UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU
--------------- UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE
(UFR/SVT)
Mémoire Présenté
Par : Tibila KIENTEGA
Pour l’obtention du Master II
de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées
de l’Université de Ouagadougou
SUR LE THEME:
Parasitoses intestinales en milieu scolaire et détection
de Giardia intestinalis par PCR en temps Réel au
Burkina Faso (BF).
Soutenu le 18 Décembre 2015 devant le jury composé de :
Président : Prof Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou
Membres : Dr Serge P. DIAGBOUGA, Maitre de Recherche, IRSS / CNRST,
Ouagadougou
Dr Florencia W. DJIGMA, Assistante, Université de Ouagadougou
LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE
(LABIOGENE)
N° d’Ordre ............................../LABIOGENE
i
Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA
De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont
incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les
outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du
diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice
par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de
l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du
Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de
fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour
conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité
ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une
surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre
corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des
cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y
rester.
Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a pour but
de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à
disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences
pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires.
Le master BioGeMA est :
Un Master à dimension sous-régionale
Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaires
Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE
Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des
médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres
hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il
ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de
chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la
constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau
africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.
Professeur Jacques SIMPORE
Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire
et de Génétique Moléculaire
UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologie
Université de Ouagadougou – Burkina Faso
ii
DEDICACES
Nous dédions ce travail à nos deux parents qui nous ont quittés. Que Dieu
Tout Puissant vous garde auprès de lui !
A notre chère épouse Judith qui nous a toujours encouragé et soutenu.
A nos enfants chéris: Aude, Guénaël et Ivan, nous espérons que vous
ferez mieux que papa.
A nos frères, sœurs, oncles, cousins, ….
A tous nos proches qui nous ont soutenus d’une manière ou d’une autre.
iii
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé dans le Laboratoire de l’Institut de Recherche en Science de la Santé
(IRSS) et dans le Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquée
(LABIOGENE) logé au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI (CERBA).
Nous exprimons notre profonde gratitude :
A notre Directeur de mémoire, Pr Jacques SIMPORE, Professeur titulaire de Génétique et de
Biologie moléculaires, Coordonnateur du Master en Biologie Moléculaire et en Génétique
Moléculaire Appliquées (BioGeMA), Directeur du CERBA / LABIOGENE, Recteur de
l’Université Saint Thomas d’Aquin, pour avoir accepté de diriger ce mémoire, pour le support
financier de l’étude et pour son encadrement exceptionnel malgré ses multiples occupations.
Au Dr Pokiandi Serge DIAGBOUGA, Maitre de recherche en Microbiologie-Immunologie à
l’IRSS, pour l’encadrement, l’enseignement, le soutien inestimable et la confiance témoignée
lors de la réalisation de ce travail. Merci d’avoir accepté la codirection de ce mémoire.
Au Dr Djénéba OUERMI, Maître assistante, pour son encadrement et ses enseignements.
Au Dr Florencia DJIGMA, Assistante à l’UFR/SVT, pour ses enseignements, son
encadrement et ses conseils et pour avoir accepté de juger ce travail.
Au corps professoral de l’UFR/SVT et en particulier celui du Master de BioGeMA pour la
contribution à notre formation.
A Mlle T. Rébecca COMPAORE, Mr Abdoul K. OUATTARA, Mr Lassina TRAORE, Mr
Serge T. SOUBEIGA et à tous les autres Doctorants du LABIOGENE pour leurs conseils et
appui technique à la réalisation de ce mémoire.
Au Père Albert YONLI et à tout le personnel du CERBA pour l’accueil et l’accompagnement.
Aux étudiants de Master 2 de BioGeMA, pour l’esprit de famille et de solidarité entretenu.
A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine pour son soutien financier à travers le
programme PACER2.
Au Pr Gueladio CISSE, Investigateur principal du projet « Vegetable Go to School » et son
équipe au Swiss TPH, notamment Séverine Erismann et Astrid Knoblauch pour le soutien
financier, les conseils et la collaboration à la réalisation de ce mémoire.
Au personnel du Laboratoire de l’IRSS, pour l’appui lors de la collecte des échantillons.
iv
RESUME :
Introduction : Les parasitoses intestinales constituent un problème majeur de santé publique
pour la population burkinabé. L’objectif de la présente étude a été de caractériser les parasites
intestinaux dont Giardia intestinalis particulièrement chez les écoliers au Burkina Faso. Ce
travail a été réalisé dans un contexte de mise en œuvre de programme de prévention des
maladies associées à l’hygiène défectueuse.
Méthodes : Il s’est agi d’une étude transversale descriptive qui a eu lieu du 20 Décembre
2014 au 31 Août 2015 chez des élèves dans huit écoles des régions du Centre-ouest et du
Plateau-central du Burina Faso. L’âge de ces élèves variait entre 8 et 14 ans. Un examen
parasitologique des selles a été réalisé à deux reprises sur deux échantillons de selles obtenus
sur deux jours consécutifs chez chaque participant. Les selles contenant des kystes de Giardia
intestinalis ont fait l’objet d’une confirmation de la présence par PCR en temps réel.
Résultats : Au total, 441 enfants d’âge scolaire ont été examinés. La prévalence moyenne des
enfants parasités pour l’ensemble des régions a été de 81,6 %. Les écoles des villages du
Centre-ouest ont présenté une plus forte prévalence en parasites intestinaux (89,0 %) par
rapport aux écoles des villages du Plateau-central (74,4 %). Des poly parasitismes ont été
observés dans 49,2 % des échantillons, qui ont présenté parfois deux, trois, quatre ou cinq
parasites à la fois. Le parasite le plus représenté a été Entamoeba histolytica / dispar (67,4 %).
A la microscopie, Giardia intestinalis est venu en troisième position après Entamoeba coli
(35,4 %) avec une prévalence de 25,9 %. Il est le plus souvent retrouvé en association avec
Entamoeba histolytica / dispar (63,8 %). L’helminthe le plus fréquent a été Hymenolepis
nana, avec une prévalence de 6,8 %. La PCR en temps réel réalisé sur un total de 97
échantillons (94 positifs et 03 négatifs) a confirmé 77,3 % des résultats de la microscopie,
contre 22,7 % des échantillons contenant des kystes à la microscopie qui se sont révélés
négatifs à la PCR.
Conclusion : A travers cette étude, la PCR en temps réel a été appliquée à la recherche de
Giardia intestinalis, un protozoaire intestinal qui touche les enfants avec de nombreuses
infestations récurrentes et ou rechutes. C’est la première étude de caractérisation moléculaire
de ce parasite au Burkina Faso. Nos travaux confirment la présence et l’ampleur des
protozooses intestinales parmi les enfants dans les villages ou zones rurales du pays.
Mots clés : Burkina Faso, parasitoses intestinales, Giardia intestinalis, PCR en Temps Réel.
v
ABSTRACT :
Introduction: Intestinal parasitoses remain a major public health problem in Burkina Faso
population.The aim of this study was to characterize the intestinal parasites whose Giardia
intestinalis particularly in stools of school age children at Burkina Faso. This work was carry
out in context of prevention programme implementation of defective hygiene associated
diseases.
Methods: It was about a descriptive cross-sectional study which started December 20, 2014
at August 31, 2015 at pupils of eight schools of Western Center and Central Plate areas of
Burkina Faso. Stool parasitological examination was carried out twice on two stools for each
participant during two consecutive days. The pupil’s age varied between 8 and 14 years. Stool
samples containing cysts of Giardia intestinalis were the subject of parasite detection by real
time PCR.
Results: Total population of 441 school age children were examined.The average prevalence
of parasitized pupils was 81.6 %. The schools of Western Center villages presented a stronger
rate of intestinal parasites (89.0 %) compared to the schools of central Plate villages (74.4 %).
A multiple parasites associations were found in 49.2 % of the samples, which sometimes
presented two, three, four or five parasites at the same time.The most widespread parasite was
Entamoeba histolytica / dispar (67.4 %). By microscopy, Giardia intestinalis came in third
position with a rate from total prevalence of 25.9 % after Entamoeba coli (35.4 %). It is
generally in association with Entamoeba histolytica / dispar (63.8 %). The most frequent
helminth was Hymenolepis nana, with a prevalence of 6.8 %. The real time PCR on a total of
97 samples (94 positive and 03 negative) confirmed 77.3 % of microscopy results, however,
22.7 % of samples presenting cysts at microscopy appeared negative with the Real Time PCR.
Conclusion: Through this study, the real time PCR was applied in Giardia intestinalis search,
an intestinal protozoon which concerns children with many recurring infestations and or
relapses.It is the first molecular study of this parasite characterization in Burkina Faso.Our
work confirms the presence and the width of the intestinal protozooses among the children in
the villages or rural zones of the country.
Key words: Burkina Faso, intestinal parasitoses, Giardia intestinalis, Real Time PCR.
vi
SOMMAIRE
Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ..................................................................... 1
DEDICACES ............................................................................................................................. ii
REMERCIEMENTS ................................................................................................................. iii
RESUME : ................................................................................................................................. iv
ABSTRACT : ............................................................................................................................. v
SOMMAIRE ............................................................................................................................. vi
LISTE DES FIGURES : .......................................................................................................... viii
LISTE DES TABLEAUX : ..................................................................................................... viii
ABREVIATIONS : ................................................................................................................... ix
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1
PARTIE 1 : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................. 4
1- GENERALITES SUR LES PARASITOSES INTESTINALES .................................... 4
1-1- Définition ........................................................................................................................ 4
1-2- Mode de contamination des parasites intestinaux ........................................................... 4
1-3- Aires de répartition des parasitoses intestinales et importance en pathologie clinique .. 5
1-4- Agents des parasitoses intestinales-classification ........................................................... 6
1-5- Méthodes de diagnostic ................................................................................................... 8
1-6- Mesures de lutte ............................................................................................................ 10
1-7- Traitement des parasitoses intestinales : ....................................................................... 10
2- RAPPEL SUR LA GIARDIOSE .................................................................................. 10
2-1- Le parasite ..................................................................................................................... 11
2-1.1 Définition/historique : ..................................................................................................... 11
2-1.2 Taxonomie : .................................................................................................................... 11
2-1.3 Morphologie .................................................................................................................. 13
2-1.4 Biologie: ........................................................................................................................ 14
2-1.5 Le Génome de Giardia intestinalis ................................................................................. 16
vii
2-2- Épidémiologie de la giardiose ....................................................................................... 17
2-3- Méthodes diagnostiques ................................................................................................ 18
2-4- Traitement et prévention ............................................................................................... 19
PARTIE 2 : NOTRE ETUDE .................................................................................................. 20
1- OBJECTIFS DE L’ETUDE .......................................................................................... 20
2- MATERIELS ET METHODES .................................................................................... 20
2-1- Milieu de l’étude (cadre et champs d’étude) ................................................................. 20
2-2- Type et période d’étude ................................................................................................. 22
2-3- Population d’étude / Échantillonnage. .......................................................................... 23
2-4- Méthodes, techniques et instruments de collecte de données ....................................... 23
2-5- Analyse parasitologique des selles ................................................................................ 24
2-6- Diagnostic moléculaire : PCR en Temps Réel .............................................................. 26
2-6.1 Extraction de l’ADN des kystes à partir des selles ......................................................... 26
2-6.2 PCR en temps réel ........................................................................................................... 27
2-7- Considérations éthiques ................................................................................................. 28
2-8- Méthode de traitement des données. ............................................................................. 28
3- RESULTATS ................................................................................................................ 29
3-1- Population d’étude ......................................................................................................... 29
3-2- Prévalence des parasitoses intestinales ......................................................................... 33
3-3- Résultats de la PCR en temps réel ................................................................................. 42
4- DISCUSSION ............................................................................................................... 46
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................... 53
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................. 54
ANNEXES ............................................................................................................................... 64
viii
LISTE DES FIGURES :
Figure 1 : Forme végétative de Giardia intestinalis ............................................................... 13
Figure 2 : Schéma d'un kyste de Giardia intestinalis ............................................................. 14
Figure 3 : Schéma des réservoirs et voies de contamination de Giardia intestinalis. ............ 15
Figure 4: cycle évolutif de Giardia intestinalis. ..................................................................... 16
Figure 5: localisation des écoles (villages) cibles ................................................................... 21
Figure 6 : Images de deux kystes de G. intestinalis vus à l’examen direct ............................. 33
Figure 7 : Trophozoïte d’Entamoeba coli observé à l’examen direct ..................................... 33
Figure 8 : Hymenolepis nana observé à l’examen direct ........................................................ 34
Figure 9 : Balantidium coli à l’examen direct. ........................................................................ 34
Figure 10: Répartition des différentes formes de G. intestinalis rencontrés ........................... 38
Figure 11 : Graphique du résultat de l'amplification par la PCR en temps réel ...................... 42
Figure 12 : Résumé comparatif des résultats de la PCR en temps réel avec la microscopie .. 45
LISTE DES TABLEAUX :
Tableau I : Répartition de la population totale enquêtée selon l’école et le sexe : ................. 29
Tableau II : caractéristiques sociodémographique de la population ayant fait l’objet de la
PCR en temps réel : .................................................................................................................. 31
Tableau III : Autres caractéristiques sociodémographiques et socioéconomiques de la
population : ............................................................................................................................... 32
Tableau IV : Répartition globale des enfants parasités par école ........................................... 35
Tableau V : Prévalence des différents parasites intestinaux selon l’école d’origine : ............ 36
Tableau VI : Polyparasitisme par école sur la population totale (441 élèves) ........................ 37
Tableau VII : Coexistence Giardia intestinalis et autres parasites fréquents ........................ 38
Tableau VIII : Répartition des parasites les plus fréquents sur les 120 échantillons selon les
critères sociodémographiques. ................................................................................................. 40
Tableau IX : Répartition des parasites rencontrés sur les 97 échantillons selon d’autres
critères sociodémographique ou économiques ......................................................................... 41
Tableau X : Résultats de la PCR en temps réel selon les critères sociodémographiques : ..... 43
Tableau XI : Résultats de la PCR en temps réel selon d’autres critères sociodémographiques
et / ou socioéconomiques ......................................................................................................... 44
Tableau XII : confrontation des résultats de la microscopie à ceux de la PCR en Temps Réel:
.................................................................................................................................................. 45
ix
ABREVIATIONS :
ADN Acide Désoxyribonucléique
ARN Acide RiboNucléique
ARNr ARN ribosomique
BHQ Black Hole Quencher
CERBA Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni
EDTA Ethylène Diamine Tétra-acétique
EFIA Elongation Factor 1 Alpha
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Essay
g gradient
Gdh glutamate déshydrogénase
IFI Immunofluorescence Indirecte
IRSS Institut de Recherche en Science de la Santé
LABIOGENE Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire
M molaire
NaCl Chlorure de Sodium
OMD Objectif du Millénaire pour le Développement
PBS Phosphate Buffer Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
Rpm Rotation par minute
SIDA Syndrome d’Immunodéficience Humaine
SSU rRNA ou rRNA 18S Small Subunit of ribosomal Ribonucleic Acid
TAMRA 6-carboxytétraméthylrhodamine
Taq Thermophilus aquaticus
TBE Tris Borate EDTA
TE Tampon d’Elution
TPI Triose Phosphate Isomerase
VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine
WASH Water, Sanitation and Hygiene
INTRODUCTION ET ENONCE DU PROBLEME
1
INTRODUCTION
Dans le monde, les parasitoses intestinales constituent un sérieux problème de santé publique.
Il a été estimé que plus de trois milliards de personnes sont infestées par les parasites
intestinaux dans le monde (Keiser et Utzinger, 2010). Ces parasitoses intestinales,
généralement provoquées par les helminthes et les protozoaires intestinaux, restent fréquentes
surtout dans les pays à hygiène précaire dont le nôtre. En effet, une étude récente réalisée à
Bobo Dioulasso au Burkina Faso (BF) sur les demandes d’examen parasitologique à la
recherche d’étiologie de gastroentérites a montré une prévalence globale des parasitoses
intestinales de 65,3 %, dont la majorité (53 %) sont transmises par l’eau sale (Sangare et al.,
2015). Parmi les protozoaires, Entamoeba histolytica (E. histolytica) a un rôle majeur dans la
survenue de syndromes dysentériques dits amibiens. D’autres protozoaires ont un rôle plus
discutable. Cependant, Giardia intestinalis (G. intestinalis) et Trichomonas intestinalis (T.
intestinalis) doivent retenir l'attention car assez fréquents (Niyizurugero et al., 2013). En
2005, l’incidence mondiale de la Giardiose a été évaluée entre 20-60% (Yakoob et al., 2005).
Dans les pays à climat tropicaux, un fort pourcentage d'enfants, même élevés dans de bonnes
conditions d'hygiène, sont porteurs d’helminthes comme Schistosoma mansoni, Trichuris
trichiura, Ascaris lumbricoides, Taenia saginata (Nyantekyi et al., 2014).
Ces parasitoses mettent à mal le parcours scolaire des enfants du fait qu’elles entrainent une
insuffisance pondérale, des retards de croissance, d’importants coûts pour les soins, un
manque d’attention en classe, l’absentéisme à l’école (Mamo, 2014), de même que l’abandon
scolaire voire la pauvreté et donc l’incapacité des parents à honorer les frais de scolarité.
Outre ces effets néfastes, d’autres études ont montré que les enfants atteints de ces parasitoses
intestinales sont plus affectés par différentes autres maladies infectieuses comparées à
d’autres non infestés (Yentur et al., 2014). Ainsi ces pathologies constituent des causes de
morbidité dans les pays tropicaux surtout parmi les enfants affectés par le VIH (Jegede et al.,
2014).
Le diagnostic de ces maladies se fait principalement par microscopie optique. Cependant, la
microscopie bien que considérée comme standard pour la détection des parasites intestinaux
(Verweij et al., 2003), demeure faiblement sensible. L’utilisation de la PCR en Temps Réel
permet d’augmenter significativement la sensibilité et la spécificité de la détection ou
caractérisation de certains parasites dont Giardia intestinalis. Ce protozoaire est très fréquent
2
chez l’enfant et même chez l’adulte ; il a été retrouvé chez 43,74 % de sujets de 5 mois à 72
ans souffrant de gastroentérites reçu au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou
(CMSCO) (Karou et al., 2011). Il provoque chez ces derniers des infestations récurrentes ou
de rechutes faites de diarrhée souvent alternée de constipation. L’évaluation de sa prévalence
par la biologie moléculaire nous permet d’être renseignés sur l’efficacité du diagnostic
microscopique.
Au Burkina Faso, la tranche d’âge de la population de 6 à 11 ans, est la plus nombreuse, soit 2
943 055, représentant 18% de la population totale (Sources : INSD, recensement 2006). Cette
tranche d’âge est celle qui est la plus touchée en matière d’infestations parasitaires. Ce groupe
correspond aux enfants en âge scolaire, la population cible de cette étude. L’objectif de cette
étude a été de déterminer la prévalence des parasitoses intestinales en milieu scolaire et de
mettre à profit la PCR en Temps Réel pour confirmer la présence de kystes de Giardia
intestinalis observés en microscopie ordinaire.
Énoncé du problème
Les parasitoses intestinales présentent toujours un fort taux de morbidité dans le monde,
surtout dans les régions tropicales et dans les pays en développement. A l’heure actuelle, sur
le plan de la lutte, les parasitoses intestinales ne sont pas considérées en termes de gravité
comme d’autres maladies comme le VIH-SIDA et le paludisme, si bien qu’elles demeurent un
problème majeur de santé publique dans nos contrées. Les facteurs favorables à l’existence de
ces pathologies sont essentiellement les conditions climatiques (tropicales), les conditions
d'hygiène et d’assainissement rudimentaires, la malnutrition, la pauvreté et le manque
d’encadrement des ménages (Bouree et al., 1984). En conséquence, des millions de personnes
sont affectées à travers le monde dont la grande majorité des cas se retrouvent dans les pays
en développement (OMS, 2012). Ces maladies sont particulièrement sévères chez l’enfant
chez qui, elles sont à l’origine de malnutrition, d’anémie, de faible résistance aux infections et
du fort taux de mortalité infantiles (Yentur et al., 2014).
Parmi les parasites incriminés, Giardia intestinalis est très souvent retrouvé dans les selles
d’enfants (Fonseca et al., 2014). Cette espèce est identifiable à la microscopie ordinaire et
caractérisable par la biologie moléculaire (PCR en Temps Réel), technique plus sensible
(Elsafi et al., 2013). Il existe très peu de données de surveillance sur la prévalence de ce
parasite. Une approche de la prise en charge des giardioses intégrant cet aspect pour une
prévention en amont (niveau animal) à travers l’identification des génotypes incriminés et le
3
contrôle de la qualité du diagnostic microscopique par la biologie moléculaire devient de plus
en plus nécessaire. En effet, la PCR en temps réel n’a pas encore été utilisée pour la détection
de ce parasite dans notre pays.
De nombreuses initiatives pour résoudre les problèmes sanitaires liés aux parasites intestinaux
ont été prises dans le passé. Il s’agit des programmes Water Sanitation Hygiene (WASH)
engagés par des ONG (Terre des Hommes par exemple), du projet intégré de lutte contre les
maladies négligées au BF lancé depuis 2007 par notre pays ; et du projet VGTS (Vegetable
Go to School ou les légumes vont à l’école) qui a vu le jour en 2014. Ces programmes visent
d’une part à accroître la perception et la connaissance des populations sur l’hygiène,
l’assainissement et la santé, et d’autre part à traiter tout cas de parasitose diagnostiqué.
En dépit de ces efforts, beaucoup d’enfants demeurent affectés. De nouvelles initiatives de
contrôle s’avèrent indispensables. L'évaluation soigneuse des mesures de contrôle des
parasitoses est essentielle pour s'assurer qu'elles sont rentables. Cependant, l'obtention de
résultats probants exige une connaissance de l’épidémiologie des parasites (dont G.
intestinalis) et la disponibilité de données fiables sur celle-ci.
C’est pourquoi la présente étude s’est donnée pour objectif de caractériser les parasites
intestinaux dont Giardia intestinalis particulièrement chez les enfants d’âge scolaires au BF.
Elle a permis d’obtenir des informations précises sur les parasitoses intestinales de l’enfant et
surtout de Giardia intestinalis en milieu scolaire dans deux régions du BF et a permis de
susciter la mise en œuvre de programme efficace et efficient pour leur contrôle.
PARTIE 1 : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
4
PARTIE 1 : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1- GENERALITES SUR LES PARASITOSES INTESTINALES
1-1- Définition
Les parasites sont des êtres vivants qui, pendant une partie ou la totalité de leur existence,
vivent aux dépens d'autres êtres appelés hôtes. On parle de parasitisme, lorsque la présence du
parasite est d’emblée pathogène pour son hôte (Zee et Zinkham, 1975). L’infestation est la
pénétration d'un parasite non microbien dans l'organisme.
Certains parasites se développent dans le tube digestif de l’hôte et sont à l’origine de
symptomatologie diverses au niveau intestinal et ou stomacal ; ce sont les parasites
intestinaux et les maladies provoquées sont appelées parasitoses intestinales. Parmi les
parasites en cause, on distingue des Métazoaires et des Protozoaires. Les Protozoaires sont des
êtres unicellulaires dépourvus de chlorophylle doués de mouvement. Ils se multiplient par
mitose ou par reproduction sexuée (Faust et Jung, 1956). Les Métazoaires quant à eux sont
des êtres pluricellulaires renfermant entre autres les Plathelminthes et les Némathelminthes à
localisation intestinale. Ces parasites pour survivre, s’adaptent à l’environnement dans lequel
ils se trouvent en subissant différentes transformations. Le cycle de développement du
parasite est la suite des transformations se déroulant dans un ordre précis avec ou sans passage
dans le milieu extérieur, que doit subir celui-ci depuis la naissance au stade adulte
reproducteur (Centeno-Lima et al., 2013). Ainsi, chez les protozoaires, lorsque les conditions
ne sont pas favorables à leur développement, certains se transforme en kystes qui sont des
formes de résistance (Erlandsen et al., 1996).
1-2- Mode de contamination des parasites intestinaux
Les parasites intestinaux peuvent pénétrer dans l'organisme par deux voies différentes : la
voie buccale et la voie transcutanée.
- Pénétration par voie buccale :
La contamination se fait par ingestion d'éléments infestant contenus dans l'eau ou les aliments
souillés à la faveur d'une faute d'hygiène : cas d’œufs embryonnés d'ascaris ou de
5
trichocéphale, de kystes mûrs d'amibes, de Giardia ou oocystes mûrs de coccidies, de larves
de ténias (Feng et Xiao, 2011).
- Pénétration par voie transcutanée :
Elle se fait de façon active par effraction cutanée. Ce mode de contamination est le fait des
larves strongyloïdes ou d'anguillules, d'ankylostome et de furcocercaire de schistosomes
(Terer et al., 2013).
1-3- Aires de répartition des parasitoses intestinales et importance en pathologie
clinique
1-3.1 Répartition géographique:
On distingue deux groupes :
- Les parasitoses cosmopolites :
Elles peuvent s'observer sur toute la surface du globe. Cependant, elles sont plus fréquentes en
zones tropicales et intertropicales qu'en zones tempérées (Sulaiman et al., 2004; Brandonisio,
2006) : amibiase, giardiose, trichomonose, ascaridiose, trichocéphalose, téniasis.
- Les parasitoses tropicales et intertropicales
Ce sont des parasitoses qui sévissent à l'état endémique exclusivement dans les régions
chaudes et humides du globe (Sulaiman et al., 2004) : nécatorose, anguillulose, bilharziose.
1-3.2 Importance des parasitoses intestinales sur le plan clinique
Au cours de ces deux dernières décennies, les parasitoses intestinales ont fait l'objet de
nombreuses études. Ces études ont permis de situer la place occupée par les parasitoses
intestinales dans l'ensemble de la pathologie infectieuse.
Les parasites peuvent exercer sur l'organisme des actions diverses quelquefois isolées,
généralement associées, qui rendent souvent complexe la pathogénie des maladies parasitaires
(Bouree et Aube, 1987). On distingue cinq types d'action sur l'organisme :
- Action spoliatrice :
Tout parasite s'accroit plus ou moins directement aux dépens de l'organisme auquel il dérobe
une partie des substances assimilables. Cette action peut être insignifiante (ascaris, oxyure)
ou très importante (ankylostomes) (Zenian et Gillin, 1985; Yentur et al., 2014).
6
- Action toxique:
Elle est due aux toxines libérées au moment de la piqûre des hôtes vecteurs ou au moment de
la pénétration transcutanée des larves. Elle peut être aussi due aux toxines sécrétées par
certains parasites à l'intérieur de l'organisme (toxines nécrosantes des amibes, toxine
hémolytique des bothriocéphales, etc...) (Aubry, 1984; Bouree et Aube, 1987).
- Action traumatique :
Elle est liée à l’effraction cutanée lors de la piqûre des vecteurs et lors de la pénétration des
larves de vers. Cette effraction cutanée constitue une porte d'entrée pour la surinfection.
Elle est aussi due à l’effraction des tissus lors de la migration des formes larvaires, de même
qu’à l’ulcération de l'intestin par les amibes (Aubry, 1984; Zenian et Gillin, 1985).
- Action mécanique:
C’est l’obstruction de l'intestin ou du canal de WIRSUNG par un paquet d’ascaris (Zenian et
Gillin, 1985).
- Action inflammatoire et irritative :
Certains parasites occasionnent par leur présence même, une irritation plus ou moins intense.
On peut citer par exemple, l'irritation du côlon par certains protozoaires entraînant une
diarrhée (Chapoutot et al., 1997; Enserink et al., 2015).
1-4- Agents des parasitoses intestinales-classification
Les parasites intestinaux de l’homme peuvent être subdivisés selon leur forme microscopique
en deux grands groupes que sont les protozoaires intestinaux (unicellulaires) et les helminthes
intestinaux (pluricellulaires) (Suzuki et al., 2013).
1-4.1 Les protozoaires intestinaux
En fonction de l'appareil locomoteur, on distingue quatre classes : les rhizopodes, les
flagellés, les ciliés et les sporozoaires (Goldsmith et Heyneman, 1989).
- Classe des rhizopodes :
Ils se déplacent à l'aide de pseudopodes (amibes surtout) : Entamoeba histolytica, Entamoeba
coli, Entamoeba hartmanni, Endolimax nana, Pseudolimax butschlii….
7
- Classe des flagellés :
Ils se déplacent à l'aide de flagelles : Trichomonas intestinalis, Giardia intestinalis,
Chilomastix mesnilii, Retortamonas intestinalis,….
- Classe des ciliés :
Ils se déplacent à l'aide de cils vibratiles. Seul Balantidium coli possède un intérêt médical.
- Classe des sporozoaires / Coccidies :
Ils sont dépourvus d'appareil locomoteur différencié. Ce sont surtout: Isospora belli,
Sarcocystis hominis et Cryptosporidium spp.
1-4.2 Les helminthes intestinaux
Ce sont des êtres pluricellulaires possédant des tissus différenciés. Ils sont reconnus sous
formes adultes des deux sexes, sous forme larvaire, embryonnaire ou ovulaire.
On distingue: les némathelminthes ou vers ronds ou nématodes et les plathelminthes ou vers
plats subdivisés en cestodes et en trématodes (Suzuki et al., 2013).
- Les nématodes
Ce sont pour la plupart des vers ovipares à sexes séparés. Les nématodes intestinaux
spécifiques de l'Homme sont : Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Ascaris
lumbricoïdes, Enterobius vermicularis, Strongyloïdes stercoralis, Trichuris trichiura.
- Les plathelminthes
Cestodes
Ce sont des vers généralement hermaphrodites, dépourvus de tube digestif et ayant un corps
segmenté : Taenia saginata, Taenia solium, Hymenolepis nana,….
Les trématodes
Ils sont pourvus d'un tube digestif incomplet et d'un corps non segmenté. On distingue les
douves (hermaphrodites) et les schistosomes (à sexes séparés).
Les douves: Fasciola hepatica, Dicrocoelium dendriticum, Fasciolopsis bush,
Clonorchis sinensis.
Certaines sont de localisation hépatique, mais leurs œufs sont éliminés dans l'intestin.
Les schistosomes ou bilharzies: Schistosoma mansoni, Schistosoma intercalatum,
Schistosoma japonicum, Schistosoma guinneensis,… (Suzuki et al., 2013).
8
1-5- Méthodes de diagnostic
Chaque parasite n’est bien mis en évidence que par la technique qui lui est adaptée.
1-5.1 Techniques de conservation :
- La conservation provisoire au froid à +4°C : bonne conservation des kystes de
protozoaires et ou d’œufs d’helminthes, avec cependant une mort rapide des trophozoïtes
de protozoaires et aussi des larves d’anguillules (Kuk et al., 2012).
- La conservation des œufs d’helminthes et kystes de protozoaires (Kuk et al., 2012) :
La congélation à -80°C ou -20°C, pendant de longues périodes.
La méthode à l’eau formolée (5 – 20% V/V d’eau distillée ou physiologique) ; elle
donne une bonne conservation tant que le prélèvement reste liquide.
- La conservation des formes végétatives d’amibes en quelques semaines :
Mercurothiolate-Iode-Formol (MIF) (Verweij et al., 2003).
1-5.2 Technique de détection coprologique :
Le diagnostic parasitologique des affections intestinales repose sur un examen coprologique
pour la mise en évidence de l’agent pathogène sous l’une ou l’autre de ses différentes formes
(adultes, larves, œufs, kystes, levures ou filaments) dans les principaux secteurs accessibles
(selles, sang, urines, liquide broncho alvéolaire, prélèvements muqueux…). Ainsi, pour de
nombreuses infections intestinales parasitaires, le standard d’or diagnostique reste l’examen
microscopique des selles fraîches (natives) ou des selles fixées (Verweij et al., 2003).
Cependant, un examen négatif isolé n’a aucune valeur d’élimination et de ce fait, le
prélèvement doit être refait ; idéalement, il faut pratiquer trois examens à quelques jours
d’intervalles avant d’affirmer la négativité. Une seule analyse ne permet de déceler la
présence de parasites que dans 29 % des cas (Guy et al., 2004). Les raisons sont multiples :
- La rareté des éléments parasitaires ;
- L’efficacité des techniques utilisées ;
- Une période muette de rejet d’éléments caractéristiques : giardiose, amibose, nématodes.
Aussi, le diagnostic direct peut se faire à l’œil nu pour la mise évidence des parasite adultes
(ascaris, ténia, anguillules,…) ou nécessiter la mise en œuvre de techniques particulières
tendant à concentrer par centrifugation, filtration, ou la mise en œuvre de techniques
9
d’extraction (technique de Baermann dans l’anguillulose). Certains parasites doivent faire
l’objet d’une recherche spéciale (coloration spéciale pour Cryptosporidia, Microsporidia). En
ce qui concerne les oxyures, la méthode de choix est celle de la bande adhésive ou Scotch test
de Graham.
L’examen des selles doit être réalisé dans l’heure suivant son émission avec quelques
particularités sinon il faut les fixer avec comme conséquence la perte de mobilité des
trophozoïtes (Kuk et al., 2012).
1-5.3 Diagnostic indirect d’orientation :
Il peut être spécifique : sérologique à la recherche d’anticorps ou d’antigènes circulants ; ou
aspécifique : protidogramme, modifications de l’hémogramme telle que l’anémie,
l’éosinophilie (Loscher et Saathoff, 2008).
Les réactions immunologiques surtout sérologiques à la recherche d’anticorps ou d’antigènes
circulants, doivent être idéalement :
- spécifiques d’espèce et si possible de stade : réactions de précipitation, analyse immuno
électrophorétique, co-électrosynérèse ;
- sensible et quantitative : IFI, méthode ELISA, réactions d’agglutination directe ou de
lyse, d’agglutination passive de particules de « latex », d’hémagglutination passive, de
déviation ou fixation du complément.
Les examens sérologiques sont optimaux pour les parasites qui, du fait de l’envahissement
intestinal et du passage dans les tissus, provoquent une réaction par production d’anticorps
(Strongyloides stercoralis). Toutefois, lors de l’interprétation de tels tests sérologiques, il
convient de prendre en considération aussi bien la sensibilité et la spécificité que les réactions
croisées. De même, la sérologie peut être négative durant la phase aiguë d’une maladie et doit
être répétée deux à quatre semaines plus tard, préférablement au bout de trois mois en cas de
soupçon de schistosomiase (Whitty et al., 2000).
Outre l’éosinophilie, une augmentation du taux global des IgE peut également indiquer
diverses maladies parasitaires (Reese et Lehrer, 2000).
1-5.4 Techniques moléculaires : PCR (polymerase Chain réaction)
La mise au point récente de techniques de recherche de parasites par biologie moléculaire, est
d’un apport précieux. Ainsi, on peut caractériser certains parasites intestinaux par PCR
qualitative et ou par PCR quantitative (en temps réel) (Mathis et al., 1996).
10
1-6- Mesures de lutte
Les parasitoses intestinales sont des maladies liées au péril fécal. Le péril fécal est l'ensemble
des risques et des dangers causés par les excréments, les urines et les ordures déposés sans
précautions dans la nature (Boltanski, 1954). Par conséquent, la prophylaxie va reposer sur la
mise en œuvre d'un ensemble de moyens tendant à l'éradication du péril fécal. Pour une
prophylaxie efficace et durable, les précautions suivantes sont à prendre:
- Lutte contre le réservoir des parasites
Il est nécessaire de dépister et de traiter les sujets malades et les porteurs asymptomatiques
découverts lors d'examens parasitologiques systématiques. Des traitements de masse aux
antihelminthiques sont assurés dans certains pays et le risque de résistance n’est pas écarté
(Geerts et Gryseels, 2001).
- Lutte contre les hôtes intermédiaires : le dépistage et les soins des animaux, la
destruction des mollusques dangereux dans les eaux douces pour les schistosomiases.
- Protection de l'homme sain : la promotion de l'hygiène individuelle, la lutte contre les
mouches, le contrôle sanitaire du circuit alimentaire et l’éducation sanitaire: il faut éviter
la contamination de l'eau par un approvisionnement en eau potable soit par des circuits
de distribution, de station de traitement, soit par la construction de puits.
1-7- Traitement des parasitoses intestinales :
En principe, un traitement n’est pertinent que lorsque l’agent pathogène a été mis en évidence
et que le tableau clinique concorde également. Tous les agents pathogènes détectés dans les
selles sont loin d’être responsables de troubles gastro-intestinaux (Shukla et Sidhu, 2011;
Veenemans et al., 2011).
2- RAPPEL SUR LA GIARDIOSE
La giardiose, aussi appelée lambliase, est une parasitose intestinale due au protozoaire
flagellé, G. intestinalis (synonymes : Giardia lamblia, Giardia duodenalis, Lamblia
intestinalis). G. intestinalis est le protozoaire cosmopolite le plus commun au cours des
11
infections intestinales humaines (Adam, 2001). L’enfant est le plus touché par rapport à
l’adulte (Basset et al., 1986).
2-1- Le parasite
2-1.1 Définition / historique :
Le genre Giardia a été décrit initialement par van Leeuwenhoek en 1681 dans ses propres
selles diarrhéiques.
Par la suite, il a été décrit plus en détails par Lambl en 1859 qui a pensé qu’il appartenait au
genre Cercomonas et l’a nommé Cercomonas intestinalis (Adam, 2001).
En 1879, Grassi a nommé un organisme de rongeur Dimorphus muris (maintenant connu
comme appartenant au genre Giardia) ignorant la première description de Lambl.
Entre 1882 et 1883, Kunstler a décrit un organisme dans un têtard (G. agilis ?), qu’il a nommé
Giardia pour la première fois comme nom de genre.
En 1888, Blanchard a suggéré le nom Lamblia intestinalis avant que Stiles lui ait attribué le
nom G. duodenalis en 1902 (Stiles, 1902).
Plus tard, en 1915, Kofoid et Christiansen, ont proposé le nom G. lamblia et ensuite, G.
enterica en 1920 (Kofoid et Christiansen, 1915).
En 1952, Filice a publié une description détaillée de Giardia et a proposé trois espèces sur la
base de la morphologie du corps médian : G. duodenalis, G. muris, and G. agilis.
Le nom d’espèce G. lamblia a été largement admis dans les années 1970 (Hill et al., 1984;
Farthing et al., 1986).
Au début des années 1980, certains auteurs ont encouragé l'utilisation du nom G. duodenalis
et après les années 1990, le nom G. intestinalis a été proposé par d’autres (Fraser et al., 1997;
Adam, 2001).
2-1.2 Taxonomie :
Selon la classification la plus récente (Adam, 2001) Giardia duodenalis est un organisme
unicellulaire faisant partie:
- Du règne des Protozoaires (eucaryotes unicellulaires) ;
12
- Du phylum des Sarcomastigophora, du sous-phylum Mastigophora (flagellés
intestinaux) ;
- De l’ordre des Diplomonadida caractérisé par une symétrie bilatérale ;
- De la famille des Hexamitidae (présence de 8 flagelles) ;
- Du genre Giardia (présence d'un disque adhésif ventral).
La taxonomie du genre Giardia est basée sur la morphologie ; en particulier sur la forme du
trophozoïte, des corps médians et sur la taille du disque ventral adhésif comparé à la taille de
la cellule. Ainsi, on a : Giardia agilis, Giardia muris, Giardia duodenalis, Giardia psittaci et
Giardia ardeae, Giardia microti (Monis et Thompson, 2003).
L’unité morphologique des isolats retrouvés masque en réalité une considérable diversité
génétique et biotypique (Meloni et al., 1995). Les données taxonomiques ont ainsi dû être
reconsidérées (Monis et Thompson, 2003).
Les isolats de Giardia intestinalis provenant d’humains et d’autres mammifères sont retrouvés
dans deux assemblages génétiques: Assemblage A et Assemblage B (Monis et al., 1996).
L’Assemblage A étant lui-même séparé en deux groupes : A-I et A-II. A-I comprend des
isolats retrouvés aussi bien chez les humains que chez les animaux. L’isolat A-II est connu
pour être retrouvé exclusivement chez les humains (Thompson et al., 2000). Une étude plus
récente vient cependant de retrouver des isolats A-II chez des animaux domestiques (Ponce-
Macotela et al., 2002).
L’Assemblage B est essentiellement retrouvé chez les humains. La diversité génétique des
génotypes de l’assemblage B est plus important que ceux retrouvés dans l’assemblage A.
Nombre de ces génotypes n’ont été retrouvés que chez une seule espèce hôte, ce qui laisse
supposer une plus grande ancienneté de cet assemblage (Thompson et al., 2000).
Par la même étude, ce dernier a révélé plusieurs nouveaux groupes génétiques autres que les
Assemblages A et B au sein de Giardia intestinalis apparaissant spécifiques de leur hôte :
- Les assemblages C et D, isolés chez le chien
- L’assemblage E, isolé chez le bétail (bovins, ovins, caprins, porcins)
- L’assemblage F, isolé chez le chat
- L’assemblage G, isolé chez le rat.
Ces données sont en faveur d’une grande complexité au sein de l’espèce Giardia intestinalis
(Monis et al., 2003).
13
2-1.3 Morphologie
Giardia lamblia se présente sous 2 formes (Adam, 2001) :
- La forme végétative (FV) ou trophozoïte (Figure 1) :
Son aspect est pirifonne. Le trophozoïte mesure 6 à 10 μm de largeur sur 10 à 20 μm de
longueur pour une épaisseur de 2 à 4 μm. Il possède une dépression ventrale qui joue un rôle
dans la fixation du parasite aux cellules intestinales. L'extrémité antérieure est arrondie et
l’extrémité postérieure est pointue. Il est actif et mobile grâce à quatre paires de flagelles :
2 flagelles antérolatéraux, prenant leur origine devant les noyaux et sortant par la face
dorsale.
2 flagelles postéro-latéraux, prenant leur origine entre les noyaux et sortant par la face
ventrale.
2 flagelles caudaux, prenant leur origine entre les noyaux et sortant par la face ventrale
à l'extrémité postérieure du parasite.
2 flagelles ventraux épais, au fond du sillon formé par la concavité de la face ventrale.
Un axostyle partage le corps en deux moitiés symétriques contenant chacune un gros noyau à
contours ovalaires situés dans le tiers antérieur. Transversalement, deux structures parallèles
en forme de bâtonnets plus ou moins incurvés, les corps médians, correspondent à des
agrégats denses de microtubules et de protéines contractiles. Il ne contient ni mitochondrie,
disparue au cours de son évolution, ni appareil de Golgi (Hashimoto et al., 1998; Manning et
al., 2011). Lors de son observation à l’objectif à immersion, il ressemble à un « visage de
clown » (Conboy, 1997).
Figure 1 : Forme végétative de Giardia intestinalis
À gauche : vue de face ; à droite : vue de profil. (Guillaume, 2007)
14
- La forme kystique (Figure 2):
Le kyste est une forme de résistance. Il a une forme ovale, une paroi à double contour
d’épaisseur 0.3-0.5 μm et mesure 7 à 10 sur 8 à 12 μm. La paroi du kyste est composée
principalement de N-acétylgalactosamine (GalNAc) (Mok et al., 2005; Chatterjee et al.,
2010). Le kyste renferme 2 à 4 noyaux, des résidus de flagelles et de corps médians, donnant
l'impression de contenir un « S » au centre et correspondant à deux trophozoïtes
incomplètement séparés mais formés.
Figure 2 : Schéma d'un kyste de Giardia intestinalis
(Guillaume, 2007)
2-1.4 Biologie:
- Modes de transmission
La transmission de la giardiose, parasitose liée au péril fécal, se fait par voie orale de façon
directe ou indirecte (Hunter et Thompson, 2005; Traub et al., 2009).
directe: par les mains sales, provoquant des épidémies dans les crèches.
indirecte: par l'eau de boisson surtout ou les aliments souillés de matières fécales, les
crudités souillées (figure 3).
Cette transmission peut être également d’origine animale: mammifères (chat, chien, bovins,
ovins) (Hunter et Thompson, 2005).
Les facteurs de risque de la giardiose sont : les voyages dans les pays hyper endémiques, la
mauvaise hygiène des mains, la consommation d’eau du robinet contaminée, la consommation
de végétaux crus (salades), la natation dans les rivières et lacs, le contact avec de jeunes
enfants portant des couches (Bello et al., 2011).
Noyau
x
Axostyle
Corps médians
Résidus de flagelles
15
Figure 3 : Schéma des réservoirs et voies de contamination de Giardia intestinalis.
(Bertrand et Schwartzbrod, 2007)
- Cycle évolutif :
L'infection commence par l'ingestion de kystes à quatre noyaux (Figure 4). Le passage dans
l'estomac, avec la baisse de pH, suivi d'une remontée du pH dans l'intestin, conduit à la lyse
de la paroi du kyste qui libère un excyzoïte à quatre noyaux dans le duodénum. Celui-ci
évolue en forme végétative ou trophozoïte. Les trophozoïtes s'accrochent à la muqueuse
intestinale grâce au disque ventral. Ils se multiplient et prolifèrent par scissiparité. C'est eux
seuls qui sont responsables des symptômes. Une partie de la population évolue en kystes au
niveau du côlon. Ceux-ci seront expulsés avec les selles et pourront résister de longues
périodes en attendant une ingestion (Lewis et Freedman, 1992).
Formation du kyste : (dans jéjunum, + sels biliaires):
Les FV s’immobilisent, diminuent de taille et s’entourent d’une membrane de plus en plus
épaisse. Les deux (2) noyaux se divisent pour donner un Kyste mur à 4 noyaux ; ce kyste
contient ainsi deux (2) entités (Bittencourt-Silvestre et al., 2010; Sulemana et al., 2014).
16
Leur formation varie dans le temps, leur nombre diminue progressivement et disparait en sept
(7) à dix (10) jours d’où la période muette (absence de kyste).
FV : forme
Figure 4: cycle évolutif de Giardia intestinalis.
Source : DPDx-CDC Parasitology Diagnostic Web Site (http://www.dpd.cdc.gov); consulté en
Janvier 2015
2-1.5 Le Génome de Giardia intestinalis
Le génome est constitué d’au moins cinq (5) chromosomes dans chaque noyau correspondant
à un total de 1,2 x 107 paires de bases. Ce qui équivaut à environ 12 Mb pour 5 chromosomes
avec un contenu en GC de 42 à 48% (Adam, 2001). Environ 95% de ce génome a été
séquencé en 2004 (Adams et al., 2004). Leur partie centrale est assez constante, mais les
télomères sont variables (Adam et al., 1988; Le Blancq et Adam, 1998). Le génome de
1
Légende
1 : ingestion du kyste par l’eau
de boisson souillée, aliments,
légumes,… ;
2 : évolution du kyste dans
l’estomac, duodénum,
l’intestin ;
3 : élimination de kystes et/ou
trophozoïtes infectieux ;
4 : contamination des aliments,
eaux de boissons, légumes,… ;
4
3
2
Kyste
FV
17
Giardia intestinalis a les caractéristiques des cellules eucaryotes, en particulier des
chromosomes linéaires avec des séquences télomériques semblables aux autres eucaryotes
(TAGGG) (Hu et al., 2009). La chromatine se forme par association avec 5 histones (H1,
H2a, H2b, H3, H4). Aucun intron n'est décrit (Adam, 2000).
Des études de validation plus précises de la classification, ont visé à comparer, des gènes dont
les séquences sont moins conservées que l'ARNr, comme la GDH et surtout la TPI (Amar et
al., 2002; Read et al., 2004; Sulaiman et al., 2004; Traub et al., 2004). Les gènes de la TPI et
de l'EFIA ont été séquencés pour trois espèces: G. lamblia, G. muris et G. ardeae. Par contre,
le gène de la GDH a été séquencé pour seulement deux espèces: G. lamblia et G. ardeae.
Actuellement, le gène de la TPI est également séquencé pour l'espèce G. microti (Sulaiman et
al., 2004). Les travaux de ce dernier ont conforté solidement la classification de l'espèce G.
lamblia en différents génotypes. Parmi ces gènes, seul l'ARNr 18S a été séquencé pour cinq
espèces: G. lamblia, G. muris, G. microti, G. ardeae et G. psittaci.
2-2- Épidémiologie de la giardiose
La giardiose est la cause la plus fréquente de diarrhée non bactérienne en Amérique du Nord.
C’est une maladie fréquente dans les pays tropicaux en développement et qui est présente
dans les pays développés tempérés. Dans les pays industrialisés, cette prévalence varie de 2 à
7 % (Rodriguez-Hernandez et al., 1996). Aux États-Unis, la prévalence estimée à partir
d’échantillons de selles humaines était de 3,8 % (Barwick et al., 2003). Dans les pays
tropicaux, cette prévalence chez l’adulte varie de 12 % à 30 % dans les populations adultes
(Loscher et Saathoff, 2008). Au Burkina Faso, Simporé et al. en 2009, Karou et al. en 2011,
Nitiema et al. en 2011 et Ouermi et al., en 2012 ont trouvé respectivement des prévalences de
7,6 %, 43,47 %, 11,3 % et 24.83% au CMSCO parmi les demandes d’analyses
parasitologiques à la recherches d’étiologies de gastroentérites (Simpore et al., 2009; Karou et
al., 2011; Nitiema et al., 2011; Ouermi et al., 2012).
La distribution et la prévalence des génotypes chez l’homme ne sont pas actuellement
connues car leur identification n’est pas systématique dans la giardiose (Thompson, 2004).
Actuellement, la prédominance d’un génotype n’est pas démontrée. Mais une distribution des
génotypes semble être observée selon la localisation géographique (Sulaiman et al., 2004).
18
2-3- Méthodes diagnostiques
2-3.1 Détection par EPS :
Les kystes de G. intestinalis sont excrétés de façon intermittente dans les selles. L’analyse de
plusieurs échantillons est donc recommandée pour la détection du parasite. La sensibilité de
cette recherche s’accroît lorsqu’on répète le test (3 en tout). Selon des auteurs, surtout pour la
Giardiose, l’examen parasitologique des selles ne permet pas d’avoir un reflet correct de
l’ampleur de l’infestation parasitaire, l’examen d’un unique échantillon de selles ne détectant
le parasite que dans 50 à 70 % des cas (Burke, 1975; Heresi et Cleary, 1997). Selon les
mêmes, si trois selles sont examinées, la fréquence d’identification augmente à 95 %.
2-3.2 Recherche d’Ag spécifiques dans les selles:
Les méthodes telles que les tests immunologiques permettent une détection avec de meilleures
sensibilités. L’avenir est donc aux tests immunologiques rapides détectant des antigènes
parasitaires dans les selles. Ces tests, très performants, ne sont pas encore disponibles. La
technique d’immunofluorescence directe basée sur l’utilisation d’anticorps est
particulièrement spécifique et sensible pour la détection des cas (Chaudhuri et al., 1997;
Garcia et Shimizu, 1997; Feng et Xiao, 2011).
2-3.3 Caractérisation par biologie moléculaire.
L’utilisation de méthodes moléculaires de détection telle la PCR permet de détecter la parasite
et de caractériser ces génotypes dans les selles. Mais cette méthode ne donne pas
d’information sur la viabilité ou le caractère infectieux du pathogène. Les premières études
par PCR ont utilisé le gène de la giardine comme cible pour la PCR. Une faible sensibilité
avait alors été obtenue, probablement en raison de la présence d’une seule copie du gène
(Baque et al., 2011). L’amplification de la région ITS (inter-transcriptor spacing) des gènes
de l’ARN ribosomal de G. intestinalis a été choisie par une étude récente et a donné
d’excellents résultats. La méthode s’est révélée être plus spécifique et plus sensible que les
méthodes microscopiques et immunologiques (Schuurman et al., 2007; Elsafi et al., 2013).
Son utilisation s’avère être rapide et fiable pour la détection de ce parasite dans les selles
d’humains et pourrait être utilisée en routine (Ghosh et al., 2000).
Dans cet objectif, d’autres méthodes telles que la Reverse- Transcriptase PCR sont utilisées.
Enfin, l’utilisation de PCR en temps réel permet de quantifier avec de précision les
assemblages du parasite (Caccio, 2004).
19
La technique de Restriction Fragment Lengh Polymorphism (RFLP) a notamment été utilisée
pour comparer les séquences d’ADN d'isolats de G. intestinalis d'origine humaine et animale.
La digestion de l'ADN par des enzymes de restriction ou endonucléases permet d'obtenir des
profils électrophorétiques pour la comparaison des différents isolats lors d'études
épidémiologiques (Nash et al., 1985). La PCR-RFLP associe l'amplification de l'ADN par
PCR à la digestion enzymatique par des enzymes de restriction.
2-3.4 Autres méthodes
- le tubage duodénal pour la recherche de FV dans le liquide.
- la biopsie jéjunale: indiquée devant un syndrome de malabsorption et EPS négatif:
présence de G. intestinalis et atrophie villositaire (Saran et al., 2001; Perez-Roldan et al.,
2008).
- la culture : possible mais pas pour la routine. La multiplication de G. intestinalis par
mise en culture est difficile à obtenir. Cependant, elle est réalisable sur certains milieux
complexes tel que le milieu BIS 33 « Mexico », en utilisant la solution saline seule,
additionnée de bile de bœuf desséchée. L’inoculum doit être massif (Ripert et al., 1996).
2-4- Traitement et prévention
Le traitement repose sur les nitro-imidazolés, comme le métronidazole (Busatti et al., 2013).
Un contrôle de l’efficacité du traitement un mois après la fin du traitement est recommandé.
En cas d’échec du traitement, il faut évoquer une source persistante du parasite dans
l’entourage. L’albendazole peut être utilisé en deuxième intention (Payne et al., 2002).
La prévention individuelle et collective repose sur l’hygiène de l’eau de boisson et des
aliments, et sur le lavage des mains. Il faut tenir compte du fait que les kystes de G.
intestinalis sont relativement résistants à la chloration, aux ultra-violets et à la congélation
PARTIE 2 : NOTRE ETUDE
20
PARTIE 2 : NOTRE ETUDE
1- OBJECTIFS DE L’ETUDE
1-1- Objectif général
Caractériser les parasites intestinaux causes d’infections en milieu scolaire au Burkina Faso.
1-2- Objectifs spécifiques
- Identifier les parasites intestinaux sources de maladies chez les Elèves de huit écoles
primaires des régions du Centre-ouest et du Plateau-central au Burkina Faso.
- Apprécier la prévalence de ces parasites parmi les écoliers au BF.
- Détecter Giardia intestinalis pathogènes pour l’homme dans les selles des écoliers par
PCR en Temps Réel.
- Confronter les résultats positifs de la microscopie avec la PCR en temps réel.
2- MATERIELS ET METHODES
2-1- Milieu de l’étude (cadre et champs d’étude)
Notre étude a été menée en plusieurs étapes comprenant une enquête accompagnée d’une
collecte d’échantillons de selles dans les écoles incluses, une analyse parasitologique de ces
selles suivie d’une analyse moléculaire.
2-1.1 Situation des sites d’enquête :
L'étude a concerné huit villages situés dans deux régions du Burkina Faso (Figure 5): la
région du Centre-ouest (Douré A, Goundi B, Ipendo A, Tio A) et la région du Plateau-central
(Loumbila A, Linoghin, Tangzougou, Wavoussé).
Ce travail a été mené dans le cadre d’un projet dénommé « VGTS pour Vegetables Go to
School », en cours, qui soutient le développement de jardins scolaires dans certaines écoles en
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 21
Afrique et en Asie, et qui est conjointement mis en œuvre par le Centre Mondial des Légumes
(World Vegetables Centre - AVRDC) à Taiwan, l’Université de Freiburg (ALU) en
Allemagne et l’Institut Tropical et Santé Publique Suisse (Swiss TPH). Ainsi les sites
d’enquêtes ont été choisis selon des critères définis qui sont :
- Le degré d’acceptation de la population, des enseignants et des élèves.
- La prévalence de la malnutrition par rapport à la situation nationale.
- L’existence de cantine scolaire
- L’existence de terres arables autour de l’école
- Et l’’engagement volontaire des personnes ressources de l’éducation
Figure 5: localisation des écoles (villages) cibles
Source : Institut Géographique du Burkina (BNDT, Mars 2015) :
www.igb.bf/index.php/reference/carto-et-sig. Consulté en Mars 2015
Ces régions ont un climat de type soudano-sahélien, marqué par une saison pluvieuse qui
s’étend sur environ 4 mois de Juin à Septembre et une saison sèche qui va d’Octobre à Mai.
Ce climat est principalement caractérisé par deux régimes : la saison hivernale sous
l’influence d’un vent humide (mousson) qui est la source des manifestations pluvieux-
orageuses, et la saison sèche caractérisée par un régime de vent sec (harmattan).
L’activité économique y est faible. Ce sont des zones surtout agricoles et de petits élevages.
Situation des villages ou écoles ciblés
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 22
Quant aux infrastructures sanitaires, nous avons noté des Centre de Santé et de Promotion
Sociale (CSPS) dans tous les huit sites.
2-1.2 Laboratoires d’analyses biologiques
Les analyses parasitologiques des prélèvements de selles ont été réalisées dans le Laboratoire
de l’Institut de Recherche en Science de la Santé (IRSS). L’IRSS, un des quatre instituts du
Centre National de Recherche Science et Technologique (CNRST) situé en face du Centre
Hospitalier Universitaire Yalgado Ouédraogo, est une structure du Ministère de la Recherche
Scientifique et de l’Innovation.
L’analyse moléculaire a été réalisée au Laboratoire de Biologie moléculaire et de Génétique
Moléculaire (LABIOGENE) de l’Université de Ouagadougou logé au CERBA.
Le CERBA, est situé au secteur 51, Arrondissement 11 de Ouagadougou et relève du district
sanitaire de Bogodogo. Créé par la délégation camillienne, ce centre a pour missions
premières la formation et la promotion de jeunes chercheurs en particulier dans le domaine
biomoléculaire où il dispose d’un plateau technique moderne (appareils PCR en temps réel,
PCR classique, HPLC, séquenceur). Les activités de recherche s’articulent autour de plusieurs
axes :
- la recherche fondamentale et les sciences du génome se décomposant en sous-axes tels
les pathologies génétiques (hémoglobinopathies, ostéoporose, déficiences génétiques),
les marqueurs de résistance génétique (résistance bactérienne aux antimicrobiens), le
diagnostic moléculaire de diverses pathologies en particulier des pathologies émergentes
(VIH, HPV, VHC, VHB) ainsi que sur la vaccinologie.
- des études de nature à valoriser la médecine traditionnelle (travaux sur des recettes
traditionnelles fournies par des tradipraticiens).
- Les deux derniers axes comprennent la recherche clinique (suivi biologique et clinique
des personnes vivant avec le VIH, activités portant sur la PTME, expérimentations
pharmaco-cliniques) et la recherche en nutrition (réhabilitation nutritionnelle des enfants
malnutris).
2-2- Type et période d’étude
Il s’est agi d’une étude transversale descriptive qui a eu lieu dans les écoles ci-dessus citées, et
qui a concerné un échantillon d’enfants présents et consentants durant la période de collecte.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 23
Une première phase d’enquête dite pilote s’est déroulée le 20 Décembre 2014 à l’école de
Zongo / Loumbila. La deuxième phase a concerné l’enquête proprement dite qui s’est
déroulée du 02 au 18 Février 2015 dans les écoles des huit villages choisis.
Les analyses moléculaires se sont déroulées du 17 au 31 Août 2015 au CERBA /
LABIOGENE.
2-3- Population d’étude / Échantillonnage.
Les élèves des classes des Cours Elémentaire 2ème année (CE2) et Cours Moyen 1ère année
(CM1) des huit écoles ci-dessus citées ont été ciblés pour cette enquête. Globalement, 441
élèves ont été inclus avec en moyenne 55 participants par école dont environ 27 élèves par
classe. Des échantillons biologiques ont été recueillis pour des analyses au Laboratoire. Ces
échantillons ont concerné des prélèvements de selles collectés chez chaque élève inclus dans
l’étude à raison de deux échantillons de selles par élève sur deux jours consécutifs.
Tous ces prélèvements ont été transportés dans des glacières au laboratoire de l’IRSS dans les
quatre (4) heures qui ont suivi la collecte pour une analyse microscopique immédiate.
Pour la suite de notre travail concernant la PCR en temps réel, tous les prélèvements de selles
reçus au cours de la période indiquée et dont l’examen microscopique a montré la présence de
kyste de Giardia intestinalis ont été retenus. Seules trois selles négatives ont été aussi
conservées à cet effet.
2-4- Méthodes, techniques et instruments de collecte de données
Elle s’est faite sur la base d’un questionnaire et a été effectuée sur les quatre cent quarante et
un (441) élèves. Tous les participants ont donné leur avis sur l’objet du questionnaire et les
éléments de base ont été la connaissance et le comportement en matière d’hygiène, d’eau,
d’assainissement (WASH pour Water Sanitation Hygiene) et nutrition y compris l’évaluation
du respect des bonnes pratiques d’hygiène. Une observation directe a été faite pour certaines
parties du module concernant les caractéristiques socio-économiques des ménages et les
autres aspects importants de l’hygiène.
Les prélèvements de selles ont été réalisés sur deux jours consécutifs chez chaque élève afin
d’augmenter les chances de détection des parasites.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 24
Le poids de chaque écolier enquêté a été mesuré à l’aide d’une balance électronique portatif,
de même que la taille (à l’aide d’une toise graduée) en plus de l’âge.
2-5- Analyse parasitologique des selles
2-5.1 Précautions avant le recueil de selle chez les élèves
Les élèves ont été conseillés de supprimer pendant les trois (3) jours qui ont précédé le
prélèvement:
- les compositions pharmaceutiques contenant du charbon végétal, du bismuth, des sels de
magnésium, du kaolin et du benzonaphtol.
- les produits opaques utilisés en radiologie, en particulier les composés barytés.
- les suppositoires et les huiles laxatifs, en particulier l'huile de paraffine.
La présence de ces éléments dans les selles rend l'examen microscopique difficile, car ils
augmentent le volume des culots de centrifugation et peuvent être la cause d'erreurs
d'identification.
2-5.2 Prélèvement de la selle
Chaque élève a été conseillé de déposer sa selle, le matin, dans un récipient propre, sec et sur
lequel est collée une étiquette portant son identité. Il a été bien indiqué aux élèves qu'ils ne
doivent pas mélanger la selle avec de l'urine, ni du papier hygiénique ou de coton.
Le transport des prélèvements s’est fait dans des glacières contenant de la glace (ice box) afin
de les maintenir à +4°C jusqu’à l’arrivée au laboratoire dans le plus bref délai possible pour
éviter une élévation de la température qui risquerait de lyser les trophozoïtes de protozoaires.
2-5.3 Examen macroscopique des selles
II a consisté à noter la consistance de la selle ainsi que la présence éventuelle de sang, de
glaires, de mucosités, de pus et de parasites macroscopiques.
2-5.4 Examen microscopique des selles
Chaque élève enquêté a fourni deux échantillons de selles en deux jours consécutifs. Chaque
prélèvement a fait l’objet d’un examen direct à l’état frais et d’un examen après concentration
selon la méthode de Ritchie et la méthode de Kato-Katz.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 25
2-5.4-1 Examen direct à l’état frais
Il a été effectué après dilution d’une noix de selle dans 10 fois son volume d’eau
physiologique à 0,9%. Ensuite, sur une lame porte objet, on a déposé à l’aide d’une pipette
pasteur, une goutte de cette dilution.
Pour les selles glaireuses, nous avons prélevé à l’aide d’une anse de platine directement la
glaire qu’on a déposée sur la lame.
Les préparations ont été ensuite recouvertes de lamelle (22 x 22), pour la lecture
microscopique à l’objectif x10 et x40 dans le but d’identifier les œufs et les larves
d’helminthes ainsi que les kystes et les formes végétatives de protozoaires.
2-5.4-2 Examen après concentration
- Méthode Formol-éther ou de Ritchie simplifiée, (Ridley et Hawgood, 1956) :
Principe : Elle est caractérisée par la mise en présence de deux phases liquides non miscibles,
l'une aqueuse et l'autre constituée par l'éther, un solvant des lipides. Il se crée un coefficient
de partage entre ces deux phases et la répartition de chaque élément fécal dans chacune d'elles
sera fonction de son pouvoir hydrophile ou lipophile.
Réalisation : Annexe 2
Cette technique est applicable à la recherche des kystes de protozoaires et des œufs
d’helminthes sauf pour les œufs d'ascaris détruits par cette méthode.
- Méthode par éclaircissement de Kato-Katz (OMS, 1994) :
Principe : décoloration. En effet, elle permet la recherche et la quantification des œufs et
larves d’helminthes dans une quantité connue de selles, donc nécessite l’emploi d’une
solution éclaircissante et l’utilisation d’une plaque perforée à diamètre et profondeur connus
(plaque calibrée).
Réalisation : Annexe 3
A l’issue de ces analyses, quatre-vingt et quatorze (94) échantillons de selles contenant des
kystes de Giardia intestinalis plus trois (03) échantillons n’en contenant pas ont été conservés
à -80°C durant six (6) mois à l’IRSS en attente de l’analyse moléculaire ; puis ils ont été
transférer au CERBA / LABIOGENE où ils ont été conservé à -20°C pendant une semaine,
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 26
juste le temps de réaliser l’extraction d’ADN. Cinq échantillons (enquête pilote) ont été
préalablement fixés au formol à 10%.
2-6- Diagnostic moléculaire : PCR en Temps Réel
L’analyse moléculaire a consisté en la détection de Giardia intestinalis dans les selles des
écoliers par PCR en temps réel en utilisant le thermocycleur 7500 Fast Real Time PCR System
de Applied Biosystem.
2-6.1 Extraction de l’ADN des kystes à partir des selles
L’extraction a été réalisée dans un premier temps avec le kit DNA-Sorb-B de Sacace
Biotechnologies® pour cinquante (50) échantillons. Ensuite, elle a été faite par la méthode
Sarkari B. modifiée pour quarante et sept (47) échantillons.
2-6.1-1 Utilisation du Kit DNA-Sorb-B de Sacace Biotechnologies®
- Réactifs : Kit d’extraction « DNA-Sorb-B », Sacace Biotechnologies®.
- Prétraitement des échantillons avant l’extraction :
Avant l’étape d’extraction, les échantillons ont été préalablement traités comme suit : Ils ont
d’abord été décongelés. Une suspension de chaque échantillon est préparée en introduisant
dans un tube de polypropylène de 1.5 ml étiquetés 1,0 mL de solution saline et 0,1g
d’échantillon de selles. La suspension est agitée au vortex puis centrifugé à 7 000 - 12 000 g
pendant 5 mn. Ensuite, 100 μL du culot sont transférés dans un tube eppendorf où on a ajouté
800 μL de tampon PBS à 10%. Après agitation au vortex et centrifugation pendant 5 mn à 7
000 - 12 000g, le surnageant est éliminé. Le culot a été suspendu à nouveau avec 300 μL de
tampon PBS à 10% par agitation au vortex.
L’échantillon ainsi préparé est prêt pour l’étape d’extraction.
- Extraction :
Elle a été réalisée en suivant le protocole du fabriquant du kit « DNA-Sorb-B » de Sacace
Biotechnologies® (voir annexe 4).
L’ADN extrait a été conservé à – 20°C jusqu’à utilisation.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 27
2-6.1-2 Méthode d’extraction de Sarkari, B. modifiée :
(Sarkari et al., 2012).
L’ADN des kystes de G. intestinalis pour 47 échantillons a été extrait à partir des selles par la
méthode proposée par Sarkari, B. que nous avons légèrement modifié par remplacement du
phénol chloroforme par du NaCl 5M pour la précipitation des protéines (élimination). La
procédure détaillée se trouve à l’annexe 5.
2-6.2 PCR en temps réel
Principe : il est basé sur la mesure de la fluorescence émise au cours de la PCR qui est
proportionnelle au nombre de copies d'ADN néo synthétisé.
- Mélange réactionnel
Le volume total de la réaction d’amplification pour chaque échantillon a été de 25μL (12 μL
de Taq Man Universal Master Mix, 3 µL de la sonde 0,25µM, 1 µL de chacun des deux
amorces 50 µM (sens et anti-sens), (Applied Biosystem), 3 µL d’eau DNase-RNase free et 5
μL d’ADN extrait.
- Programme d’amplification sur ABI 7500
L’amplification a été réalisée en utilisant le programme par défaut de l’automate ABI
7500 de Applied Biosystem », en augmentant simplement le nombre de cycle à 45. Elle a été
faite en utilisant une amorce ciblant une séquence spécifique du gène de la petite sous unité de
l’ARN ribosomique (SSU-rRNA ou 18S rRNA). Le programme détaillé a été le suivant :
60° C pendant 1 minute : préchauffage
95° C pendant 10 minutes : dénaturation initiale X 1 cycle
95° C pendant 15 secondes : dénaturation
60° C pendant 1 minute : hybridation + élongation
60° C pendant 1 minute extension finale
L’amplification a duré au total 1 heure 37 mn.
X 45 cycles
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 28
- Interprétation des résultats
L’analyse a été faite à l’aide du logiciel 7500 Software v2.0.6 de Applied Biosystem :
l’intensité de la fluorescence est exprimée en fonction du nombre de cycles. Chaque cycle est
proportionnel à la concentration d’amplicons. Nous avons défini le cycle seuil (Ct) qui
représente le nombre de cycles requis où le signal d’émission de fluorescence est
statistiquement et significativement plus élevé au-dessus de la ligne de base (ligne seuil). Les
résultats de l’analyse des fluorescences ont été interprétés présent ou absent selon le cycle
seuil comme suit :
Ct < 45,0 = Résultat positif (présent)
Ct ≥ 45,0 = Résultat Négatif (absent)
2-7- Considérations éthiques
Le protocole de recherche a été soumis en Avril 2014 à l’examen du comité d’éthique pour la
recherche en santé (CERS) du Burkina Faso et a obtenu un avis favorable (délibération CERS
Mai 2014). Une version amendée du protocole de recherche a été soumise au CERS en février
2015 et a obtenu un avis favorable. Les observations qui ont été faites ont été prises en
considération avant le démarrage de l’enquête dans les écoles.
Conformément aux dispositions prévues dans le protocole de recherche, tous les élèves
parasités ont bénéficié gratuitement de traitements comme suit :
Albendazole pour le traitement contre les helminthes
Metronidazole pour le traitement contre les amibes
Nicosamide pour le traitement contre Hymenolepis nana
2-8- Méthode de traitement des données.
Les données ont été saisies sur un microordinateur à l’aide du Logiciel Excel 2013 avant
d’être traitées avec le logiciel SPSS® version 20.
Le test de Chi deux de Pearson a été utilisé pour l’étude d’association entre G. intestinalis
(microscopie) comme variable dépendante d’une part et d’autre part, les caractéristiques
sociodémographiques, socioéconomiques, l’hygiène individuel et le résultat PCR comme
paramètres indépendants. Les résultats ont été considérés significatifs lorsque p < 0,05.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 29
3- RESULTATS
3-1- Population d’étude
- Sur la population totale enquêtée :
L’enquête a porté sur une population totale de 441 élèves, âgés de 8 à 14 ans et fréquentant les
classes de CE2 et de CM1 de huit écoles choisies dans deux régions du Burkina Faso :
Plateau-central et Centre-ouest. Un sexe ratio de 1,09 en faveur du sexe masculin a été
obtenu. Ainsi, la population totale enquêtée se répartit comme suit dans le tableau I :
Tableau I : Répartition de la population totale enquêtée selon l’école et le sexe :
Région
Ecole
N enfants
inclus
Total par
région
N(%)
Sexe
Masculin
N(%)
Féminin
N(%)
Plateau-
Central
(PC)
Linoghin A 60
227(51,5)
230(52,2%)
211(47,8%)
Loumbila A 55
Tangzougou 56
Wavoussé 56
Centre-
Ouest
(CO)
Ipendo A 51
214(48,5)
Tio A 53
Goundi B 54
Douré A 56
Total général 441
N : effectif ; % : pourcentage
- Caractéristiques sociodémographiques et économiques de la population ayant fait
l’objet de la PCR en temps réel :
Sur 120 échantillons positifs à G. intestinalis à la microscopie soit 27,2 % (Tableau V), 94 ont
présenté des kystes contre 26 qui ont présenté des FV. Pour la détection moléculaire du
parasite, nous avons retenu seulement 03 échantillons de selles négatifs, ainsi que tous les
prélèvements de selles pour lesquels l’examen microscopique a montré la présence de kyste
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 30
(94 échantillons) de G. intestinalis. Nous n’avons pas inclus les échantillons contenant des
trophozoïtes de G. intestinalis pour la PCR en temps réel. Cela est dû au fait que nous avions
voulu initialement réalisé un génotypage qui ciblait uniquement les kystes dont la
conservation est plus facile. Cependant, pour des questions de moyens financiers, nous avons
limité ce travail à la détection de l’espèce parasitaire. C’est ainsi qu’au moment de la
réalisation de la PCR, nous n’avons pu prendre en compte que ces échantillons collectés
depuis le mois de Décembre 2014 et de Février 2015 chez les élèves qu’on ne pouvait plus
toucher (vacances scolaires). Les caractéristiques sociodémographiques et socioéconomiques
de cette population de 97 élèves sont réparties comme suit dans les tableaux II et III ci-dessus.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 31
Tableau II : caractéristiques sociodémographique de la population ayant fait l’objet de la PCR en temps réel :
Ecoles
Sexe Tranche d’âge (ans) Classe fréquentée
Total
N(%) Masculin
N(%)
Féminin
N(%)
Np
N(%)
8-9
N(%)
10-11
N(%)
12-13
N(%)
Np
N(%)
CE2
N(%)
CMI
N(%)
Douré A 12(70,6) 5(29,4) 0 0 8(47,1) 9(52,9) 0 9(52,9) 8(47,1) 17(17,5)
Goundi B 7(63,6) 4(36,4) 0 0 2(18,2) 9(81,8) 0 6(54,5) 5(45,5) 11(11,3)
Ipendo A 4(40) 6(60) 0 3(30) 7(70) 0 0 3(30) 7(70) 10(10,3)
Tio A 9(69,2) 4(30,8) 0 0 6(46,1) 7(53,8) 0 6(46,2) 7(53,8) 13(13,4)
Linoghin 8(66,7) 4(33,3) 0 2(16,7) 6(50) 4(33,3) 0 5(41,7) 7(58,3) 12(12,4)
Loumbila A 6(40) 4(26,7) 5(33,3) 2(13,3) 5(33,3) 3(20) 5(33,3) 9(60) 6(40) 15(15,5)
Tangzougou 3(42,9) 4(57,1) 0 1(14,3) 4(57,1) 2(28,6) 0 5(71,4) 2(28,6) 7(7,2)
Wavousse 8(66,7) 4(33,3) 0 1(8,3) 7(58,3) 4(33,3) 0 8(66,7) 4(33,3) 12(12,4)
Total 57(58,8) 35(36,1) 5(5,1) 9(9,3) 45(46,4) 38(39,2) 5(5,1) 51(52,6) 46(47,4) 97(100,0)
N= effectif ; % = pourcentage ; Np : non précisé
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 32
Tableau III : Autres caractéristiques sociodémographiques et socioéconomiques de la population :
Ecoles
Niveau instruction chef ménage Profession
parent
Disponibilité d’eau
potable pour ménage
Présence de latrine à
domicile
Total Primaire
N(%)
Secondaire
N(%)
Sans niveau
N(%)
Cult./élev.
N(%)
Oui
N(%)
Non
N(%)
Oui
N(%)
Non
N(%)
Douré A 1(5,9) 0 16(94,1) 17(100) 15(88,2) 2(11,8) 9(52,9) 8(47,1) 17(17,5)
Goundi B 3(27,3) 1(9,1) 7(63,6) 11(100) 9(81,8) 2(18,2) 5(45,5) 6(54,5) 11(11,3)
Ipendo A 1(10) 0 9(90) 10(100) 9(90) 1(10) 3(30) 7(70) 10(10,3)
Tio A 3(23,1) 2(15,4) 8(61,5) 13(100) 13(100) 0 0 13(100) 13(13,4)
Linoghin 3(25) 2(16,7) 7(58,3) 12(100) 12(100) 0 7(58,3) 5(41,7) 12(12,4)
Loumbila A 0 1(6,7) 14(93,3) 15(100) 10(66,7) 5(33,3) 6(40) 9(60) 15(15,5)
Tangzougou 1(14,3) 0 6(85,7) 7(100) 7(100) 0 4(57,1) 3(42,9) 7(7,2)
Wavousse 0 0 12(100) 12(100) 12(100) 0 5(41,7) 7(58,3) 12(12,4)
Total 12(12,4) 6(6,2) 79(81,4) 97(100) 87(89,7) 10(10,3) 39(40,2) 58(59,8) 97(100,0)
Cult./élev : cultivateur / éleveur ;
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 33
3-2- Prévalence des parasitoses intestinales
Nous présentons ici quelques images de parasites que nous avons observés au cours de l’étude
lors de l’examen microscopique des selles (grossissement X400) :
Figure 6 : Images de deux kystes de G. intestinalis vus à l’examen direct (flèches)
Source : Photo de T. KIENTEGA ; Février 2015.
Figure 7 : Trophozoïte d’Entamoeba coli observé à l’examen direct (flèche)
Source : Photo de T. KIENTEGA ; Février 2015.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 34
Figure 8 : Hymenolepis nana observé à l’examen direct (flèche)
Source : Photo de T. KIENTEGA ; Février 2015.
Figure 9 : Balantidium coli à l’examen direct (flèche)
Source : Photo de T. KIENTEGA ; Février 2015.
3-2.1 Prévalence globale des parasitoses intestinales selon l’école
La prévalence des parasitoses intestinales par école présentée dans le tableau IV montre un
taux moyen d’infestations intestinales à 81,6 %. La région du Centre-ouest est plus touchée
que celle du Plateau-central, avec une disparité selon l’école d’origine (P<0,05). Ainsi, la
prévalence la plus élevée est observée à l’école Douré A avec 93% d’infestation, suivi de
Ipendo A avec 92%.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 35
Tableau IV : Répartition globale des enfants parasités par école
Région écoles N d’enfants
testés
N infestés % infestés % global
par région
Plateau
central
Linoghin A 60 49 82%
74,4%
Loumbila A 55 30 55%
Tangzougou 56 50 89%
Wavoussé 56 40 71%
Centre-
ouest
Ipendo A 51 47 92%
89%
Tio A 53 46 87%
Goundi B 54 46 85%
Douré A 56 52 93%
Total général 441 360 81,6%
P=0,001 : significatif
3-2.2 Prévalence des parasites intestinaux selon l’école ou le village
Nous avons noté une prévalence particulièrement élevée des différentes protozooses (83,4%)
parmi les élèves des écoles enquêtées par rapport à celle des helminthoses intestinales
(7,5%). Les protozoaires les plus rencontrés ont été respectivement Entamoeba histolytica /
dispar (67,4%), Entamoeba coli (35,4%) et Giardia intestinalis (27,2%) (Tableau V). Nous
n’avons pas pu distinguer morphologiquement E. histolytica de E. dispar à travers l’examen
microscopique, voilà pourquoi tout au long de notre document nous avons fait mention de E.
histolytica / dispar.
Ailleurs, Hymenolepis nana est l’helminthe le plus rencontré à un taux de prévalence de 6.8%.
Une différence statistique significative a été constatée sur la prévalence de certains parasites
selon les écoles : E. histolytica / dispar, T. intestinalis et H. nana (P < 0,05). Cependant G.
intestinalis n’a pas montré de différence statistique significative ni selon les écoles (P=0,168),
ni selon la région (P=0,115).
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 36
Tableau V : Prévalence des différents parasites intestinaux selon l’école d’origine :
Régions
Parasites
Ecoles
E. histolytica
/ dispar
%
E.
coli
%
G.
intestinalis
%
T.
intestinalis
%
H.
nana
%
N.
americanus
%
S.
stercoralis
%
B. coli
%
Centre-ouest
Douré A (N=56) 82,1 32,1 33,9 19,6 8,9 3,6
Goundi B(N=54) 79,6 42,6 27,8 16,7 11,1 0 0,02
Ipendo A (N=51) 80,4 41,2 23,5 7,8 2 0
Tio A (N=53) 73,6 45,3 30,2 18,9 18,9 0 0,02
Plateau-central
Loumbila A(N=55) 29,1 30,9 30,9 16,4 1,8 1,8
Tangzougou(N=56) 67,9 28,6 19,6 32,1 8,9 0
Linoghin A(N=60) 68,3 35 20,0 23,3 1, 7 0
Wavoussé(N=56) 58,9 28,6 23,2 30,4 1,8 0
Moy. par parasite (/441) 67,4 35,4 27,2 20,9 6,8 0,7 0,0023 0,0023
P 0,001 * 0,402 0,168 0,047 * 0,002* 0,175 - -
Moy. Générale 83,4% 7,5%
Moy. : Moyenne ; * : significatif
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 37
3-2.3 Polyparasitisme des élèves
Le tableau VI nous présente le polyparasitisme des enfants par école. Un taux global de co-
infestation de 49,2% a été noté avec cependant une disparité entre les deux régions, le Centre-
ouest présentant la plus forte prévalence en polyparasitisme (57,5% en moyenne) par rapport
au Plateau-central (41,4%), surtout avec des taux importants dans trois écoles (Tio A, Goundi
B, Douré A). Cette disparité est significative (P<0,001). 31,7% des sujets ont hébergé chacun
deux parasites intestinaux, 13,8% ont présenté trois parasites et 2,9% quatre parasites. Pour
trois élèves du Centre-ouest, nous avons rencontré une coïnfection à cinq parasites.
Tableau VI : Polyparasitisme par école sur la population totale (441 élèves)
Régions
Ecoles
Biparasites
N (%)
Triparasites
N (%)
≥ 4
parasites
N (%)
% moy.
polyparasites
% par
région
Plateau
central
Linoghin A
(N=60)
13 (21,7) 12 (20) 1 (1,7) 43,3
41,4
Loumbila A
(N=55)
16 (29,1) 2 (3,6) 0 32,7
Tangzougou
(N=56)
15 (26,8) 5 (8,9) 3 (5,4) 41,1
Wavoussé
(N=56)
21 (37,5) 5 (8,9) 1 (1,8) 48,2
Centre-
ouest
Ipendo A
(N=51)
15 (29,4) 8 (15,7) 0 45,1
57,5
Tio A (53) 20 (37,7) 10 (18,9) 4 (7,5) 64,2
Goundi B
(N=54)
20 (37,0) 12 (22,2) 2 (3,7) 63
Douré A
(N=56)
20 (35,7) 7 (8,9) 5 (8,9) 57,1
% 31,7 13,8 3,6 49,2
P < 0,05 * 0,001 *
*= p significatif ; %= pourcentage ; moy.= moyenne
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 38
3-2.4 Co-infestation de G. intestinalis et autres parasites retrouvés
La prévalence globale de la Giardiose a été de 27,2 % (120 échantillons positifs). Sur cet
effectif, 94 échantillons de selles (78,3%) ont présenté des formes kystiques contre 26
échantillons de selles (21,7%) qui ont présenté de formes végétatives (Figure 10).
Figure 10: Répartition des différentes formes de G. intestinalis rencontrés
(Nombre total de cas positifs = 120)
Pour les analyses de biologie moléculaire, nous avons retenus 97 échantillons de selles dont
les 94 cas de kystes observés et 03 échantillons exempts du parasite sous toutes ses formes.
Sur ces trois derniers échantillons négatifs, un a présenté une larve de S. stercoralis.
Le tableau VII est un croisement entre les sujets infestés par G. intestinalis d’une part, et
d’autre part avec les autres parasites rencontrés chez les mêmes sujets: la présence de G.
intestinalis a été fortement associée à celle de E. histolytica/dispar (P= 0,025) ; cependant, les
autres parasites retrouvés n’ont pas été associés au parasitisme par G. intestinalis (P> 0,05).
L’association G. intestinalis / E. coli a été la deuxième association la plus importante (34%).
Tableau VII : Coexistence Giardia intestinalis et autres parasites fréquents
E. histolitica / dispar E. coli T. intestinalis H. nana
Présent
N(%)
Absent
N(%)
Présent
N(%)
Absent
N(%)
Présent
N(%)
Absent
N(%)
Présent
N(%)
Absent
N(%)
G. intestinalis
(N=94)
60(63,8)
34(36,2) 32(34,0) 62(66,0) 26(27,7) 68(72,3) 7(7,4) 87(92,6)
P 0,025 * 0,217 0,287 0,624
* : significatif
Formes kystiques
Formes végétatives
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 39
La prévalence de Giardia intestinalis n’a pas montré de significativité statistique (P > 0,05) ni
selon l’école, ni selon le sexe, ni selon les groupes d’âge (Tableau VIII).
Bien que les effectifs des élèves polyparasités par école soient légèrement différents, aucune
différence statistiquement significative n’a été constatée. De même, il n’y a aucune variation
significative du polyparasitisme selon l’âge.
L’infestation multiple a été plus élevée chez les garçons (86%) que chez les filles (77,1%) ;
une significativité statistique a été observée (P= 0,038).
En ce qui concerne la classe fréquentée, seul E. histolytica / dispar a présenté une différence
statistique significative, donnant un taux très élevé (76,1%) pour le CM1 par rapport au CE2
(49%). Aussi, la fréquence de polyparasitisme a été plus élevée chez les sujets du CMI
(89,1%) que chez ceux du CE2 (72,5%) ; cette différence a été significative (P= 0,040)
(Tableau IX).
Sur le niveau d’instruction du chef de ménage (Tableau IX), une logique s’est dégagée : le
plus gros effectif d’élèves parasités (81,4%) a été remarqué parmi les élèves dont le chef de
ménage n’a reçu aucune instruction scolaire, suivi par les élèves à parent limité à des études
primaires (12,4%) et en fin par ceux dont les parents ont atteint le secondaire (6,2%).
Cependant, aucune différence statistique significative n’a été constatée (P > 0,05).
Pour ce qui est des latrines domestiques (Tableau IX), on a noté que 58 ménages sur les 97 au
total n’en avaient pas, contre seulement 39/97 qui en disposaient. T. intestinalis seul s’est
montré associé à la présence de latrine au domicile de l’élève (P= 0,002).
Enfin pour le critère d’eau potable, avec 87/97 de ménages qui en ont accès contre 10/97 qui
n’en ont pas accès, nous n’avons pas observé de différence statistique significative par rapport
à l’infestation des élèves.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 40
Tableau VIII : Répartition des parasites les plus fréquents sur les 97 échantillons selon les
critères sociodémographiques.
*= p significatif ;
Critère
Kyste
Giardia
N
E.
histolytica
/dispar N
E.
coli
N
T.
intestinalis
N
H.
nana
N
S.
stercoralis
N
Poplyparasitis
me
N
Ecole
Douré A (N=19) 17 13 4 2 2 0 15
Goundi B (N=15) 8 6 3 2 2 1 8
Ipendo A (N=12) 10 7 4 1 0 0 8
Tio (N=16) 13 10 5 3 2 0 12
Linoghin (N=12) 12 8 4 5 0 0 9
Loumbila A
(N=17)
15 4 6 3 0 0 10
Tangzougou
(N=11)
7 4 1 4 1 0 5
Wavousse (N=13) 12 8 5 6 0 0 11
P = 0,17 0,12 0,88 0,095 0,32 - 0,59
Age (ans)
8-9 (N=9) 9 4 4 4 0 0 8
10-11 (N=45) 43 32 18 12 4 1 37
12-13 (N=38) 37 23 9 10 3 0 31
Non précisé (N=5) 5 1 1 0 0 0 2
P = 0,86 0,09 0,33 0,35 0,73 - 0,13
Sexe
Masculin (N=57) 55 39 21 16 2 1 49
Féminin (N=35) 34 20 10 10 5 0 27
Non précisé (N=5) 5 1 1 0 0 0 2
P = 0,90 0,08 0,58 0,38 0,12 - 0,038*
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 41
Tableau IX : Répartition des parasites rencontrés sur les 97 échantillons selon d’autres
critères sociodémographique ou économiques
*= significatif ; Sans instr. : Sans instruction
Critère
Kyste
Giardia
N
E.
histolytica
/dispar N
E. coli
N
T.
intestinalis
N
H. nana
N
S.
stercoralis
N
Poplyparasiti
sme N
Classe
CE2 (N=51) 48 25 19 16 5 1 37
CMI (N=46) 46 35 13 10 2 0 41
P = 0,09 0,006* 0,35 0, 28 0,30 - 0,04*
Niveau instruction chef de ménage
Primaire
(N=12)
11 8 6 5 1 1 10
Secondaire
(N=06)
6 4 0 1 0 0 4
Sans instr.
(N=79)
77 48 26 20 6 0 64
P = 0,50 0,9 0,10 0,42 0,78 - 0,67
Latrine à domicile
Présent (N=39) 38 24 11 17 3 0 32
Absent (N=58) 56 36 21 9 4 1 46
P = 0,81 0,96 0,41 0,002 * 0,89 0,41 0,74
Eau potable
Oui (N=87) 84 56 28 23 6 1 71
Non (N=10) 10 4 4 3 1 0 7
P = 0,55 0,13 0,62 0,81 0,72 0,73 0,38
N Total = 97
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 42
3-3- Résultats de la PCR en temps réel
La figure 11 ci-dessus présente les résultats sous forme de courbes d’intensité de la
fluorescence qui sont exprimées en fonction du nombre de cycles. Le résultat a été considéré
positif pour les échantillons dont les courbes ont franchi le seuil (ΔRn= 0,2) et négatifs dans
le cas contraire.
Figure 11 : Graphique du résultat de l'amplification par la PCR en temps réel
ΔRn : Amplitude de l'intensité de fluorescence émise.
3-3.1 Résultats de la PCR en temps réel selon les critères sociodémographiques et
socioéconomiques
Un effectif de 97 échantillons de selles a été soumis à la PCR en temps réel. Parmi les 97
échantillons, 94 ont présenté des kystes de G. intestinalis à la microscopie contre 03
échantillons qui ont été négatifs.
Le résultat de la PCR a montré la présence de G. intestinalis dans 72 échantillons parmi les 97
au total. Les plus faibles taux de positivité à la PCR ont été observés pour trois (3) des quatre
(04) écoles de la région du Plateau-central. Cependant, aucune différence statistiquement
significative n’a été observée (P>0,05) (Tableau X).
Ces résultats de PCR en temps réel n’ont subi aucune variation significative ni selon l’âge, ni
selon le sexe, ni selon la classe fréquentée par l’élève, ni selon le niveau d’instruction du
parent, ni selon la présence ou non de latrine à domicile, ni selon la disponibilité d’eau
potable pour le ménage d’origine ; P > 0,05 pour tous ces critères (Tableau X et XI).
Seuil
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 43
Tableau X : Résultats de la PCR en temps réel selon les critères sociodémographiques :
NS : non significatif
Critère PCR en temps réel positif
N(%)
Ecole /Village
Douré A (N=17) 16(94,1)
Goundi B (N=11) 7(63,6)
Ipendo A (N=10) 9(90,0)
Tio (N=13) 9(69,2)
Linoghin (N=12) 7(58,3)
Loumbila A (N=15) 10(66,7)
Tangzougou (N=7) 6(85,7)
Wavousse (N=12) 8(66,7)
Total (N = 97) 72(74,2)
P = NS (0,290)
AGE des élèves (ans)
8-9 (N=9) 6(66,7)
10-11 (N=45) 37(82,2)
12-13 (N=38) 25(65,8)
Non précisé (N=5) 4(80,0)
P = NS (0,351)
Sexe des élèves
Masculin (N=57) 43(75,4)
Féminin (N=35) 25(71,4)
Non précisé (N=5) 4(80,0)
P = NS (0,872)
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 44
Tableau XI : Résultats de la PCR en temps réel selon d’autres critères sociodémographiques
et / ou socioéconomiques
NS : non significatif
Critères PCR en temps réel positif
(N)
Classe fréquentée
CE2 (N=51) 39(76,5)
CMI (N=46) 33(71,7)
P = NS (0,595)
Niveau instruction parent
Primaire (N=12) 8(66,7)
Secondaire (N=06) 4(66,7)
Sans instruction (N=79) 60(75,9)
P = NS (0,719)
Latrine domestique
Présent (N=39) 30(76,9)
Absent (N=58) 42(72,4)
P = NS (0,619)
Eau potable (présence)
Oui (N=87) 64(73,6)
Non (N=10) 8(80,0)
P = NS (0,659)
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 45
3-3.2 Confrontation des résultats de la PCR en Temps Réel avec la microscopie
Le tableau XII ci-dessous présente les résultats résumés de la détection de G. intestinalis par
la microscopie et sa caractérisation par la PCR en temps réel. Des 94 échantillons positifs à la
microscopie, seulement 72 (76,6 %) se sont révélés positifs à la PCR en temps réel contre 22
(23,4 %) qui ont été négatifs. Les 03 échantillons initialement négatifs à la microscopie sont
restés négatifs par la PCR en temps réel. Ces résultats sont très statistiquement significatifs
avec P = 0,003 (tableau XII).
Tableau XII : confrontation des résultats de la microscopie à ceux de la PCR en Temps Réel:
Echantillons de selles
PCR (N = 97)
Positive
N (%)
Négative
N (%)
Microscopie de Giardia
intestinalis (N = 97)
Présence (N=94) 72 (76,6) 22 (23,4)
Absence (N=03) 0 03 (100)
P 0,003
Ainsi, en résumé, nous avons obtenu une confirmation des résultats de la microscopie pour
77,3 % des tests contre 22,7 % de résultats PCR (négatifs) discordant avec ceux de la
microscopie (positifs) (Figure 12).
Figure 12 : Résumé comparatif des résultats de la PCR en temps réel avec la microscopie
Résultats PCR identiques à la microscopie
Résultats PCR différents de la microscopie
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 46
4- DISCUSSION
Nous avons effectué l’enquête sur un effectif initial de 441 élèves des classes de CE2 et CMI
de huit écoles des régions du Plateau-central et du Centre-ouest dont quatre écoles par région.
L’âge des élèves a varié entre 8 et 14 ans, avec cependant environ 70 % qui avaient un âge
compris entre 10 et 12 ans. Ceci s’explique par le niveau scolaire de ces élèves dans notre
pays où l’inscription à l’école se fait à partir de 7 ans.
Le nombre de garçons (52,2 %) était plus élevé que celui des filles (47,8 %), ce qui est
contraire aux statistiques nationales (le sexe féminin représente 51,7 % contre 48,3 % pour le
sexe masculin selon le RGPH, 2006). Dans nos pays, et surtout dans les villages, les filles
n’ont pas la même chance d’aller à l’école que les garçons pour des raisons culturelles.
Pour le besoin de la réalisation de la PCR en temps réel l’effectif a été réduit à 97 échantillons
dont 58,8 % sont de sexe masculin.
Sur la prévalence des parasitoses intestinales :
Les résultats des enquêtes parasitologiques ont montré que tous les villages étudiés sont
touchés par les parasitoses intestinales avec une prévalence globale de 81,6 %. Cette
prévalence est très élevée par rapport à celles trouvée par d’autres auteurs au Burkina Faso qui
étaient respectivement de 52,47 % chez des sujets de 5 mois à 72 ans souffrant de
gastroentérites reçu au CMSCO (Karou et al., 2011), de 60,82 % des analyses effectuées au
laboratoire du CMSCO de 1991 à 2010 (Ouermi et al., 2012), de 71,5 % parmi les prisonniers
de la maison d’arrêt de Ouagadougou en 2010 (Zida et al., 2014), de 65,3 % des prescriptions
d’analyses faites par les cliniciens à l’hôpital Sourou Sanou en 2012 (Sangare et al., 2015).
Elle est presque le double de celle observée (46.5%) dans une étude menée dans la zone de
Sourou (BF) chez les enfant de 0 à 16 ans en 2002 (Dianou et al., 2004). Cela traduit le fait
qu’il n’y aurait pas eu d’amélioration significative sur le plan de l’hygiène et de la prévention.
Toutefois, des disparités quant à l’intensité de l’endémie selon le site (Tableau IV) ont été
observée avec une différence statistiquement significative (p<0,05). Sur ce sujet, Hussein
avait trouvé que le taux d’infestation parasitaire des écoliers était fonction du lieu de
résidence (Hussein, 2011).
La région du Centre-ouest a été la plus touché (89 %) par rapport à la région du Plateau-
central (74,4 %), (P<0,05). Ce qui pourrait s’expliquer par le problème de disponibilité d’eau
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 47
potable significativement constaté dans la dite région comparativement au Plateau-central
(P<0,05). Puisque, les parasites observés se transmettent par l’eau de boisson souillée.
D’ailleurs, les deux plus fortes prévalences en parasitoses (93 % et 92 %) ont été observées
parmi les élèves de deux écoles du Centre-ouest, qui sont parmi les villages ayant les faibles
disponibilités en eau potable et en latrines domestiques (Tableau IV). Cependant une école du
Plateau-central (Loumbila A) qui a apparemment moins accès à l’eau potable (66,7%
d’accessibilité), a montré paradoxalement la plus faible prévalence en parasitose (55%). Ce
qui pourrait s’expliquer par le niveau de vie et ou d’hygiène (Zonta et al., 2014) de la
population de cette zone qui se confond à la ville de Ouagadougou, puisque jouxtant cette
dernière. Ne dit-on pas qu’un meilleur accès à l’eau doit être accompagné par des pratiques
d’hygiène effectuées au bon moment (Curtis et al., 2000). De nombreuses études ont
d’ailleurs montré qu’une eau potable à la source peut faire l’objet de manipulations qui
multiplient les risques de contamination (Wright et al., 2004). Par ailleurs, une autre
hypothèse explicative peut venir de la variable d’accès à l’eau et de sa définition relativement
grossière. La question de l’accès à l’eau ne peut se réduire à une seule modalité par ménage.
La prévalence des protozoaires (83,4 %) a été statistiquement plus importante que celle des
helminthes (7,5 %). Les raisons de cette différence (significative car P<0,05) pourraient être
les traitements antihelminthiques qui ont été administrés à la population générale du Burkina
Faso en Décembre 2014, qui auraient éliminé ces helminthes sans pour autant éliminer les
protozoaires qui demandent un traitement long en utilisant les mêmes médicaments. D’autres
études ont montré des prévalences similaires (6,06% et 7,4%) pour les helminthes au Burkina
Faso (Ouermi et al., 2007; Zida et al., 2014).
Cette étude nous a permis de relever les parasites intestinaux les plus prévalant (tableau
V) qui ont été notamment des protozoaires dont E. histolytica / dispar (67,4%), E. coli
(35,4%), G. intestinalis (27,2%) et T. intestinalis (20,9%), qui sont des parasites à
transmission fécale. Pour ces protozoaires, Karou et collaborateurs ont trouvé dans le même
pays respectivement 30,74 %, 43,47 %, 21,72 % pour E. histolytica / dispar, G. intestinalis, T.
intestinalis dans la recherche d’étiologie de gastroentérites (Karou et al., 2011). Dans notre
étude, seule la prévalence de G. intestinalis a subi une baisse sensible par rapport à ces
résultats, celle de E. histolytica / dispar ayant doublé. Dans le cas de la prévalence de G.
intestinalis en baisse, la différence de niveau de vie entre les zones rurales et les zones
urbaines pourrait expliquer cela. Cependant une prévalence presque similaire a été observée
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 48
pour G. intestinalis (24,83 %) par Ouermi et al. au Burkina Faso (Ouermi et al., 2012). Une
enquête effectuée en zone rurale au Zimbabwe avait aussi donné des résultats similaires pour
ce parasite fréquemment rencontré avec 23 % de portage (Simango et Dindiwe, 1987). Ce qui
dénote de conditions d’hygiène médiocres ainsi que l’insuffisance en traitement des eaux de
boisson dans ces villages. G. intestinalis a été généralement considéré comme le micro-
organisme le plus fréquemment mis en cause dans les épidémies à partir d'eau destinée à la
consommation humaine aux Etats-Unis, (Barwick et al., 2000). Un chercheur a décrit trois
épidémies de giardiose qu’il a liées soit à une déficience du traitement de potabilisation, soit
une eau souterraine non traitée, ou encore une déficience du système de distribution (Quihui-
Cota et al., 2008). En témoigne une étude chez les enfants de 2 à 41 mois atteints de
gastroentérite aigue, qui a montré des prévalences très faibles (7,6 % pour G. intestinalis ; et
1,08 % pour Entamoeba) (Simpore et al., 2009) ; puisque les nourrissons ne sont autorisés à
boire de l’eau sauf le lait maternel. Cependant, la méconnaissance des génotypes responsables
ne permettant pas de prendre des mesures idoines de prévention, car si les génotypes animaux
sont en cause, les sujets traités se seraient plus vite réinfestés, étant donné la promiscuité avec
certains animaux réservoirs (chien, chat, …) et l’absence d’action préventives côté animal. Ce
qui pourrait justifier en outre, cette forte prévalence de l’espèce.
La répartition par école a montré une forte disparité pour E. histolytica / dispar, T. intestinalis
(P<0,05 pour ces espèces). Les écoles du Centre-ouest ont cumulé les plus fortes prévalences,
dénotant de mauvaises conditions d’hygiène individuelle, collective, l’insuffisance d’eau
potable, et dans une certaine mesure du manque de latrine pour certains ménages (tableau V).
L’helminthe le plus représenté a été Hymenolepis nana. Ces observations ont été déjà faites au
cours d’autres études réalisées par Simporé et collaborateurs d’une part et d’autre part par
Karou et collaborateurs respectivement sur l’étiologie des gastroentérites aigues chez les
enfants de 2 à 41 mois et chez des personnes âgées de 5 mois à 72 ans au Burkina Faso
(Simpore et al., 2009; Karou et al., 2011). La prévalence (6,8 %) dans la présente étude est
relativement basse par rapport aux résultats obtenus (10,2%) en 2002 dans des zones
hydroagricole du Burkina Faso (Dianou et al., 2004). Cette différence s’explique par le fait
que les zones hydroagricoles sont plus favorables aux helminthes. Le taux d’infestation par
école a montré des disparités énormes (P=0,002) avec notamment une école (de Tio A,
Centre-ouest) qui a présenté presque le triple (18,9%) de la moyenne d’infestation de cet
helminthe. Une explication possible est l’absence totale de latrine domestique dans tous les
ménages enquêtés de ce village (tableau III). Aussi, la deuxième école la plus infestée par H.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 49
nana en est une autre du Centre-ouest (Goundi B) qui a présenté 11,1% de portage. Les
conditions du milieu, certaines habitudes alimentaires et les comportements de ces
populations expliquent en partie cette situation. En effet, les populations des deux villages les
plus infestés, qui appartiennent à la province du Sanguié, ont des aliments très riches en
viande de porc, hôte définitif de H. nana. Des marchés spéciaux de porc au four ont souvent
lieu. Ainsi, si la cuisson n’est pas bien faite, des ténias infestants subsisteraient et infesteraient
les consommateurs de la viande.
Le polyparasitisme (tableau VI) a été très important avec un taux global de coïnfection de
49,2%, avec cependant des disparités selon la région, voire selon le village (P<0,05). En
Turquie un taux proche (44,8 %) a été observé chez les enfants, taux fortement corrélé avec
l’anémie (Yentur et al., 2014). Le polyparasitisme semble lié au sexe (les sujets masculins
plus touchés, 86%) et à la classe de l’élève de façon significative (P<0,05). L’analyse des
données du polyparasitisme a montré que le biparasitisme a représenté 31,7 %, le
triparasitisme 13,8% et les sujets hébergeant 4 à 5 parasites ont représenté 3,6 % de la
population. Dans la majorité des cas retrouvés, les sujets polyparasités souffrent de
biparasitisme ou triparasitisme à protozoaires. En effet, L’association entre G. intestinalis et
E. histolytica / dispar a montré une significativité statistique (P<0,05). Les co-infestations G.
intestinalis avec respectivement E. coli (34%), T. intestinalis (27,7%) et H. nana (7,4%) bien
que aussi importantes n’ont pas été statistiquement significatives. Les écoles Goundi B et Tio
A (Centre-ouest) sont celles qui ont eu les prévalences les plus élevées en polyparasitisme. La
présence d’association parasitaire montre le très faible niveau d’hygiène sanitaire, alimentaire
et fécale ainsi que les conditions de vie défavorables de ces sujets polyparasités. La
prédominance des espèces de protozoaires s’explique par le fait que les parasites concernés
ont le plus souvent des modes d’infestations semblables. Ils reflètent les conditions de vie et
de l’environnement avoisinant de la population, qui fait que ceux qui en sont porteurs
représentent des sujets à risque (Basualdo et al., 2007).
Bien que différente selon les écoles, l’infestation par G. intestinalis n’a pas montré de
différence statistiquement significative selon le site. E. histolytica / dispar est associé au
niveau scolaire de l’élève avec une différence statistique significative (P=0,006), montrant
paradoxalement une prévalence élevée parmi les élèves de CM1 (76,1%) par rapport à ceux
de CE2 (49,0%) (Tableau VIII). De même, la prévalence de T. intestinalis a augmenté de
façon significative en fonction de la présence de latrine domestique (P=0,002), laissant
apparaitre que la présence de latrine au domicile de l’élève favorisait l’infestation à T.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 50
intestinalis. Ce qui pourrait se justifier par une mauvaise utilisation des toilettes et une
insalubrité (non assainissement) de ces lieux de défécation. Aussi, le manque d’hygiène des
mains après l’utilisation des toilettes pourraient justifier cet état de fait.
Les données recueillies ont indiqué que globalement la différence d’infestation entre les
groupes d’âge n’est pas significative (p>0,05).
Sur la détection de G. intestinalis PCR en temps réel :
La PCR en temps réel a été réalisée sur des échantillons positifs et négatifs à G. intestinalis
(kyste) à la suite d’une détection par microscopie ordinaire de deux prélèvements de selles en
deux jours successifs chez les écoliers. C’est la première étude de caractérisation moléculaire
de ce parasite au Burkina Faso.
Les résultats de la PCR en temps réel ont été différents de ceux de la microscopie. En effet, 22
cas (23,4 %) initialement positifs à la microscopie se sont révélés négatifs à la PCR. Ainsi,
77,3 % (N=75) des résultats de la microscopie ont été confirmés par la PCR. Cette différence
a été très significative (P=0,003), donnant un taux de détection par la PCR relativement faible
par rapport à la microscopie prise comme base ici. Ce résultat est en contradiction avec le
principe selon lequel la PCR en temps réel pour G. intestinalis est plus sensible que la
microscopie (Verweij et al., 2003; Elsafi et al., 2013). Bien qu’ayant détecté par PCR des cas
de G. intestinalis parmi des échantillons initialement négatifs à la microscopie, Verweij et al.
avaient aussi obtenu 102 (98,1%) positifs par PCR en temps réel sur 104 échantillons
contenant des kystes de G. intestinalis (Verweij et al., 2003). Une sensibilité plus faible (93,4
%) a été observée en ciblant des séquences du gène de la petite sous unité de l’ARNr (même
gène ciblé dans cette étude) comme indiqué par Verweij Jaco en 2003 (Boadi et al., 2014).
L’absence de détection constatée à la PCR pour les 22 échantillons initialement positifs en
microscopie et qui traduise une absence d’ADN cible, pourrait s’expliquer par une lyse des
kystes suivie d’une possible dégradation de l’ADN du parasite par les DNases contenues dans
les selles durant la conservation (Kuk et al., 2012) qui a été à -80°C durant six mois (02
Février à Août 2015) puis à -20°C en moins d’une semaine jusqu’à l’extraction. Aussi, le
même auteur avait déjà fait mention d’inhibiteurs qui se trouveraient dans les selles. Dans
cette étude, nous n’avons pas purifié les kystes avant l’extraction faute de moyen, alors que
d’autres auteurs le préconisent (Bertrand et al., 2005). La non purification préalable des
kystes pourrait expliquer l’absence d’amplification de l’ADN qui serait inhibée par les
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 51
produits de dégradation de l’hémoglobine présents dans les selles (bilirubine, acides biliaires,
ions minéraux) (Kuk et al., 2012). Notons que les techniques de biologie moléculaire
présentent les avantages majeurs d'augmenter de façon considérable la rapidité, la sensibilité
et la spécificité de détection des micro-organismes, mais sont en contrepartie sensibles à un
grand nombre de composés inhibiteurs pouvant alors entraîner une sous-estimation des kystes
ou un résultat faussement négatif.
Une autre justification possible serait une surestimation des cas positifs de G. intestinalis lors
de la microscopie, avec notamment d’éventuels faux positifs. A ce niveau, nous précisons que
les échantillons présentant des kystes ont été vérifiés à toutes les fois par au moins deux
personnels du Laboratoire expérimenté. Aussi, le kyste de ce protozoaire est très facilement
identifiable au microscope par un technicien averti, comme c’est le cas de ceux qui ont
participé à l’activité.
D’ailleurs, quelque fois, nous n’avons identifié que de rares kystes de G. intestinalis mais
seulement après la concentration des selles par la technique de Ritchie décrite plus haut en
matériels et méthodes. Concernant la PCR en temps réel de G. intestinalis, Bertrand et
collaborateurs ont trouvé que pour une concentration initiale de 1,8.102 kystes.200µL-1,
seulement 33 % de réactions positives étaient observées (Bertrand et al., 2004; Bertrand et
Schwartzbrod, 2007).
En outre nous sommes tentés de nous interroger sur l’éventuelle insuffisance de lyse des
kystes. Le kyste de G. intestinalis a une paroi très épaisse et difficile à lyser. Mais la reprise
de l’extraction de cas négatifs a donné de l’ADN non amplifié, donc nous permettant de
minimiser cet aspect sur la lyse de la paroi.
Globalement, les résultats de la PCR n’ont varié ni selon le site, ni selon l’âge, ni selon le
sexe, ni selon la classe fréquentée par l’élève, ni selon le niveau d’instruction du parent, ni
selon la présence de latrine à domicile, ni selon la disponibilité d’eau potable ; pour toutes ces
variables aucune différence statistiquement significative n’a été observée (P>0,05). Ce qui est
similaire aux résultats obtenus à la microscopie pour la même espèce.
Les plus faibles taux de positivité à la PCR sont observés surtout dans la région du Plateau-
central où les résultats de 3 écoles sur 4 ont subi une baisse d’au moins 4 cas, alors qu’au
Centre-ouest, seule une école a présenté un faible taux de positifs. Ceci confirme les cas
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 52
positifs observés à la microscopie au Centre-ouest et ainsi la forte prévalence en giardiose
obtenue.
Des 5 échantillons contenant les kystes de G. intestinalis qui ont été conservés avec du formol
avant d’être congelés, 1 seul s’est révélé négatif par la PCR en temps réel. Ce résultat nous
suggère que cette méthode peut être considérée comme une alternative à la congélation qui est
tributaire d’une disponibilité permanente d’électricité cependant non effective dans nos pays.
Des études plus approfondies sur ce sujet pourraient mieux nous éclairer.
Nous n’avons pas inclus un grand nombre d’échantillon négatif pour G. intestinalis à l’issue
de la microscopie, afin de nous donner la possibilité de contrôler ces résultats supposés
négatifs, par cette technique plus sensible qu’est la PCR en temps réel. Egalement, nous
n’avons pas inclus les formes trophozoïtes du parasite. Cependant, cette non inclusion est due
à l’idée initiale de réaliser un génotypage de kystes de G. intestinalis sur les échantillons que
nous avions pu collectés depuis le mois de Février 2015 chez les élèves que nous ne pouvions
plus toucher au moment de la réalisation de la PCR (vacances scolaires). En effet, c’est pour
des raisons financières que nous avons limité ce travail à la détection de ce parasite par PCR
en temps réel.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 53
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
En milieu scolaire dans les zones rurales au BF, les parasitoses intestinales restent très
fréquentes, le type de parasite rencontré pouvant être variable d’un village à un autre.
Globalement 81,6 % des élèves enquêtés dans les huit villages étaient infestés par les parasites
intestinaux, dont la majorité étaient des protozoaires intestinaux (E. histolytica / dispar, E.
coli, G. intestinalis, T. intestinalis). La région du Centre-ouest a présenté une forte prévalence
(89 %) en parasitose intestinale comparée à la région du Plateau-central (74,4 %).
Dans la présente étude, nous avons utilisé deux méthodes de diagnostic de l’espèce parasitaire
G. intestinalis : la microscopie, supposée être le standard d’or bien que moins sensible, et la
PCR en temps réel, une technique de pointe de biologie moléculaire non accessible en routine,
très sensible même si dans cette étude, nous n’avons pu apporter la preuve. Elle nous a permis
de confirmer 77,3% des résultats et soulevé des doutes sur 22,7 % des cas positifs obtenus à la
microscopie.
Nos données vont dans le sens d’une meilleure prise en compte de l’épidémiologie locale
avec dans certaines zones, une plus grande importance à accorder aux protozoaires et/ou aux
helminthes dans les stratégies thérapeutiques. Une politique d’assainissement à grande
échelle, un contrôle vétérinaire régulier au niveau des animaux domestiques et un meilleur
accès aux soins permettraient de diminuer la prévalence de ces maladies qui pèsent sur l’état
de santé des enfants. Cela passe par la connaissance de la carte de distribution spatiale des
principaux foyers de transmission de ces protozooses.
Les résultats obtenus dans cette étude nous ouvrent les perspectives suivantes :
Envisager une étude moléculaire plus large pour contrôler la qualité (sensibilité et spécificité)
de la microscopie et pour le génotypage de Giardia intestinalis dans notre pays en incluant un
grand nombre d’échantillons négatifs.
Recommandations /suggestions
Au projet VGTS, de prendre en compte les infections bactériennes dans les prochaines
prospections ou études d’impact à mi-parcours.
Au Ministère de la Santé, d’organiser des études de résistances parasitaires aux
antiparasitaires notamment les antihelminthiques vu la fréquence de distributions de ces
médicaments dans notre pays, et vu les notifications de résistance dans certains Pays.
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Janvier 2015.
ANNEXE
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 64
ANNEXES
Annexe 1 :
Fiche de collecte d’échantillons de selles chez les écoliers
Identification de l’élève :
Fiche No :………………………………ID ménage/élève :……………………………
Sexe de l’élève enquêté : Masculin Féminin NP
Classe fréquentée :……………… CE2 CM1
Région :……………………Province…………………….Village……………………
Ecole :……………………………………..Date de l’enquête :………………………
Echantillons de Selles : oui non
Indicateurs anthropométriques courants de l’état nutritionnel :
Date de naissance : ____/____/______
Age(Années) : 8-10 10-12 12-14 NP
Poids :………………………………………Taille :……………………………
Caractéristiques socio-culturelles :
Ethnie :………………………………………………………………………….
Niveau d’instruction du chef de ménage :………………………………………
Profession du chef de ménage :…………………………………………………
Connaissance des maladies parasitaires liées au manque d’hygiène et des agents
responsables :
Connaissances du péril fécal : Oui Non PR
Présence de latrines : Oui Non VM
Défécation dans des latrines : Oui Non PR
Disponibilité d’eau potable :
Disponibilité permanente d’eau……………… Oui Non
Etat de santé de l’enfant:
Présence de symptômes : Oui non NSP ; Si oui, date de début : ____/____/______
Est-ce que l’enfant fait la diarrhée ? Oui non NSP Nombre de selles/jour :………
Initiation traitement antiparasitaire : Oui Non NSP PR
Dénomination du médicament :………………………date dernière prise :……………….
Est-ce qu’il y a des animaux dans le ménage ? 1: absent 2: poules 3: chien
4: chèvre 5: âne 6: vache 7: autre…………. 99: PR
Analyse de Laboratoire :
Parasite(s) identifié(s) :………………………………………………………………………
Commentaire :………………………………………………………………………………
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Annexe 2:
Technique de concentration selon Ritchie modifiée :
2 g de selles a été diluée dans 20 ml d'eau formolée à 10%, puis tamisée sur un chinois.
Nous avons recueilli 2 ml du filtrat dans un tube dans lequel nous avons ajouté 1 ml d'éther.
Nous avons bouché le tube et avons agité de façon à obtenir une émulsion homogène.
Nous avons ensuite centrifugé les tubes pendant 2 minutes à 2000 tr/mn.
Nous avons obtenu trois couches dont une couche aqueuse, une couche épaisse contenant des
débris et une couche éthérée légèrement jaunâtre.
Nous avons vidé le tube brusquement, et alors examiné entre lame et lamelle le culot.
Annexe 3 :
Technique de Kato-Katz :
Réalisation : Après avoir tamisé la selle, on a rempli le trou de la plaque calibrée appliquée
sur la lame ; ensuite nous avons retiré la plaque puis écrasé la selle par la cellophane imbibée
au préalable de solution de Kato (trempés au moins 24 heures). La cellophane est alors
retournée sur un papier filtre. Après un temps d’éclaircissement de 30 à 50 minutes à la
température ambiante, la préparation est lue à l’objectif X10.
Annexe 4 :
Protocole d’extraction de l’ADN par le kit « DNA-Sorb-B, Sacace Biotechnologies® » :
1. La solution de lyse et la solution de lavage (en cas de stockage à +2-8C) devraient être
réchauffées à 60-65C jusqu'à la disparition des cristaux de glace.
2. Préparer le nombre nécessaire de tubes de polypropylène de 1.5 ml.
3. ajouter à chaque tube 300 ul de solution de lyse. Etiqueter les tubes
4. ajouter 100 ul de l’échantillon dans le tube approprié.
5. Vortex vigoureux des tubes avant d’incuber pendant 5 min à la température de 65°C.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 66
6. Centrifuger tous les tubes à 5 000 r/min pendant 5 sec.
Si l'échantillon n'est pas complètement dissous, il faut re-centrifuger le tube durant 5 min à 12
000 r/min et transférer le surnageant dans un nouveau tube pour l'extraction d'ADN.
7. Vortex vigoureux du sorbant et ajout de 20µl à chaque tube.
8. Vortex pendant 5-7 sec et incuber tous les tubes pendant 3 min à la température ambiante.
Répéter cette étape.
9. Centrifuger tous les tubes pendant 30 sec à 5000g (r/min) et à l'aide d'une micropipette avec
un embout anti-aérosol, enlever soigneusement et jeter le surnageant de chaque tube sans
déranger le culot. Changer les bouts entre les tubes.
10. ajouter 300 µl de la solution de lavage 1 à chaque tube. Vortexer vigoureusement et
centrifuger durant 30 sec à 8000 g (r/min). Enlever et jeter le surnageant de chaque tube.
11. Ajouter 500 µl de la solution de lavage 2 à chaque tube. Vortexer vigoureusement et
centrifuger pendant 30 sec à 8000 g. Enlever et jeter le surnageant de chaque tube.
12. Répéter l'étape 12 et incuber tous les tubes avec le bouchon ouvert pendant 5 min à 65°C.
13. resuspendre le culot dans 50 µl de l’éluent (DNA-eluent). Incuber pendant 5 min à 65°C et
à vortex périodiquement.
14. Centrifuger les tubes pendant 1 min à 12 000 g.
15. Le surnageant contient l'ADN prêt pour l'amplification.
Annexe 5 :
Protocole d’extraction par la méthode de Sarkari, B. modifiée
1. 200 μl de la suspension de kystes en eau distillée ou PBS, ajouter à 200 μl de Triton X100
(2% ou 3%) sont chauffés pendant 30 min à 72ºC.
2. Centrifuger et recueillir le surnageant
3. A 200 µl de l’échantillon (surnageant), on a ajouté 200 μl de la solution de lyse ;
4. Ajouter 10 μl de protéinase K puis incubation toute une nuit à 37ºC.
Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 67
5. Centrifuger et recueillir le surnageant ;
6. Ajouter 200µl de NaCl 5M au surnageant et vortexer pendant 15 secondes. Isoler les
protéines précipitées par centrifugation à 13000 rpm pendant 5 min.
7. Transférer 500μl du surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Ajouter 1 ml d'éthanol
absolu (T° ambiante). Laissez précipiter l'ADN en agitant les tubes délicatement à la
main. Isoler l'ADN par centrifugation à 13000 rpm pendant 1 minute ; puis jeter le
surnageant.
8. Laver deux fois avec 800µl d'éthanol 70% frais (préalablement conservé à -20°C).
Vortexer, et centrifuger à 13000 rpm pendant 1 min puis jeter le surnageant.
9. Eliminer le reste d'éthanol en égouttant les tubes sur du papier absorbant, puis les sécher à
bouchon ouvert sur incubateur.
10. Dissoudre l'ADN dans 50µl de Tampon d’élution (TE) et vortexer pendant 30 secondes
puis incuber.
11. Utiliser 2µl d'ADN pour la quantification au Nanodrop.
12. Conserver l’ADN à -20°C.
Annexe 6 :
Amorces et sondes de G. intestinalis utilisés (Applied Biosystem) :
Cible Code d’accès Fonction Séquence (5’ – 3’)
G.
intestinalis
2338334 Amorce sens GAC GGC TCA GGA CAA CGG TT
2338334 Amorce anti sens TTG CCA GCG GTG TCC G
Sonde FAM–CCC GCG GCG GTC CCT GCT AG-BHQ
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