyD88-dépendante (Pirhonen et al., 1999). Il a été démontré que

la signalisation dépendant du récepteur IL-1R contribue à la protection de l’hôte, mais est

également responsable de l’immuno-pathologie présentée suite à l’infection par le virus

influenza A (Schmitz et al., 2005). Schmitz et al. (2005) a démontré que les souris IL-1R-/-

ne

présentaient ni la pathologie inflammatoire pulmonaire, ni le recrutement excessif de

neutrophiles typiques des pneumonies à influenza ; cependant, ces souris présentaient une

moindre production d’IgM anti-influenza, un retard dans l’élimination des particules virales et

une mortalité accrue. Une autre étude chez de souris IL-1R-/-

a mis en évidence une

diminution de la morbidité et un déplacement de la mortalité dans le temps après infection par

une souche H5N1 HPAI (Perrone et al., 2010). Ces souris présentaient une diminution de la

production de cytokines et du recrutement de macrophages alvéolaires et de neutrophiles dans

les poumons (Perrone et al., 2010). Des niveaux élevés en IL-1β conduisent par ailleurs à des

réponses pro-inflammatoires plus importantes chez des patients atteints du syndrome de

détresse respiratoire aigüe (Pugin et al., 1996). De même, des niveaux élevés en TNF-α sont

associés à de plus grandes morbidité et mortalité après infection par des souches HPAI chez

l’homme et les modèles animaux (Szretter et al., 2007). Chez la souris, un traitement avec un

anticorps anti-TNF-α résulte en une diminution du recrutement de cellules inflammatoires, de

la production de cytokines et de la morbidité suite à l’infection par le virus influenza A

(Hussell et al., 2001). Des résultats paradoxaux ont été rapportés chez des souris TNFR-/-

suite

52

à l’infection par un virus H5N1, aucune différence n’ayant été observée dans la sévérité de la

maladie (Salomon et al., 2007). Fait intéressant, les souris dépourvues à la fois d’IL-1β et de

TNF-α présentaient une plus faible mortalité, une moindre production de cytokines et

chimiokines et une réduction du nombre de neutrophiles et macrophages alvéolaires dans les

poumons, par rapport aux souris intactes (Perrone et al., 2010).

Des niveaux élevés en IL-6 ont été retrouvés dans le sérum de patients atteints d’infections

provoquées par des virus H5N1 et H1N1 et mis en corrélation directe avec la progression des

symptômes (Van Reeth, 2000; Kaiser et al., 2001). Les niveaux élevés détectés dans le sérum

de macaques infectés avec la souche pandémique H1N1 de 1918 ont été interprétés comme

une réponse inflammatoire aberrante (Kobasa et al., 2007). Par contre, la suppression de

l’expression d’IL-6 n’a pas modifié le taux de survie de souris infectées avec une souche de

virus H5N1 (Salomon et al., 2007), ce qui suggère un rôle moindre d’IL-6 dans le

développement des lésions pulmonaires après infection par le virus influenza. D’un autre côté,

Dienz et al. (2012) ont montré que la déficience en IL-6 ou en son récepteur IL-6R provoque

la persistance du virus dans le poumon et par conséquent des lésions pulmonaires plus sévères

et une mortalité accrue. L’IL-6 semble par ailleurs essentielle dans la mise en place d’une

immunité adaptative efficace contre le virus influenza A (Dienz et Rincon, 2009).

En plus des cytokines, plusieurs molécules chimio-taxiques sont exprimées après infection par

le virus influenza A chez l’homme et les modèles animaux. De façon similaire, la production

locale et systémique de chimiokines a été corrélée avec le développement de lésions associées

à l’infection par le virus influenza A (Van Reeth, 2000; De Jong et al., 2006; Kobasa et al.,

2007). Ainsi, des niveaux plus élevés en MCP-1 (CCL2) et IP-10 (CXCL10) ont été retrouvés

dans le sérum de patients infectés par un virus H5N1 hautement pathogène, en comparaison

avec des patients infectés par des souches moins pathogènes (De Jong et al., 2006). De même,

l’ARNm de RANTES (CCL5) est davantage exprimé dans des cultures primaires de

53

macrophages humains infectés par le virus H5N1 que dans ceux infectés par des souches

H1N1 ou H3N2 (Cheung et al., 2002). Bien qu’il existe une corrélation entre la surproduction

de chimiokines et la sévérité de l’infection par le virus influenza A, la responsabilité

individuelle de chaque chémokine dans la pathogenèse est à ce jour difficile à prouver. A titre

d’exemple, l’infection de souris dépourvues de récepteurs CCR2 et CCR5 a donné des

résultats paradoxaux. Les souris déficientes en CCR5 ont développé une pneumonie sévère et

ont succombé rapidement à l’infection. Au contraire, les souris déficientes en récepteur CCR2

ont développé une maladie bien plus légère, avec réduction de l’infiltrat inflammatoire et des

lésions pulmonaires, et une amélioration du taux de survie. Par contre, les titres viraux

pulmonaires étaient plus importants chez ces souris dépourvues de CCR2 (Dawson et al.,

2000). Cependant, il a été déterminé plus tard que des souris CCL2-/-

succombaient à

l’infection par une souche de virus H5N1 en présentant des taux de survie similaires à ceux

des souris CCL2+/+

(Salomon et al., 2007). Les apparentes contradictions entre les résultats de

ces études peuvent être liées aux différences quant aux souches virales utilisées ou aux

protocoles employés ou par l’effet d’autres chimiokines qui ont les mêmes actions

biologiques. Certaines cytokines, aux propriétés anti-inflammatoires, ont pour effet de

prévenir ou de limiter les lésions associées à l’activation du système immunitaire. Ainsi,

l’IL-10 constitue un élément central dans la régulation de la réponse immunitaire contre les

infections virales, bactériennes et parasitaires (Couper et al., 2008). Des niveaux élevés en

IL-10 ont été décrits chez des patients atteints par le virus influenza A (De Jong et al., 2006).

Cette surexpression d’IL-10 a été interprétée comme une réponse secondaire à l’inflammation

excessive. Une autre étude a montré qu’en inhibant le récepteur IL-10R, une infection

sublétale devenait une maladie sévère avec un haut taux de mortalité (Sun et al., 2009). Les

principales sources d’IL-10 sont les lymphocytes T CD8 et CD4 infiltrant le poumon après

infection par le virus influenza A (Sun et al., 2009; Mckinstry et al., 2012). Figure 4

54

Figure 4 : Exemple de cascades d’activation de l’expression des IFNs de type I après

détection d’ARN viral par différents récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires

PRRs et cascade d’activation de l’expression des gènes stimulés par les interférons.

Un autre médiateur de l’inflammation est le système du complément (C’). Il consiste en un

groupe complexe des protéines sériques, glycoprotéines et des récepteurs solubles ou unis aux

membranes, qu’ensemble jouent un rôle centrale dans l’immunité contre des pathogènes. Le

complément est un component phylogénétiquement très conservé de l’immunité innée

(Sunyer et Lambris, 1998). Le complément interagit aussi dans la réponse immunitaire

adaptative comme médiateur inflammatoire de l’interaction antigène-anticorps et comme pont

55

entre l’immunité innée et adaptative (Dempsey et al., 1996; Carroll, 2004). Le système du

complément peut être activé par la voie classique, la voie alternative et par la voie des

lectines. Les réactions antigène-anticorps activent la voie classique, lorsque les voies

alternative et des lectines sont activées indépendamment des anticorps par interactions entre

des components spécifiques du complément avec des groupes glucidiques et des

polysaccharides présentes dans les membranes des pathogènes (Lambris, 1988; Muller-

Eberhard, 1988; Mastellos et al., 2003). L’activation du complément se passe par des

cascades d’activation séquentielles à travers des clivages protéolytiques des protéines du C’

qui conduisent à la génération des produits actives d’action médiatrice sur plusieurs effets,

dont l’inflammation, la chimiotaxie de leucocytes et la phagocytose des particules et cellules

opsonisées (Muller-Eberhard, 1988). Un résultat directe de ces événements est la lyse des

cellules et microorganismes cible du complexe d’attaque des membranes du complément. A

l’heure actuelle, plus de 30 protéines ont été identifiées, et la déficience particulière d’un des

component est souvent associée à une déficience dans l’établissement d’une réponse

immunitaire efficace (Hicks et al., 1978; Wetsel et al., 1990; Brummer et Stevens, 1994;

Ashman et al., 2003). Des protéines du complément, le component C3 est le plus

multifonctionnel, c’es le plus abondant dans le sérum, il peut interagir avec plus de 20

protéines et il est commun pour les trois voies d’activation (Wetsel, 1995; Mastellos et al.,

2003). Le clivage de C3 par les conversasses hautement spécifiques conduit à la génération de

C3a et C3b, de propriétés anaphylactiques et multi-activatrices, respectivement (Alsenz et al.,

1992; Lambris et al., 1994; Mastellos et al., 2003; Markiewski et Lambris, 2007). Le facteur

C5 du complément est activé par action du C3b et est clivé en C5a et C5b (Discipio et al.,

1983). Des études plus récentes suggèrent que le facteur C5 du complément pourrait être aussi

activé en absence du C3, par voie de la trombine (Huber-Lang et al., 2006). Le C5a est une

puissante anaphylatoxine chimiotactique, d’effet médiée par l’activation des cellules voie

56

leur récepteur C5aR ; et C5b fait partie du « complexe d’assemblement C5b9 » qui induit la

lyse des cellules ciblées par le complément (Morgan, 1999). L’activation du complément face

à une infection virale peut être mise en place avec et sans interaction des anticorps et peut

mener à la neutralisation du virus, à la phagocytose des particules virales enrobées du

complément, à la lyse des cellules infectées par le virus et aussi à la génération d’un processus

inflammatoire antivirale (Mastellos et al., 2003; Dunkelberger et Song, 2010). La souris

DBA/2J possède une déficience du facteur C5 du complément, qui a été liée à sa sensibilité

accrue présentée face aux pathogènes Candida albicans, Cryptococcus neoformans et à un

virus influenza A (Hicks et al., 1978; Wetsel et al., 1990; Brummer et Stevens, 1994; Ashman

et al., 2003)

1.3.3 Rôle du macrophage alvéolaire

L’infection expérimentale à l’aide d’un virus influenza A provoque un recrutement de

macrophages/monocytes dans les poumons infectés. Ces cellules peuvent être infectées et

contribuer à la réplication et à la dissémination virale (Van Riel et al., 2011; Pang et al.,

2013), mais peuvent aussi se protéger de l’infection par l’intermédiaire des interférons de type

I (Hermesh et al., 2010). L’infiltration de macrophages peut contribuer à la pathologie

pulmonaire et augmenter la morbidité et la mortalité. Mais, ce sont les macrophages

alvéolaires résidents qui jouent le rôle primordial dans le contrôle de la dissémination et

l’élimination des particules virales (Tumpey et al., 2005b). Dans un modèle murin d’infection

par le virus H1N1 de 1918, la déplétion des macrophages alvéolaires par instillation intra-

nasale de liposomes de clodronate s’est traduite par une diminution de la production de

cytokines et chimiokines, avec une augmentation du taux de mortalité par rapport aux groupes

contrôles clodronate-négatifs. De plus, cette déplétion chimique des macrophages alvéolaires

avant infection a transformé une infection sublétale en une maladie mortelle avec des titres

57

viraux très élevés. Paradoxalement, dans les mêmes conditions et suite à l’infection par la

souche PR8 du virus (faiblement pathogène), la sévérité de la maladie et la mortalité n’ont pas

montré de différences avec ou sans traitement au clodronate (Tate et al., 2010). Dans le

modèle porcin, les macrophages alvéolaires sont indispensables pour contrôler l’infection par

le virus influenza A (Kim et al., 2008). Suite à la déplétion de leurs macrophages alvéolaires,

les porcs ont montré une augmentation du taux de mortalité et une aggravation des lésions

pulmonaires par rapport aux porcs non déplétés. Il existe trois types de macrophages résidents

dans le tissu pulmonaire, les macrophages bronchiques, les macrophages interstitiels et les

macrophages alvéolaires. Les macrophages alvéolaires se trouvent dans la lumière alvéolaire,

où ils constituent ~95% du contenu cellulaire en conditions physiologiques (Reynolds, 1987).

Les macrophages alvéolaires occupent un espace unique de l’organisme, une position extra-

épithéliale dans l’interface entre le poumon et l’atmosphère externe, d’où ils stimulent une

réponse immunitaire innée non spécifique contre divers agents étrangers (Tate et al., 2010;

Balhara et Gounni, 2012). Dans le poumon de la souris, on considère que la proportion des

macrophages alvéolaires par alvéole est de 1 sur 3, respectivement ; et que la population totale

des macrophages alvéolaires dans le poumon varie entre 1 et 2 millions (Westphalen et al.,

2014).

Ces dernières années, plusieurs travaux sur l’origine des macrophages tissulaires ont remis en

cause le dogme qui soutenait que les monocytes circulants et originaires de la moelle osseuse

pénétraient constamment les tissus pour reconstituer directement les stocks de macrophages

résidents (Epelman et al., 2014; Ginhoux et Jung, 2014; Kopf et al., 2015). La théorie la plus

communément admise aujourd’hui est que plusieurs groupes de macrophages tissulaires, dont

les macrophages alvéolaires, ont pour origine des cellules embryonnaires qui migrent dans les

organes pendant le développement fœtal. Le maintien tout au long de la vie des populations

58

de macrophages alvéolaires se ferait par auto-renouvèlement autonome (Epelman et al., 2014;

Ginhoux et Jung, 2014; Kopf et al., 2015).

Le macrophage alvéolaire est équipé d’une grande quantité de récepteurs spécifiques de

reconnaissance des pathogènes, dont la famille des TLR et NLRP, mais aussi des CLRs et des

récepteurs « scavengers », qui vont favoriser la phagocytose/endocytose des agents

pathogènes, des débris cellulaires et des corps étrangers. Toutes ces caractéristiques font du

macrophage alvéolaire une cellule de « première ligne de défense » (Lohmann-Matthes et al.,

1994; Mosser, 1994; Thoma-Uszynski et al., 2001; Taylor et al., 2005; Kumagai et al., 2007).

Les macrophages alvéolaires, comme les macrophages en général, sont classés d’après leur

profil de sécrétion de cytokines en deux sous-populations, décrites comme les polarisations

« classique » M1 et « alternative » M2 (Mantovani et al., 2009). Les macrophages M1 sont

connus principalement pour être impliqués dans les réponses inflammatoires dirigées contre

des pathogènes intracellulaires (Cassol et al., 2009; Moreira et al., 2010), tandis que les

macrophages M2 sont impliqués dans la défense contre des pathogènes extracellulaires, dont

certains parasites, et la phagocytose des cellules en apoptose (Mills et al., 2000). L’interféron-

γ produit par les lymphocytes T auxiliaires 1 (Th1) et le lipopolysaccharide bactérien

induisent une polarisation des macrophages en type M1, tandis que les cytokines produites par

les lymphocytes T auxiliaires 2 (Th2), dont IL-4 et Il-13, induisent une polarisation en M2

(Mills et al., 2000; Cassol et al., 2009). Le statut de polarisation M1 inclut donc les

macrophages activés par des cytokines de type Th1 ou des médiateurs pro-inflammatoires

dont le « facteur stimulateur des colonies granulocytes-monocytes » (GM-CSF), TNF-α, IL-6,

IL-1β, IL-12 et plusieurs PAMPs, tandis qu’une signalisation plutôt anti-inflammatoire

provoque la polarisation M2, où interviennent des molécules telles que le « facteur stimulant

des macrophages » (M-CSF), IL-10, Il-4, des glucocorticoïdes et la sérotonine (Mills et al.,

59

2000; Cassol et al., 2009; Balhara et Gounni, 2012; Murray et al., 2014). Ces caractéristiques

sont résumées dans la figure 5.

Figure 5 : Polarisation des macrophages. Différents stimuli activent le développement des

différentes populations fonctionnelles des monocytes/macrophages. L’activation classique M1

est induite par des produits microbiens et des cytokines inflammatoires, principalement l’IFN-

γ. Les macrophages M1 possèdent une activité microbicide et pro-inflammatoire. L’activation

alternative M2 des macrophages est induite par les IL-4 et IL-13 produites par les

lymphocytes auxiliaires Th2 et sont impliqués plutôt dans la réparation tissulaire et la fibrose

(Mitchell, 2012).

60

Ces deux types d’activation ont initialement été décrits respectivement pour les infections

bactériennes et parasitaires. A ce jour, une série d’observations démontrent que le processus

de polarisation est bien plus complexe et répond à plusieurs médiateurs endogènes et à des

stimuli exogènes. Il a ainsi été démontré que IL-4 peut induire la production d’IL-6, IL-12p70

et TNF-α par les macrophages M1, par exemple (Varin et al., 2010).

Des données récentes mettent en question ce spectre bipolaire d’activation et indiquent par

contre un spectre multipolaire et continu d’activation des macrophages, par des stimuli très

variés (Martinez et Gordon, 2014). Ces nouveaux éléments permettent d’inclure les infections

virales et l’action des interférons dans l’activation des macrophages. Si l’on considère les

divers processus pathogéniques associés à différents virus, on ne peut pas attribuer aux virus

un type précis d’activation des macrophages et il faut donc tenir compte de leur hétérogénéité

et analyser chaque cas d’une façon dynamique (Crespo et al., 2013; Schneider et al., 2014a;

Shirey et al., 2014).

Quoi qu’il en soit, le rôle des macrophages alvéolaires dans la protection contre le virus

influenza est considéré comme essentiel (Schneider et al., 2014a). La réactivité des

macrophages alvéolaires est critique pour la protection des voies respiratoires par la

restriction de la dissémination et par la mise en place d’une immunité innée efficace contre le

virus influenza A. Le succès de l’infection dépend de la capacité du virus influenza à

échapper et même à profiter de la réponse immunitaire de l’hôte. Ainsi, bien que les cellules

épithéliales du système respiratoire soient le site primaire de réplication virale, plusieurs

études ont montré la réplication du virus au sein même des macrophages alvéolaires des

souris après infection in vivo et in vitro (Martinez et al., 2009). Un élément essentiel du rôle

des macrophages alvéolaires dans la lutte contre les infections virales est sans nul doute

l’expression des interférons de type I. La contribution des macrophages alvéolaires au

contrôle précoce de la réplication et de la dissémination virale est telle que, quand ils sont

61

déplétés, l’efficacité de l’élimination des particules virales diminue drastiquement dès 24

heures après infection (Kumagai et al., 2007), mais les macrophages alvéolaires participent

également activement au contrôle de l’infection par phagocytose des cellules infectées et des

particules virales elles-mêmes, action qui est partagée avec les neutrophiles (Hashimoto et al.,

2007). La sécrétion des IFNs de type I a également un impact sur le recrutement des cellules

myéloïdes vers le site d’infection. Après la détection du virus influenza A, les interférons de

type I produits par les macrophages alvéolaires induisent une différentiation et une

prolifération des cellules souches hématopoïétiques ainsi qu’une augmentation de

l’expression de la chémokine MCP-1 (CCL2), qui va recruter les monocytes «CCR2-

dependants Ly6Chi » provenant de la moelle osseuse. Cependant, en l’absence d’interférons

de type I, ce sont les monocytes de type « CCR2-Ly6Cint » qui seront recrutés dans les

poumons infectés où ils vont produire de grandes quantités d’interleukine 8 (IL-8), chémokine

agissant sur les neutrophiles ; ce phénotype est associé à une pneumonie sévère et à une haute

mortalité (Tumpey et al., 2005a; Serbina et Pamer, 2006; Essers et al., 2009; Sato et al., 2009;

Seo et al., 2011; Divangahi et al., 2015).

1.3.4 Rôle d’autres types cellulaires

La pathologie provoquée par différentes souches virales d’origine humaine, aviaire ou porcine

hautement virulentes est caractérisée par une pneumonie sévère, avec un infiltrat

inflammatoire neutrophilique important (Perrone et al., 2008; Garigliany et al., 2010). Après

infection par une souche de sous-type H5N1, les patients gravement malades ont présenté une

expression plasmatique d’interleukine 8 (IL-8) beaucoup plus importante, associée à un

recrutement accru de neutrophiles, par rapport à des patients infectés par des souches

saisonnières moins pathogènes (De Jong et al., 2006). Par ailleurs, la déplétion complète des

neutrophiles chez la souris résulte en une moindre élimination des particules virales et en une

62

augmentation de la morbidité et de la mortalité après infection par différentes souches de

virus influenza A (Tumpey et al., 2005b; Brandes et al., 2013). Par contre, une atténuation de

la réponse neutrophilique a permis d’augmenter le taux de survie des souris après infection

par la souche PR8 du virus (Brandes et al., 2013). Ces différentes études suggèrent que

l’infiltrat neutrophilique, bien que nécessaire au contrôle de l’infection par le virus influenza,

participe s’il est excessif aux lésions pulmonaires et à leurs conséquences cliniques.

Pendant l’infection par le virus influenza A, les cellules dendritiques résidentes dans le

poumon jouent un rôle essentiel dans l’activation des lymphocytes T au niveau des ganglions

lymphatiques médiastinaux (Lambrecht et Hammad, 2012). Différentes sous-populations de

cellules dendritiques sont identifiées grâce aux analyses immunophénotypiques par

cytométrie en flux, avec chacune des capacités variables à activer les lymphocytes T dans la

lutte contre le virus (Lambrecht et Hammad, 2012). Des études ont mis en évidence un lien

entre la réponse des cellules dendritiques et la sévérité de la pathologie présentée suite à

l’infection, la morbidité et la mortalité (Dawson et al., 2000). Une autre étude a établi une

corrélation entre l’infection par des virus influenza hautement pathogènes avec une

augmentation des cellules dendritiques productrices de TNF-α et d’oxyde nitrique (TipDcs),

phénomène qui n’est pas apparu suite à l’infection par des virus influenza faiblement

pathogènes (Aldridge et al., 2009). Il est par ailleurs apparu qu’une réduction de l’infiltration

de TipDCs et la production de chimiokines MCP-1 et MCP-3 augmentait la survie suite à

l’infection (Aldridge et al., 2009). Dans leur ensemble, ces études suggèrent qu’il existe une

« petite fenêtre » d’équilibre entre les effets protecteurs et les effets néfastes des cellules

dendritiques pendant l’infection contre le virus influenza A.

63

1.4 Résultats préliminaires

Des expériences préliminaires menées au sein du laboratoire de Pathologie Systémique de la

Faculté de Médecine Vétérinaire de l’Université de Liège ont confirmé les différences de

sensibilité entre les souris DBA/2J et C57BL/6J à l’infection par le virus influenza et ouvert

de nouvelles pistes de recherche.

Le modèle mis en œuvre est basé sur un virus H1N1 d’origine porcine

(A/Swine/Iowa/4/1976(H1N1)) adapté à la souris par 32 passages pulmonaires successifs. Ces

passages pulmonaires ont été effectués sur différentes lignées de souris de laboratoire en

partant des plus sensibles au virus influenza jusqu’aux plus résistantes. Ces lignées de souris

furent : 129Sv, C3H/HeN, BALB/c puis FVB, respectivement (Habyarimana et Desmecht,

résultats non publiés).

Après la murinisation, le virus est devenu hautement virulent pour les souris de laboratoire

(Garigliany et al., 2010). Au terme du processus d’adaptation, quatre substitutions seulement

ont été détectées : E219W et L544S dans l’HA ; A542S dans la PB1 et S145F dans la NA

(résultats non publiés).

Pour mesurer objectivement la létalité du virus P32, nous avons déterminé la dose létale 50

(LD50) pour différentes lignées murines. Le Tableau 4 reprend les données concernant les

lignées DBA/2J et C57BL/6J.

64

Tableau 4. Determination de la dose létale 50

Lignée de

souris

Titre de l’inoculum

(PFUs/souris)

Souris

mortes

Souris

survivantes

Taux de

Mortalité (%)

DBA/2J 9000 4 0 100

900 5 0 100

90 5 0 100

9 5 0 100

1 2 3 40

C57BL/6J 9000 4 1 80

900 5 0 100

90 5 0 100

9 0 5 0

1 0 5 0

Tableau 4 : Taux de mortalité des souris DBA/2J et C57BL/6J au jour 14 après infection par

des dilutions sériées de virus influenza H1N1 P32.

L’analyse du Tableau 4 nous a permis de déterminer une dose infectieuse (environ 9

PFUs/souris) permettant d’obtenir 100% de mortalité chez DBA/2J et 0% de mortalité chez

C57BL/6J. La dose infectieuse standard de ~9 PFUs/souris dans un volume de 50μl de PBS a

été administrée par voie intranasale. Cette méthode a pour objectif d’atteindre les voies

respiratoires profondes du poumon et d’obtenir une infection homogène et reproductible et

pas nécessairement de recréer l’infection naturelle qui est généralement restreinte aux voies

respiratoires supérieures et caractérisée par une maladie bénigne (Salomon et al., 2007;

Perrone et al., 2008).

Après infection in vivo, le taux de mortalité et l’évolution du poids vif ont été concordants

avec les résultats décrits précédemment dans la littérature, confirmant la sensibilité accrue de

DBA/2, c'est-à-dire une perte de poids vif rapide à partir du jour 3 après infection avec

dyspnée sévère puis mortalité aux jours 7 à 8 après infection (ou l’euthanasie en cas de perte

de poids supérieure à 20% du poids vif initial). (Figure 6(A)). En comparaison, les souris

65

C57BL/6J ne perdaient au maximum que 8% de leur poids vif (au jour 8 pi) avec retour au

poids de départ avant la fin de l’expérience (14 jours) et un taux de survie de 100%.

Figure 6(B)

Figure 6 : Perte de poids vif des souris DBA/2J et C57BL/6J mesurée pendant 8 jours après

inoculation intra-nasale de 9 PFUs (plaque-forming unit) par souris de virus influenza A P32

(A). Taux de survie durant les 14 jours suivant l’infection (B).

La mesure des titres viraux pulmonaires a révélé des écarts significatifs à partir du jour 3

après infection, avec un nombre de PFUs (plaque-forming unit) par gramme de poumon

significativement supérieur chez DBA/2J (Figure 7). Les titres viraux atteignaient un pic au

jour 6 pi (post-infection) pour les deux lignées de souris, mais ceux chez DBA/2J étaient

encore environ deux fois supérieurs à ceux mesurés dans les poumons des souris C57BL/6J.

Au jour 3 pi, le ratio entre les titres mesurés pour les deux lignées de souris était de 7. Une

fois encore, ces données démontrent que la différence de sensibilité entre DBA/2J et

C57BL/6J intervient très tôt dans le processus infectieux, bien avant la mise en place d’une

immunité adaptative.

66

Figure 7 : Titres viraux pulmonaires mesurés chez des souris DBA/2J et C57BL/6J durant les

huit jours suivant l’inoculation intranasale de 9 PFUs/souris de virus A/swine/Iowa/4/1976

(H1N1), variant murinisé P32. Student t-test : *P < 0.05, et ***P < 0.001.

Parallèlement, l’évaluation histopathologique a mis en évidence des lésions pulmonaires plus

sévères et étendues dans les poumons de la souris DBA/2J (Figure 8). Durant les trois

premiers jours après infection, l’exsudat inflammatoire se focalisait majoritairement dans et

autour des bronches et bronchioles pour les deux lignées de souris. Aux jours 6-7 après

infection, une progression des lésions chez la souris DBA/2J se traduisait par une sévère

pneumonie caractérisée par un abondant infiltrat des neutrophiles, avec parallèlement une

nécrose de l’épithélium des bronches et bronchioles, des dommages alvéolaires diffus avec

des dépôts fibrineux (membranes hyalines) et une vasculite. Chez la souris C57BL/6J, la

pneumonie était moins sévère et les lésions circonscrites principalement autour des voies

respiratoires (Figure 8). Ces résultats sont concordants avec ceux obtenus par d’autres

équipes (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009). Les différences entre les deux lignées de

souris semblent donc se manifester très tôt au cours de l’infection, ce qui, à nouveau, suggère

67

l’importance de l’immunité innée et tend à limiter voire à exclure le rôle de l’immunité

acquise pour expliquer les différences de sensibilité entre les souris DBA/2J et C57BL/6J.

Figure 8 : Lésions microscopiques dans les poumons des souris DBA/2J et C57BL/6J au

cours de l’infection in vivo par le virus influenza A/swine/Iowa/4/1976 (H1N1), variant

murinisé P32. La coloration à l’hématoxyline/éosine montre de grandes différences au niveau

de l’infiltrat de neutrophiles et de macrophages, beaucoup plus sévère chez DBA/2J.

L’épithélium des bronchioles est à différents stades de nécrose, avec desquamation, présence

de neutrophiles et sécrétion fibrineuse dans la lumière des bronchioles des poumons

principalement chez DBA/2J.

Par ailleurs, le marquage de la nucléoprotéine virale par immunohistochimie sur des coupes

de poumons à différents temps post-infection a montré que les particules virales sont

68

principalement présentes au niveau des voies respiratoires jusqu’au troisième jour après

infection, avant d’atteindre les alvéoles pulmonaires, pour les deux lignées de souris (Figure

9). Le marquage était néanmoins nettement plus prononcé chez DBA/2J, ce qui confirme les

titres viraux pulmonaires plus importants mesurés chez cette lignée.

Figure 9 : Marquage par immunohistochimie de la nucléoprotéine virale sur coupes

histologiques de poumon de souris DBA/2J et C57BL/6J, trois jours après infection à l’aide

du virus influenza A/swine/Iowa/4/1976 (H1N1), variant murinisé P32.

Dans leur ensemble, ces observations suggèrent que soit l’épithélium des voies respiratoires

de DBA/2J amplifie la population virale de façon plus importante, soit les macrophages

alvéolaires de C57BL/6J phagocytent et éliminent les particules virales ou limitent la

réplication virale plus efficacement, soit une conjonction de ces deux phénomènes. Par

69

ailleurs, la déficience en facteur C5 du complément jouant un rôle majeur dans la sensibilité

de DBA/2J à Candida albicans (Ashman et al., 2003), l’effet de cette déficience sur la

sensibilité de DBA/2J au virus influenza doit être déterminé.

1.5 Objectifs

D’après les données disponibles dans la littérature et les résultats préliminaires obtenus dans

le laboratoire, il apparaît clairement que trois axes de recherche se dégagent en vue de

préciser l’origine de la sensibilité extrême au virus influenza A, axes qui se traduisent par les

trois objectifs suivants :

Comparaison de la permissivité des cellules de l’arbre respiratoire de DBA/2J et

C57BL/6J au virus influenza A ;

Pour mener cette étude, nous allons extraire, isoler et mettre en culture primaire différents

types cellulaires de l’arbre respiratoire des deux lignées des souris, à savoir les cellules

épithéliales de la trachée, les pneumocytes de type II et les macrophages alvéolaires. Suite à

l’infection de ces cultures cellulaires, le nombre de particules virales produites et présentes

dans les surnageants sera mesuré. L’expression des récepteurs spécifiques du virus influenza

présents en surface des membranes plasmiques de ces cellules sera également analysée et

mise en relation avec les différents degrés de permissivité obtenus.

Etude du rôle des macrophages alvéolaires dans la sensibilité/résistance des souris

DBA/2J et C57BL/6J à l’infection ;

L’influence directe des macrophages alvéolaires dans le différentiel de susceptibilité à

l’infection va être déterminée par des expériences de déplétion et de transfert adoptif des

70

macrophages alvéolaires sur les souris. Les macrophages alvéolaires des deux lignées de

souris seront comparés en termes de capacité de phagocytose des virions, de niveau

d’expression de cytokines/chimiokines et d’aptitude à conditionner les épithéliums

respiratoires contre l’infection virale.

Etude de l’impact de la déficience en facteur C5 du complément sur la sensibilité

des souris DBA/2J à l’infection.

Une expérience de complémentation de souris DBA/2J avec du sérum riche en facteur C5 du

complément avant leur infection in vivo sera mise en place. Cette approche nous permettra

d’évaluer l’importance de la déficience en ce facteur dans la sensibilité extrême des souris

DBA/2j à l’infection par le virus influenza A.

71

2 RESULTATS

2.1 Hyporeactivity of alveolar macrophages and higher respiratory cell

permissivity characterize DBA/2J mice infected by influenza A virus

Résumé

Le virus influenza constitue un problème majeur de santé publique. On estime que chaque

année entre le 10 et 15% de la population mondiale est affectée par une souche saisonnière du

virus influenza A. Dans la plupart des cas, l’infection est limitée à un syndrome fébrile léger

mais, dans les groupes à risque, la maladie peut évoluer gravement en une pneumonie virale,

souvent compliquée par une infection bactérienne secondaire, voire entrainer la mort. Le

modèle murin a été largement utilisé pour étudier l’infection par le virus influenza chez les

mammifères. Parmi le grand éventail de lignées de souris Mx-négatives utilisées, les lignées

DBA/2J et C57BL/6J se sont révélées comme deux extrêmes en termes de

sensibilité/résistance à l’infection par le virus influenza A, quelle que soit la souche virale

employée. Plusieurs équipes ont tenté d’expliquer les raisons de ces différences,

principalement par des approches génétiques ayant eu recours à des analyses QTL des

« Recombinant inbred lines » entre ces deux lignées de souris, ce qui a mené à de très longues

listes de gènes candidats, mais dont leur influence respective n’a malheureusement pas pu être

déterminée. Nous avons choisi une approche phénotypique, en analysant chaque étape de

l’infection, de manière à identifier les facteurs directement liés aux différences de

susceptibilité entre les deux lignées de souris. Les résultats de ces analyses comparatives

menées in vivo et ex vivo suggèrent que la dysfonction des macrophages alvéolaires ainsi que

la permissivité accrue présentée par les cellules des voies respiratoires et du parenchyme

pulmonaire des souris DBA/2J rendraient cette lignée de souris plus sensible à l’infection par

le virus influenza A. Il apparaît également que le facteur C5 du complément, absent chez

72

DBA/2J, ne jouait pas de rôle significatif dans la sensibilité de cette lignée murine au virus

influenza A, dans nos conditions expérimentales.

73

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26134384

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26134384

74

Hyporeactivity of alveolar macrophages and higher respiratory cell permissivity

characterize DBA/2J mice infected by influenza A virus

Tomás Casanova*, Els Van de Paar*, Daniel Desmecht†, and Mutien Garigliany

†.

*, † : contributed equally

Author affiliation

Department of Veterinary Pathology, University of Liège, Boulevard de Colonster 20 (B43),

4000 Liège (Belgium).

Corresponding author

Mutien Garigliany, Department of Veterinary Pathology, University of Liège, Boulevard de

Colonster 20 (B43), 4000 Liège (Belgium). Phone: +3243664074. E-

mail: [email protected]

Keywords

Mouse; influenza; alveolar macrophage; cell permissivity

mailto:[email protected]

75

Abstract

Influenza A virus remains a major public health problem. Mouse models have been widely

used to study influenza infection in mammals. DBA/2J and C57BL/6J represent extremes in

terms of susceptibility to influenza A infection among inbred laboratory mouse strains.

Several studies focused specifically on the factors responsible for the susceptibility of

DBA/2J or the resistance of C57BL/6J and resulted in impressive lists of candidate genes or

factors over- or under-expressed in one of the strains. We adopted a different, phenotypical,

approach to identify the critical steps of the infection process accounting for the differences

between DBA/2J and C57BL/6J strains. We concluded that both a dysfunction of alveolar

macrophages and an increased permissivity of respiratory cells rendered DBA/2J more

susceptible to influenza infection.

Introduction

It is estimated that seasonal influenza globally affects between 5 and 10% of adults and

between 20 and 30% of children every year (WHO 2012). Besides, 3-5 million cases of

severe influenza are recorded yearly, resulting in up to 500,000 deaths worldwide (WHO,

www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/). The annual financial burden of seasonal

influenza (vaccination, general practitioner visits, pharmaceuticals, hospitalizations) is

estimated to 6 to 14 billion euros for the sole Europe and up to ~87 billion US dollars in the

United States (Klepser, 2014; Preaud et al., 2014). Besides, several outbreaks of pandemic

influenza were responsible for a heavier burden in terms of fatalities, among which the most

famous was the 1918 H1N1 influenza pandemic, accounting for up to 50 million deaths

(Murray et al., 2006). The impressive impact influenza virus has on public health resulted in a

tremendous research effort aiming to understand the pathogenesis of influenza infection in

humans. Mouse models of influenza pneumonia have been widely used to describe the disease


76

and to apprehend the virulence factors of different influenza strains or the factors responsible

for variations in the resistance to infection of several mouse strains (Srivastava et al., 2009;

Garigliany et al., 2010). In particular, the DBA/2J and C57BL/6J mouse strains, the former

extremely susceptible, the latter much more resistant to influenza infection, have been widely

used thanks to the availability of large numbers of genetically characterized recombinant lines

of these two parental strains, which greatly helped the QTL analyses of the susceptible or

resistant phenotypes (Boon et al., 2009; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012).

Together with studies on the parental strains, these experiments resulted in long lists of

candidate genes proposed to be responsible for the susceptibility of DBA/2J and for the

resistance of C57BL/6J to influenza infection (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009;

Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon et al., 2014; Dengler et

al., 2014). While it became evident that the susceptibility/resistance traits were multigenic in

origin (Boon et al., 2009; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon et al., 2014),

genes effectively involved in these phenotypes still remain unknown. In addition, a recent

study challenged the reliability of QTL mapping using DBA/2J and C57BL/6J recombinant

inbred lines (Wang et al., 2014).

To help to define the factors involved in the susceptibility of DBA/2J mice to influenza

infection, we adopted a phenotypic approach to identify the critical steps of the infection

process accounting for this extreme susceptibility.

Overall, the data presented here support the role of a dysfunction of alveolar macrophages,

together with an increased permissivity of several cell types of the airways and lung

parenchyma to influenza infection in the higher susceptibility of the DBA/2J strain to this

virus. In our conditions, the C5 complement deficiency in DBA/2J plays little or no role in the

process.

77

Materials and Methods

1. Virus, mouse strains, infection procedures

The mouse-adapted variant of A/Swine/Iowa/4/1976 (H1N1) has been described previously

(Garigliany et al., 2010). Eight-week-old female DBA/2J and C57BL/6J mice were obtained

from Charles River Laboratories (France). Challenge studies were conducted in biosafety

level 2 facilities accredited by the Belgian Council for Laboratory Animal Science, under the

guidance of the Institutional Animal Care and Use Committees of the University of Liège

(No: 13-1503). Mice were housed in microisolator cages ventilated under negative pressure

with HEPA-filtered air. The light/dark cycle was 12/12 h, and the animals were allowed free

access to food and water. Before each inoculation or euthanasia procedure, the animals were

anesthetized by intraperitoneal injection of a mixture of ketamine (50 mg/kg) and xylazine

(30 mg/kg).

Groups of 10 DBA/2J and C57BL/6J mice were intranasally inoculated with 9 PFUs of

mouse-adapted swine H1N1 influenza A virus, as previously described (Garigliany et al.,

2010). Mice were monitored daily for changes in body weight, signs of illness and mortality.

2. Viral titration, histopathology, virus-specific immunohistochemistry and myeloperoxydase

activity

Groups of 4 DBA/2J and C57BL/6J mice were infected as previously described and

euthanized daily by pentobarbital overdosing and exsanguinated by cutting the brachial artery

from day 0 (before infection, negative control) to day 8 post-infection (pi). Lungs were

harvested and, after wet weight was recorded, were homogenized in 1ml of sterile phosphate-

buffered saline (PBS; Lonza, Belgium). Homogenates were centrifuged at 3,000g for 10min

and supernatants were stored at -80°C. Viral titration was performed using the ID Screen®

78

Influenza A Antigen Capture ELISA kit (ID-Vet, France), using a reference lung homogenate

titrated by standard plaque assay to establish a calibration curve.

For the evaluation of microscopic lesions, groups of 4 DBA/2J and C57BL/6J mice were

euthanized at day 0 (before infection, negative control), 3, 6 and 7 after standard intranasal

infection, as previously detailed. Lungs were harvested and fixed in 4% paraformaldehyde

(Sigma-Aldrich, Germany) and processed routinely as 5μm sections stained with hematoxylin

and eosin for histopathological evaluation. Virus-specific immunohistochemical analysis was

performed as previously described (Garigliany et al., 2010).

For myeloxperoxydase (MPO) activity measurement, groups of five DBA/2J and C57BL/6J

were infected and euthanized as previously mentioned from day 0 (negative control) to day 7

pi. Lungs were homogenized in 1.5ml of PBS, centrifuged at 300g for 10min and supernatants

were aliquoted and stored at -80°C for cytokine/chemokine analysis (see below). The pellet

was resuspended in 1ml of PBS. Half of the suspension (500μl) was submitted to a

centrifugation at 4,500g for 10min. The resulting pellet was dissolved in 500μl PBS with

5mg/ml hexadecyltrimethyl ammonium bromide (HTAB) and 5mM

ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich, Germany). After a new

centrifugation at 4,500g for 10min, 50μl of the supernatant was placed in a tube with 50μl

PBS-HTAB-EDTA, 500μl Hank's Buffered Salt Solution, 25μl of 1.25mg/ml o-dianisidine

dihydrochloride and 25μl of 0.05% hydrogen peroxide (Sigma-Aldrich, Germany). The

solution was incubated at 37°C for 15min. The reaction was stopped by adding 25μl of

10mg/ml sodium azide (Sigma-Aldrich, Germany) and the optical density (O.D.) was

measured at 460nm (Multiskan Spectrum spectrophotometer, Thermo Scientific, USA).

79

3. Primary culture of respiratory cells and in vitro infection, ex vivo infection of tracheal

explants

Alveolar macrophages and type II pneumocytes were isolated during the same procedure.

After euthanasia of mice as previously detailed, trachea was sectioned distal to the larynx and

500μl of calcium- and magnesium-free PBS (Lonza, Belgium) containing 0.2% EDTA

(Sigma-Aldrich, Germany) were instilled intratracheally using a 20g catheter (Terumo,

Japan). The instilled solution was aspirated and submitted to centrifugation at 300g for 5min

to pellet alveolar macrophages. Alveolar macrophages (100,000/well) were transferred to 24-

well plates (Greiner BioOne, Germany) in 1ml per well of RPMI (Roswell Park Memorial

Institute) medium containing 2% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin and

0.6% fungizone (Lonza, Belgium) and were incubated at 37°C and 5% CO2. After alveolar

macrophages isolation, 1ml of PBS containing 0.5% dispase (Gibco, Japan) was instilled into

the trachea to the lungs after what the trachea was tightly closed by ligature. Lungs were

immersed for 30min in 8ml of the PBS-dispase solution and incubated at 37°C for 30min.

Lungs were then homogenized and the homogenate was transferred to 40ml of DMEM

medium (Dulbecco’s modified Eagle's Medium; Lonza, Belgium) and vortexed for 5min. The

digested cells were pelleted by centrifugation at 300g for 5min, resuspended and transferred

(100,000/well) to a 24-well plate in 1ml of complete BEBM (Bronchial Epithelial Cell Basal

Medium; Lonza, Belgium) for 4h. After adherence of fibroblasts, non-adherent cells

(pneumocytes) were transferred to a new 24-well plate coated with 300μl/well of BD Matrigel

(BD Biosciences, USA) and incubated at 37°C and 5% CO2.

Epithelial tracheal cells were isolated separately. After careful dissection, the trachea was

harvested, opened and placed in 3ml PBS-dispase solution for 30min at 37°C. Ten ml of

DMEM medium were then added and the mixture was vortexed for 10min. Cells in

80

suspension were pelleted by centrifugation at 300g for 5 min. Fibroblast elimination and cell

culture were performed as previously described for type II cells.

Infection of primary cultures was performed in triplicate using a multiplicity of infection

(MOI) of 1 of the mouse-adapted swine H1N1 influenza strain in 1ml of serum-free DMEM

containing 0,5μg/ml of TPCK trypsin (Sigma-Aldrich, Germany) and 1% penicillin-

streptomycin and 0.6% fungizone. At 24h and 48h pi, 200μl of culture supernatant were

harvested and stored at -80°C. Viral titers were measured as previously described.

Neuraminidase pre-treatment of tracheal epithelial cells was performed using 160mU/ml of

Vibrio cholerae neuraminidase (Sigma-Aldrich) for 3h at 37°C. Serum-free DMEM was used

as a negative control. After two washing steps in PBS, cells were infected as previously

detailed.

Tracheal explants were obtained after careful dissection and opening of the trachea. Each

trachea was placed in an individual well in a 6-well plate and the infection was performed in

the same conditions as for primary cultures of respiratory cells but with 50PFUs/explant.

Culture supernatants were harvested at 24, 48 and 72h pi and viral titers were obtained as

previously described.

4. Flow cytometry analysis of α2,3 and α2,6-linked sialic acids expression using lectin

cytochemistry

Primary cultures of respiratory cells were prepared as previously described from DBA/2J and

C57BL/6J mice. After 24h of culture, cells were harvested in 500μl of trypsin-EDTA solution

1x (Lonza, Belgium), pelleted and resuspended in 500μl of PBS with 1% BSA (bovine serum

albumin; Sigma-Aldrich, Germany) for 1h at room temperature. After one washing step in

PBS, cells were resuspended in 250μl of 1/250 Sambucus nigra (SNA) or Maackia amurensis

(MAAII) (Vector, USA) solution in PBS-BSA and incubated on ice for 18h. After two

81

washing steps in PBS, cells were resuspended in 250μl of 1/500 streptavidin-FITC (Vector,

USA) solution in PBS-BSA and kept on ice for 1h. After two last washing steps, cells were

resuspended in 500μl of PBS and the mean fluorescence intensity was measured using a BD

FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, USA).

5. In vitro evaluation of the phagocytic properties of alveolar macrophages and in vivo

depletion using clodronate

Alveolar macrophages from DBA/2J and C57BL/6J were harvested as previously. Virus

inactivation was performed by 30min direct exposition to UV-light and verification by

subsequent culture. Alveolar macrophages (500,000/well) were incubated with ~100

inactivated viral particles/macrophage in 6-well plates for 14h at 37°C. Cells were harvested,

stained for viral nucleoprotein and submitted to flow cytometry using the protocol detailed in

Garigliany et al. (2012), with the influenza nucleoprotein polyclonal antibody described in

Garigliany et al. (2010).

For the alveolar macrophages depletion assay, groups of 5 DBA/2J and C57BL/6J mice were

treated using liposome-encapsulated dichloromethylene diphosphonate (clodronate;

ClodronateLiposomes.com) as described in Tate et al. (2010). Briefly, mice were treated

under general anaesthesia (as described for the infection process) with a total of 100µl of

clodronate liposomes, in two steps (50µl each), 24h before infection. Five DBA/2J and 5

C57BL/6J were mock-treated with liposomes/PBS and kept as untreated controls. All mice

were infected as previously described and monitored daily for signs of illness and mortality.

The depletion treatment efficacy was assessed by counting the residual alveolar macrophages

after bronchioalveolar lavage.

82

6. Cytokines/chemokines expression in vivo

Sample collection for the analysis of cytokines/chemokines expression in vivo has been

detailed previously (point 2: “Viral titration...and myeloperoxydase activity”). A commercial

ELISA was used to quantify levels of interleukine 6 (IL-6), interferon gamma (IFN-gamma),

monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) (BD OptEIA™ sets; BD biosciences, USA),

macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP-1alpha) and macrophage inflammatory

protein 2 (MIP-2) (Mouse CCL3/MIP-1 alpha and Mouse CXCL2/MIP-2 DuoSets; R&D

Systems, USA), according to manufacturers’ instructions. The levels of CXCL1 chemokine

(KC), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1 β (IL-1 β) were measured using

BD Bead-based immunossays and a BD FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, USA).

7. Expression of cytokines/chemokines mRNAs by alveolar macrophages in vitro

Alveolar macrophages from DBA/2J and C57BL/6J mice were harvested and infected as

previously but using an MOI of 10, in triplicate. Mock-infected alveolar macrophages were

used a controls. At 0, 3, 6, 12 and 48h pi, alveolar macrophages were harvested and submitted

to total RNA extraction using TRIzol reagent (Life Technologies, USA), according to

manufacturer’s instructions. The expression of several cytokines/chemokines mRNAs was

determined as in Dermine (2013). Briefly, total mRNA was retrotranscribed using TaqMan

reverse transcription reagents (Life Technologies, USA), using oligo (dT) primers, according

to manufacturer’s instructions. Quantitative PCRs were performed using SYBR Green PCR

Master Mix and a StepOnePlus qPCR device (Life Technologies, USA). All primers are

detailed in Table 1 and were described in Dermine (2013). Primers for IFNλ, IL-8, KC and

MIP-2 have been described elsewhere (Patten et al., 2010; Shimizu et al., 2013; Mahmutovic-

Persson et al., 2014). CanX was used as house-keeping gene and fold induction values were

calculated from mock-infected controls.

83

8. Role of complement in DBA/2J mice susceptibility

Five DBA/2J mice were rescued by infusion of C5-sufficient serum as described in Ashman

and others (2003). Five control DBA/2J mice received heat-inactivated (56°C, 30 min)

decomplemented serum. One hour after serum injection, both groups of mice were infected by

influenza A virus as previously described. Mice were monitored daily for changes in body

weight, signs of illness and mortality.

9. Statistical analysis

Means and standard deviations were calculated and data of body weight loss, viral titres,

myeloperoxidase activity, mean fluorescence and cytokines/chemokines levels were analysed

using the Student t-test and the GraphPad prism software (GraphPad Software, San Diego,

California; www.graphpad.com).

Results

1. In vivo infection

After infection with 9 PFUs per mouse (a dose known to cause 100% of mortality in DBA/2J

mice and 0% in C57BL/6J; data not shown), death occurred at day 7 and 8 for DBA/2J mice

(Fig1a). A regular but severe weight loss was observed from day 4 to day 8 pi in DBA/2J

mice, culminating at ~ 20% of loss from initial body weight (Fig1b). Lung viral titer

differences between both strains were marked from day 1 pi and the maximal ratio was

observed at day 3 pi (around 8 times higher titer in DBA/2J; Fig1c). In both strains, lung viral

titers toped at day 6 pi before a sharp drop on days 7 and 8 with an almost complete clearance

of the virus. Lung wet weight only slightly increased in C57BL/6J mice while it increased

from day 3 pi onwards and was about twice its control value at day 8 pi in DBA/2J mice

(Fig1d). In parallel, lesions of pneumonia and consolidation were more intense and more

84

widespread in DBA/2J than in C57BL/6J mice (Fig2a). In the latter, lesions were significantly

less pronounced on day 8 pi than on day 7 pi (Fig2a).

Histopathological evaluation of the lungs mirrored the lesions observed macroscopically on

the lungs. As expected, lesions were more severe and diffuse in DBA/2J mice. Only mild

lesions were observed on day 3 pi for both strains, mainly focused on bronchi and bronchioles

(Fig2b). Typically, the bronchial/bronchiolar epithelial necrosis was much more severe for

DBA/2J (Fig2b). On days 6 and 7 pi, a severe diffuse mixed inflammatory infiltrate (with

abundant polymorphonuclear neutrophils) was observed in DBA/2J with a severe necrotizing

bronchitis/bronchiolitis and interstitial pneumonia accompanied by diffuse alveolar damage

and hyaline membranes (Fig2b). Vasculitis was obvious. In C57BL/6J, lesions of pneumonia

were milder and mainly centred around bronchioles and mainly consisted of mononuclear

cells with much fewer neutrophils. Peri-bronchial and peri-vascular cuffing was prominent

(Fig2b).

Immunohistochemical staining of the viral nucleoprotein revealed a more diffuse and more

intense viral replication in the lungs of DBA/2J. In contrast, viral replication was mainly

centred on bronchi, bronchioles and surrounding lung parenchyma in C57BL/6J (Fig2c).

To better define the differences in neutrophilic infiltrates observed on histopatholgy, a

measure of myeloperoxydase activity throughout the infection process was undertaken for

both strains (Fig3a). While the myeloperoxydase activity remained fairly stable in C57BL/6J

from day 0 to day 7 pi, it increased in DBA/2J from day 3 pi to day 7 pi where it attained

more than thrice its control value (Fig3a). To assess if this neutrophilic influx was an intrinsic

property of the DBA/2J mouse strain or simply a reflect of the higher viral lung titers

observed in this strain, we repeated this experiment and included a group of C57BL/6J

infected with about 100 times more viral particles than in the standard experiment, a dose

known to be lethal for 100% of C57BL/6J mice. In this assay, in spite of the expected death of

85

all C57BL/6J infected with this high viral dose, the myeloperoxydase activity remained stable

and indiscernible from that observed in C57BL/6J infected with the low viral dose (Fig3b).

Viral titrations revealed that titers in lungs from heavily infected C57BL/6J were of the same

magnitude or even higher (significant only for day 3 pi) than lung titers from DBA/2J mice

infected with the standard dose (data not shown).

2. Comparative permissivity of tracheal epithelial cells, type II pneumocytes and alveolar

macrophages in vitro and tracheal explants ex vivo

Since differences in in vivo lung titers were obvious early in the infectious process between

DBA/2J and C57BL/6J mice, we wanted to determine if the permissivity of individual cell

types of the airways and lung could account for part or all of this difference. Primary cultures

of alveolar macrophages, type II alveolar cells and tracheal epithelial cells were prepared

from DBA/2J and C57BL/6J mice. After in vitro infection, viral lung titers were significantly

higher for DBA/2J for all three cell types at 48h pi (Fig4a). At 24h pi the difference was

significant only for alveolar macrophages and tracheal epithelial cells (Fig4a). Besides, viral

amplification was much more efficient in tracheal epithelial cells than in type II pneumocytes

and was intermediate in alveolar macrophages, for both mouse strains (Fig4a).

The ex vivo infection of tracheal explants from both mouse strains yielded similar results with

a significantly higher viral titer measured at 72h pi for DBA/2J (Fig4b).

3. Sialic acids expression on respiratory cell types in vitro

Using α2,3- and α2,6-specific lectins, we assessed the expression of both sialic acids linkages

types on the surface of alveolar macrophages, type II alveolar cells and tracheal epithelial

cells from both mouse strains. Both linkage types were expressed on all cell types from

DBA/2J and C57BL/6J mice (Fig5). No difference was observed for the expression of α2,6-

86

linked sialic acids, but there were significantly more α2,3 sialic acids on the alveolar

macrophages and epithelial tracheal cells from susceptible DBA/2J than from resistant

C57BL/6J mice (Fig5).

To assess the impact of this increased α2,3 receptors expression in DBA/2J on the previously

observed greater permissivity of respiratory cells from this strain to influenza virus, we pre-

treated primary cultures of tracheal cells from DBA/2J and C57BL/6J with a neuraminidase

before standard infection. The neuraminidase pre-treatment completely abolished differences

in viral amplification between both mouse strains but did not completely impede the infection

(Fig6).

4. Evaluation of the role played by alveolar macrophages in susceptibility/resistance

We then assessed the in vitro phagocytic activity of inactivated viral particles by alveolar

macrophages from DBA/2J and C57BL/6J. After 14h of incubation of alveolar macrophages

cultures with inactivated virus, the viral uptake was significantly higher for DBA/2J

macrophages compared to that of C57BL/6J (Fig7).

Besides, in vivo depletion of alveolar macrophages was achieved using clodronate treatment

before challenge with standard dose of influenza virus. All mice died from influenza virus

inoculation when they were pretreated with clodronate (Fig8). Clodronate-treated DBA/2J

mice died 2 to 3 days earlier than untreated ones (Fig8).

5. Cytokines/chemokines expression in vivo

Given the role played by alveolar macrophages in the resistance to influenza infection and the

potential involvement of innate immunity in the higher viral amplification properties observed

in vitro and in vivo for DBA/2J, we measured the expression of a set of cytokines and

chemokines during the infection process in vivo. Lung levels of IL-6, TNFα, IFNγ, MCP-1,

87

MIP-1α, MIP-2, KC and IL-1β were compared from D0 to D7 pi for DBA/2J and C57BL/6J

mice (Fig9). The expression of all measured cytokines/chemokines was significantly higher in

DBA/2J mice than in C57BL/6J, after day 3 pi for most cytokines/chemokines and only after

day 6 for MIP-1α and IFNγ (Fig9). The difference was particularly pronounced and marked

from the beginning of the infection for KC and MIP-2 (Fig9). The levels of GCP-2 were not

significantly modified (data not shown).

To test the hypothesis that enhanced KC and MIP2 levels in the DBA/2J might be responsible

for the increased influx of neutrophils in the lungs of this strain, we assessed the effect of

pharmacological inhibition of CXCR2 inhibition, using the SB225002 compound, on DBA/2J

mice susceptibility after influenza infection. SB225002 treatment of mice did not affect the

survival rate, body weight loss, myeloperoxidase activity and MCP-1 and MIP-1α expression,

even if mortality occurred slightly later in treated DBA/2J mice (data not shown).

6. Cytokines/chemokines mRNA expression by alveolar macrophages in vitro

The mRNA expression (fold induction) was measured for a series of cytokines/chemokines

during the first 48h after in vitro infection of DBA/2J and C57BL/6J alveolar macrophages by

influenza virus. Unexpectedly, with the relative exception of KC and IFNλ, the expression of

all measured mRNAs was higher for C57BL/6J macrophages (Fig10).

7. Effect of complement on DBA/2J mice susceptibility

The infusion of complement-sufficient serum in DBA/2J mice before infection by influenza A

virus did not affect the survival rate or body weight loss (Figure 11).

88

Discussion

The extreme susceptibility of the DBA/2J mouse strain to influenza infection has been

demonstrated by several studies for different virus subtypes (Boon et al., 2009; Srivastava et

al., 2009; Alberts et al., 2010; Blazejewska et al., 2011; Trammell et Toth, 2011; Dengler et

al., 2012; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Liberati et al., 2013; Preusse et al.,

2013; Zaraket et al., 2013; Dengler et al., 2014). Most of the studies which addressed the

question adopted a genetic or transcriptomic strategy to identify genes differently expressed

during the course of the infection or which segregated with resistance or susceptibility in

recombinant inbred lines from parental C57BL/6J and DBA/2J mice (Boon et al., 2009;

Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon

et al., 2014; Dengler et al., 2014). These studies resulted in an impressive list of candidate

genes which were differently expressed in DBA/2J and C57BL/6J to potentially explain their

susceptibility or resistance, respectively, but it is still unknown so far if the higher mortality

rate in DBA/2J results from a higher amplification of the virus and/or from differences in

innate or adaptative immunity. Besides, the reliability of QTL mapping using recombinant

inbred lines has been recently challenged, raising some doubts about the results proposed by

these previous studies (Wang et al., 2014). In order to bring new elements of response, we

adopted a phenotypic approach, aiming to describe and compare the different steps of the

infection process which are most likely to explain the differences between both mouse strains.

We used a highly virulent murinized variant of a swine H1N1 influenza A strain for which a

mouse model had been previously described in detail (Garigliany et al., 2010).

First, we described the mortality, lung weight, body weight, lung titers, macroscopic and

microscopic lesions during the course of a standardized infection procedure in DBA/2J and

C57BL/6J, using a viral dose known to cause 100% of mortality in the former and 0% in the

latter. All data converged to confirm a severe, necrotizing and extensive bronchitis,

89

bronchiolitis and pneumonia in DBA/2J mice, with a striking abundance of

polymorphonuclear neutrophils. The more “necrotizing” and neutrophilic character of the

lesions had been previously observed using human PR8 H1N1 strain (Srivastava et al., 2009).

Besides, the importance of neutrophils in the pathogenicity of influenza pneumonia is

consistent with the higher granulocytes/lymphocytes ratio observed in the blood of

susceptible DBA/2J mice during the course of infection (Dengler et al., 2014). To confirm the

predominance of neutrophils in DBA/2J infected lungs, we measured the myeloperoxydase

(MPO) activity throughout the infection (Bradley et al., 1982). While stable for C57BL/6J,

the MPO activity level in DBA/2J mice at day 7 was more than thrice that of day 0,

confirming the massive influx of neutrophils in the lungs of these mice during the infection.

In our model as in other studies (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al.,

2010; Blazejewska et al., 2011; Trammell et al., 2012), the early (from day 1 post-infection)

and strong viral amplification is a hallmark of susceptible DBA/2J mice. It has been

previously suggested that this increased viral load might account for an enhanced level of

cytokines and chemokines (Alberts et al., 2010), which could be responsible for the

neutrophilic influx we and others (Srivastava et al., 2009) observed in DBA/2J. To

specifically address this hypothesis, we infected C57BL/6J mice with a ~ 100 higher dose of

virus than in the standard procedure, leading to 100% of mortality in this “resistant” strain.

We observed that the level of myeloperoxydase activity remained unchanged while lung titers

reached those observed in DBA/2J mice, showing that the higher neutrophilic influx is a

characterisitic of DBA/2J mice independent of the mortality rate and the viral load, since

heavily infected C57BL/6J mice died without this influx. As a consequence, it seems unlikely

that the differences in cytokines and chemokines expression between DBA/2J and C57BL/6J

mice are only due to the higher viral load in the former, as previously suggested (Alberts et

90

al., 2010). Our findings clearly indicate that the higher neutrophilic influx should be regarded

as a feature of DBA/2J influenza pneumonia.

In most studies, including ours, mortality occurred within the 7 or 8 days post-infection,

suggesting that a defective adaptative immunity is not involved in the greater susceptibility of

DBA/2J (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Blazejewska et al.,

2011; Trammell et al., 2012). Further, intramuscular immunization of DBA/2J mice with live

H1N1 virus, even after a single vaccine shot, has been shown to be protective after

subsequent viral challenges, yielding the same level of resistance as in C57BL/6J mice,

showing that DBA/2J mice are fully immunocompetent in terms of adaptative immunity

(Dengler et al., 2012). The higher viral amplification observed in DBA/2J might thus be the

result of defects in the innate immunity and/or of a higher permissivity of the cell populations

of the airways and lung parenchyma of DBA/2J. To answer this question, we prepared

primary cultures of alveolar macrophages, type II pneumocytes and tracheal epithelial cells

from DBA/2J and C57BL/6J mice. We showed that in vitro amplification of influenza virus

by these three cell types was higher for DBA/2J, particularly for alveolar macrophages and

epithelial tracheal cells, than for C57BL/6J. This higher permissivity of DBA/2J respiratory

cells could be the consequence of a defective type I interferon response but it has been

previously shown that DBA/2J mice expressed high levels of IFNβ1 and IFNγ after infection

and that IFN-dependent genes are rather up-regulated in DBA/2J mice, suggesting an intact

interferon response (Alberts et al., 2010). A second hypothesis could be the relative

abundance of the main two types of influenza A receptors, α2,3- and α2,6-linked sialic acids

on the surface of airways and lung cells of DBA/2J. The type and amount of receptors are

well-known elements of the species barrier for influenza A viruses (De Graaf et Fouchier,

2014) and such differences would easily explain the higher replication rate of influenza virus

in respiratory cells of DBA/2J mice. Further, among the numerous candidate genes suggested

91

in previous studies, a difference of expression of the GalNAc-alpha-2,6-sialyltransferase has

been noted between susceptible and resistant mice (Boon et al., 2009). We thus measured the

level of expression of both receptor types on the surface of alveolar macrophages, type II

pneumocytes and tracheal epithelial cells using specific lectins and flow cytometry.

Unexpectedly, there was no difference in α2,6-linked receptors expression between DBA/2J

and C57BL/6J respiratory cells, but there was a clear overexpression of α2,3-linked sialic

acids on the alveolar macrophages and tracheal epithelial cells. Since, in our previous

challenges, tracheal cells were the most permissive of the three cell types we studied, we

wanted to assess the effect of a neuraminidase pre-treatment on the permissivity of tracheal

DBA/2J and C57BL/6J cells to influenza A virus. The neuraminidase pre-treatment abolished

the differences in viral titers between DBA/2J and C57BL/6J, suggesting that the higher

number of α2,3-linked sialic acid receptors accounted, at least for a part, for the higher viral

titers measured in vitro after infection of respiratory cells from DBA/2J and it is likely to be

an important factor in vivo, too. Interestingly, the neuraminidase pre-treatment did not

completely impede the viral replication, suggesting incomplete treatment or alternative route

of entry for the virus, which has been described before (Edinger et al., 2014). Further, the

α2,3 linkage has been shown to predominate in the lower airways of mice (Glaser and others

2007; Ning and others 2009) and mouse-adaptation of human influenza strains is often

associated with a switch to α2,3 specificity (Hensley and others 2009; Keleta and others 2008;

Smeenk and others 1996). In this context, the overexpression of α2,3-linked sialic acids in

DBA/2J airways is consistent with its increased susceptibility to influenza infection.

In addition to the higher amplification of influenza virus by individual cell types of the

DBA/2J respiratory tree, we investigated the phagocytic properties of alveolar macrophages

which, if defective, could have a cumulative effect on the higher viral lung titers measured in

DBA/2J. We measured the uptake of UV-inactivated H1N1 influenza virus particles at 14h

92

post-incubation. Unexpectedly, the uptake was much higher in DBA/2J macrophages,

suggesting that phagocytosis in itself is not defective in this mouse strain. Given the high

amplification of live influenza virus observed in vitro in DBA/2J alveolar macrophages, it is

tempting to suggest that the killing of phagocytosed viral particles is less effective in this

strain and rather results in a productive infection than in viral clearance. This view is

consistent with findings regarding the susceptibility of DBA/2J to Mycobacterium

tuberculosis infection compared to C57BL/6J (Marquis et al., 2009). The transfer of the

chromosome 7 Trl3 (tuberculosis resistance locus 3) region, one of the QTL associated with

resistance in C57BL/6J for this infection, in the DBA/2J genome rendered the congenic mice

much more resistant to the infection, their macrophages becoming able to restrict the infection

(Marquis et al., 2009). These data are likely transposable to influenza virus infection and

alveolar macrophages probably play a central role in DBA/2J susceptibility to influenza. The

role of Trl3 has not been directly assessed for influenza resistance, but some of the genes

proposed in the previous studies on influenza susceptibility of DBA/2J mice belong to this

locus, notably Ifih1 and CXCL11 (Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012). In addition, the

C5 complement factor, for which DBA/2J are deficient (Wetsel et al., 1990), might play a

role since mouse peritoneal macrophages were shown to be inefficient in terms of fungistasis

in the case of absence of C5 in a model using C. neoformans (Brummer et Stevens, 1994). To

evaluate the impact of C5 deficiency on influenza susceptibility, we supplemented DBA/2J

mice with complement-sufficient serum before standard infection procedure. No differences

could be detected in terms of body weight loss, clinical signs or survival rate between

complement-supplemented and unsupplemented DBA/2J mice, suggesting that C5 factor

deficiency is not critical to explain the extreme susceptibility of DBA/2J mice to influenza in

our experimental conditions, while it has been shown to be important with other pathogens

(Ashman and others 2003; Brummer and Stevens 1994) and was associated with prolonged

93

disease, more severe lung lesions and lower survival after H3N2 influenza infection in one

study (Hicks and others 1978). The reasons for these discrepancies regarding the impact on

resistance to influenza infection are unclear, but the procedure we used to supplement

DBA/2J mice for C5 complement factor was successful in increasing their resistance to

Candida albicans (Ashman and others 2003). Besides, the effect of C5 complement on

influenza resistance was demonstrated by others using Balb/c mice, thus with a different

genetic background (Hicks and others 1978). Further, these previous results could only be

observed on a relatively narrow range of infectious doses (Hicks and others 1978) and it is

possible that the infectious dose in our challenges was too high (or the strain too virulent) to

allow these observations. Since this last infectious dose was associated with mild disease and

no mortality in C57BL/6J mice, C5 deficiency is unlikely to explain the gap in

susceptibility/resistance to influenza virus infection between DBA/2J and C57BL/6J mice.

To further determine the role played by alveolar macrophages in the mouse in vivo resistance

to influenza virus, we treated DBA/2J and C57BL/6J mice with clodronate before standard

influenza challenge. Clodronate (dichloromethylene diphosphonate) is selectively taken up by

phagocytic macrophages and accumulates in the cytosol, resulting in macrophages death and

depletion (Tate et al., 2010). Alveolar macrophages depletion abolished the resistance of

C57BL/6J mice. Further, death occurred about two days earlier in clodronate-treated DBA/2J

mice than in untreated ones, suggesting that the relatively deficient DBA/2J alveolar

macrophages still have some protective effects. This experiment reinforces the critical role

played by alveolar macrophages in the resistance to influenza pneumonia in mice.

Besides, we investigated the expression of cytokines and chemokines after influenza infection

by DBA/2J and C57BL/6J in the lungs in vivo and by their alveolar macrophages in vitro. In

agreement with previous studies, all measured cytokines and chemokines were overexpressed

by DBA/2J after influenza infection compared to C57BL/6J, especially after day 3 pi (Boon et

94

al., 2009; Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al.,

2012; Boon et al., 2014). Remarkably, KC and MIP-2 were markedly overexpressed in

DBA/2J and this from the very beginning of the infection. This finding, together with the

prominent neutrophilic infiltrate observed in DBA/2J lungs after influenza infection, suggest a

link of cause and effect between overexpression of these potent neutrophil chemo-attractants

and the neutrophilic influx to the lung. Since CXCR2 seems to be the main chemotactic

receptor involved in the acute inflammation of the lung (Konrad et Reutershan, 2012), we

assessed the effect of its specific pharmacologic inhibition using SB225002 (Herbold et al.,

2010) on the neutrophilic influx, survival rate, body weight, MPO activity, MCP-1 and MIP-

1α expression in DBA/2J mice after influenza A infection. The SB225002 treatment did not

affect any of the parameters at pharmacologically active dosages, suggesting either a role of

CXCR1 receptor in the pathogenesis or the involvement of other chemokines.

Next, we measured by real time PCR the expression of the mRNA of several cytokines and

chemokines by alveolar macrophages from both strains during the first 48h after infection.

Strikingly, with the exception of KC and IFNλ, the expression of all mRNAs was much lower

in DBA/2J macrophages. This apparent hyporeactivity, although at first sight conflicting with

results obtained in vivo, is in agreement with the previous observation that levels of cytokines

in the culture medium of lung slices ex vivo were lower after influenza infection in DBA/2J

than in C57BL/6J (Trammell et al., 2012). The authors suggested that systemic host

inflammatory response was important to explain the cytokines/chemokines burst observed in

vivo in DBA/2J. In addition, the higher granulocytes/lymphocytes ratio described in infected

DBA/2J mice compared to C57BL/6J confirms that there is a systemic cytokinic/chemokinic

reaction (Dengler et al., 2014). Taken together, these observations suggest that cells from the

airways and lung parenchyma, including alveolar macrophages, are probably not directly

responsible for the cytokines/chemokines overexpression measured in vivo in infected

95

DBA/2J when compared to C57BL/6J mice. This lack of specific reactivity of alveolar

macrophages in DBA/2J together with the dramatic effect of clodronate treatment on

C57BL/6J mice suggest a model in which alveolar macrophages are key players in the first

times of the influenza infection process and are largely responsible for the extreme

susceptibility of DBA/2J to influenza pneumonia.

Overall, the results presented in this study show for the first time the involvement of the

permissivity of respiratory cell populations and of a lack of reactivity of alveolar

macrophages in the very low resistance level of DBA/2J to influenza virus. We confirm that

the susceptibility of DBA/2J is multigenic in origin. Individual cell types of the respiratory

tree of DBA/2J show an enhanced in vitro amplification of influenza A virus and this while

the interferon response seems conserved. Epithelial tracheal cells and alveolar macrophages

of DBA/2J express higher amounts of α2,3-linked sialic acid receptors than their C57BL/6J

counterparts, which probably explains, at least in part, their higher permissivity. Alveolar

macrophages of DBA/2J seem to present conserved phagocytic abilities, but our observations

together with those from others suggest that their capacity to kill the virus after phagocytosis

might be deficient. In spite of a general overexpression of cytokines and chemokines in the

lungs of influenza infected DBA/2J mice compared to C57BL/6J, the alveolar macrophages

infected in vitro show the opposite phenotype, with a marked hyporeactivity of DBA/2J

macrophages which suggests that the cytokine/chemokine burst observed in vivo in DBA/2J is

rather systemic in origin. Restoration of complement sufficiency in DBA/2J mice did not

improve their resistance to influenza infection in our hands. The central role played by

alveolar macrophages in influenza resistance is confirmed by the dramatic effect of alveolar

macrophage depletion using clodronate in resistant C57BL/6J mice. Adoptive transfer of

alveolar macrophages will help to define the role played by alveolar macrophages in the

extreme susceptibility of DBA/2J mice to influenza virus. On a molecular point of view,

96

future research should address the question of the replacement of genes included in the Trl3

locus of chromosome 7 on the susceptibility of DBA/2J mice to influenza A virus and other

respiratory pathogens.

Acknowledgments

We thank Wallonie-Bruxelles International and CONICYT PAI/INDUSTRIA 79090016 for

support this PhD project.

97

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102

Table 1. Primers Used for Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction Evaluation of Cytokine/Chemokine mRNA Expression

Gene name Direction Primer sequence Amplicon size (bp) Accession No.

IL-1β Forward 5' – GCAACTGTTCCTGAACTCAAC – 3' 89 NM_008361.3

Reverse 5' – ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT – 3'

IL-6 Forward 5' – AGTGTGAGGCAGAGAGCCAGCAT – 3' 121 M20572.1

Reverse 5' – TGGATGGAAGTCTCCTGCGTGGA – 3'

IL-10 Forward 5' – CACATGCTCCTAGAGCTGCGGACT – 3' 94 M84340.1

Reverse 5' – TCAGGTGATGGCAGGAAGAAAGGCT – 3'

IL-12p35 Forward 5' – CCAAGGTCAGCGTTCCAACA – 3' 90 M86672.1

Reverse 5' – AGAGGAGGTAGCGTGATTGACA – 3'

IL-12/23p40 Forward 5' – CATCTACCGAAGTCCAATGCAAAG – 3' 68 M86671.1

Reverse 5' – GGAATTGTAATAGCGATCCTGAGCTT – 3'

IL-17

Forward 5'– CTCAGACTACCTCAACCGTTC – 3' 180 BC119303.1

Reverse 5' – TTCAGGACCAGGATCTCTTGC – 3'

IL-23p19

Forward 5'– CCGGGAGACCCAACAGATG – 3' 78 NM_031252.2

Reverse 5'– CGAAGGATCTTGGAACGGAGAAG – 3'

IFNα

Forward 5' – GACTTTGGATTTCCCCTGGAG – 3' 115 M68944.1

Reverse 5' – AAGCCTTTGATGTGAAGAGGTTC – 3'

IFNβ

Forward 5' – GTTACACTGCCTTTGCCATCC – 3' 96 X14455.1

Reverse 5' – CAACAATAGTCTCATTCCACCCAG – 3'

IFN λ

Forward 5' – ACCAGGCTCCCAGTGGAA – 3' 83 XM_006540121.1

Reverse 5' – TTTTTGAAGGCCTGCAGCTCT – 3'

TNF-α

Forward 5' – ACCCTCACACTCAGATCATC – 3' 188 BC117057.1

Reverse 5' – GAGTAGACAAGGTACAACCC – 3'

103

MIP-1α

Forward 5' – CCTCTGTCACCTGCTCAACA – 3' 163 NM_011337.2

Reverse 5' – GATGAATTGGCGTGGAATC – 3'

MIP-2

Forward 5' – CCGTCATGGATGTCTACGTG – 3' 170 NM_178241.4

Reverse 5' – CAGCAGCAGGATACCACTGA – 3'

MCP-1

Forward 5' – AGTGTGAGGCAGAGAGCCAGCAT – 3' 120 M20572.1

Reverse 5' – TGGATGGAAGTCTCCTGCGTGGA – 3'

KC Forward 5' – GCTGGGATTCACCTCAAGAAC – 3' 196 NM_008176.3

Reverse 5' – AGCAGTCTGTCTTCTTTCTCC – 3'

RANTES Forward 5' – ACAGCACATGCATCTCCCACAGC – 3' 128 U02298.1

Reverse 5' – ACCCTCGACTTACATGGTGAGGCA – 3'

104

FIG. 1. Survival rates (A) of DBA/2J and C57BL/6J mice after intranasal inoculation with 9

PFUs per mouse of influenza A over a 14-day experimental period. Body weight loss (B) and

lung viral titers (C) were measured over eight days. The lung wet weight (D) was studied over

one week. Five mice were used in each group. All values are mean ± s.d. Student t-test. *P <

0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.

105

FIG. 2. Gross (A) and microscopic (B) appearance of lungs from DBA/2J (A, B, E, F) and

C57BL/6J (C, D, G, H) mice during the course of influenza A infection in vivo. Foci of

consolidation are observed with the evolution of the infection in C57BL/6J and DBA/2J mice

lungs, more obvious in the latter (B). Lung histology (H&E) from both mouse strains shows

the various levels of inflammatory infiltrate consisting predominantly of neutrophils, admixed

with macrophages. Bronchiolar epithelium is damaged and the airspaces contain numerous

neutrophils and fibrin. Expression and distribution of the viral nucleoprotein in the lung tissue

was determined by immunohistochemistry (C, A-H).

106

FIG. 3. Myeloxperoxydase activity determination in lungs from DBA/2J and C57BL/6J mice

after infection with ~9 PFUs (A) or ~9 PFUs and ~877 PFUs H1N1 (B). Student t-test. *P <

0.05 and ***P < 0.001.

107

FIG. 4. Viral titers in the culture supernatant after primary cell cultures (A) and tracheal

explants (B) infection in vitro. The alveolar macrophages (AM), type II alveolar cells (T II P)

and tracheal epithelial cells (TEC) isolated from DBA/2J and C57BL/6J mice were infected

with an MOI of 1 and each tracheal explant was infected with 50 PFUs. Titers are expressed

as PFU/ml. Student t-test. *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.

108

FIG. 5. Expression of alpha 2,3 (MAAII) and alpha 2,6 (SNA) sialic acid receptors on

alveolar macrophages (AM), type II penumocytes (T II P) and tracheal epithelial cells (TEC)

isolated from DBA/2J and C57BL/6J mice. The receptor expression is expressed as mean

fluorescence intensity ± s.d. Student t-test. *P < 0.05, **P < 0.01.

109

FIG. 6. Viral titers in the culture supernatant after pretreatment with neuraminidase (NA) of

tracheal epithelial cells (TEC) in vitro. Titers are expressed as PFU/ml ± s.d. Student t-test.

**P < 0.01

110

FIG. 7. Comparison of alveolar macrophage phagocytic activity from DBA/2J and C57BL/6J

in vitro. The uptake of U.V. inactivated influenza virus particles was assessed after 14h of

incubation by measurement of the intracellular viral nucleoprotein (NP) content by flow

cytometry. Results are expressed as mean fluorescence intensity ± s.d. Student t-test. *P <

0.05.

111

FIG. 8. : Survival rates of clodronate-treated or untreated DBA/2J and C57BL/6J mice during

the course of influenza A infection in vitro. Five mice were used in each group.

112

FIG. 9. Cytokines/chemokines production in the lungs of DBA/2J and C57BL/6J mice during

the course of influenza A infection. Results are expressed as pg/ml ± s.d. Student t-test. *P <

0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.

113

FIG. 10. Cytokines/chemokines mRNA expression (fold induction) by alveolar macrophages

from DBA/2J and C57BL/6J mice after in vitro infection by influenza A virus (MOI of 10).

The mRNA expression of these cytokines/chemokines were assessed by RT-qPCR at different

times post-infection and comparative CT method using CanX as house-keeping gene. Student

t-test. *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001.

114

FIG. 11. Survival rates (A) and body weight follow-up (B) of influenza A infected DBA/2J

mice after infusion of complement-sufficient or heat-inactivated serum.

115

2.2 The critical role played by alveolar macrophages in the resistance to

influenza pneumonia is mediated by type I interferons

Résumé

Le virus influenza constitue un problème majeur de santé publique. Tous les ans, pendant les

épidémies saisonnières, un pourcentage important de la population mondiale (~10%) est

infecté par le virus influenza A. L’impact épidémiologique du virus est encore aggravé par les

épisodes pandémiques dont certains, comme la grippe espagnole de 1918, ont abouti à la mort

de plusieurs dizaines de millions de personnes à travers le monde. Des efforts intenses de

recherche ont eu pour but de mieux comprendre la pathogenèse de cette infection en ayant

recours au modèle murin. Parmi les lignées de souris Mx-négatives étudiées, les souris

DBA/2J et C57BL/6J constituent respectivement deux extrêmes en termes de sensibilité et de

résistance au virus influenza A. Ces différences de susceptibilité ont fait l’objet de

nombreuses études, principalement par des approches génétiques grâce aux analyses des QTL

de croisements entre ces deux lignées de souris. Ces études ont abouti à de grandes listes de

gènes candidats mais permettre de démontrer l’implication directe d’un de ces gènes. Par une

approche phénotypique, nous avons précédemment décrit le rôle majeur joué par les

macrophages alvéolaires dans la sensibilité des souris DBA/2J à l’infection. En particulier, il

apparaissait que les macrophages alvéolaires de DBA/2J présentaient une expression de

cytokines et chimiokines très limitée après leur infection in vitro par le virus influenza, en

comparaison avec ceux de C57BL/6J. Dans la présente étude, nous démontrons par des

expériences de transferts adoptifs que les macrophages alvéolaires conditionnent la résistance

au virus influenza A in vivo chez la souris. De plus, nous montrons que la permissivité accrue

de l’arbre respiratoire de DBA/2J à l’infection virale est la conséquence, au moins en partie,

de l’expression trop faible d’interférons de type I par ses macrophages alvéolaires.

116

The critical role played by alveolar macrophages in the resistance to influenza

pneumonia is mediated by type I interferons

T Casanova, E Van de Paar, E Levy, D Desmecht, M Garigliany

Department of Veterinary Pathology, Fundamental and Applied Research for Animals and

Health (FARAH), University of Liège, Liège, Belgium.

Correspondence: M Garigliany or D Desmecht ([email protected] or

[email protected]); phone: +32 4 366 4075; Fax: +32 4 366 4565

The authors declare no conflict of interest.



117

ABSTRACT

Influenza A virus is a major threat to public health. Among mouse models used to study the

pathogenesis of influenza pneumonia, DBA/2J and C57BL/6J are extremes in terms of

susceptibility and resistance, respectively. In spite of intense research activity on the topic, the

reasons explaining the differences in resistance between these two mouse strains remain

unclear. We recently showed that alveolar macrophages of the susceptible DBA/2J strain

present a reduced expression activity of cytokines and chemokines after in vitro infection by

the virus. Here we show that alveolar macrophages conditions the resistance to influenza A

pneumonia, with a critical role of the levels of type I interferons produced by these

macrophages.

INTRODUCTION

Influenza A virus typically infects 5-10% of the global human population each year during

seasonal epidemics (WHO, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/). Several

pandemics, due to the emergence of highly virulent strains, were observed in the recent

history, among which the 1918 H1N1 pandemic, responsible for an estimated 50 million

casualties worldwide.1 The economic burden of influenza is extremely high in terms of

medical care, loss of work time and reduced productivity, letting alone the associated

mortality.2,3

These facts justify the tremendous research effort that has been made to

understand the pathogenesis of influenza pneumonia.

Mice represent the most widely used animal model of influenza infection.4 Laboratory mice,

most of which are devoid of the protective Mx1 gene,5 vary in their resistance to influenza

pneumonia. Among the Mx-negative strains, DBA/2J and C57BL/6J were extensively studied

as models of susceptible and resistant strains, respectively.6–13

These studies, many of which


118

used recombinant inbred lines between these two parental strains and Quantitative Trait Loci

(QTL) mapping, resulted in large lists of candidate genes proposed to explain the

susceptibility of DBA/2J or the resistance of C57BL/6J to influenza.6–12

But the relevance of

all this genes in the pathogenesis of influenza pneumonia in DBA/2J has never been

confirmed while a recent study challenged the reliability of QTL mapping using recombinant

inbred lines from DBA/2J and C57BL/6J.14

We previously showed that a reduced expression

of several cytokines/chemokines characterized alveolar macrophages (AMs) from DBA/2J

infected by influenza A virus and that depletion of alveolar macrophages abolished the

resistance of C57BL/6J mice.13

The potential link between this reduced cytokinic/chemokinic

reactivity of DBA/2J AMs and their inability to protect mice during influenza infection

remains unclear.

In this study, we show by experiments of adoptive transfers that alveolar macrophages

condition the outcome of influenza infection in mice, since DBA/2J macrophages confer

susceptibility and those from C57BL/6J make recipient mice resistant. We further

demonstrate that a soluble factor expressed by C57BL/6J AMs upon infection is able to

restrict viral replication in mouse pneumocytes. By specific blockade of type I interferons

(IFNs) receptors, we show that this protection is mediated by type I IFNs. Taken together, our

results indicate that the levels of type I IFNs produced by alveolar macrophages in the early

course of influenza lung infection are determinant for the severity of the disease and the

survival rate.

RESULTS

Alveolar macrophages determine the outcome of influenza infection in vivo

To evaluate the role played by alveolar macrophages in the in vivo resistance to influenza

pneumonia, we studied the effect of adoptive transfer of AMs from susceptible DBA/2J or

119

resistant C57BL/6J mice on (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice susceptibility to infection. While

F1 mice showed an intermediate but high level of resistance to influenza infection in terms of

body weight loss, survival rate (80%) and lung lesions, the depletion of their alveolar

macrophages rendered them highly susceptible, resulting in 100% mortality at day 8 post-

infection (Figure 1, 2 and 3). Adoptive transfer of AM from DBA/2J in (DBA/2J X

C57BL/6J) F1 mice was associated with 100% mortality at day 8 post-infection and dramatic

weight loss (Figure 1 and 2). Lung lesions in F1 mice transferred with DBA/2J AM were

characterized by an intense neutrophilic influx, necrotizing bronchiolitis and widespread

diffuse alveolar damage (Figure 3). Similar lesions were observed in AM-depleted F1 mice

(Figure 3). (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice transferred with C57BL/6J AM showed no

mortality, no significant body weight loss after infection and lung lesions restricted to the

peribronchiolar areas (Figure 1, 2 and 3).

Immunohistochemical staining for influenza nucleoprotein showed a stronger and more

widespread presence of viral antigens in bronchioles and alveolae of F1 mice treated with

clodronate or transferred with DBA/2J AMs at day 8 post-infection (Figure 4). PBS-treated

(DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice and those transferred with C57BL/6J showed minimal

infection at this time of the infection (Figure 4).

A soluble factor expressed by infected alveolar macrophages conditions the permissivity

of mouse pneumocytes to infection

Given the high viral titers observed in DBA/2J mice in the early phase of infection, we aimed

to assess the impact of alveolar macrophages on the permissivity of alveolar epithelial cells to

influenza infection. To address this question, we pre-incubated MLE-12 mouse pneumocytes

with UV-sterilized supernatants from infected DBA/2J or C57BL/6J AMs before in vitro

infection of these MLE-12 cells with influenza virus. Lung titers in the supernatants of

120

infected MLE-12 cells were significantly (24 hours post-infection) to highly significantly (48

hours post-infection) decreased by pre-conditioning of the cells by C57BL/6J AMs

supernatant, while supernatant from DBA/2J mice had no significant effect (Figure 5).

Decreased expression of type I interferons by DBA/2J alveolar macrophages is

responsible for the inability of this mouse strain to control influenza infection

It is known that DBA/2J AMs express less type I interferons after in vitro influenza

infection,13

but the cause-to-effect link between this lower expression and the higher

permissivity to influenza virus of alveolar epithelial cells in this mouse strain is still missing.

To specifically answer this question, we repeated the in vitro infection of MLE-12 after pre-

incubation with supernatants from infected DBA/2J or C57BL/6J AMs but this time after

blockade of IFNAR1 receptors by a specific antibody on the surface of MLE-12 cells. The

blockade of IFNAR1 receptors annihilated the inhibitory effect conferred by C57BL/6J AMs

supernatant on influenza replication in MLE-12 cells at 24h and 48h post-infection (Figure

6). Comparatively, IFNAR1 receptors blockade also slightly increased virus yield in MLE-12

cells pre-conditioned by DBA/2J AMs supernatant, but this was significant only at 24h post-

infection (Figure 6).

DISCUSSION

Mouse models have long been used to study influenza pneumonia in mammals. DBA/2J and

C57BL/6J strains are extremes in terms of susceptibility to influenza A infection, the former

highly susceptible, the latter resistant.6,8–12,15–20

Several studies specifically addressed the

question of the extreme susceptibility of DBA/2J to influenza A virus by different approaches

including the use of QTL mapping and recombinant inbred lines, yielding impressive lists of

candidate genes, whose respective role has so far not been confirmed.6–12

Furthermore, the

121

reliability of QTL mapping based on recombinant inbred lines from DBA/2J and C57BL/6J

parental strains has recently been challenged.14

Using a phenotypic approach, we previously

showed that alveolar macrophages from DBA/2J express much less cytokines and

chemokines after in vitro infection by influenza A virus than those from C57BL/6J.13

Together with the higher viral amplification observed soon after infection in DBA/2J mouse

lungs and the high susceptibility conferred to C57BL/6J mice upon depletion of their alveolar

macrophages by clodronate, this result suggests that AMs play a critical role in the

susceptibility to influenza A infection in DBA/2J mice.13

Similar observations in ferrets,21

pigs22

and mouse23–26

confirm the importance of AMs in the innate immune response to

influenza virus. To define the involvement of alveolar macrophages in the respective

susceptibility of DBA/2J and/or the resistance of C57BL/6J to influenza, we performed

adoptive transfer experiments in recipient (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice. The use of F1

mice as recipients was necessary given the fact that DBA/2J and C57BL/6J express different

MHC H2 molecules.27

F1 mice with their own alveolar macrophages showed a high level of

resistance to influenza, but slightly lower than that of C57BL/6J mice. Clodronate treatment

to deplete alveolar macrophages in F1 mice rendered them highly susceptible, with 100%

mortality at day 8 post-infection. Adoptive transfer of DBA/2J alveolar macrophages in

depleted F1 recipient mice did not increase their resistance, while the transfer of C57BL/6J

alveolar macrophages conferred a complete resistance, similar to that of wild-type C57BL/6J

mice in the same conditions.13

One or several functions of alveolar macrophages are thus

essential in the protection against influenza pneumonia. A deficiency in such functions in

DBA/2J mouse alveolar macrophages is responsible for the extreme susceptibility of this

mouse strain to influenza A virus.

DBA/2J are able to mount a protective adaptive immunity against influenza virus after

vaccination.17

Similarly, another model of depletion of alveolar macrophages in mice

122

permitted to conclude that alveolar macrophages are not necessary to the development of an

efficient adaptive immunity.25

We previously showed that influenza infection in DBA/2J mice

results in an earlier (from day 2 post-infection) and much higher viral amplification than in

resistant C57BL/6J, once again ruling out the involvement of adaptive immunity.13

Besides,

depletion of alveolar macrophages in mice is associated with higher viral replication and

higher lung levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, TNF-α and IL-6,24

which is

typically what is observed in DBA/2J mice after influenza infection.6–11,13

The deficient

functions of DBA/2J alveolar macrophages which result in this higher viral amplification

might be related to the central role played by AM in the innate immune response, especially

type I interferons production, and/or to the clearance of viral particles and infected cells via

the phagocytic activity of these macrophages. Since alveolar macrophages from DBA/2J

express much less cytokines and chemokines, including type I IFNs, after in vitro infection

than those from C57BL/6J,13

it is tempting to suggest that the decreased levels of type I IFNs

fail to restrict viral replication in DBA/2J lung tissues. This view is consistent with the fact

that IFNβ1 has been shown to be the most upregulated gene after infection of human alveolar

macrophages by influenza A virus.28

To investigate this hypothesis, we measured the effect of

a pre-conditioning of mouse MLE-12 pneumocytes by UV-inactivated supernatant from

infected DBA/2J or C57BL/6J alveolar macrophages on the virus yield after infection of the

pre-conditioned cells. The supernatant from infected C57BL/6J alveolar macrophages had a

strong antiviral activity, decreasing the viral titer at 48h post-infection by a ~2.7 ratio. Thus,

one or several soluble factors expressed in higher amounts by infected C57BL/6J alveolar

macrophages were able to make MLE-12 cells less permissive to influenza infection. As type

I interferons come first as candidates and since DBA/2J alveolar macrophages show a lower

expression of a broad spectrum of cytokines and chemokines after in vitro influenza

infection,13

we assessed the impact of the specific blockade of IFNAR1 receptors on the

123

protection conferred to MLE-12 cells by supernatant from C57BL/6J AMs. Blocking IFNAR1

receptors annihilated the protective effect of C57BL/6J AMs supernatant, showing that this

effect is mostly mediated by type I IFNs. This observation is consistent with the fact that

alveolar macrophages are the main producers of type I IFNs in the lung upon infection.29

Besides, since type I IFNs limit the expression of pro-inflammatory cytokines and the severity

of lung pathology,30–32

the hypothesis of insufficient type I IFNs production by AMs in

DBA/2J mice is concordant with the cytokinic storm and exacerbated lung lesions observed in

this mouse strain after influenza A infection.6–11,13

This view is reinforced by the high

susceptibility, the higher lung cytokines/chemokines levels and the strong neutrophilic influx

observed in IFNAR-/-

mice infected by influenza A virus.33

Regarding the mechanisms involved in the deficient expression of type I IFNs by DBA/2J

alveolar macrophages, hypotheses can only be speculative. Factors involved in the activation

pathway of IFNα and IFNβ expression might be limiting, due to lower expression or to

affected function linked to mutations. As an example, interferon regulatory factor 7 (IRF7),

essential for type I IFNs expression,34

is part of the trl3 susceptibility/resistance locus on

chromosome 7, thought to be involved in the increased susceptibility of DBA/2J mice to

Mycobacterium tuberculosis.35

Similarly, Ifih1 (or MDA-5, Melanoma Differentiation-

Associated protein 5) is a cytoplasmic sensor of viral RNA which has been suggested to be

linked to DBA/2J susceptibility to influenza A infection.10

It has to be noted here that Ifih1

protein from DBA/2J mouse (GenBank accession number: ABO33314) presents a K to E

substitution at position 368 when compared to that from C57BL/6J36

but this there is currently

no report about a potential dysfunction of this factor in DBA/2J mice. C5 complement factor-

and CD94-deficiencies have been ruled out to explain the high susceptibility of DBA/2J to

influenza A virus.13,37

Another factor, Gpnmb or DC-HIL or osteoactivin, is known to be

absent in DBA/2J mice due to the presence of a premature stop codon, which is thought to

124

induce a high incidence of glaucoma in this mouse strain.38

DC-HIL/gpnmb is a

transmembrane protein expressed on different cell types, including macrophages. It has been

shown that antigen presenting cells from DBA/2J, devoid of DC-HIL/gpnmb, fail to induce

antigen induced immune tolerance when treated with TGFβ2.39

In macrophages, DC-

HIL/gpnmb acts as a feedback regulator of inflammation,40

which would also be a plausible

explanation for the cytokinic storm observed in DBA/2J after influenza A infection, since it is

not expressed in this strain. To our knowledge, a link between the lack of DC-HIL/gpnmb and

a lower type I IFN response in macrophages has never been established, but the availability of

DBA/2J.gpnmb+ mice, which are homozygous for the wild-type version of the protein, would

be helpful to address this question. Additional research is clearly needed to enlighten this

point.

There remains that in addition to the deficient type I interferons response, DBA/2J alveolar

macrophages could also be inefficient in the phagocytosis and destruction of viral particles or

infected cells. We previously showed that the uptake of viral particles by DBA/2J alveolar

macrophages was not affected and that the inactivation of infectious viral particles was likely

deficient.13

A model of Mycobacterium tuberculosis infection showed that DBA/2J alveolar

macrophages were insufficiently activated and unable to control bacterial infection, in spite of

higher levels of inducible nitric oxide synthase than in C57BL/6J macrophages.41

On the same

way, DBA/2J macrophages showed a reduced bactericidal activity in a model of

Pseudomonas aeruginosa infection while phagocytosis in itself was conserved.42

Whether the

reduced microbicidal activity of DBA/2J macrophages is intrinsic or results from a deficient

activation which could be linked to the altered interferon activation remains to be determined.

Overall the results presented in this study demonstrate that alveolar macrophages are

responsible for the high susceptibility of DBA/2J mouse strain to influenza pneumonia. In

particular, DBA/2J alveolar macrophages present a deficient type I interferons response,

125

which fail to protect adjacent lung epithelial cells and results in higher viral lung titers.

Further research should focus on the pathways of activation of type I IFNs expression and on

the deficient microbicidal activity of DBA/2J macrophages.

METHODS

Mice and virus

Eight-week-old DBA/2J and C57BL/6J mice were obtained from Charles River Laboratories

(Saint Germain sur l'Arbresle, France). (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice were obtained by

crossing female DBA/2J and male C57BL/6J mice. Challenge studies were conducted under

biosafety level 2 facilities accredited by the Belgian Council for Laboratory Animal Science

under the guidance of the Institutional Animal Care and Use Committees of the University of

Liège (No: 13-1499).

The mouse-adapted swine H1N1 influenza A virus strain and the in vivo infection procedure

have been described previously.13,43

Adoptive transfer of alveolar macrophages

Depletion of alveolar macrophages was performed on groups of five female (DBA/2J X

C57BL/6J) F1 mice by instillation of 100µl of liposome encapsulated dichloromethylene

diphosphonate (clodronate; ClodronateLiposomes.org, Amsterdam, The Netherlands) as

described in 23

and 13

. Control mice were mock-treated with 100µl liposomes/PBS

(Phosphate-Buffered Saline, Lonza, Verviers, Belgium). Transfer of alveolar macrophages

was performed 24h after clodronate depletion. Depletion efficacy was assessed by counting

residual alveolar macrophages 24h after treatment in bronchoalveolar lavage fluids.

Isolation of alveolar macrophages was performed on groups of five female DBA/2J or

C57BL/6J mice per recipient F1 mouse using the method described in 13

and 44

. Briefly,

126

isolated AMs from five donor mice were pooled (2,5 106 AMs), pelleted by centrifugation at

300g for 5min and resuspended in 100µl of PBS before intranasal instillation of each depleted

(DBA/2J X C57BL/6J) F1 mouse. Standard influenza inoculation of (DBA/2J X C57BL/6J)

F1 mice (PBS-treated, depleted, transferred with DBA/2J or with C57BL/6J macrophages)

was realized 24h after the transfer. Mice were monitored daily for clinical signs, mortality and

body weight changes. Lung samples were harvested on day 8 post-infection from each group

for histopathological and immunohistochemical (targeting influenza nucleoprotein)

evaluation, as described previously.13,43

Assessment of the antiviral activity of supernatants from DBA/2J or C57BL/6J infected

alveolar macrophages

Alveolar macrophages from eight-week-old female DBA/2J and C57BL/6J mice were

isolated as previously. Alveolar macrophages (100,000/well) were transferred to 6-well plates

(Greiner BioOne, Wemmel, Belgium) in 1 mL/well of RPMI (Roswell Park Memorial

Institute) medium containing 2% fetal bovine serum, 1% penicillin–streptomycin and 0.6%

fungizone (Lonza, Verviers, Belgium) and were incubated at 37°C and 5% CO2. Alveolar

macrophages were infected using a multiplicity of infection (MOI) of 10 of the mouse

adapted swine H1N1 influenza strain in 1mL of serum-free RPMI medium for 24h. Culture

supernatant was harvested at 24h post-infection, centrifuged at 300g for 5min to eliminate cell

debris, and UV-inactivated for 30min as described in 13

. MLE-12 mouse pneumocytes (ATCC

CRL-2110) were cultured in 6-well plates (Greiner BioOne, Wemmel, Belgium) in 3ml of

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Lonza, Verviers, Belgium) containing 10%

fetal bovine serum, 1% penicillin–streptomycin, and 0.6% fungizone (Lonza, Verviers,

Belgium). Supernatant from infected DBA/2J or C57BL/6J alveolar macrophages was diluted

1/20 in 2ml serum-free DMEM and transferred to each well of MLE-12 cells, for 14h. Control

127

MLE-12 cells received serum-free DMEM alone. Infection of MLE-12 cells was performed in

triplicate at a MOI of 0.01 of the mouse adapted swine H1N1 influenza strain in 2mL of

serum-free DMEM. Culture supernatants were collected at 24h and 48h post-infection and

stored at -80°C. Viral titers were measured as described in 13

.

For the blockade of IFNAR1 receptors, anti-IFNAR1 antibody clone MAR1–5A3 (Santa Cruz

Biotechnology, Dallas, USA) was diluted at 10µg/ml in 2ml DMEM with 10% fetal bovine

serum, 1% penicillin–streptomycin, and 0.6% fungizone (Lonza, Verviers, Belgium) and

added to MLE-12 cells for 3h at 37°C and 5% CO2. Supernatant from infected alveolar

macrophages from DBA/2J or C57BL/6J was then added to MLE-12 cells 3h after the

addition of anti-IFNAR1 antibody. The infection was performed as previously.

Statistical analysis

Means and standard deviations were calculated and data for body weight loss and viral titers

were analysed by the two-way ANOVA and the post Bonferroni test; and the Student t-test,

respectively, using the GraphPad prism software (GraphPad Software, San Diego, California;

www.graphpad.com).

DISCLOSURE

The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank Jérôme Wayet and Michaël Sarlet for excellent technical support. This work was

supported by Wallonie-Bruxelles International and CONICYT PAI/INDUSTRIA 79090016.

128

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134

FIGURE LEGENDS

Figure 1

Body weight follow-up of (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice (PBS-treated, clodronate depleted,

transferred with DBA/2J or with C57BL/6J macrophages) after intranasal inoculation with 9

PFUs per mouse of H1N1 influenza A virus over a 14-day experimental period.

The p-values for significance were calculated in all pairs between groups/strains for all days

shown in the figure 1 using a two-way ANOVA and Bonferroni test. F1 mice transferred with

alveolar macrophages from DBA/2J susceptible strain showed significant differences in

weight loss compared to F1+C57BL/6J A.M. mice (P < 0.01 for days 5-6 and P < 0.001 for

days 7-8). The F1+clodr+C57BL/6J A.M. mice showed significant differences with

F1+clodronate mice (P < 0.01 for days 5-6-8 and P < 0.001 for day 7) and with F1+PBS mice

(P < 0.1 for day 5).

135

Figure 2

Survival rate of (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice (PBS-treated, clodronate depleted,

transferred with DBA/2J or with C57BL/6J macrophages) after intranasal inoculation with 9

PFUs per mouse of H1N1 influenza A virus over a 14-day experimental period.

136

Figure 3

Microscopic appearance (hematoxylin and eosin) of lungs from (DBA/2J X C57BL/6J) F1

mice (A: PBS-treated; B: clodronate depleted; C: transferred with C57BL/6J alveolar

macrophages; D: transferred with DBA/2J alveolar macrophages) at day 8 after intranasal

inoculation with 9 PFUs per mouse of H1N1 influenza A virus. Foci of lung consolidation,

suppurative to lymphocytic infiltration and diffuse alveolar damage are obvious in F1 mice

treated with clodronate (B) and F1 mice transferred with DBA/2J alveolar macrophages (D).

Original magnification x200.

137

Figure 4

Immunohistochemical staining showing the distribution of influenza antigens (nucleoprotein;

bright red precipitate) in the lung tissues of (DBA/2J X C57BL/6J) F1 mice (A: PBS-treated;

B: clodronate depleted; C: transferred with C57BL/6J alveolar macrophages; D: transferred

with DBA/2J alveolar macrophages) at day 8 after intranasal inoculation with 9 PFUs per

mouse of H1N1 influenza A virus.

138

Figure 5

Viral titers in the culture supernatant of MLE-12 mouse pneumocytes infected by H1N1

influenza A virus. MLE-12 cells were pre-treated with culture supernatants from infected

DBA/2J or C57BL/6J alveolar macrophages during 14h before infection. Titers are expressed

as PFU/mL. Student’s t-test. *P < 0.05, **P < 0.01.

139

Figure 6

Effect of the blockade of IFNAR1 receptors on the viral titers in the culture supernatant at 24h

(A) and 48h (B) after infection of MLE-12 mouse pneumocytes by H1N1 influenza A virus.

MLE-12 cells were pre-treated with culture supernatants from infected DBA/2J or C57BL/6J

alveolar macrophages during 14h before infection. Titers are expressed as PFU/mL. Student’s

t-test. ***P < 0.001.

140

3 DISCUSSION GENERALE

Le virus influenza A constitue un problème majeur tant pour la santé publique que pour la

santé animale. L’Organisation Mondiale de la Santé estime qu’environ 500.000 cas de

mortalité par an dans la population humaine sont associées aux souches saisonnières du virus

de la grippe. Les virus influenza A ont également été responsables de plusieurs épisodes

pandémiques depuis le début du 20ème

siècle, au cours desquels des souches hautement

pathogènes et transmissibles du virus ont causé des millions de décès, la pandémie la plus

célèbre étant la « grippe espagnole » de 1918 avec ~50 millions de morts (Morens et al.,

2010). Face à l’ampleur de cette problématique, de très nombreuses études ont été menées

pour mieux appréhender les caractéristiques, la structure, les facteurs de virulence, les

variations antigéniques et la pathogénie du virus ainsi que l’élaboration et l’étude de

l’efficacité de vaccins. A ce jour, le virus influenza est l’un des virus les plus étudiés.

Néanmoins, les facteurs de résistance de l’hôte à l’infection restent largement méconnus.

Différents modèles animaux ont été utilisés pour étudier la pathogénie de l’infection, la

transmission et le développement de vaccins contre le virus influenza A. Les animaux le plus

souvent utilisés sont le furet, le porc, le cochon d’inde, le hamster, les primates non humains

et, surtout, la souris (Bouvier et Lowen, 2010; Thangavel et Bouvier, 2014). Le modèle murin

présente l’avantage d’une grande reproductibilité des résultats grâce à la disponibilité de

nombreuses lignées consanguines (« inbred lines ») (Bouvier et Lowen, 2010). Parmi les

souches Mx-négatives de souris de laboratoire, plusieurs études ont démontré que les souris

DBA/2J et C57BL/6J constituent deux extrêmes en termes de sensibilité et de résistance à

l’infection par le virus influenza A. Lorsque les souris DBA/ 2J et C57BL/6J ont été infectées

par différentes souches de virus, quelles soient d’origine humaine, aviaire, hautement ou

faiblement pathogènes, murinisées ou pas, la souris DBA/2J s’est systématiquement montrée

141

plus sensible à l’infection (Boon et al., 2009; Srivastava et al., 2009; Nedelko et al., 2012;

Trammell et al., 2012; Dengler et al., 2014). La souris DBA/2J présente des taux de morbidité

et mortalité à l’infection bien plus importants que ceux de C57BL/6J. De plus, les doses

virales nécessaires pour atteindre la maladie sont beaucoup plus faibles chez la souris

DBA/2J. Les lésions pulmonaires, beaucoup plus sévères chez DBA/2J, sont caractérisées

principalement par un infiltrat massif de neutrophiles et macrophages et par la présence d’un

exsudat fibrineux et par la nécrose de l’épithélium des bronches et bronchioles (Boon et al.,

2009; Srivastava et al., 2009; Dengler et al., 2014). Pour essayer d’expliquer les facteurs

responsables de cette différence de sensibilité à l’infection, plusieurs études ont eu recours à

des Recombinant Inbred Lines entre ces deux lignées. Cependant, ces études ont abouti à de

très longues listes de gènes candidats dont l’influence respective n’a pas pu être déterminée

(Boon et al., 2009; Alberts et al., 2010; Nedelko et al., 2012; Trammell et al., 2012; Boon et

al., 2014; Wang et al., 2014). De plus, ces études se sont focalisées exclusivement sur la

réponse à l’infection par DBA/ 2J et C57BL/6J et pas aux caractéristiques intrinsèques

propres de chaque lignée qui pourraient favoriser (ou non) l’infection par le virus influenza A.

Pour apporter de nouveaux éléments de réponse quant aux facteurs responsables de l’extrême

sensibilité de la souche DBA/2J, nous avons opté pour une approche phénotypique, visant à

identifier les étapes de l’infection virale où se maximisent les différences entres les souches

murines sensible et résistante. Notre modèle d’infection s’est basé sur un variant adapté à la

souris, par 32 passages pulmonaires, du virus « A/Swine/Iowa/4/1976 (H1N1) » (P32). Ce

modèle expérimental a recours à deux lignées de souris qui se comportent d’une façon

extrêmement différente suite à une infection par la même dose infectieuse virale. Nous

croyons que c’est la manière la plus objective d’étudier les facteurs associés à la résistance à

l’infection.

142

Une autre manière de procéder aurait pu être d’augmenter la dose infectieuse chez C57BL/6J

de manière à atteindre une morbidité et une mortalité comparables dans les deux lignées de

souris. Cette approche aurait permis de comparer la pathogénie virale dans les deux modèles

de souris avec une symptomatologie comparable. Ainsi, s’il est bien admis que la pathogénie

des virus influenza A varie notablement selon la souche de virus utilisée (Garigliany et al.,

2010), il ne serait pas surprenant de retrouver un phénomène similaire entre deux lignées de

souris différentes infectées par le même virus.

Les résultats préliminaires obtenus par des infections in vivo menées au sein du laboratoire de

Pathologie Systémique de la Faculté de Médecine Vétérinaire de l’Université de Liège ont

confirmé les différences de susceptibilité entre DBA/2J et C57BL/6J. Ces résultats ont mis en

évidence le fait que les poumons de DBA/2J amplifiaient le virus influenza de façon

significativement plus importante que ceux de la souris C57/BL/6J dès les jours 2 et 3 après

infection in vivo et que cette amplification des particules virales provenait principalement des

cellules épithéliales des voies respiratoires, tel que démontré par marquage de la

nucléoprotéine virale par immunohistochimie.

De plus, les lésions microscopiques ont montré une sévère pneumonie caractérisée par un

abondant infiltrat de neutrophiles, accompagnée de bronchite et bronchiolite nécrosantes,

similaires aux caractéristiques histopathologiques décrites après l’infection de souris par

d’autres souches virales, dont le virus PR8 (Srivastava et al., 2009). L’infiltrat pulmonaire de

neutrophiles semble en accord avec les modifications des paramètres sanguins décrites par

Dengler et al. (2014) qui ont mis en évidence une sévère neutrophilie chez DBA/2J,

neutrophilie qui a de plus été proposée comme marqueur de pathogénicité de l’infection

virale. Pour confirmer la sévérité de l’infiltrat neutrophilique, nous avons mesuré l’activité de

la myéloperoxidase (MPO) au niveau des poumons au cours de l’infection. Chez C57BL/6J,

cette activité est restée stable, alors que chez DBA/2J l’afflux massif de neutrophiles se

143

marque rapidement par une augmentation de l’activité MPO dès le jour 3 après infection.

D’autres études ont suggéré que cet afflux de neutrophiles dans les poumons de DBA/2J

pouvait être lié à de hautes concentrations en cytokines pro-inflammatoires et chimiokines

dans le tissu pulmonaire (Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010). Pour déterminer si

l’afflux de neutrophiles était une caractéristique propre à DBA/2J ou le simple reflet d’une

charge virale supérieure chez cette lignée, nous avons infecté des souris C57BL/6J à l’aide

d’une dose virale 100 fois supérieure, de manière à obtenir 100% de mortalité dans cette

lignée résistante. Dans ces conditions, les titres viraux pulmonaires sont proches de ceux

obtenus chez DBA/2J avec la dose « standard », mais il n’y a pas d’afflux de neutrophiles ni

d’augmentation importante de l’activité MPO. Ces données démontrent que l’infiltrat

neutrophilique est une caractéristique intrinsèque à la souche DBA/2J (Casanova et al., 2015).

Par ailleurs, si l’on tient compte du fait que dans la plupart des études la mortalité des souris

DBA/2J intervient aux jours 7-8 après infection virale (Boon et al., 2009; Srivastava et al.,

2009; Alberts et al., 2010; Blazejewska et al., 2011; Trammell et al., 2012) et que

l’immunisation préalable protège efficacement les souris DBA/2J contre l’infection avec des

virus homologues (Dengler et al., 2012), on peut affirmer que DBA/2J est compétente du

point de vue de l’immunité acquise et que son extrême sensibilité est associée à un déficit au

niveau de l’immunité innée. En particulier, DBA/2J semble incapable de contrôler l’infection

virale, avec une amplification massive du virus dès le jour 3 post-infection. Pour expliquer ces

observations, plusieurs hypothèses sont envisageables : soit les cellules des voies respiratoires

de DBA/2J présentent une permissivité accrue au virus influenza A, soit les macrophages

alvéolaires sont déficients en termes de phagocytose ou autres fonctions antivirales, soit une

conjonction de ces phénomènes. Enfin, le rôle du facteur C5 du complément, pour lequel

DBA/2J est déficient, dans la sensibilité au virus influenza A doit être étudié.

144

Pour répondre à ces questions, nous avons tout d’abord entrepris d’isoler plusieurs types

cellulaires de l’arbre respiratoire des souris DBA/2J et C57BL/6J pour en comparer la

permissivité in vitro. La dissection du système respiratoire des souris nous a permis d’obtenir

des cultures primaires de cellules épithéliales de la trachée, de pneumocytes et de

macrophages alvéolaires, ainsi que des explants de trachée. L’infection in vitro de ces cellules

nous a permis de démontrer que, dans nos conditions expérimentales, toutes les cellules

extraites de l’arbre respiratoire de la souris DBA/2J amplifient le virus de façon plus

importante que celles extraites de C57BL/6J (Casanova et al., 2015).

L’évaluation des titres viraux dans les surnageants de culture cellulaire a été effectuée par

mesure des protéines virales produites (nucléoprotéine), avec un kit ELISA commercial que

nous avons validé par rapport à une droite standard déterminée par dilution d’un surnageant

dûment titré par « plaque assay ». Le choix de l’ELISA a été fait pour sa grande

reproductibilité et au vu de la difficulté à obtenir des plages de lyse en « plaque assay » à

l’aide de la souche de virus P32. En effet, la lecture des « plaque assays » nécessite de

marquer par immunocytochimie les antigènes viraux dans chaque puits pour pouvoir

identifier et compter les plages de lyse sous microscope, ce qui en pratique était infaisable à

grande échelle. De plus, même dans ces conditions, le « plaque assay » a démontré un

manque de sensibilité et sous-estime probablement les titres viraux réels. En effet, les

dilutions utilisées pour la mesure des doses létales 50 ont montré que l’infection des souris

par « 1 particule virale » induisait la mort d’un pourcentage significatif des souris (voir

tableau 4 : dose létale), ce qui est évidemment aberrant. Une autre méthode possible aurait

été la PCR en temps réel, basée sur la détection d’un segment du génome viral, mais cette

méthode présente le même désavantage que l’ELISA, à savoir de ne pas distinguer les

particules virales infectieuses des non-infectieuses. Notre objectif étant la mise en évidence de

différences de production de nouvelles particules virales dans différentes conditions, la

145

méthode ELISA employée nous a apporté une évaluation de cette production à la fois fiable,

reproductible et insensible à la dégradation de l’ARN viral ou à l’inactivation du virus.

Ces différences de permissivité au virus sont tout à fait cohérentes avec nos observations in

vivo et renforcent les résultats des titres viraux pulmonaires obtenus dans les travaux de Boon

et al. (2009) et Srivastava et al. (2009), avec les souches virales H1N1 (PR8), H7N7

(SC35M) et H5N1 (HK213). Tant pour DBA/2J que pour C57BL/6J, les macrophages

alvéolaires et surtout les cellules trachéales, sont apparus comme de meilleurs amplificateurs

du virus par rapport aux pneumocytes. Nous avons également confirmé le fait que notre

souche virale murinisée se situe dans le groupe des souches de virus influenza capables de se

répliquer efficacement dans les macrophages alvéolaires (Van Riel et al., 2011). Cette

permissivité augmentée chez DBA/2J pourrait découler d’une réponse interféron déficiente

dans cette lignée, mais il a été démontré que l’expression d’IFNβ1 et d’IFNγ était intacte

(Alberts et al., 2010). Une autre hypothèse serait l’abondance et le type de récepteurs présents

en surface des cellules des voies respiratoires des souris DBA/2J, en comparaison avec

C57BL/6J. Donc, pour tenter d’expliquer cette permissivité accrue présentée par les cellules

épithéliales de la trachée, les pneumocytes et les macrophages alvéolaires de DBA/2J, nous

avons étudié l’expression des acides sialiques liés en α2,6 et en α2,3, les principaux récepteurs

au virus influenza A présents en surface des cellules cibles de la souris (Ning et al., 2009).

Les types de liaison et le niveau d’expression des acides sialiques constituent des facteurs

essentiels dans la barrière d’espèce pour les virus influenza A (Suzuki, 2005). Le cas le plus

étudié est celui de l’expression relative des acides sialiques liés en α2,3 et en α2,6,

prédominants largement dans les cellules des espèces aviaires et chez l’homme,

respectivement ; en conséquence, l’hémagglutinine des souches virales aviaires présente une

affinité accrue pour les acides sialiques en α2,3, alors que les souches humaines sont plus

spécifiques des récepteurs liés en α2,6 (Suzuki, 2005). Pour traverser cette barrière d’espèce,

146

les virus aviaires doivent adapter leur HA de façon à générer une affinité suffisante pour

adhérer efficacement aux cellules humaines exprimant les récepteurs liés en α2,6. Dans le cas

des cellules épithéliales respiratoires du porc, elles expriment les deux types de récepteurs et

sont donc également sensibles aux souches virales aviaires et humaines, ce qui a valu à cette

espèce le surnom de « mixing vessel » de par sa capacité à abriter des co-infections entre

souches aviaires et humaines et à favoriser ainsi leur réassortiment génétique (Crisci et al.,

2013). Pour étudier l’expression des acides sialiques en surface des cellules de DBA/2J et

C57BL/6J, nous avons eu recours aux lectines MAAII pour le marquage des liaisons en α2,3

et SNA pour les liaisons en α2,6. Par analyse en cytométrie en flux, nous avons démontré que

l’expression des acides sialiques liés en α2,3 était significativement plus importante en

surface des cellules épithéliales de la trachée et des macrophages alvéolaires provenant de la

souris DBA/2J (Casanova et al., 2015). Aucune différence significative n’a été identifiée pour

les pneumocytes. Les acides sialiques liés en α2,6 étaient quant à eux également exprimés,

sans présenter de différences significatives entre les deux lignées de souris. Ces résultats sont

cohérents avec ceux décris par Ning et al. (2009) qui ont mis en évidence l’expression des

deux types de récepteurs dans plusieurs organes, dont la trachée et les poumons des souris

BALB/c, mais ils sont en relative contradiction avec les résultats obtenus précédemment par

Ibricevic et al. (2006) qui concluaient à l’absence d’acides sialiques liés en α2,6 dans les

poumons des souris. L’expression accrue des récepteurs liés en α2,3 en surface des cellules de

DBA/2J pourrait avoir un impact direct sur leur permissivité et expliquer au moins en partie la

différence d’amplification des particules virales produites entre les cellules de DBA/2J et

celles de C57BL/6J. Pour étudier spécifiquement ce point, nous avons prétraité des cultures

primaires de cellules épithéliales de la trachée, les plus permissives des trois types cellulaires

étudiés, à l’aide d’une neuraminidase, de manière à éliminer la majeure partie des récepteurs

acides sialiques liés en α2,3 et en α2,6 en surface des cellules. Après infection virale, nous

147

avons constaté que ce prétraitement enzymatique abolissait complètement les différences de

titres viraux entre DBA/2J et C57BL/6J (Casanova et al., 2015). Ces résultats suggèrent que

l’excès de récepteurs acides sialiques liés en α2,3 chez DBA/2J serait au moins en partie

responsable de sa plus grande permissivité au virus influenza A. Ce prétraitement à la

neuraminidase n’as pas empêché complètement la réplication virale, ce qui peut s’expliquer

soit par un traitement incomplet soit par une voie d’entrée alternative pour le virus, comme

cela a déjà été décrit (Edinger et al., 2014). Si l’on considère que les d’acides sialiques liés en

α2,3 sont prédominants dans les voies respiratoires des souris (Glaser et al., 2007; Ning et al.,

2009) et que le processus de murinisation des souches virales d’origine humaine est associé à

des changements au niveau du site de liaison au récepteur de l’HA, se traduisant par une

affinité accrue pour les liaisons en α2,3 (Keleta et al., 2008; Hensley et al., 2009), il apparaît

d’autant plus probable que la surexpression des récepteurs acides sialiques liés en α2,3 joue

un rôle direct dans la sensibilité majeure des souris DBA/2J.

Les titres viraux plus élevés observés chez DBA/2J pourraient, en plus d’une permissivité

augmentée, être la conséquence d’un déficit au niveau de la capacité de phagocytose et

d’élimination des particules virales des macrophages alvéolaires. Nous avons ainsi mesuré

l’absorption de particules virales inactivées aux UV par les macrophages alvéolaires après 14

heures d’incubation, par marquage de la nucléoprotéine virale intracellulaire. De façon

inattendue, les macrophages alvéolaires de DBA/2J ont montré un marquage intracellulaire

trois fois supérieur à celui de C67BL/6J, ce qui démontre que les macrophages alvéolaires de

DBA/2J ne sont pas déficients en termes de phagocytose sensu stricto (Casanova et al., 2015).

Néanmoins, les résultats des infections in vitro réalisées précédemment ayant montré que ces

macrophages amplifiaient le virus de façon exacerbée, en comparaison avec ceux de

C57BL/6J, il est probable que les macrophages alvéolaires de DBA/2J soient incapables de

détruire efficacement les particules virales phagocytées mais, il est aussi probable qu’avec la

148

technique que nous avons employée pour comparer l’efficacité de la phagocytose,

l’internalisation des certaines particules virales inactivées aux UV dans les macrophages

alvéolaires se soit également produite par endocytose comme dans le cycle viral naturel (et

pas seulement pas phagocytose). Il est donc possible que la fluorescence moyenne mesurée

soit en fait l’addition de ces deux phénomènes.

Des observations similaires ont été faites pour les macrophages alvéolaires de DBA/2J après

infection par Pseudomonas aeruginosa, montrant clairement une phagocytose intacte, mais une

activité bactéricide inferieure à celle des macrophages alvéolaires de C57BL/6J (Wilson et al., 2007).

Ces résultats rejoignent également les données obtenues par Marquis et al. (2009) à l’aide

d’un modèle de tuberculose chez DBA/2J, souche très sensible mais qui devient plus

résistante après le transfert de la région Trl3 du chromosome 7 (« tuberculosis resistance

locus 3 »), associé à la résistance de C57BL/6J et identifié par QTL. Cette acquisition de

résistance chez DBA/2J se traduit par la capacité de ses macrophages à contrôler et détruire

les mycobactéries intracellulaires.

Une autre hypothèse à envisager pour expliquer la sensibilité extrême de DBA/2J au virus

influenza A est sa déficience en facteur C5 du complément (Wetsel et al., 1990). Il a ainsi par

exemple été démontré que l’absence de facteur C5 jouait un rôle déterminant dans l’incapacité

des macrophages péritonéaux de DBA/2J à détruire Cryptococcus neoformans (Brummer et

Stevens, 1994). Pour étudier l’impact du facteur C5 sur la sensibilité de DBA/2J au virus

influenza, nous avons supplémenté des souris DBA/2J en facteur C5 par transfert passif de

sérum compétent riche en facteur C5 provenant de souris SJL/J, comme décrit précédemment

dans un modèle d’infection de DBA/2J par Candida albicans (Ashman et al., 2003). Nous

n’avons pas trouvé de différence significative entre les souris DBA/2J complément-

compétentes et les DBA/2J contrôles (supplémentées avec du sérum décomplémenté), ni au

niveau de la perte de poids vif après infection, ni au niveau des signes cliniques ou des taux

149

de survie à l’infection, ce qui suggère que la déficience en facteur C5 du complément chez la

souris DBA/2J n’explique pas, dans nos conditions expérimentales, sa sensibilité au virus

influenza A (Casanova et al., 2015). Une autre étude a permis d’associer la présence du

facteur C5 à une maladie plus légère et à une amélioration des taux de survie après infection

par de faibles doses d’un virus influenza H3N2, effet qui disparaissait suite à l’augmentation

des doses virales (Hicks et al., 1978). Il est donc possible que le facteur C5 du complément

joue un rôle dans la protection contre le virus influenza chez la souris, mais cet effet semble

mineur et non déterminant.

Pour déterminer le rôle des macrophages alvéolaires dans la résistance au virus influenza A,

nous avons étudié l’effet d’une déplétion de ces macrophages par instillation de liposomes de

clodronate avant infection in vivo de souris DBA/2J et C57BL/6J. Le clodronate

(dichloromethylene diphosphonate) est une molécule spécifiquement captée par les

macrophages et qui provoque l’apoptose et la déplétion sélective de ce type cellulaire, dans le

cas présent les macrophages alvéolaires (Tate et al., 2010). Les liposomes constituent un

véhicule permettant d’améliorer la captation par le macrophage et la libération intracellulaire

du clodronate. La déplétion des macrophages alvéolaires a aboli la résistance des souris

C57BL/6J et les a fait succomber à l’infection entre les jours 6-9 après infection, ce que

démontre le rôle central joué par les macrophages alvéolaires dans le développement de la

maladie (Casanova et al., 2015). Les souris DBA/2J traitées au clodronate ont également

présenté une aggravation de la maladie et leur mortalité est intervenue ~1 à 2 jours avant celle

des DBA/2J contrôles, ce qui suggère que les macrophages alvéolaires de DBA/2J, bien que

déficients, confèrent malgré tout un certain degré de protection.

Pour mieux appréhender le développement de la réponse immune innée chez les souris

DBA/2J et C57BL/6J, nous avons étudié l’expression de cytokines et chimiokines produites

dans les poumons de ces souris après infection in vivo. A l’aide d’ELISAs quantitatifs

150

spécifiques, nous avons déterminé les cinétiques d’expression au cours des sept premiers

jours après infection. Nous avons ainsi mis en évidence une surexpression significative de la

plupart des cytokines/chimiokines mesurées chez DBA/2J dès le troisième jour post-infection,

en comparaison avec C57BL/6J. Ces résultats rejoignent les observations faites par d’autres

équipes précédemment, qui ont décrit des patterns d’expression similaires après infection par

d’autres souches de virus influenza et d’autres méthodes de détection (Boon et al., 2009;

Srivastava et al., 2009; Alberts et al., 2010; Trammell et Toth, 2011; Nedelko et al., 2012;

Boon et al., 2014). Ces résultats confirment donc la mise en place d’une « tempête

cytokinique » chez DBA/2J. L’apparition de cette tempête coïncide avec l’explosion des titres

viraux pulmonaires typiquement observée chez cette souche. De façon remarquable, les

chimiokines KC et MIP-2 étaient fortement surexprimées chez DBA/2J, ce qui suggère un

lien de cause à effet avec l’afflux massif de neutrophiles observé concomitamment dans le

poumon de ces souris. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons mesuré l’effet du blocage

du récepteur CXCR2, décrit comme le principal récepteur impliqué dans les désordres

inflammatoires des pneumonies aigues (neutrophiles) et commun aux chimiokines KC et

MIP-2 (Konrad et Reutershan, 2012), sur l’afflux de neutrophiles dans le poumon au cours de

l’infection des souris DBA/2J. Ce blocage pharmacologique a été décrit dans un modèle

murin d’infection à pneumocoque (Herbold et al., 2010), où un traitement à l’aide du

composé « SB225002 » (antagoniste du CXCR2) permettait de diminuer considérablement

l’afflux de neutrophiles et de macrophages dans le poumon. Suite au blocage du récepteur et

après infection par le virus P32, nous avons suivi l’afflux de neutrophiles de façon qualitative

(histopathologie) et quantitative par mesure de l’activité de la MPO, ainsi que le taux de

survie, la perte de poids vif et l’expression des chimiokines MCP-1 et MIP-1α, chez les souris

DBA/2J. Le traitement n’a été associé à aucune variation dans les paramètres analysés, ce qui

151

suggère soit l’implication d’au moins un autre récepteur des chimiokines (par exemple

CXCR1), soit l’influence d’autres cytokines et chimiokines dans la pathogénie de la maladie.

Les macrophages alvéolaires jouant un rôle majeur dans l’induction de la réponse immune

innée, nous avons mesuré par PCR en temps réel l’expression des ARNm d’une série de

cytokines et chimiokines par les macrophages alvéolaires de DBA/2J et C57BL/6J au cours

de l’infection in vitro par le virus influenza.

De façon inattendue, à l’exception de KC et IFNλ, tous les ARNm des cytokines, étaient

largement sous-exprimés par les macrophages alvéolaires de DBA/2J (Casanova et al., 2015).

Dans ces macrophages alvéolaires, l’expression des molécules comme IFN-α, IFN-β, IL-1β,

MIP-1α, MIP-2α, MCP-1 a été pratiquement nulle dans les premières heures après infection,

en comparaison avec les macrophages alvéolaires de la souris résistante, C57BL/6J.

Si l’on regarde plus en détail l’expression des cytokines par les macrophages alvéolaires de

DBA/2J entre une heure et trois heures après infection, on peut observer que l’expression

relative des IFN-β, IFN-λ, IL-10 et IL-23 diminue significativement après une forte hausse

après une heure. Une hypothèse pour expliquer ce « shut off » des macrophages de DBA/2J

serait que la « contre-attaque » du virus, notamment par la production de protéine virale NS1,

et qui cible notamment l’expression d’interférons, serait beaucoup plus efficace dans cette

lignée murine que chez C57BL/6J. Ce phénomène correspondrait à l’effet d’« interférence

inverse » décrit par Lindenmann (1960) et qui a été expliqué principalement par l’action

inhibitrice de la protéine virale NS1 sur l’activation des interférons, grâce à plusieurs

mécanismes de suppression (Egorov et al., 1998; Ayllon et Garcia-Sastre, 2015). Dans une

expérience future, nous pourrions étudier l’effet de la protéine NS1 (et d’autres protéines

virales inhibitrices des IFNs, dont PB1-F2 et PA-X) par modification (mutation, déplétion) du

gène NS1 avant d’infecter les macrophages alvéolaires de DBA/2J pour étudier l’impact des

altérations sur l’expression de cytokines par les macrophages de DBA/2J. Une autre option

152

envisageable pour étudier la capacité intrinsèque des macrophages alvéolaires de DBA/2J

dans la production de cytokines serait de mesurer leur réponse (ex vivo) à un traitement au

Poly I:C, de façon à éviter l’effet potentiel de « shut off » de l’expression de protéines

cellulaires par le virus.

A première vue, ces résultats montrant une quasi-absence d’expression de

cytokines/chimiokines par les macrophages de DBA/2J semblent contradictoires avec la

tempête cytokinique observée dans les poumons après infection in vivo de cette lignée de

souris. Cependant, une autre étude a montré des résultats similaires suite à l’infection ex vivo

par un virus influenza A sur des coupes de poumon, les explants infectés de DBA/2J

exprimant significativement moins de cytokines/chimiokines que ceux de C57BL/6J

(Trammell et al., 2012). Il en ressort donc que la tempête cytokinique observée chez DBA/2J

est probablement d’origine systémique et non pulmonaire. Cette même hypothèse pourrait

expliquer l’abondant infiltrat neutrophilique présent dans les poumons de DBA/2J (Dengler et

al., 2014). De plus, le rôle central des endothéliums dans la « tempête cytokinique » et la

mortalité a aussi été démontré suite à l’infection par le virus influenza A dans le modèle

murin (Teijaro et al., 2011).

Il est à noter ici qu’il aurait également été possible de quantifier directement les cytokines du

surnageant de culture cellulaire à l’aide de la technique ELISA mais vu que cette expérience

visait à étudier très spécifiquement la réponse des macrophages alvéolaires à travers les

cytokines et au début de l’infection dans des moments très précis, l’ELISA aurait eu comme

limitation celle de mesurer une accumulation progressive des cytokines dans les surnageants

au fil des heures. A l’opposé, la PCR en temps réel nous a permis de mettre en évidence de

façon dynamique les variations de concentrations en ARN messagers de ces cytokines avec

un effet cumulatif beaucoup plus limité. Cet avantage nous a ainsi permis de mettre en

évidence de façon très claire une chute de l’expression de certaines cytokines chez les

153

macrophages alvéolaires de DBA/2J entre la première et troisième heure après infection,

résultats qui n’aurait probablement pas été détecté avec l’ELISA.

Il apparaît suite à cette expérience que les macrophages alvéolaires de DBA/2J présentent une

certaine hyporéactivité en termes de production de cytokines/chimiokines dans les poumons

des souris DBA/2J infectées (Casanova et al., 2015). Cette production insuffisante de

cytokines, dont les interférons, pourrait être en partie responsable de l’amplification virale

accrue observée chez DBA/2J, puisque le phénomène d’interférence virale y serait faible

voire inexistant en comparaison avec la situation chez C57BL/6J. Pour définir dans quelle

mesure les macrophages alvéolaires contribuent aux phénotypes « sensible/résistant »

observés chez DBA/2J et C57BL/6J, nous avons mis en œuvre une expérience de transfert

adoptif de macrophages alvéolaires de DBA/2J et C57BL/6J à des souris F1 issues de

croisements entre ces deux lignées de souris. Le recours à des individus F1 était indispensable

pour une question de compatibilité des complexes majeurs d’histocompatibilité. Les souris F1

(4 groupes) ont été d’abord déplétées de leurs macrophages alvéolaires par traitement au

clodronate, avant instillation de macrophages alvéolaires après 48 heures. Deux groupes ont

reçu les macrophages alvéolaires soit de DBA/2J, soit de C57BL/6J, un groupe contrôle a subi

la déplétion de ses macrophages sans transfert et un dernier groupe contrôle a conservé ses

propres macrophages alvéolaires. Suite à l’infection par le virus P32, nous avons suivi

l’évolution du poids vifs et les taux de survie pendant 14 jours. De façon intéressante, le

phénotype de résistance à l’infection par le virus influenza était entièrement associé aux

macrophages alvéolaires de C57BL/6J, alors que les macrophages de DBA/2J augmentaient la

sensibilité des souris F1 à l’infection. Les F1 déplétées de leurs macrophages alvéolaires

étaient également très sensibles et les F1 avec leurs propres macrophages présentaient une

résistance intermédiaire. Il apparaît donc clairement que le macrophage alvéolaire détermine

le devenir de l’infection dans ce modèle de pneumonie à influenza.

154

Il est tentant, au vu de ces résultats, de suggérer que la sensibilité accrue de DBA/2J soit

associée à l’hyporéactivité cytokinique/chimiokinique de ses macrophages alvéolaires et

notamment à leur incapacité à exprimer des concentrations adéquates en molécules antivirales

comme les interférons de type I, IFN-α et IFN-β, dans les premiers temps de l’infection, ce

qui conduirait à une réplication virale incontrôlée dans les voies respiratoires de DBA/2J.

L’excès de cellules inflammatoires et la tempête cytokinique n’apparaissent que dans un

second temps et ne seraient que la conséquence de l’incapacité de DBA/2J à contrôler les

premiers temps de l’infection virale.

Pour tenter de démontrer que l’effet protecteur des macrophages alvéolaires de C57BL/6J

passe par un facteur soluble, nous avons incubé des cultures de cellules MLE-12

(pneumocytes de souris) pendant 14 heures avec les surnageants issus de cultures de

macrophages alvéolaires de DBA/2J et C57BL/6J infectés par le virus P32. Les virions

présents dans ces surnageants ont préalablement été inactivés aux UV pour ne pas provoquer

une infection productive. Suite aux 14 heures d’incubation, les cultures de cellules MLE-12

ont été infectées et les titres viraux ont été mesurés à 24 heures et 48 heures après infection.

Les cellules MLE-12 exposées au surnageant des macrophages de DBA/2J ont amplifié les

particules virales de façon significativement plus importante que celles exposées au

surnageant des macrophages alvéolaires de C57BL/6J. Ce résultat démontre que des facteurs

solubles interviennent dans la protection conférée par les macrophages alvéolaires de

C57BL/6J contre le virus influenza A. Parmi les molécules candidates, les interférons de type

I figurent évidemment au premier plan. Comme les macrophages alvéolaires de DBA/2J

expriment de plus faibles quantités de toute une série de cytokines et chimiokines après

infection in vitro, la seule manière de démontrer l’implication des interférons de type I dans la

protection conférée par les macrophages de C57BL/6J était de bloquer l’effet de ces

interférons à l’aide d’un anticorps spécifique de leur récepteur (IFNAR1). En reproduisant

155

l’expérience de conditionnement des cellules MLE-12 par le surnageant de culture des

macrophages alvéolaires infectés des deux lignées de souris, mais cette fois en bloquant

l’effet des IFNs de type I à l’aide d’un anticorps anti-IFNAR1, nous avons aboli l’effet

protecteur du surnageant provenant des macrophages alvéolaires de C57BL/6J. Ce résultat

démontre que les interférons de type I produits par les macrophages alvéolaires de C57BL/6J

au début de l’infection jouent un rôle majeur dans la permissivité moindre de l’arbre

respiratoire de cette lignée de souris résistante à l’infection par le virus influenza A. Nous

avons choisi les cellules MLE-12 parce qu’elles s’ajustaient le mieux à notre modèle

d’infection ; ce sont, avant tout, des pneumocytes de souris, elles sont permissives au virus

influenza A et, de plus, elles proviennent de la lignée de souris FVB/N, qui est Mx-négative et

qui présente une résistance intermédiaire (entre DBA/2J et C57BL/6J) à l’infection par notre

virus P32 (résultats non publiés).

Ce modèle, qui place le macrophage alvéolaire au centre de la résistance à l’infection par un

virus influenza A, notamment par son niveau d’expression d’IFNs de type I, mériterait de plus

d’être testé pour d’autres modèles animaux de la maladie. En effet, les macrophages

alvéolaires ont été décrits comme indispensables au contrôle de l’infection par le virus

influenza chez le porc et dans d’autres modèles murins, ce qui a été mis en évidence suite à

des expériences de déplétion des macrophages alvéolaires, avec des résultats et dans des

conditions similaires aux nôtres (Kim et al., 2008; Tate et al., 2010). Il est essentiel de

déterminer si nos observations sont seulement valables dans les limites des lignées de souris

et de la souche virale utilisée ou constituent un élément conservé de la pathogénie de la

pneumonie à influenza chez les mammifères. De même, il serait intéressant de tester notre

modèle chez l’homme, espèce dans laquelle une susceptibilité accrue à l’infection a aussi été

décrite dans certains groupes ethniques, comme les habitants des îles polynésiennes,

principalement les îles Samoa, où les épisodes pandémiques se présentent avec des taux de

156

morbidité et mortalité bien supérieurs à la moyenne mondiale (1919; Kool et al., 2013;

Shanks et Brundage, 2013). Les causes de la sensibilité accrue de ces communautés

autochtones au virus influenza restent inconnues à ce jour. Il est tentant, au vu de nos

observations chez la souris, de proposer qu’un mécanisme similaire soit à l’œuvre chez ces

populations, avec une moindre activité des macrophages alvéolaires. Cette hypothèse mérite

d’être spécifiquement envisagée.

D’un autre coté, il a été démontré que le pré-conditionnement de souris par exposition à des

probiotiques comme Lactobacillus sp. conférait une protection contre l’infection par le virus

influenza A par activation de l’immunité innée, en particulier des macrophages alvéolaires

(Park et al., 2013; Nakayama et al., 2014; Zelaya et al., 2015). De plus, des expériences

similaires menées avec des probiotiques chez des personnes volontaires suggèrent que la

protection conférée par la « pré-activation » du système immunitaire est modulée par la

stimulation de la voie des IFNs de type I des macrophages (Sugimura et al., 2015). Cette

observation est tout à fait cohérente avec nos résultats qui démontrent, eux, qu’une lignée de

souris dont les macrophages alvéolaires présentent une plus grande réactivité en termes de

réponse interféron est plus résistante à l’infection par le virus influenza A. Ces évidences

renforcent non seulement l’hypothèse selon laquelle une stimulation rapide des macrophages

alvéolaires dans les premiers temps de l’infection protégeraient contre le virus influenza A,

mais aussi que ce phénomène serait médié principalement par les interférons de type I. Il

ressort aussi de ces recherches que la stimulation précoce de la voie des IFNs de type I dans

les macrophages alvéolaires des mammifères, par des molécules exogènes, pourrait être

utilisée de façon préventive/prophylactique dans les populations sensibles au virus

influenza A.

Certaines études (Van Reeth, 2000; Davidson et al., 2014) mettent en évidence un effet

délétère des IFNs de type I dans la pathogénie et la progression de l’infection par le virus

157

influenza A, notamment par leur implication dans la « tempête cytokinique ». Bien qu’a priori

ces résultats semblent opposés aux nôtres, ils sont en fait très difficiles à comparer car ils ont

été obtenus dans des modèles différents, avec des lignées de souris de fond génétique

différent, ainsi que des souches de virus et des doses infectieuses différentes et, surtout, les

paramètres étudiés ne sont pas les mêmes. En effet, dans le modèle DBA/2J, il y a là aussi des

concentrations en interférons nettement supérieures dans les broyats de poumons au cours de

l’infection et ils participent très certainement à la tempête cytokinique, la morbidité et les

lésions (Casanova et al., 2015). En dépit de cela, nous avons montré qu’une expression locale

et rapide (dans les premiers instants du cycle viral) d’interférons de type I par les

macrophages alvéolaires de C57BL/6J (les souris résistantes) avait un effet protecteur sur

l’épithélium respiratoire. Ce qui est évident, c’est que si l’infection virale est rapidement

maitrisée, il n’y a pas de tempête cytokinique et moins de lésions. Tout est donc une question

de timing et microenvironnement.

D’un autre coté et bien que nous ayons démontré un rôle majeur des interférons de type I

produits pas les macrophages alvéolaires dans la résistance à l’infection, il est aussi possible

qu’un autre produit des macrophages alvéolaires puisse conférer un certain degré de

résistance antivirale aux épithéliums. Il est également envisageable que les épithéliums de

C57BL/6J soient capables de produire des quantités protectrices d’IFNs, ce qui paraît

cependant moins évident, vu la sensibilité extrême à l’infection présentée par les souris

C57BL/6J suite à la déplétion de leurs macrophages alvéolaires. Il serait néanmoins

intéressant d’étudier ces deux possibilités.

158

4 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Les souris DBA/2J et C57BL/6J ont été largement utilisées dans la littérature comme modèles

d’infection par le virus influenza A. Un nombre considérable de gènes-candidats et de

mécanismes divers ont été proposés pour expliquer les phénotypes extrêmes de

sensibilité/résistance de ces deux lignées de souris, sans démonstration irréfutable.

Au terme de cette étude phénotypique, au cours de laquelle nous avons décortiqué les

différentes phases de l’infection pour identifier les étapes où se marquent les différences entre

DBA/2J et C57BL/6J, nous sommes en mesure de placer le macrophage alvéolaire, et en

particulier sa capacité à induire une résistance à l’infection des cellules environnantes par

l’intermédiaire des interférons de type I, en élément central de la résistance à l’infection par le

virus influenza.

Bien que nous ne puissions exclure une capacité moindre des macrophages alvéolaires de

DBA/2J à inactiver les particules virales, il apparaît clairement que le manque d’expression de

cytokines dans les premiers temps de l’infection, en particulier des interférons de type I, ne

permet pas à la souris DBA/2J de contrôler l’infection virale. La déplétion des macrophages

alvéolaires de C57BL/6J abolit sa résistance et le transfert adoptif de macrophages alvéolaires

de C57BL/6J à des souris F1 les rend résistantes à l’infection. Les lésions exacerbées et la

tempête cytokinique observée chez DBA/2J dans les dernières phases de l’infection ne

seraient que la conséquence de l’incapacité de cette lignée de souris à contrôler

l’amplification virale dans les premiers temps de l’infection.

Par ailleurs, nos résultats ont également montré que différents types cellulaires de l’arbre

respiratoire de DBA/2J étaient plus permissifs à l’infection in vitro, ce qui pourrait en partie

être lié à une plus grande expression de récepteurs de type α2,3 en surface de ces cellules mais

aussi également à une réponse interféron inefficace.

159

Enfin, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’effet de la déficience en facteur C5 du

complément sur la sensibilité des souris DBA/2J à l’infection par le virus influenza dans nos

conditions expérimentales.

La suite logique de notre travail semble être l’étude moléculaire de la cascade intracellulaire

d’activation de la réponse interféron dans les macrophages alvéolaires de DBA/2J de façon à

identifier le ou les facteur(s) limitant(s). En parallèle, l’influence possible du virus sur cette

« réactivité moindre » chez DBA/2J devrait également être examinée, notamment par analyse

de l’expression de la protéine NS1 du virus, le principal effecteur viral dans les phénomènes

d’ « interférence inverse » et de « shut off » des fonctions cellulaires.

Des expériences de complémentation au cours desquelles la réponse interféron des souris

DBA/2J serait restaurée permettraient de démontrer de façon irréfutable le rôle central joué

par cette déficience dans la sensibilité extrême de cette lignée murine au virus influenza. Par

ailleurs, au vu de la grande diversité des mécanismes impliqués dans la pathogénie des

pneumonies à virus influenza en fonction de la souche infectante, il serait intéressant de

reproduire les expériences mises en œuvre ici de manière à déterminer si les conclusions que

nous en avons tirées sont applicables à tous les virus influenza A ou seulement à certaines

souches.

Il serait aussi intéressant d’étudier le phénotype des macrophages alvéolaires provenant des

personnes issues de groupes et populations historiquement connus comme plus sensibles à

l’infection par le virus influenza A. Il est en effet envisageable que cette sensibilité accrue soit

également liée à une réponse moins efficace de leurs macrophages alvéolaires en termes de

production d’interférons de type I notamment suite à l’infection virale. Les populations

originaires des Iles de la Polynésie, dont les îles Samoa, seraient des groupes cibles pour

mener ce type d’études. De la même façon, au sein de la population générale, il paraît

160

essentiel d’étudier le lien possible entre le phénotype des macrophages alvéolaires et la

sévérité des symptômes associés à l’infection par le virus influenza A.

On pourrait également imaginer que ce travail puisse signifier le début d’un nouveau champ

de recherche pharmacologique visant à augmenter ou améliorer la réponse interféron des

macrophages alvéolaires des individus particulièrement sensibles au virus influenza A (voire

d’autres virus). La protection conférée grâce à la « pré-activation » des macrophages

alvéolaires par exposition à des probiotiques, démontrée dans d’autres études, confirme que

ce type cellulaire est essentiel à la résistance contre l’infection par le virus influenza A, mais

aussi que cet effet protecteur peut être modulé et optimisé par des stimuli exogènes.

Enfin, si ce mécanisme s’applique à d’autres espèces, il serait possible de sélectionner des

lignées d’animaux domestiques (porc, cheval voire poulet) plus résistantes au virus influenza,

en relation avec la réactivité de leurs macrophages alvéolaires. Cette sélection serait effectuée

suite à une analyse des macrophages alvéolaires récoltés et phénotypés systématiquement

avec nos conditions expérimentales. L’objectif serait d’améliorer le degré de résistance à

l’infection de la descendance.

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