Mémoire Présenté - LaBioGene · 2016-06-20 · protozooses intestinales parmi les enfants dans...

UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU

--------------- UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE

(UFR/SVT)

Mémoire Présenté

Par : Tibila KIENTEGA

Pour l’obtention du Master II

de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées

de l’Université de Ouagadougou

SUR LE THEME:

Parasitoses intestinales en milieu scolaire et détection

de Giardia intestinalis par PCR en temps Réel au

Burkina Faso (BF).

Soutenu le 18 Décembre 2015 devant le jury composé de :

Président : Prof Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou

Membres : Dr Serge P. DIAGBOUGA, Maitre de Recherche, IRSS / CNRST,

Ouagadougou

Dr Florencia W. DJIGMA, Assistante, Université de Ouagadougou

LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

(LABIOGENE)

N° d’Ordre ............................../LABIOGENE

i

Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA

De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont

incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les

outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du

diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice

par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de

l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du

Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de

fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour

conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité

ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une

surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre

corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des

cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y

rester.

Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a pour but

de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à

disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences

pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires.

Le master BioGeMA est :

Un Master à dimension sous-régionale

Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaires

Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE

Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des

médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres

hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il

ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de

chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la

constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau

africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.

Professeur Jacques SIMPORE

Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire

et de Génétique Moléculaire

UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologie

Université de Ouagadougou – Burkina Faso

ii

DEDICACES

Nous dédions ce travail à nos deux parents qui nous ont quittés. Que Dieu

Tout Puissant vous garde auprès de lui !

A notre chère épouse Judith qui nous a toujours encouragé et soutenu.

A nos enfants chéris: Aude, Guénaël et Ivan, nous espérons que vous

ferez mieux que papa.

A nos frères, sœurs, oncles, cousins, ….

A tous nos proches qui nous ont soutenus d’une manière ou d’une autre.

iii

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé dans le Laboratoire de l’Institut de Recherche en Science de la Santé

(IRSS) et dans le Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquée

(LABIOGENE) logé au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI (CERBA).

Nous exprimons notre profonde gratitude :

A notre Directeur de mémoire, Pr Jacques SIMPORE, Professeur titulaire de Génétique et de

Biologie moléculaires, Coordonnateur du Master en Biologie Moléculaire et en Génétique

Moléculaire Appliquées (BioGeMA), Directeur du CERBA / LABIOGENE, Recteur de

l’Université Saint Thomas d’Aquin, pour avoir accepté de diriger ce mémoire, pour le support

financier de l’étude et pour son encadrement exceptionnel malgré ses multiples occupations.

Au Dr Pokiandi Serge DIAGBOUGA, Maitre de recherche en Microbiologie-Immunologie à

l’IRSS, pour l’encadrement, l’enseignement, le soutien inestimable et la confiance témoignée

lors de la réalisation de ce travail. Merci d’avoir accepté la codirection de ce mémoire.

Au Dr Djénéba OUERMI, Maître assistante, pour son encadrement et ses enseignements.

Au Dr Florencia DJIGMA, Assistante à l’UFR/SVT, pour ses enseignements, son

encadrement et ses conseils et pour avoir accepté de juger ce travail.

Au corps professoral de l’UFR/SVT et en particulier celui du Master de BioGeMA pour la

contribution à notre formation.

A Mlle T. Rébecca COMPAORE, Mr Abdoul K. OUATTARA, Mr Lassina TRAORE, Mr

Serge T. SOUBEIGA et à tous les autres Doctorants du LABIOGENE pour leurs conseils et

appui technique à la réalisation de ce mémoire.

Au Père Albert YONLI et à tout le personnel du CERBA pour l’accueil et l’accompagnement.

Aux étudiants de Master 2 de BioGeMA, pour l’esprit de famille et de solidarité entretenu.

A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine pour son soutien financier à travers le

programme PACER2.

Au Pr Gueladio CISSE, Investigateur principal du projet « Vegetable Go to School » et son

équipe au Swiss TPH, notamment Séverine Erismann et Astrid Knoblauch pour le soutien

financier, les conseils et la collaboration à la réalisation de ce mémoire.

Au personnel du Laboratoire de l’IRSS, pour l’appui lors de la collecte des échantillons.

iv

RESUME :

Introduction : Les parasitoses intestinales constituent un problème majeur de santé publique

pour la population burkinabé. L’objectif de la présente étude a été de caractériser les parasites

intestinaux dont Giardia intestinalis particulièrement chez les écoliers au Burkina Faso. Ce

travail a été réalisé dans un contexte de mise en œuvre de programme de prévention des

maladies associées à l’hygiène défectueuse.

Méthodes : Il s’est agi d’une étude transversale descriptive qui a eu lieu du 20 Décembre

2014 au 31 Août 2015 chez des élèves dans huit écoles des régions du Centre-ouest et du

Plateau-central du Burina Faso. L’âge de ces élèves variait entre 8 et 14 ans. Un examen

parasitologique des selles a été réalisé à deux reprises sur deux échantillons de selles obtenus

sur deux jours consécutifs chez chaque participant. Les selles contenant des kystes de Giardia

intestinalis ont fait l’objet d’une confirmation de la présence par PCR en temps réel.

Résultats : Au total, 441 enfants d’âge scolaire ont été examinés. La prévalence moyenne des

enfants parasités pour l’ensemble des régions a été de 81,6 %. Les écoles des villages du

Centre-ouest ont présenté une plus forte prévalence en parasites intestinaux (89,0 %) par

rapport aux écoles des villages du Plateau-central (74,4 %). Des poly parasitismes ont été

observés dans 49,2 % des échantillons, qui ont présenté parfois deux, trois, quatre ou cinq

parasites à la fois. Le parasite le plus représenté a été Entamoeba histolytica / dispar (67,4 %).

A la microscopie, Giardia intestinalis est venu en troisième position après Entamoeba coli

(35,4 %) avec une prévalence de 25,9 %. Il est le plus souvent retrouvé en association avec

Entamoeba histolytica / dispar (63,8 %). L’helminthe le plus fréquent a été Hymenolepis

nana, avec une prévalence de 6,8 %. La PCR en temps réel réalisé sur un total de 97

échantillons (94 positifs et 03 négatifs) a confirmé 77,3 % des résultats de la microscopie,

contre 22,7 % des échantillons contenant des kystes à la microscopie qui se sont révélés

négatifs à la PCR.

Conclusion : A travers cette étude, la PCR en temps réel a été appliquée à la recherche de

Giardia intestinalis, un protozoaire intestinal qui touche les enfants avec de nombreuses

infestations récurrentes et ou rechutes. C’est la première étude de caractérisation moléculaire

de ce parasite au Burkina Faso. Nos travaux confirment la présence et l’ampleur des

protozooses intestinales parmi les enfants dans les villages ou zones rurales du pays.

Mots clés : Burkina Faso, parasitoses intestinales, Giardia intestinalis, PCR en Temps Réel.

v

ABSTRACT :

Introduction: Intestinal parasitoses remain a major public health problem in Burkina Faso

population.The aim of this study was to characterize the intestinal parasites whose Giardia

intestinalis particularly in stools of school age children at Burkina Faso. This work was carry

out in context of prevention programme implementation of defective hygiene associated

diseases.

Methods: It was about a descriptive cross-sectional study which started December 20, 2014

at August 31, 2015 at pupils of eight schools of Western Center and Central Plate areas of

Burkina Faso. Stool parasitological examination was carried out twice on two stools for each

participant during two consecutive days. The pupil’s age varied between 8 and 14 years. Stool

samples containing cysts of Giardia intestinalis were the subject of parasite detection by real

time PCR.

Results: Total population of 441 school age children were examined.The average prevalence

of parasitized pupils was 81.6 %. The schools of Western Center villages presented a stronger

rate of intestinal parasites (89.0 %) compared to the schools of central Plate villages (74.4 %).

A multiple parasites associations were found in 49.2 % of the samples, which sometimes

presented two, three, four or five parasites at the same time.The most widespread parasite was

Entamoeba histolytica / dispar (67.4 %). By microscopy, Giardia intestinalis came in third

position with a rate from total prevalence of 25.9 % after Entamoeba coli (35.4 %). It is

generally in association with Entamoeba histolytica / dispar (63.8 %). The most frequent

helminth was Hymenolepis nana, with a prevalence of 6.8 %. The real time PCR on a total of

97 samples (94 positive and 03 negative) confirmed 77.3 % of microscopy results, however,

22.7 % of samples presenting cysts at microscopy appeared negative with the Real Time PCR.

Conclusion: Through this study, the real time PCR was applied in Giardia intestinalis search,

an intestinal protozoon which concerns children with many recurring infestations and or

relapses.It is the first molecular study of this parasite characterization in Burkina Faso.Our

work confirms the presence and the width of the intestinal protozooses among the children in

the villages or rural zones of the country.

Key words: Burkina Faso, intestinal parasitoses, Giardia intestinalis, Real Time PCR.

vi

SOMMAIRE

Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ..................................................................... 1

DEDICACES ............................................................................................................................. ii

REMERCIEMENTS ................................................................................................................. iii

RESUME : ................................................................................................................................. iv

ABSTRACT : ............................................................................................................................. v

SOMMAIRE ............................................................................................................................. vi

LISTE DES FIGURES : .......................................................................................................... viii

LISTE DES TABLEAUX : ..................................................................................................... viii

ABREVIATIONS : ................................................................................................................... ix

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1

PARTIE 1 : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................. 4

1- GENERALITES SUR LES PARASITOSES INTESTINALES .................................... 4

1-1- Définition ........................................................................................................................ 4

1-2- Mode de contamination des parasites intestinaux ........................................................... 4

1-3- Aires de répartition des parasitoses intestinales et importance en pathologie clinique .. 5

1-4- Agents des parasitoses intestinales-classification ........................................................... 6

1-5- Méthodes de diagnostic ................................................................................................... 8

1-6- Mesures de lutte ............................................................................................................ 10

1-7- Traitement des parasitoses intestinales : ....................................................................... 10

2- RAPPEL SUR LA GIARDIOSE .................................................................................. 10

2-1- Le parasite ..................................................................................................................... 11

2-1.1 Définition/historique : ..................................................................................................... 11

2-1.2 Taxonomie : .................................................................................................................... 11

2-1.3 Morphologie .................................................................................................................. 13

2-1.4 Biologie: ........................................................................................................................ 14

2-1.5 Le Génome de Giardia intestinalis ................................................................................. 16

vii

2-2- Épidémiologie de la giardiose ....................................................................................... 17

2-3- Méthodes diagnostiques ................................................................................................ 18

2-4- Traitement et prévention ............................................................................................... 19

PARTIE 2 : NOTRE ETUDE .................................................................................................. 20

1- OBJECTIFS DE L’ETUDE .......................................................................................... 20

2- MATERIELS ET METHODES .................................................................................... 20

2-1- Milieu de l’étude (cadre et champs d’étude) ................................................................. 20

2-2- Type et période d’étude ................................................................................................. 22

2-3- Population d’étude / Échantillonnage. .......................................................................... 23

2-4- Méthodes, techniques et instruments de collecte de données ....................................... 23

2-5- Analyse parasitologique des selles ................................................................................ 24

2-6- Diagnostic moléculaire : PCR en Temps Réel .............................................................. 26

2-6.1 Extraction de l’ADN des kystes à partir des selles ......................................................... 26

2-6.2 PCR en temps réel ........................................................................................................... 27

2-7- Considérations éthiques ................................................................................................. 28

2-8- Méthode de traitement des données. ............................................................................. 28

3- RESULTATS ................................................................................................................ 29

3-1- Population d’étude ......................................................................................................... 29

3-2- Prévalence des parasitoses intestinales ......................................................................... 33

3-3- Résultats de la PCR en temps réel ................................................................................. 42

4- DISCUSSION ............................................................................................................... 46

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................... 53

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................. 54

ANNEXES ............................................................................................................................... 64

viii

LISTE DES FIGURES :

Figure 1 : Forme végétative de Giardia intestinalis ............................................................... 13

Figure 2 : Schéma d'un kyste de Giardia intestinalis ............................................................. 14

Figure 3 : Schéma des réservoirs et voies de contamination de Giardia intestinalis. ............ 15

Figure 4: cycle évolutif de Giardia intestinalis. ..................................................................... 16

Figure 5: localisation des écoles (villages) cibles ................................................................... 21

Figure 6 : Images de deux kystes de G. intestinalis vus à l’examen direct ............................. 33

Figure 7 : Trophozoïte d’Entamoeba coli observé à l’examen direct ..................................... 33

Figure 8 : Hymenolepis nana observé à l’examen direct ........................................................ 34

Figure 9 : Balantidium coli à l’examen direct. ........................................................................ 34

Figure 10: Répartition des différentes formes de G. intestinalis rencontrés ........................... 38

Figure 11 : Graphique du résultat de l'amplification par la PCR en temps réel ...................... 42

Figure 12 : Résumé comparatif des résultats de la PCR en temps réel avec la microscopie .. 45

LISTE DES TABLEAUX :

Tableau I : Répartition de la population totale enquêtée selon l’école et le sexe : ................. 29

Tableau II : caractéristiques sociodémographique de la population ayant fait l’objet de la

PCR en temps réel : .................................................................................................................. 31

Tableau III : Autres caractéristiques sociodémographiques et socioéconomiques de la

population : ............................................................................................................................... 32

Tableau IV : Répartition globale des enfants parasités par école ........................................... 35

Tableau V : Prévalence des différents parasites intestinaux selon l’école d’origine : ............ 36

Tableau VI : Polyparasitisme par école sur la population totale (441 élèves) ........................ 37

Tableau VII : Coexistence Giardia intestinalis et autres parasites fréquents ........................ 38

Tableau VIII : Répartition des parasites les plus fréquents sur les 120 échantillons selon les

critères sociodémographiques. ................................................................................................. 40

Tableau IX : Répartition des parasites rencontrés sur les 97 échantillons selon d’autres

critères sociodémographique ou économiques ......................................................................... 41

Tableau X : Résultats de la PCR en temps réel selon les critères sociodémographiques : ..... 43

Tableau XI : Résultats de la PCR en temps réel selon d’autres critères sociodémographiques

et / ou socioéconomiques ......................................................................................................... 44

Tableau XII : confrontation des résultats de la microscopie à ceux de la PCR en Temps Réel:

.................................................................................................................................................. 45

ix

ABREVIATIONS :

ADN Acide Désoxyribonucléique

ARN Acide RiboNucléique

ARNr ARN ribosomique

BHQ Black Hole Quencher

CERBA Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni

EDTA Ethylène Diamine Tétra-acétique

EFIA Elongation Factor 1 Alpha

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Essay

g gradient

Gdh glutamate déshydrogénase

IFI Immunofluorescence Indirecte

IRSS Institut de Recherche en Science de la Santé

LABIOGENE Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire

M molaire

NaCl Chlorure de Sodium

OMD Objectif du Millénaire pour le Développement

PBS Phosphate Buffer Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

Rpm Rotation par minute

SIDA Syndrome d’Immunodéficience Humaine

SSU rRNA ou rRNA 18S Small Subunit of ribosomal Ribonucleic Acid

TAMRA 6-carboxytétraméthylrhodamine

Taq Thermophilus aquaticus

TBE Tris Borate EDTA

TE Tampon d’Elution

TPI Triose Phosphate Isomerase

VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine

WASH Water, Sanitation and Hygiene

INTRODUCTION ET ENONCE DU PROBLEME

1

INTRODUCTION

Dans le monde, les parasitoses intestinales constituent un sérieux problème de santé publique.

Il a été estimé que plus de trois milliards de personnes sont infestées par les parasites

intestinaux dans le monde (Keiser et Utzinger, 2010). Ces parasitoses intestinales,

généralement provoquées par les helminthes et les protozoaires intestinaux, restent fréquentes

surtout dans les pays à hygiène précaire dont le nôtre. En effet, une étude récente réalisée à

Bobo Dioulasso au Burkina Faso (BF) sur les demandes d’examen parasitologique à la

recherche d’étiologie de gastroentérites a montré une prévalence globale des parasitoses

intestinales de 65,3 %, dont la majorité (53 %) sont transmises par l’eau sale (Sangare et al.,

2015). Parmi les protozoaires, Entamoeba histolytica (E. histolytica) a un rôle majeur dans la

survenue de syndromes dysentériques dits amibiens. D’autres protozoaires ont un rôle plus

discutable. Cependant, Giardia intestinalis (G. intestinalis) et Trichomonas intestinalis (T.

intestinalis) doivent retenir l'attention car assez fréquents (Niyizurugero et al., 2013). En

2005, l’incidence mondiale de la Giardiose a été évaluée entre 20-60% (Yakoob et al., 2005).

Dans les pays à climat tropicaux, un fort pourcentage d'enfants, même élevés dans de bonnes

conditions d'hygiène, sont porteurs d’helminthes comme Schistosoma mansoni, Trichuris

trichiura, Ascaris lumbricoides, Taenia saginata (Nyantekyi et al., 2014).

Ces parasitoses mettent à mal le parcours scolaire des enfants du fait qu’elles entrainent une

insuffisance pondérale, des retards de croissance, d’importants coûts pour les soins, un

manque d’attention en classe, l’absentéisme à l’école (Mamo, 2014), de même que l’abandon

scolaire voire la pauvreté et donc l’incapacité des parents à honorer les frais de scolarité.

Outre ces effets néfastes, d’autres études ont montré que les enfants atteints de ces parasitoses

intestinales sont plus affectés par différentes autres maladies infectieuses comparées à

d’autres non infestés (Yentur et al., 2014). Ainsi ces pathologies constituent des causes de

morbidité dans les pays tropicaux surtout parmi les enfants affectés par le VIH (Jegede et al.,

2014).

Le diagnostic de ces maladies se fait principalement par microscopie optique. Cependant, la

microscopie bien que considérée comme standard pour la détection des parasites intestinaux

(Verweij et al., 2003), demeure faiblement sensible. L’utilisation de la PCR en Temps Réel

permet d’augmenter significativement la sensibilité et la spécificité de la détection ou

caractérisation de certains parasites dont Giardia intestinalis. Ce protozoaire est très fréquent

2

chez l’enfant et même chez l’adulte ; il a été retrouvé chez 43,74 % de sujets de 5 mois à 72

ans souffrant de gastroentérites reçu au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou

(CMSCO) (Karou et al., 2011). Il provoque chez ces derniers des infestations récurrentes ou

de rechutes faites de diarrhée souvent alternée de constipation. L’évaluation de sa prévalence

par la biologie moléculaire nous permet d’être renseignés sur l’efficacité du diagnostic

microscopique.

Au Burkina Faso, la tranche d’âge de la population de 6 à 11 ans, est la plus nombreuse, soit 2

943 055, représentant 18% de la population totale (Sources : INSD, recensement 2006). Cette

tranche d’âge est celle qui est la plus touchée en matière d’infestations parasitaires. Ce groupe

correspond aux enfants en âge scolaire, la population cible de cette étude. L’objectif de cette

étude a été de déterminer la prévalence des parasitoses intestinales en milieu scolaire et de

mettre à profit la PCR en Temps Réel pour confirmer la présence de kystes de Giardia

intestinalis observés en microscopie ordinaire.

Énoncé du problème

Les parasitoses intestinales présentent toujours un fort taux de morbidité dans le monde,

surtout dans les régions tropicales et dans les pays en développement. A l’heure actuelle, sur

le plan de la lutte, les parasitoses intestinales ne sont pas considérées en termes de gravité

comme d’autres maladies comme le VIH-SIDA et le paludisme, si bien qu’elles demeurent un

problème majeur de santé publique dans nos contrées. Les facteurs favorables à l’existence de

ces pathologies sont essentiellement les conditions climatiques (tropicales), les conditions

d'hygiène et d’assainissement rudimentaires, la malnutrition, la pauvreté et le manque

d’encadrement des ménages (Bouree et al., 1984). En conséquence, des millions de personnes

sont affectées à travers le monde dont la grande majorité des cas se retrouvent dans les pays

en développement (OMS, 2012). Ces maladies sont particulièrement sévères chez l’enfant

chez qui, elles sont à l’origine de malnutrition, d’anémie, de faible résistance aux infections et

du fort taux de mortalité infantiles (Yentur et al., 2014).

Parmi les parasites incriminés, Giardia intestinalis est très souvent retrouvé dans les selles

d’enfants (Fonseca et al., 2014). Cette espèce est identifiable à la microscopie ordinaire et

caractérisable par la biologie moléculaire (PCR en Temps Réel), technique plus sensible

(Elsafi et al., 2013). Il existe très peu de données de surveillance sur la prévalence de ce

parasite. Une approche de la prise en charge des giardioses intégrant cet aspect pour une

prévention en amont (niveau animal) à travers l’identification des génotypes incriminés et le

3

contrôle de la qualité du diagnostic microscopique par la biologie moléculaire devient de plus

en plus nécessaire. En effet, la PCR en temps réel n’a pas encore été utilisée pour la détection

de ce parasite dans notre pays.

De nombreuses initiatives pour résoudre les problèmes sanitaires liés aux parasites intestinaux

ont été prises dans le passé. Il s’agit des programmes Water Sanitation Hygiene (WASH)

engagés par des ONG (Terre des Hommes par exemple), du projet intégré de lutte contre les

maladies négligées au BF lancé depuis 2007 par notre pays ; et du projet VGTS (Vegetable

Go to School ou les légumes vont à l’école) qui a vu le jour en 2014. Ces programmes visent

d’une part à accroître la perception et la connaissance des populations sur l’hygiène,

l’assainissement et la santé, et d’autre part à traiter tout cas de parasitose diagnostiqué.

En dépit de ces efforts, beaucoup d’enfants demeurent affectés. De nouvelles initiatives de

contrôle s’avèrent indispensables. L'évaluation soigneuse des mesures de contrôle des

parasitoses est essentielle pour s'assurer qu'elles sont rentables. Cependant, l'obtention de

résultats probants exige une connaissance de l’épidémiologie des parasites (dont G.

intestinalis) et la disponibilité de données fiables sur celle-ci.

C’est pourquoi la présente étude s’est donnée pour objectif de caractériser les parasites

intestinaux dont Giardia intestinalis particulièrement chez les enfants d’âge scolaires au BF.

Elle a permis d’obtenir des informations précises sur les parasitoses intestinales de l’enfant et

surtout de Giardia intestinalis en milieu scolaire dans deux régions du BF et a permis de

susciter la mise en œuvre de programme efficace et efficient pour leur contrôle.

PARTIE 1 : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

4

PARTIE 1 : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1- GENERALITES SUR LES PARASITOSES INTESTINALES

1-1- Définition

Les parasites sont des êtres vivants qui, pendant une partie ou la totalité de leur existence,

vivent aux dépens d'autres êtres appelés hôtes. On parle de parasitisme, lorsque la présence du

parasite est d’emblée pathogène pour son hôte (Zee et Zinkham, 1975). L’infestation est la

pénétration d'un parasite non microbien dans l'organisme.

Certains parasites se développent dans le tube digestif de l’hôte et sont à l’origine de

symptomatologie diverses au niveau intestinal et ou stomacal ; ce sont les parasites

intestinaux et les maladies provoquées sont appelées parasitoses intestinales. Parmi les

parasites en cause, on distingue des Métazoaires et des Protozoaires. Les Protozoaires sont des

êtres unicellulaires dépourvus de chlorophylle doués de mouvement. Ils se multiplient par

mitose ou par reproduction sexuée (Faust et Jung, 1956). Les Métazoaires quant à eux sont

des êtres pluricellulaires renfermant entre autres les Plathelminthes et les Némathelminthes à

localisation intestinale. Ces parasites pour survivre, s’adaptent à l’environnement dans lequel

ils se trouvent en subissant différentes transformations. Le cycle de développement du

parasite est la suite des transformations se déroulant dans un ordre précis avec ou sans passage

dans le milieu extérieur, que doit subir celui-ci depuis la naissance au stade adulte

reproducteur (Centeno-Lima et al., 2013). Ainsi, chez les protozoaires, lorsque les conditions

ne sont pas favorables à leur développement, certains se transforme en kystes qui sont des

formes de résistance (Erlandsen et al., 1996).

1-2- Mode de contamination des parasites intestinaux

Les parasites intestinaux peuvent pénétrer dans l'organisme par deux voies différentes : la

voie buccale et la voie transcutanée.

- Pénétration par voie buccale :

La contamination se fait par ingestion d'éléments infestant contenus dans l'eau ou les aliments

souillés à la faveur d'une faute d'hygiène : cas d’œufs embryonnés d'ascaris ou de

5

trichocéphale, de kystes mûrs d'amibes, de Giardia ou oocystes mûrs de coccidies, de larves

de ténias (Feng et Xiao, 2011).

- Pénétration par voie transcutanée :

Elle se fait de façon active par effraction cutanée. Ce mode de contamination est le fait des

larves strongyloïdes ou d'anguillules, d'ankylostome et de furcocercaire de schistosomes

(Terer et al., 2013).

1-3- Aires de répartition des parasitoses intestinales et importance en pathologie

clinique

1-3.1 Répartition géographique:

On distingue deux groupes :

- Les parasitoses cosmopolites :

Elles peuvent s'observer sur toute la surface du globe. Cependant, elles sont plus fréquentes en

zones tropicales et intertropicales qu'en zones tempérées (Sulaiman et al., 2004; Brandonisio,

2006) : amibiase, giardiose, trichomonose, ascaridiose, trichocéphalose, téniasis.

- Les parasitoses tropicales et intertropicales

Ce sont des parasitoses qui sévissent à l'état endémique exclusivement dans les régions

chaudes et humides du globe (Sulaiman et al., 2004) : nécatorose, anguillulose, bilharziose.

1-3.2 Importance des parasitoses intestinales sur le plan clinique

Au cours de ces deux dernières décennies, les parasitoses intestinales ont fait l'objet de

nombreuses études. Ces études ont permis de situer la place occupée par les parasitoses

intestinales dans l'ensemble de la pathologie infectieuse.

Les parasites peuvent exercer sur l'organisme des actions diverses quelquefois isolées,

généralement associées, qui rendent souvent complexe la pathogénie des maladies parasitaires

(Bouree et Aube, 1987). On distingue cinq types d'action sur l'organisme :

- Action spoliatrice :

Tout parasite s'accroit plus ou moins directement aux dépens de l'organisme auquel il dérobe

une partie des substances assimilables. Cette action peut être insignifiante (ascaris, oxyure)

ou très importante (ankylostomes) (Zenian et Gillin, 1985; Yentur et al., 2014).

6

- Action toxique:

Elle est due aux toxines libérées au moment de la piqûre des hôtes vecteurs ou au moment de

la pénétration transcutanée des larves. Elle peut être aussi due aux toxines sécrétées par

certains parasites à l'intérieur de l'organisme (toxines nécrosantes des amibes, toxine

hémolytique des bothriocéphales, etc...) (Aubry, 1984; Bouree et Aube, 1987).

- Action traumatique :

Elle est liée à l’effraction cutanée lors de la piqûre des vecteurs et lors de la pénétration des

larves de vers. Cette effraction cutanée constitue une porte d'entrée pour la surinfection.

Elle est aussi due à l’effraction des tissus lors de la migration des formes larvaires, de même

qu’à l’ulcération de l'intestin par les amibes (Aubry, 1984; Zenian et Gillin, 1985).

- Action mécanique:

C’est l’obstruction de l'intestin ou du canal de WIRSUNG par un paquet d’ascaris (Zenian et

Gillin, 1985).

- Action inflammatoire et irritative :

Certains parasites occasionnent par leur présence même, une irritation plus ou moins intense.

On peut citer par exemple, l'irritation du côlon par certains protozoaires entraînant une

diarrhée (Chapoutot et al., 1997; Enserink et al., 2015).

1-4- Agents des parasitoses intestinales-classification

Les parasites intestinaux de l’homme peuvent être subdivisés selon leur forme microscopique

en deux grands groupes que sont les protozoaires intestinaux (unicellulaires) et les helminthes

intestinaux (pluricellulaires) (Suzuki et al., 2013).

1-4.1 Les protozoaires intestinaux

En fonction de l'appareil locomoteur, on distingue quatre classes : les rhizopodes, les

flagellés, les ciliés et les sporozoaires (Goldsmith et Heyneman, 1989).

- Classe des rhizopodes :

Ils se déplacent à l'aide de pseudopodes (amibes surtout) : Entamoeba histolytica, Entamoeba

coli, Entamoeba hartmanni, Endolimax nana, Pseudolimax butschlii….

7

- Classe des flagellés :

Ils se déplacent à l'aide de flagelles : Trichomonas intestinalis, Giardia intestinalis,

Chilomastix mesnilii, Retortamonas intestinalis,….

- Classe des ciliés :

Ils se déplacent à l'aide de cils vibratiles. Seul Balantidium coli possède un intérêt médical.

- Classe des sporozoaires / Coccidies :

Ils sont dépourvus d'appareil locomoteur différencié. Ce sont surtout: Isospora belli,

Sarcocystis hominis et Cryptosporidium spp.

1-4.2 Les helminthes intestinaux

Ce sont des êtres pluricellulaires possédant des tissus différenciés. Ils sont reconnus sous

formes adultes des deux sexes, sous forme larvaire, embryonnaire ou ovulaire.

On distingue: les némathelminthes ou vers ronds ou nématodes et les plathelminthes ou vers

plats subdivisés en cestodes et en trématodes (Suzuki et al., 2013).

- Les nématodes

Ce sont pour la plupart des vers ovipares à sexes séparés. Les nématodes intestinaux

spécifiques de l'Homme sont : Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Ascaris

lumbricoïdes, Enterobius vermicularis, Strongyloïdes stercoralis, Trichuris trichiura.

- Les plathelminthes

Cestodes

Ce sont des vers généralement hermaphrodites, dépourvus de tube digestif et ayant un corps

segmenté : Taenia saginata, Taenia solium, Hymenolepis nana,….

Les trématodes

Ils sont pourvus d'un tube digestif incomplet et d'un corps non segmenté. On distingue les

douves (hermaphrodites) et les schistosomes (à sexes séparés).

Les douves: Fasciola hepatica, Dicrocoelium dendriticum, Fasciolopsis bush,

Clonorchis sinensis.

Certaines sont de localisation hépatique, mais leurs œufs sont éliminés dans l'intestin.

Les schistosomes ou bilharzies: Schistosoma mansoni, Schistosoma intercalatum,

Schistosoma japonicum, Schistosoma guinneensis,… (Suzuki et al., 2013).

8

1-5- Méthodes de diagnostic

Chaque parasite n’est bien mis en évidence que par la technique qui lui est adaptée.

1-5.1 Techniques de conservation :

- La conservation provisoire au froid à +4°C : bonne conservation des kystes de

protozoaires et ou d’œufs d’helminthes, avec cependant une mort rapide des trophozoïtes

de protozoaires et aussi des larves d’anguillules (Kuk et al., 2012).

- La conservation des œufs d’helminthes et kystes de protozoaires (Kuk et al., 2012) :

La congélation à -80°C ou -20°C, pendant de longues périodes.

La méthode à l’eau formolée (5 – 20% V/V d’eau distillée ou physiologique) ; elle

donne une bonne conservation tant que le prélèvement reste liquide.

- La conservation des formes végétatives d’amibes en quelques semaines :

Mercurothiolate-Iode-Formol (MIF) (Verweij et al., 2003).

1-5.2 Technique de détection coprologique :

Le diagnostic parasitologique des affections intestinales repose sur un examen coprologique

pour la mise en évidence de l’agent pathogène sous l’une ou l’autre de ses différentes formes

(adultes, larves, œufs, kystes, levures ou filaments) dans les principaux secteurs accessibles

(selles, sang, urines, liquide broncho alvéolaire, prélèvements muqueux…). Ainsi, pour de

nombreuses infections intestinales parasitaires, le standard d’or diagnostique reste l’examen

microscopique des selles fraîches (natives) ou des selles fixées (Verweij et al., 2003).

Cependant, un examen négatif isolé n’a aucune valeur d’élimination et de ce fait, le

prélèvement doit être refait ; idéalement, il faut pratiquer trois examens à quelques jours

d’intervalles avant d’affirmer la négativité. Une seule analyse ne permet de déceler la

présence de parasites que dans 29 % des cas (Guy et al., 2004). Les raisons sont multiples :

- La rareté des éléments parasitaires ;

- L’efficacité des techniques utilisées ;

- Une période muette de rejet d’éléments caractéristiques : giardiose, amibose, nématodes.

Aussi, le diagnostic direct peut se faire à l’œil nu pour la mise évidence des parasite adultes

(ascaris, ténia, anguillules,…) ou nécessiter la mise en œuvre de techniques particulières

tendant à concentrer par centrifugation, filtration, ou la mise en œuvre de techniques

9

d’extraction (technique de Baermann dans l’anguillulose). Certains parasites doivent faire

l’objet d’une recherche spéciale (coloration spéciale pour Cryptosporidia, Microsporidia). En

ce qui concerne les oxyures, la méthode de choix est celle de la bande adhésive ou Scotch test

de Graham.

L’examen des selles doit être réalisé dans l’heure suivant son émission avec quelques

particularités sinon il faut les fixer avec comme conséquence la perte de mobilité des

trophozoïtes (Kuk et al., 2012).

1-5.3 Diagnostic indirect d’orientation :

Il peut être spécifique : sérologique à la recherche d’anticorps ou d’antigènes circulants ; ou

aspécifique : protidogramme, modifications de l’hémogramme telle que l’anémie,

l’éosinophilie (Loscher et Saathoff, 2008).

Les réactions immunologiques surtout sérologiques à la recherche d’anticorps ou d’antigènes

circulants, doivent être idéalement :

- spécifiques d’espèce et si possible de stade : réactions de précipitation, analyse immuno

électrophorétique, co-électrosynérèse ;

- sensible et quantitative : IFI, méthode ELISA, réactions d’agglutination directe ou de

lyse, d’agglutination passive de particules de « latex », d’hémagglutination passive, de

déviation ou fixation du complément.

Les examens sérologiques sont optimaux pour les parasites qui, du fait de l’envahissement

intestinal et du passage dans les tissus, provoquent une réaction par production d’anticorps

(Strongyloides stercoralis). Toutefois, lors de l’interprétation de tels tests sérologiques, il

convient de prendre en considération aussi bien la sensibilité et la spécificité que les réactions

croisées. De même, la sérologie peut être négative durant la phase aiguë d’une maladie et doit

être répétée deux à quatre semaines plus tard, préférablement au bout de trois mois en cas de

soupçon de schistosomiase (Whitty et al., 2000).

Outre l’éosinophilie, une augmentation du taux global des IgE peut également indiquer

diverses maladies parasitaires (Reese et Lehrer, 2000).

1-5.4 Techniques moléculaires : PCR (polymerase Chain réaction)

La mise au point récente de techniques de recherche de parasites par biologie moléculaire, est

d’un apport précieux. Ainsi, on peut caractériser certains parasites intestinaux par PCR

qualitative et ou par PCR quantitative (en temps réel) (Mathis et al., 1996).

10

1-6- Mesures de lutte

Les parasitoses intestinales sont des maladies liées au péril fécal. Le péril fécal est l'ensemble

des risques et des dangers causés par les excréments, les urines et les ordures déposés sans

précautions dans la nature (Boltanski, 1954). Par conséquent, la prophylaxie va reposer sur la

mise en œuvre d'un ensemble de moyens tendant à l'éradication du péril fécal. Pour une

prophylaxie efficace et durable, les précautions suivantes sont à prendre:

- Lutte contre le réservoir des parasites

Il est nécessaire de dépister et de traiter les sujets malades et les porteurs asymptomatiques

découverts lors d'examens parasitologiques systématiques. Des traitements de masse aux

antihelminthiques sont assurés dans certains pays et le risque de résistance n’est pas écarté

(Geerts et Gryseels, 2001).

- Lutte contre les hôtes intermédiaires : le dépistage et les soins des animaux, la

destruction des mollusques dangereux dans les eaux douces pour les schistosomiases.

- Protection de l'homme sain : la promotion de l'hygiène individuelle, la lutte contre les

mouches, le contrôle sanitaire du circuit alimentaire et l’éducation sanitaire: il faut éviter

la contamination de l'eau par un approvisionnement en eau potable soit par des circuits

de distribution, de station de traitement, soit par la construction de puits.

1-7- Traitement des parasitoses intestinales :

En principe, un traitement n’est pertinent que lorsque l’agent pathogène a été mis en évidence

et que le tableau clinique concorde également. Tous les agents pathogènes détectés dans les

selles sont loin d’être responsables de troubles gastro-intestinaux (Shukla et Sidhu, 2011;

Veenemans et al., 2011).

2- RAPPEL SUR LA GIARDIOSE

La giardiose, aussi appelée lambliase, est une parasitose intestinale due au protozoaire

flagellé, G. intestinalis (synonymes : Giardia lamblia, Giardia duodenalis, Lamblia

intestinalis). G. intestinalis est le protozoaire cosmopolite le plus commun au cours des

11

infections intestinales humaines (Adam, 2001). L’enfant est le plus touché par rapport à

l’adulte (Basset et al., 1986).

2-1- Le parasite

2-1.1 Définition / historique :

Le genre Giardia a été décrit initialement par van Leeuwenhoek en 1681 dans ses propres

selles diarrhéiques.

Par la suite, il a été décrit plus en détails par Lambl en 1859 qui a pensé qu’il appartenait au

genre Cercomonas et l’a nommé Cercomonas intestinalis (Adam, 2001).

En 1879, Grassi a nommé un organisme de rongeur Dimorphus muris (maintenant connu

comme appartenant au genre Giardia) ignorant la première description de Lambl.

Entre 1882 et 1883, Kunstler a décrit un organisme dans un têtard (G. agilis ?), qu’il a nommé

Giardia pour la première fois comme nom de genre.

En 1888, Blanchard a suggéré le nom Lamblia intestinalis avant que Stiles lui ait attribué le

nom G. duodenalis en 1902 (Stiles, 1902).

Plus tard, en 1915, Kofoid et Christiansen, ont proposé le nom G. lamblia et ensuite, G.

enterica en 1920 (Kofoid et Christiansen, 1915).

En 1952, Filice a publié une description détaillée de Giardia et a proposé trois espèces sur la

base de la morphologie du corps médian : G. duodenalis, G. muris, and G. agilis.

Le nom d’espèce G. lamblia a été largement admis dans les années 1970 (Hill et al., 1984;

Farthing et al., 1986).

Au début des années 1980, certains auteurs ont encouragé l'utilisation du nom G. duodenalis

et après les années 1990, le nom G. intestinalis a été proposé par d’autres (Fraser et al., 1997;

Adam, 2001).

2-1.2 Taxonomie :

Selon la classification la plus récente (Adam, 2001) Giardia duodenalis est un organisme

unicellulaire faisant partie:

- Du règne des Protozoaires (eucaryotes unicellulaires) ;

12

- Du phylum des Sarcomastigophora, du sous-phylum Mastigophora (flagellés

intestinaux) ;

- De l’ordre des Diplomonadida caractérisé par une symétrie bilatérale ;

- De la famille des Hexamitidae (présence de 8 flagelles) ;

- Du genre Giardia (présence d'un disque adhésif ventral).

La taxonomie du genre Giardia est basée sur la morphologie ; en particulier sur la forme du

trophozoïte, des corps médians et sur la taille du disque ventral adhésif comparé à la taille de

la cellule. Ainsi, on a : Giardia agilis, Giardia muris, Giardia duodenalis, Giardia psittaci et

Giardia ardeae, Giardia microti (Monis et Thompson, 2003).

L’unité morphologique des isolats retrouvés masque en réalité une considérable diversité

génétique et biotypique (Meloni et al., 1995). Les données taxonomiques ont ainsi dû être

reconsidérées (Monis et Thompson, 2003).

Les isolats de Giardia intestinalis provenant d’humains et d’autres mammifères sont retrouvés

dans deux assemblages génétiques: Assemblage A et Assemblage B (Monis et al., 1996).

L’Assemblage A étant lui-même séparé en deux groupes : A-I et A-II. A-I comprend des

isolats retrouvés aussi bien chez les humains que chez les animaux. L’isolat A-II est connu

pour être retrouvé exclusivement chez les humains (Thompson et al., 2000). Une étude plus

récente vient cependant de retrouver des isolats A-II chez des animaux domestiques (Ponce-

Macotela et al., 2002).

L’Assemblage B est essentiellement retrouvé chez les humains. La diversité génétique des

génotypes de l’assemblage B est plus important que ceux retrouvés dans l’assemblage A.

Nombre de ces génotypes n’ont été retrouvés que chez une seule espèce hôte, ce qui laisse

supposer une plus grande ancienneté de cet assemblage (Thompson et al., 2000).

Par la même étude, ce dernier a révélé plusieurs nouveaux groupes génétiques autres que les

Assemblages A et B au sein de Giardia intestinalis apparaissant spécifiques de leur hôte :

- Les assemblages C et D, isolés chez le chien

- L’assemblage E, isolé chez le bétail (bovins, ovins, caprins, porcins)

- L’assemblage F, isolé chez le chat

- L’assemblage G, isolé chez le rat.

Ces données sont en faveur d’une grande complexité au sein de l’espèce Giardia intestinalis

(Monis et al., 2003).

13

2-1.3 Morphologie

Giardia lamblia se présente sous 2 formes (Adam, 2001) :

- La forme végétative (FV) ou trophozoïte (Figure 1) :

Son aspect est pirifonne. Le trophozoïte mesure 6 à 10 μm de largeur sur 10 à 20 μm de

longueur pour une épaisseur de 2 à 4 μm. Il possède une dépression ventrale qui joue un rôle

dans la fixation du parasite aux cellules intestinales. L'extrémité antérieure est arrondie et

l’extrémité postérieure est pointue. Il est actif et mobile grâce à quatre paires de flagelles :

2 flagelles antérolatéraux, prenant leur origine devant les noyaux et sortant par la face

dorsale.

2 flagelles postéro-latéraux, prenant leur origine entre les noyaux et sortant par la face

ventrale.

2 flagelles caudaux, prenant leur origine entre les noyaux et sortant par la face ventrale

à l'extrémité postérieure du parasite.

2 flagelles ventraux épais, au fond du sillon formé par la concavité de la face ventrale.

Un axostyle partage le corps en deux moitiés symétriques contenant chacune un gros noyau à

contours ovalaires situés dans le tiers antérieur. Transversalement, deux structures parallèles

en forme de bâtonnets plus ou moins incurvés, les corps médians, correspondent à des

agrégats denses de microtubules et de protéines contractiles. Il ne contient ni mitochondrie,

disparue au cours de son évolution, ni appareil de Golgi (Hashimoto et al., 1998; Manning et

al., 2011). Lors de son observation à l’objectif à immersion, il ressemble à un « visage de

clown » (Conboy, 1997).

Figure 1 : Forme végétative de Giardia intestinalis

À gauche : vue de face ; à droite : vue de profil. (Guillaume, 2007)

14

- La forme kystique (Figure 2):

Le kyste est une forme de résistance. Il a une forme ovale, une paroi à double contour

d’épaisseur 0.3-0.5 μm et mesure 7 à 10 sur 8 à 12 μm. La paroi du kyste est composée

principalement de N-acétylgalactosamine (GalNAc) (Mok et al., 2005; Chatterjee et al.,

2010). Le kyste renferme 2 à 4 noyaux, des résidus de flagelles et de corps médians, donnant

l'impression de contenir un « S » au centre et correspondant à deux trophozoïtes

incomplètement séparés mais formés.

Figure 2 : Schéma d'un kyste de Giardia intestinalis

(Guillaume, 2007)

2-1.4 Biologie:

- Modes de transmission

La transmission de la giardiose, parasitose liée au péril fécal, se fait par voie orale de façon

directe ou indirecte (Hunter et Thompson, 2005; Traub et al., 2009).

directe: par les mains sales, provoquant des épidémies dans les crèches.

indirecte: par l'eau de boisson surtout ou les aliments souillés de matières fécales, les

crudités souillées (figure 3).

Cette transmission peut être également d’origine animale: mammifères (chat, chien, bovins,

ovins) (Hunter et Thompson, 2005).

Les facteurs de risque de la giardiose sont : les voyages dans les pays hyper endémiques, la

mauvaise hygiène des mains, la consommation d’eau du robinet contaminée, la consommation

de végétaux crus (salades), la natation dans les rivières et lacs, le contact avec de jeunes

enfants portant des couches (Bello et al., 2011).

Noyau

x

Axostyle

Corps médians

Résidus de flagelles

15

Figure 3 : Schéma des réservoirs et voies de contamination de Giardia intestinalis.

(Bertrand et Schwartzbrod, 2007)

- Cycle évolutif :

L'infection commence par l'ingestion de kystes à quatre noyaux (Figure 4). Le passage dans

l'estomac, avec la baisse de pH, suivi d'une remontée du pH dans l'intestin, conduit à la lyse

de la paroi du kyste qui libère un excyzoïte à quatre noyaux dans le duodénum. Celui-ci

évolue en forme végétative ou trophozoïte. Les trophozoïtes s'accrochent à la muqueuse

intestinale grâce au disque ventral. Ils se multiplient et prolifèrent par scissiparité. C'est eux

seuls qui sont responsables des symptômes. Une partie de la population évolue en kystes au

niveau du côlon. Ceux-ci seront expulsés avec les selles et pourront résister de longues

périodes en attendant une ingestion (Lewis et Freedman, 1992).

Formation du kyste : (dans jéjunum, + sels biliaires):

Les FV s’immobilisent, diminuent de taille et s’entourent d’une membrane de plus en plus

épaisse. Les deux (2) noyaux se divisent pour donner un Kyste mur à 4 noyaux ; ce kyste

contient ainsi deux (2) entités (Bittencourt-Silvestre et al., 2010; Sulemana et al., 2014).

16

Leur formation varie dans le temps, leur nombre diminue progressivement et disparait en sept

(7) à dix (10) jours d’où la période muette (absence de kyste).

FV : forme

Figure 4: cycle évolutif de Giardia intestinalis.

Source : DPDx-CDC Parasitology Diagnostic Web Site (http://www.dpd.cdc.gov); consulté en

Janvier 2015

2-1.5 Le Génome de Giardia intestinalis

Le génome est constitué d’au moins cinq (5) chromosomes dans chaque noyau correspondant

à un total de 1,2 x 107 paires de bases. Ce qui équivaut à environ 12 Mb pour 5 chromosomes

avec un contenu en GC de 42 à 48% (Adam, 2001). Environ 95% de ce génome a été

séquencé en 2004 (Adams et al., 2004). Leur partie centrale est assez constante, mais les

télomères sont variables (Adam et al., 1988; Le Blancq et Adam, 1998). Le génome de

1

Légende

1 : ingestion du kyste par l’eau

de boisson souillée, aliments,

légumes,… ;

2 : évolution du kyste dans

l’estomac, duodénum,

l’intestin ;

3 : élimination de kystes et/ou

trophozoïtes infectieux ;

4 : contamination des aliments,

eaux de boissons, légumes,… ;

4

3

2

Kyste

FV

http://www.dpd.cdc.gov/

17

Giardia intestinalis a les caractéristiques des cellules eucaryotes, en particulier des

chromosomes linéaires avec des séquences télomériques semblables aux autres eucaryotes

(TAGGG) (Hu et al., 2009). La chromatine se forme par association avec 5 histones (H1,

H2a, H2b, H3, H4). Aucun intron n'est décrit (Adam, 2000).

Des études de validation plus précises de la classification, ont visé à comparer, des gènes dont

les séquences sont moins conservées que l'ARNr, comme la GDH et surtout la TPI (Amar et

al., 2002; Read et al., 2004; Sulaiman et al., 2004; Traub et al., 2004). Les gènes de la TPI et

de l'EFIA ont été séquencés pour trois espèces: G. lamblia, G. muris et G. ardeae. Par contre,

le gène de la GDH a été séquencé pour seulement deux espèces: G. lamblia et G. ardeae.

Actuellement, le gène de la TPI est également séquencé pour l'espèce G. microti (Sulaiman et

al., 2004). Les travaux de ce dernier ont conforté solidement la classification de l'espèce G.

lamblia en différents génotypes. Parmi ces gènes, seul l'ARNr 18S a été séquencé pour cinq

espèces: G. lamblia, G. muris, G. microti, G. ardeae et G. psittaci.

2-2- Épidémiologie de la giardiose

La giardiose est la cause la plus fréquente de diarrhée non bactérienne en Amérique du Nord.

C’est une maladie fréquente dans les pays tropicaux en développement et qui est présente

dans les pays développés tempérés. Dans les pays industrialisés, cette prévalence varie de 2 à

7 % (Rodriguez-Hernandez et al., 1996). Aux États-Unis, la prévalence estimée à partir

d’échantillons de selles humaines était de 3,8 % (Barwick et al., 2003). Dans les pays

tropicaux, cette prévalence chez l’adulte varie de 12 % à 30 % dans les populations adultes

(Loscher et Saathoff, 2008). Au Burkina Faso, Simporé et al. en 2009, Karou et al. en 2011,

Nitiema et al. en 2011 et Ouermi et al., en 2012 ont trouvé respectivement des prévalences de

7,6 %, 43,47 %, 11,3 % et 24.83% au CMSCO parmi les demandes d’analyses

parasitologiques à la recherches d’étiologies de gastroentérites (Simpore et al., 2009; Karou et

al., 2011; Nitiema et al., 2011; Ouermi et al., 2012).

La distribution et la prévalence des génotypes chez l’homme ne sont pas actuellement

connues car leur identification n’est pas systématique dans la giardiose (Thompson, 2004).

Actuellement, la prédominance d’un génotype n’est pas démontrée. Mais une distribution des

génotypes semble être observée selon la localisation géographique (Sulaiman et al., 2004).

18

2-3- Méthodes diagnostiques

2-3.1 Détection par EPS :

Les kystes de G. intestinalis sont excrétés de façon intermittente dans les selles. L’analyse de

plusieurs échantillons est donc recommandée pour la détection du parasite. La sensibilité de

cette recherche s’accroît lorsqu’on répète le test (3 en tout). Selon des auteurs, surtout pour la

Giardiose, l’examen parasitologique des selles ne permet pas d’avoir un reflet correct de

l’ampleur de l’infestation parasitaire, l’examen d’un unique échantillon de selles ne détectant

le parasite que dans 50 à 70 % des cas (Burke, 1975; Heresi et Cleary, 1997). Selon les

mêmes, si trois selles sont examinées, la fréquence d’identification augmente à 95 %.

2-3.2 Recherche d’Ag spécifiques dans les selles:

Les méthodes telles que les tests immunologiques permettent une détection avec de meilleures

sensibilités. L’avenir est donc aux tests immunologiques rapides détectant des antigènes

parasitaires dans les selles. Ces tests, très performants, ne sont pas encore disponibles. La

technique d’immunofluorescence directe basée sur l’utilisation d’anticorps est

particulièrement spécifique et sensible pour la détection des cas (Chaudhuri et al., 1997;

Garcia et Shimizu, 1997; Feng et Xiao, 2011).

2-3.3 Caractérisation par biologie moléculaire.

L’utilisation de méthodes moléculaires de détection telle la PCR permet de détecter la parasite

et de caractériser ces génotypes dans les selles. Mais cette méthode ne donne pas

d’information sur la viabilité ou le caractère infectieux du pathogène. Les premières études

par PCR ont utilisé le gène de la giardine comme cible pour la PCR. Une faible sensibilité

avait alors été obtenue, probablement en raison de la présence d’une seule copie du gène

(Baque et al., 2011). L’amplification de la région ITS (inter-transcriptor spacing) des gènes

de l’ARN ribosomal de G. intestinalis a été choisie par une étude récente et a donné

d’excellents résultats. La méthode s’est révélée être plus spécifique et plus sensible que les

méthodes microscopiques et immunologiques (Schuurman et al., 2007; Elsafi et al., 2013).

Son utilisation s’avère être rapide et fiable pour la détection de ce parasite dans les selles

d’humains et pourrait être utilisée en routine (Ghosh et al., 2000).

Dans cet objectif, d’autres méthodes telles que la Reverse- Transcriptase PCR sont utilisées.

Enfin, l’utilisation de PCR en temps réel permet de quantifier avec de précision les

assemblages du parasite (Caccio, 2004).

19

La technique de Restriction Fragment Lengh Polymorphism (RFLP) a notamment été utilisée

pour comparer les séquences d’ADN d'isolats de G. intestinalis d'origine humaine et animale.

La digestion de l'ADN par des enzymes de restriction ou endonucléases permet d'obtenir des

profils électrophorétiques pour la comparaison des différents isolats lors d'études

épidémiologiques (Nash et al., 1985). La PCR-RFLP associe l'amplification de l'ADN par

PCR à la digestion enzymatique par des enzymes de restriction.

2-3.4 Autres méthodes

- le tubage duodénal pour la recherche de FV dans le liquide.

- la biopsie jéjunale: indiquée devant un syndrome de malabsorption et EPS négatif:

présence de G. intestinalis et atrophie villositaire (Saran et al., 2001; Perez-Roldan et al.,

2008).

- la culture : possible mais pas pour la routine. La multiplication de G. intestinalis par

mise en culture est difficile à obtenir. Cependant, elle est réalisable sur certains milieux

complexes tel que le milieu BIS 33 « Mexico », en utilisant la solution saline seule,

additionnée de bile de bœuf desséchée. L’inoculum doit être massif (Ripert et al., 1996).

2-4- Traitement et prévention

Le traitement repose sur les nitro-imidazolés, comme le métronidazole (Busatti et al., 2013).

Un contrôle de l’efficacité du traitement un mois après la fin du traitement est recommandé.

En cas d’échec du traitement, il faut évoquer une source persistante du parasite dans

l’entourage. L’albendazole peut être utilisé en deuxième intention (Payne et al., 2002).

La prévention individuelle et collective repose sur l’hygiène de l’eau de boisson et des

aliments, et sur le lavage des mains. Il faut tenir compte du fait que les kystes de G.

intestinalis sont relativement résistants à la chloration, aux ultra-violets et à la congélation

PARTIE 2 : NOTRE ETUDE

20

PARTIE 2 : NOTRE ETUDE

1- OBJECTIFS DE L’ETUDE

1-1- Objectif général

Caractériser les parasites intestinaux causes d’infections en milieu scolaire au Burkina Faso.

1-2- Objectifs spécifiques

- Identifier les parasites intestinaux sources de maladies chez les Elèves de huit écoles

primaires des régions du Centre-ouest et du Plateau-central au Burkina Faso.

- Apprécier la prévalence de ces parasites parmi les écoliers au BF.

- Détecter Giardia intestinalis pathogènes pour l’homme dans les selles des écoliers par

PCR en Temps Réel.

- Confronter les résultats positifs de la microscopie avec la PCR en temps réel.

2- MATERIELS ET METHODES

2-1- Milieu de l’étude (cadre et champs d’étude)

Notre étude a été menée en plusieurs étapes comprenant une enquête accompagnée d’une

collecte d’échantillons de selles dans les écoles incluses, une analyse parasitologique de ces

selles suivie d’une analyse moléculaire.

2-1.1 Situation des sites d’enquête :

L'étude a concerné huit villages situés dans deux régions du Burkina Faso (Figure 5): la

région du Centre-ouest (Douré A, Goundi B, Ipendo A, Tio A) et la région du Plateau-central

(Loumbila A, Linoghin, Tangzougou, Wavoussé).

Ce travail a été mené dans le cadre d’un projet dénommé « VGTS pour Vegetables Go to

School », en cours, qui soutient le développement de jardins scolaires dans certaines écoles en

Mémoire de Master II BioGeMA 2014-2015 T. KIENTEGA 21

Afrique et en Asie, et qui est conjointement mis en œuvre par le Centre Mondial des Légumes

(World Vegetables Centre - AVRDC) à Taiwan, l’Université de Freiburg (ALU) en

Allemagne et l’Institut Tropical et Santé Publique Suisse (Swiss TPH). Ainsi les sites

d’enquêtes ont été choisis selon des critères définis qui sont :

- Le degré d’acceptation de la population, des enseignants et des élèves.

- La prévalence de la malnutrition par rapport à la situation nationale.

- L’existence de cantine scolaire

- L’existence de terres arables autour de l’école

- Et l’’engagement volontaire des personnes ressources de l’éducation

Figure 5: localisation des écoles (villages) cibles

Source : Institut Géographique du Burkina (BNDT, Mars 2015) :

www.igb.bf/index.php/reference/carto-et-sig. Consulté en Mars 2015

Ces régions ont un climat de type soudano-sahélien, marqué par une saison pluvieuse qui

s’étend sur environ 4 mois de Juin à Septembre et une saison sèche qui va d’Octobre à Mai.

Ce climat est principalement caractérisé par deux régimes : la saison hivernale sous

l’influence d’un vent humide (mousson) qui est la source des manifestations pluvieux-

orageuses, et la saison sèche caractérisée par un régime de vent sec (harmattan).

L’activité économique y est faible. Ce sont des zones surtout agricoles et de petits élevages.

Situation des villages ou écoles ciblés

http://www.igb.bf/index.php/reference/carto-et-sig


Quant aux infrastructures sanitaires, nous avons noté des Centre de Santé et de Promotion

Sociale (CSPS) dans tous les huit sites.

2-1.2 Laboratoires d’analyses biologiques

Les analyses parasitologiques des prélèvements de selles ont été réalisées dans le Laboratoire

de l’Institut de Recherche en Science de la Santé (IRSS). L’IRSS, un des quatre instituts du

Centre National de Recherche Science et Technologique (CNRST) situé en face du Centre

Hospitalier Universitaire Yalgado Ouédraogo, est une structure du Ministère de la Recherche

Scientifique et de l’Innovation.

L’analyse moléculaire a été réalisée au Laboratoire de Biologie moléculaire et de Génétique

Moléculaire (LABIOGENE) de l’Université de Ouagadougou logé au CERBA.

Le CERBA, est situé au secteur 51, Arrondissement 11 de Ouagadougou et relève du district

sanitaire de Bogodogo. Créé par la délégation camillienne, ce centre a pour missions

premières la formation et la promotion de jeunes chercheurs en particulier dans le domaine

biomoléculaire où il dispose d’un plateau technique moderne (appareils PCR en temps réel,

PCR classique, HPLC, séquenceur). Les activités de recherche s’articulent autour de plusieurs

axes :

- la recherche fondamentale et les sciences du génome se décomposant en sous-axes tels

les pathologies génétiques (hémoglobinopathies, ostéoporose, déficiences génétiques),

les marqueurs de résistance génétique (résistance bactérienne aux antimicrobiens), le

diagnostic moléculaire de diverses pathologies en particulier des pathologies émergentes

(VIH, HPV, VHC, VHB) ainsi que sur la vaccinologie.

- des études de nature à valoriser la médecine traditionnelle (travaux sur des recettes

traditionnelles fournies par des tradipraticiens).

- Les deux derniers axes comprennent la recherche clinique (suivi biologique et clinique

des personnes vivant avec le VIH, activités portant sur la PTME, expérimentations

pharmaco-cliniques) et la recherche en nutrition (réhabilitation nutritionnelle des enfants

malnutris).

2-2- Type et période d’étude

Il s’est agi d’une étude transversale descriptive qui a eu lieu dans les écoles ci-dessus citées, et

qui a concerné un échantillon d’enfants présents et consentants durant la période de collecte.


Une première phase d’enquête dite pilote s’est déroulée le 20 Décembre 2014 à l’école de

Zongo / Loumbila. La deuxième phase a concerné l’enquête proprement dite qui s’est

déroulée du 02 au 18 Février 2015 dans les écoles des huit villages choisis.

Les analyses moléculaires se sont déroulées du 17 au 31 Août 2015 au CERBA /

LABIOGENE.

2-3- Population d’étude / Échantillonnage.

Les élèves des classes des Cours Elémentaire 2ème année (CE2) et Cours Moyen 1ère année

(CM1) des huit écoles ci-dessus citées ont été ciblés pour cette enquête. Globalement, 441

élèves ont été inclus avec en moyenne 55 participants par école dont environ 27 élèves par

classe. Des échantillons biologiques ont été recueillis pour des analyses au Laboratoire. Ces

échantillons ont concerné des prélèvements de selles collectés chez chaque élève inclus dans

l’étude à raison de deux échantillons de selles par élève sur deux jours consécutifs.

Tous ces prélèvements ont été transportés dans des glacières au laboratoire de l’IRSS dans les

quatre (4) heures qui ont suivi la collecte pour une analyse microscopique immédiate.

Pour la suite de notre travail concernant la PCR en temps réel, tous les prélèvements de selles

reçus au cours de la période indiquée et dont l’examen microscopique a montré la présence de

kyste de Giardia intestinalis ont été retenus. Seules trois selles négatives ont été aussi

conservées à cet effet.

2-4- Méthodes, techniques et instruments de collecte de données

Elle s’est faite sur la base d’un questionnaire et a été effectuée sur les quatre cent quarante et

un (441) élèves. Tous les participants ont donné leur avis sur l’objet du questionnaire et les

éléments de base ont été la connaissance et le comportement en matière d’hygiène, d’eau,

d’assainissement (WASH pour Water Sanitation Hygiene) et nutrition y compris l’évaluation

du respect des bonnes pratiques d’hygiène. Une observation directe a été faite pour certaines

parties du module concernant les caractéristiques socio-économiques des ménages et les

autres aspects importants de l’hygiène.

Les prélèvements de selles ont été réalisés sur deux jours consécutifs chez chaque élève afin

d’augmenter les chances de détection des parasites.


Le poids de chaque écolier enquêté a été mesuré à l’aide d’une balance électronique portatif,

de même que la taille (à l’aide d’une toise graduée) en plus de l’âge.

2-5- Analyse parasitologique des selles

2-5.1 Précautions avant le recueil de selle chez les élèves

Les élèves ont été conseillés de supprimer pendant les trois (3) jours qui ont précédé le

prélèvement:

- les compositions pharmaceutiques contenant du charbon végétal, du bismuth, des sels de

magnésium, du kaolin et du benzonaphtol.

- les produits opaques utilisés en radiologie, en particulier les composés barytés.

- les suppositoires et les huiles laxatifs, en particulier l'huile de paraffine.

La présence de ces éléments dans les selles rend l'examen microscopique difficile, car ils

augmentent le volume des culots de centrifugation et peuvent être la cause d'erreurs

d'identification.

2-5.2 Prélèvement de la selle

Chaque élève a été conseillé de déposer sa selle, le matin, dans un récipient propre, sec et sur

lequel est collée une étiquette portant son identité. Il a été bien indiqué aux élèves qu'ils ne

doivent pas mélanger la selle avec de l'urine, ni du papier hygiénique ou de coton.

Le transport des prélèvements s’est fait dans des glacières contenant de la glace (ice box) afin

de les maintenir à +4°C jusqu’à l’arrivée au laboratoire dans le plus bref délai possible pour

éviter une élévation de la température qui risquerait de lyser les trophozoïtes de protozoaires.

2-5.3 Examen macroscopique des selles

II a consisté à noter la consistance de la selle ainsi que la présence éventuelle de sang, de

glaires, de mucosités, de pus et de parasites macroscopiques.

2-5.4 Examen microscopique des selles

Chaque élève enquêté a fourni deux échantillons de selles en deux jours consécutifs. Chaque

prélèvement a fait l’objet d’un examen direct à l’état frais et d’un examen après concentration

selon la méthode de Ritchie et la méthode de Kato-Katz.


2-5.4-1 Examen direct à l’état frais

Il a été effectué après dilution d’une noix de selle dans 10 fois son volume d’eau

physiologique à 0,9%. Ensuite, sur une lame porte objet, on a déposé à l’aide d’une pipette

pasteur, une goutte de cette dilution.

Pour les selles glaireuses, nous avons prélevé à l’aide d’une anse de platine directement la

glaire qu’on a déposée sur la lame.

Les préparations ont été ensuite recouvertes de lamelle (22 x 22), pour la lecture

microscopique à l’objectif x10 et x40 dans le but d’identifier les œufs et les larves

d’helminthes ainsi que les kystes et les formes végétatives de protozoaires.

2-5.4-2 Examen après concentration

- Méthode Formol-éther ou de Ritchie simplifiée, (Ridley et Hawgood, 1956) :

Principe : Elle est caractérisée par la mise en présence de deux phases liquides non miscibles,

l'une aqueuse et l'autre constituée par l'éther, un solvant des lipides. Il se crée un coefficient

de partage entre ces deux phases et la répartition de chaque élément fécal dans chacune d'elles

sera fonction de son pouvoir hydrophile ou lipophile.

Réalisation : Annexe 2

Cette technique est applicable à la recherche des kystes de protozoaires et des œufs

d’helminthes sauf pour les œufs d'ascaris détruits par cette méthode.

- Méthode par éclaircissement de Kato-Katz (OMS, 1994) :

Principe : décoloration. En effet, elle permet la recherche et la quantification des œufs et

larves d’helminthes dans une quantité connue de selles, donc nécessite l’emploi d’une

solution éclaircissante et l’utilisation d’une plaque perforée à diamètre et profondeur connus

(plaque calibrée).

Réalisation : Annexe 3

A l’issue de ces analyses, quatre-vingt et quatorze (94) échantillons de selles contenant des

kystes de Giardia intestinalis plus trois (03) échantillons n’en contenant pas ont été conservés

à -80°C durant six (6) mois à l’IRSS en attente de l’analyse moléculaire ; puis ils ont été

transférer au CERBA / LABIOGENE où ils ont été conservé à -20°C pendant une semaine,


juste le temps de réaliser l’extraction d’ADN. Cinq échantillons (enquête pilote) ont été

préalablement fixés au formol à 10%.

2-6- Diagnostic moléculaire : PCR en Temps Réel

L’analyse moléculaire a consisté en la détection de Giardia intestinalis dans les selles des

écoliers par PCR en temps réel en utilisant le thermocycleur 7500 Fast Real Time PCR System

de Applied Biosystem.

2-6.1 Extraction de l’ADN des kystes à partir des selles

L’extraction a été réalisée dans un premier temps avec le kit DNA-Sorb-B de Sacace

Biotechnologies® pour cinquante (50) échantillons. Ensuite, elle a été faite par la méthode

Sarkari B. modifiée pour quarante et sept (47) échantillons.

2-6.1-1 Utilisation du Kit DNA-Sorb-B de Sacace Biotechnologies®

- Réactifs : Kit d’extraction « DNA-Sorb-B », Sacace Biotechnologies®.

- Prétraitement des échantillons avant l’extraction :

Avant l’étape d’extraction, les échantillons ont été préalablement traités comme suit : Ils ont

d’abord été décongelés. Une suspension de chaque échantillon est préparée en introduisant

dans un tube de polypropylène de 1.5 ml étiquetés 1,0 mL de solution saline et 0,1g

d’échantillon de selles. La suspension est agitée au vortex puis centrifugé à 7 000 - 12 000 g

pendant 5 mn. Ensuite, 100 μL du culot sont transférés dans un tube eppendorf où on a ajouté

800 μL de tampon PBS à 10%. Après agitation au vortex et centrifugation pendant 5 mn à 7

000 - 12 000g, le surnageant est éliminé. Le culot a été suspendu à nouveau avec 300 μL de

tampon PBS à 10% par agitation au vortex.

L’échantillon ainsi préparé est prêt pour l’étape d’extraction.

- Extraction :

Elle a été réalisée en suivant le protocole du fabriquant du kit « DNA-Sorb-B » de Sacace

Biotechnologies® (voir annexe 4).

L’ADN extrait a été conservé à – 20°C jusqu’à utilisation.


2-6.1-2 Méthode d’extraction de Sarkari, B. modifiée :

(Sarkari et al., 2012).

L’ADN des kystes de G. intestinalis pour 47 échantillons a été extrait à partir des selles par la

méthode proposée par Sarkari, B. que nous avons légèrement modifié par remplacement du

phénol chloroforme par du NaCl 5M pour la précipitation des protéines (élimination). La

procédure détaillée se trouve à l’annexe 5.

2-6.2 PCR en temps réel

Principe : il est basé sur la mesure de la fluorescence émise au cours de la PCR qui est

proportionnelle au nombre de copies d'ADN néo synthétisé.

- Mélange réactionnel

Le volume total de la réaction d’amplification pour chaque échantillon a été de 25μL (12 μL

de Taq Man Universal Master Mix, 3 µL de la sonde 0,25µM, 1 µL de chacun des deux

amorces 50 µM (sens et anti-sens), (Applied Biosystem), 3 µL d’eau DNase-RNase free et 5

μL d’ADN extrait.

- Programme d’amplification sur ABI 7500

L’amplification a été réalisée en utilisant le programme par défaut de l’automate ABI

7500 de Applied Biosystem », en augmentant simplement le nombre de cycle à 45. Elle a été

faite en utilisant une amorce ciblant une séquence spécifique du gène de la petite sous unité de

l’ARN ribosomique (SSU-rRNA ou 18S rRNA). Le programme détaillé a été le suivant :

60° C pendant 1 minute : préchauffage

95° C pendant 10 minutes : dénaturation initiale X 1 cycle

95° C pendant 15 secondes : dénaturation

60° C pendant 1 minute : hybridation + élongation

60° C pendant 1 minute extension finale

L’amplification a duré au total 1 heure 37 mn.

X 45 cycles


- Interprétation des résultats

L’analyse a été faite à l’aide du logiciel 7500 Software v2.0.6 de Applied Biosystem :

l’intensité de la fluorescence est exprimée en fonction du nombre de cycles. Chaque cycle est

proportionnel à la concentration d’amplicons. Nous avons défini le cycle seuil (Ct) qui

représente le nombre de cycles requis où le signal d’émission de fluorescence est

statistiquement et significativement plus élevé au-dessus de la ligne de base (ligne seuil). Les

résultats de l’analyse des fluorescences ont été interprétés présent ou absent selon le cycle

seuil comme suit :

Ct < 45,0 = Résultat positif (présent)

Ct ≥ 45,0 = Résultat Négatif (absent)

2-7- Considérations éthiques

Le protocole de recherche a été soumis en Avril 2014 à l’examen du comité d’éthique pour la

recherche en santé (CERS) du Burkina Faso et a obtenu un avis favorable (délibération CERS

Mai 2014). Une version amendée du protocole de recherche a été soumise au CERS en février

2015 et a obtenu un avis favorable. Les observations qui ont été faites ont été prises en

considération avant le démarrage de l’enquête dans les écoles.

Conformément aux dispositions prévues dans le protocole de recherche, tous les élèves

parasités ont bénéficié gratuitement de traitements comme suit :

Albendazole pour le traitement contre les helminthes

Metronidazole pour le traitement contre les amibes

Nicosamide pour le traitement contre Hymenolepis nana

2-8- Méthode de traitement des données.

Les données ont été saisies sur un microordinateur à l’aide du Logiciel Excel 2013 avant

d’être traitées avec le logiciel SPSS® version 20.

Le test de Chi deux de Pearson a été utilisé pour l’étude d’association entre G. intestinalis

(microscopie) comme variable dépendante d’une part et d’autre part, les caractéristiques

sociodémographiques, socioéconomiques, l’hygiène individuel et le résultat PCR comme

paramètres indépendants. Les résultats ont été considérés significatifs lorsque p < 0,05.


3- RESULTATS

3-1- Population d’étude

- Sur la population totale enquêtée :

L’enquête a porté sur une population totale de 441 élèves, âgés de 8 à 14 ans et fréquentant les

classes de CE2 et de CM1 de huit écoles choisies dans deux régions du Burkina Faso :

Plateau-central et Centre-ouest. Un sexe ratio de 1,09 en faveur du sexe masculin a été

obtenu. Ainsi, la population totale enquêtée se répartit comme suit dans le tableau I :

Tableau I : Répartition de la population totale enquêtée selon l’école et le sexe :

Région

Ecole

N enfants

inclus

Total par

région

N(%)

Sexe

Masculin

N(%)

Féminin

N(%)

Plateau-

Central

(PC)

Linoghin A 60

227(51,5)

230(52,2%)

211(47,8%)

Loumbila A 55

Tangzougou 56

Wavoussé 56

Centre-

Ouest

(CO)

Ipendo A 51

214(48,5)

Tio A 53

Goundi B 54

Douré A 56

Total général 441

N : effectif ; % : pourcentage

- Caractéristiques sociodémographiques et économiques de la population ayant fait

l’objet de la PCR en temps réel :

Sur 120 échantillons positifs à G. intestinalis à la microscopie soit 27,2 % (Tableau V), 94 ont

présenté des kystes contre 26 qui ont présenté des FV. Pour la détection moléculaire du

parasite, nous avons retenu seulement 03 échantillons de selles négatifs, ainsi que tous les

prélèvements de selles pour lesquels l’examen microscopique a montré la présence de kyste


(94 échantillons) de G. intestinalis. Nous n’avons pas inclus les échantillons contenant des

trophozoïtes de G. intestinalis pour la PCR en temps réel. Cela est dû au fait que nous avions

voulu initialement réalisé un génotypage qui ciblait uniquement les kystes dont la

conservation est plus facile. Cependant, pour des questions de moyens financiers, nous avons

limité ce travail à la détection de l’espèce parasitaire. C’est ainsi qu’au moment de la

réalisation de la PCR, nous n’avons pu prendre en compte que ces échantillons collectés

depuis le mois de Décembre 2014 et de Février 2015 chez les élèves qu’on ne pouvait plus

toucher (vacances scolaires). Les caractéristiques sociodémographiques et socioéconomiques

de cette population de 97 élèves sont réparties comme suit dans les tableaux II et III ci-dessus.


Tableau II : caractéristiques sociodémographique de la population ayant fait l’objet de la PCR en temps réel :

Ecoles

Sexe Tranche d’âge (ans) Classe fréquentée

Total

N(%) Masculin

N(%)

Féminin

N(%)

Np

N(%)

8-9

N(%)

10-11

N(%)

12-13

N(%)

Np

N(%)

CE2

N(%)

CMI

N(%)

Douré A 12(70,6) 5(29,4) 0 0 8(47,1) 9(52,9) 0 9(52,9) 8(47,1) 17(17,5)

Goundi B 7(63,6) 4(36,4) 0 0 2(18,2) 9(81,8) 0 6(54,5) 5(45,5) 11(11,3)

Ipendo A 4(40) 6(60) 0 3(30) 7(70) 0 0 3(30) 7(70) 10(10,3)

Tio A 9(69,2) 4(30,8) 0 0 6(46,1) 7(53,8) 0 6(46,2) 7(53,8) 13(13,4)

Linoghin 8(66,7) 4(33,3) 0 2(16,7) 6(50) 4(33,3) 0 5(41,7) 7(58,3) 12(12,4)

Loumbila A 6(40) 4(26,7) 5(33,3) 2(13,3) 5(33,3) 3(20) 5(33,3) 9(60) 6(40) 15(15,5)

Tangzougou 3(42,9) 4(57,1) 0 1(14,3) 4(57,1) 2(28,6) 0 5(71,4) 2(28,6) 7(7,2)

Wavousse 8(66,7) 4(33,3) 0 1(8,3) 7(58,3) 4(33,3) 0 8(66,7) 4(33,3) 12(12,4)

Total 57(58,8) 35(36,1) 5(5,1) 9(9,3) 45(46,4) 38(39,2) 5(5,1) 51(52,6) 46(47,4) 97(100,0)

N= effectif ; % = pourcentage ; Np : non précisé


Tableau III : Autres caractéristiques sociodémographiques et socioéconomiques de la population :

Ecoles

Niveau instruction chef ménage Profession

parent

Disponibilité d’eau

potable pour ménage

Présence de latrine à

domicile

Total Primaire

N(%)

Secondaire

N(%)

Sans niveau

N(%)

Cult./élev.

N(%)

Oui

N(%)

Non

N(%)

Oui

N(%)

Non

N(%)

Douré A 1(5,9) 0 16(94,1) 17(100) 15(88,2) 2(11,8) 9(52,9) 8(47,1) 17(17,5)

Goundi B 3(27,3) 1(9,1) 7(63,6) 11(100) 9(81,8) 2(18,2) 5(45,5) 6(54,5) 11(11,3)

Ipendo A 1(10) 0 9(90) 10(100) 9(90) 1(10) 3(30) 7(70) 10(10,3)

Tio A 3(23,1) 2(15,4) 8(61,5) 13(100) 13(100) 0 0 13(100) 13(13,4)

Linoghin 3(25) 2(16,7) 7(58,3) 12(100) 12(100) 0 7(58,3) 5(41,7) 12(12,4)

Loumbila A 0 1(6,7) 14(93,3) 15(100) 10(66,7) 5(33,3) 6(40) 9(60) 15(15,5)

Tangzougou 1(14,3) 0 6(85,7) 7(100) 7(100) 0 4(57,1) 3(42,9) 7(7,2)

Wavousse 0 0 12(100) 12(100) 12(100) 0 5(41,7) 7(58,3) 12(12,4)

Total 12(12,4) 6(6,2) 79(81,4) 97(100) 87(89,7) 10(10,3) 39(40,2) 58(59,8) 97(100,0)

Cult./élev : cultivateur / éleveur ;


3-2- Prévalence des parasitoses intestinales

Nous présentons ici quelques images de parasites que nous avons observés au cours de l’étude

lors de l’examen microscopique des selles (grossissement X400) :

Figure 6 : Images de deux kystes de G. intestinalis vus à l’examen direct (flèches)

Source : Photo de T. KIENTEGA ; Février 2015.

Figure 7 : Trophozoïte d’Entamoeba coli observé à l’examen direct (flèche)



Figure 8 : Hymenolepis nana observé à l’examen direct (flèche)


Figure 9 : Balantidium coli à l’examen direct (flèche)


3-2.1 Prévalence globale des parasitoses intestinales selon l’école

La prévalence des parasitoses intestinales par école présentée dans le tableau IV montre un

taux moyen d’infestations intestinales à 81,6 %. La région du Centre-ouest est plus touchée

que celle du Plateau-central, avec une disparité selon l’école d’origine (P<0,05). Ainsi, la

prévalence la plus élevée est observée à l’école Douré A avec 93% d’infestation, suivi de

Ipendo A avec 92%.


Tableau IV : Répartition globale des enfants parasités par école

Région écoles N d’enfants

testés

N infestés % infestés % global

par région

Plateau

central

Linoghin A 60 49 82%

74,4%

Loumbila A 55 30 55%

Tangzougou 56 50 89%

Wavoussé 56 40 71%

Centre-

ouest

Ipendo A 51 47 92%

89%

Tio A 53 46 87%

Goundi B 54 46 85%

Douré A 56 52 93%

Total général 441 360 81,6%

P=0,001 : significatif

3-2.2 Prévalence des parasites intestinaux selon l’école ou le village

Nous avons noté une prévalence particulièrement élevée des différentes protozooses (83,4%)

parmi les élèves des écoles enquêtées par rapport à celle des helminthoses intestinales

(7,5%). Les protozoaires les plus rencontrés ont été respectivement Entamoeba histolytica /

dispar (67,4%), Entamoeba coli (35,4%) et Giardia intestinalis (27,2%) (Tableau V). Nous

n’avons pas pu distinguer morphologiquement E. histolytica de E. dispar à travers l’examen

microscopique, voilà pourquoi tout au long de notre document nous avons fait mention de E.

histolytica / dispar.

Ailleurs, Hymenolepis nana est l’helminthe le plus rencontré à un taux de prévalence de 6.8%.

Une différence statistique significative a été constatée sur la prévalence de certains parasites

selon les écoles : E. histolytica / dispar, T. intestinalis et H. nana (P < 0,05). Cependant G.

intestinalis n’a pas montré de différence statistique significative ni selon les écoles (P=0,168),

ni selon la région (P=0,115).


Tableau V : Prévalence des différents parasites intestinaux selon l’école d’origine :

Régions

Parasites

Ecoles

E. histolytica

/ dispar

%

E.

coli

%

G.

intestinalis

%

T.

intestinalis

%

H.

nana

%

N.

americanus

%

S.

stercoralis

%

B. coli

%

Centre-ouest

Douré A (N=56) 82,1 32,1 33,9 19,6 8,9 3,6

Goundi B(N=54) 79,6 42,6 27,8 16,7 11,1 0 0,02

Ipendo A (N=51) 80,4 41,2 23,5 7,8 2 0

Tio A (N=53) 73,6 45,3 30,2 18,9 18,9 0 0,02

Plateau-central

Loumbila A(N=55) 29,1 30,9 30,9 16,4 1,8 1,8

Tangzougou(N=56) 67,9 28,6 19,6 32,1 8,9 0

Linoghin A(N=60) 68,3 35 20,0 23,3 1, 7 0

Wavoussé(N=56) 58,9 28,6 23,2 30,4 1,8 0

Moy. par parasite (/441) 67,4 35,4 27,2 20,9 6,8 0,7 0,0023 0,0023

P 0,001 * 0,402 0,168 0,047 * 0,002* 0,175 - -

Moy. Générale 83,4% 7,5%

Moy. : Moyenne ; * : significatif


3-2.3 Polyparasitisme des élèves

Le tableau VI nous présente le polyparasitisme des enfants par école. Un taux global de co-

infestation de 49,2% a été noté avec cependant une disparité entre les deux régions, le Centre-

ouest présentant la plus forte prévalence en polyparasitisme (57,5% en moyenne) par rapport

au Plateau-central (41,4%), surtout avec des taux importants dans trois écoles (Tio A, Goundi

B, Douré A). Cette disparité est significative (P<0,001). 31,7% des sujets ont hébergé chacun

deux parasites intestinaux, 13,8% ont présenté trois parasites et 2,9% quatre parasites. Pour

trois élèves du Centre-ouest, nous avons rencontré une coïnfection à cinq parasites.

Tableau VI : Polyparasitisme par école sur la population totale (441 élèves)

Régions

Ecoles

Biparasites

N (%)

Triparasites

N (%)

≥ 4

parasites

N (%)

% moy.

polyparasites

% par

région

Plateau

central

Linoghin A

(N=60)

13 (21,7) 12 (20) 1 (1,7) 43,3

41,4

Loumbila A

(N=55)

16 (29,1) 2 (3,6) 0 32,7

Tangzougou

(N=56)

15 (26,8) 5 (8,9) 3 (5,4) 41,1

Wavoussé

(N=56)

21 (37,5) 5 (8,9) 1 (1,8) 48,2

Centre-

ouest

Ipendo A

(N=51)

15 (29,4) 8 (15,7) 0 45,1

57,5

Tio A (53) 20 (37,7) 10 (18,9) 4 (7,5) 64,2

Goundi B

(N=54)

20 (37,0) 12 (22,2) 2 (3,7) 63

Douré A

(N=56)

20 (35,7) 7 (8,9) 5 (8,9) 57,1

% 31,7 13,8 3,6 49,2

P < 0,05 * 0,001 *

*= p significatif ; %= pourcentage ; moy.= moyenne


3-2.4 Co-infestation de G. intestinalis et autres parasites retrouvés

La prévalence globale de la Giardiose a été de 27,2 % (120 échantillons positifs). Sur cet

effectif, 94 échantillons de selles (78,3%) ont présenté des formes kystiques contre 26

échantillons de selles (21,7%) qui ont présenté de formes végétatives (Figure 10).

Figure 10: Répartition des différentes formes de G. intestinalis rencontrés

(Nombre total de cas positifs = 120)

Pour les analyses de biologie moléculaire, nous avons retenus 97 échantillons de selles dont

les 94 cas de kystes observés et 03 échantillons exempts du parasite sous toutes ses formes.

Sur ces trois derniers échantillons négatifs, un a présenté une larve de S. stercoralis.

Le tableau VII est un croisement entre les sujets infestés par G. intestinalis d’une part, et

d’autre part avec les autres parasites rencontrés chez les mêmes sujets: la présence de G.

intestinalis a été fortement associée à celle de E. histolytica/dispar (P= 0,025) ; cependant, les

autres parasites retrouvés n’ont pas été associés au parasitisme par G. intestinalis (P> 0,05).

L’association G. intestinalis / E. coli a été la deuxième association la plus importante (34%).

Tableau VII : Coexistence Giardia intestinalis et autres parasites fréquents

E. histolitica / dispar E. coli T. intestinalis H. nana

Présent

N(%)

Absent

N(%)

Présent

N(%)

Absent

N(%)

Présent

N(%)

Absent

N(%)

Présent

N(%)

Absent

N(%)

G. intestinalis

(N=94)

60(63,8)

34(36,2) 32(34,0) 62(66,0) 26(27,7) 68(72,3) 7(7,4) 87(92,6)

P 0,025 * 0,217 0,287 0,624

* : significatif

Formes kystiques

Formes végétatives


La prévalence de Giardia intestinalis n’a pas montré de significativité statistique (P > 0,05) ni

selon l’école, ni selon le sexe, ni selon les groupes d’âge (Tableau VIII).

Bien que les effectifs des élèves polyparasités par école soient légèrement différents, aucune

différence statistiquement significative n’a été constatée. De même, il n’y a aucune variation

significative du polyparasitisme selon l’âge.

L’infestation multiple a été plus élevée chez les garçons (86%) que chez les filles (77,1%) ;

une significativité statistique a été observée (P= 0,038).

En ce qui concerne la classe fréquentée, seul E. histolytica / dispar a présenté une différence

statistique significative, donnant un taux très élevé (76,1%) pour le CM1 par rapport au CE2

(49%). Aussi, la fréquence de polyparasitisme a été plus élevée chez les sujets du CMI

(89,1%) que chez ceux du CE2 (72,5%) ; cette différence a été significative (P= 0,040)

(Tableau IX).

Sur le niveau d’instruction du chef de ménage (Tableau IX), une logique s’est dégagée : le

plus gros effectif d’élèves parasités (81,4%) a été remarqué parmi les élèves dont le chef de

ménage n’a reçu aucune instruction scolaire, suivi par les élèves à parent limité à des études

primaires (12,4%) et en fin par ceux dont les parents ont atteint le secondaire (6,2%).

Cependant, aucune différence statistique significative n’a été constatée (P > 0,05).

Pour ce qui est des latrines domestiques (Tableau IX), on a noté que 58 ménages sur les 97 au

total n’en avaient pas, contre seulement 39/97 qui en disposaient. T. intestinalis seul s’est

montré associé à la présence de latrine au domicile de l’élève (P= 0,002).

Enfin pour le critère d’eau potable, avec 87/97 de ménages qui en ont accès contre 10/97 qui

n’en ont pas accès, nous n’avons pas observé de différence statistique significative par rapport

à l’infestation des élèves.


Tableau VIII : Répartition des parasites les plus fréquents sur les 97 échantillons selon les

critères sociodémographiques.

*= p significatif ;

Critère

Kyste

Giardia

N

E.

histolytica

/dispar N

E.

coli

N

T.

intestinalis

N

H.

nana

N

S.

stercoralis

N

Poplyparasitis

me

N

Ecole

Douré A (N=19) 17 13 4 2 2 0 15

Goundi B (N=15) 8 6 3 2 2 1 8

Ipendo A (N=12) 10 7 4 1 0 0 8

Tio (N=16) 13 10 5 3 2 0 12

Linoghin (N=12) 12 8 4 5 0 0 9

Loumbila A

(N=17)

15 4 6 3 0 0 10

Tangzougou

(N=11)

7 4 1 4 1 0 5

Wavousse (N=13) 12 8 5 6 0 0 11

P = 0,17 0,12 0,88 0,095 0,32 - 0,59

Age (ans)

8-9 (N=9) 9 4 4 4 0 0 8

10-11 (N=45) 43 32 18 12 4 1 37

12-13 (N=38) 37 23 9 10 3 0 31

Non précisé (N=5) 5 1 1 0 0 0 2

P = 0,86 0,09 0,33 0,35 0,73 - 0,13

Sexe

Masculin (N=57) 55 39 21 16 2 1 49

Féminin (N=35) 34 20 10 10 5 0 27

Non précisé (N=5) 5 1 1 0 0 0 2

P = 0,90 0,08 0,58 0,38 0,12 - 0,038*


Tableau IX : Répartition des parasites rencontrés sur les 97 échantillons selon d’autres

critères sociodémographique ou économiques

*= significatif ; Sans instr. : Sans instruction

Critère

Kyste

Giardia

N

E.

histolytica

/dispar N

E. coli

N

T.

intestinalis

N

H. nana

N

S.

stercoralis

N

Poplyparasiti

sme N

Classe

CE2 (N=51) 48 25 19 16 5 1 37

CMI (N=46) 46 35 13 10 2 0 41

P = 0,09 0,006* 0,35 0, 28 0,30 - 0,04*

Niveau instruction chef de ménage

Primaire

(N=12)

11 8 6 5 1 1 10

Secondaire

(N=06)

6 4 0 1 0 0 4

Sans instr.

(N=79)

77 48 26 20 6 0 64

P = 0,50 0,9 0,10 0,42 0,78 - 0,67

Latrine à domicile

Présent (N=39) 38 24 11 17 3 0 32

Absent (N=58) 56 36 21 9 4 1 46

P = 0,81 0,96 0,41 0,002 * 0,89 0,41 0,74

Eau potable

Oui (N=87) 84 56 28 23 6 1 71

Non (N=10) 10 4 4 3 1 0 7

P = 0,55 0,13 0,62 0,81 0,72 0,73 0,38

N Total = 97


3-3- Résultats de la PCR en temps réel

La figure 11 ci-dessus présente les résultats sous forme de courbes d’intensité de la

fluorescence qui sont exprimées en fonction du nombre de cycles. Le résultat a été considéré

positif pour les échantillons dont les courbes ont franchi le seuil (ΔRn= 0,2) et négatifs dans

le cas contraire.

Figure 11 : Graphique du résultat de l'amplification par la PCR en temps réel

ΔRn : Amplitude de l'intensité de fluorescence émise.

3-3.1 Résultats de la PCR en temps réel selon les critères sociodémographiques et

socioéconomiques

Un effectif de 97 échantillons de selles a été soumis à la PCR en temps réel. Parmi les 97

échantillons, 94 ont présenté des kystes de G. intestinalis à la microscopie contre 03

échantillons qui ont été négatifs.

Le résultat de la PCR a montré la présence de G. intestinalis dans 72 échantillons parmi les 97

au total. Les plus faibles taux de positivité à la PCR ont été observés pour trois (3) des quatre

(04) écoles de la région du Plateau-central. Cependant, aucune différence statistiquement

significative n’a été observée (P>0,05) (Tableau X).

Ces résultats de PCR en temps réel n’ont subi aucune variation significative ni selon l’âge, ni

selon le sexe, ni selon la classe fréquentée par l’élève, ni selon le niveau d’instruction du

parent, ni selon la présence ou non de latrine à domicile, ni selon la disponibilité d’eau

potable pour le ménage d’origine ; P > 0,05 pour tous ces critères (Tableau X et XI).

Seuil


Tableau X : Résultats de la PCR en temps réel selon les critères sociodémographiques :

NS : non significatif

Critère PCR en temps réel positif

N(%)

Ecole /Village

Douré A (N=17) 16(94,1)

Goundi B (N=11) 7(63,6)

Ipendo A (N=10) 9(90,0)

Tio (N=13) 9(69,2)

Linoghin (N=12) 7(58,3)

Loumbila A (N=15) 10(66,7)

Tangzougou (N=7) 6(85,7)

Wavousse (N=12) 8(66,7)

Total (N = 97) 72(74,2)

P = NS (0,290)

AGE des élèves (ans)

8-9 (N=9) 6(66,7)

10-11 (N=45) 37(82,2)

12-13 (N=38) 25(65,8)

Non précisé (N=5) 4(80,0)

P = NS (0,351)

Sexe des élèves

Masculin (N=57) 43(75,4)

Féminin (N=35) 25(71,4)

Non précisé (N=5) 4(80,0)

P = NS (0,872)


Tableau XI : Résultats de la PCR en temps réel selon d’autres critères sociodémographiques

et / ou socioéconomiques

NS : non significatif

Critères PCR en temps réel positif

(N)

Classe fréquentée

CE2 (N=51) 39(76,5)

CMI (N=46) 33(71,7)

P = NS (0,595)

Niveau instruction parent

Primaire (N=12) 8(66,7)

Secondaire (N=06) 4(66,7)

Sans instruction (N=79) 60(75,9)

P = NS (0,719)

Latrine domestique

Présent (N=39) 30(76,9)

Absent (N=58) 42(72,4)

P = NS (0,619)

Eau potable (présence)

Oui (N=87) 64(73,6)

Non (N=10) 8(80,0)

P = NS (0,659)


3-3.2 Confrontation des résultats de la PCR en Temps Réel avec la microscopie

Le tableau XII ci-dessous présente les résultats résumés de la détection de G. intestinalis par

la microscopie et sa caractérisation par la PCR en temps réel. Des 94 échantillons positifs à la

microscopie, seulement 72 (76,6 %) se sont révélés positifs à la PCR en temps réel contre 22

(23,4 %) qui ont été négatifs. Les 03 échantillons initialement négatifs à la microscopie sont

restés négatifs par la PCR en temps réel. Ces résultats sont très statistiquement significatifs

avec P = 0,003 (tableau XII).

Tableau XII : confrontation des résultats de la microscopie à ceux de la PCR en Temps Réel:

Echantillons de selles

PCR (N = 97)

Positive

N (%)

Négative

N (%)

Microscopie de Giardia

intestinalis (N = 97)

Présence (N=94) 72 (76,6) 22 (23,4)

Absence (N=03) 0 03 (100)

P 0,003

Ainsi, en résumé, nous avons obtenu une confirmation des résultats de la microscopie pour

77,3 % des tests contre 22,7 % de résultats PCR (négatifs) discordant avec ceux de la

microscopie (positifs) (Figure 12).

Figure 12 : Résumé comparatif des résultats de la PCR en temps réel avec la microscopie

Résultats PCR identiques à la microscopie

Résultats PCR différents de la microscopie


4- DISCUSSION

Nous avons effectué l’enquête sur un effectif initial de 441 élèves des classes de CE2 et CMI

de huit écoles des régions du Plateau-central et du Centre-ouest dont quatre écoles par région.

L’âge des élèves a varié entre 8 et 14 ans, avec cependant environ 70 % qui avaient un âge

compris entre 10 et 12 ans. Ceci s’explique par le niveau scolaire de ces élèves dans notre

pays où l’inscription à l’école se fait à partir de 7 ans.

Le nombre de garçons (52,2 %) était plus élevé que celui des filles (47,8 %), ce qui est

contraire aux statistiques nationales (le sexe féminin représente 51,7 % contre 48,3 % pour le

sexe masculin selon le RGPH, 2006). Dans nos pays, et surtout dans les villages, les filles

n’ont pas la même chance d’aller à l’école que les garçons pour des raisons culturelles.

Pour le besoin de la réalisation de la PCR en temps réel l’effectif a été réduit à 97 échantillons

dont 58,8 % sont de sexe masculin.

Sur la prévalence des parasitoses intestinales :

Les résultats des enquêtes parasitologiques ont montré que tous les villages étudiés sont

touchés par les parasitoses intestinales avec une prévalence globale de 81,6 %. Cette

prévalence est très élevée par rapport à celles trouvée par d’autres auteurs au Burkina Faso qui

étaient respectivement de 52,47 % chez des sujets de 5 mois à 72 ans souffrant de

gastroentérites reçu au CMSCO (Karou et al., 2011), de 60,82 % des analyses effectuées au

laboratoire du CMSCO de 1991 à 2010 (Ouermi et al., 2012), de 71,5 % parmi les prisonniers

de la maison d’arrêt de Ouagadougou en 2010 (Zida et al., 2014), de 65,3 % des prescriptions

d’analyses faites par les cliniciens à l’hôpital Sourou Sanou en 2012 (Sangare et al., 2015).

Elle est presque le double de celle observée (46.5%) dans une étude menée dans la zone de

Sourou (BF) chez les enfant de 0 à 16 ans en 2002 (Dianou et al., 2004). Cela traduit le fait

qu’il n’y aurait pas eu d’amélioration significative sur le plan de l’hygiène et de la prévention.

Toutefois, des disparités quant à l’intensité de l’endémie selon le site (Tableau IV) ont été

observée avec une différence statistiquement significative (p<0,05). Sur ce sujet, Hussein

avait trouvé que le taux d’infestation parasitaire des écoliers était fonction du lieu de

résidence (Hussein, 2011).

La région du Centre-ouest a été la plus touché (89 %) par rapport à la région du Plateau-

central (74,4 %), (P<0,05). Ce qui pourrait s’expliquer par le problème de disponibilité d’eau


potable significativement constaté dans la dite région comparativement au Plateau-central

(P<0,05). Puisque, les parasites observés se transmettent par l’eau de boisson souillée.

D’ailleurs, les deux plus fortes prévalences en parasitoses (93 % et 92 %) ont été observées

parmi les élèves de deux écoles du Centre-ouest, qui sont parmi les villages ayant les faibles

disponibilités en eau potable et en latrines domestiques (Tableau IV). Cependant une école du

Plateau-central (Loumbila A) qui a apparemment moins accès à l’eau potable (66,7%

d’accessibilité), a montré paradoxalement la plus faible prévalence en parasitose (55%). Ce

qui pourrait s’expliquer par le niveau de vie et ou d’hygiène (Zonta et al., 2014) de la

population de cette zone qui se confond à la ville de Ouagadougou, puisque jouxtant cette

dernière. Ne dit-on pas qu’un meilleur accès à l’eau doit être accompagné par des pratiques

d’hygiène effectuées au bon moment (Curtis et al., 2000). De nombreuses études ont

d’ailleurs montré qu’une eau potable à la source peut faire l’objet de manipulations qui

multiplient les risques de contamination (Wright et al., 2004). Par ailleurs, une autre

hypothèse explicative peut venir de la variable d’accès à l’eau et de sa définition relativement

grossière. La question de l’accès à l’eau ne peut se réduire à une seule modalité par ménage.

La prévalence des protozoaires (83,4 %) a été statistiquement plus importante que celle des

helminthes (7,5 %). Les raisons de cette différence (significative car P<0,05) pourraient être

les traitements antihelminthiques qui ont été administrés à la population générale du Burkina

Faso en Décembre 2014, qui auraient éliminé ces helminthes sans pour autant éliminer les

protozoaires qui demandent un traitement long en utilisant les mêmes médicaments. D’autres

études ont montré des prévalences similaires (6,06% et 7,4%) pour les helminthes au Burkina

Faso (Ouermi et al., 2007; Zida et al., 2014).

Cette étude nous a permis de relever les parasites intestinaux les plus prévalant (tableau

V) qui ont été notamment des protozoaires dont E. histolytica / dispar (67,4%), E. coli

(35,4%), G. intestinalis (27,2%) et T. intestinalis (20,9%), qui sont des parasites à

transmission fécale. Pour ces protozoaires, Karou et collaborateurs ont trouvé dans le même

pays respectivement 30,74 %, 43,47 %, 21,72 % pour E. histolytica / dispar, G. intestinalis, T.

intestinalis dans la recherche d’étiologie de gastroentérites (Karou et al., 2011). Dans notre

étude, seule la prévalence de G. intestinalis a subi une baisse sensible par rapport à ces

résultats, celle de E. histolytica / dispar ayant doublé. Dans le cas de la prévalence de G.

intestinalis en baisse, la différence de niveau de vie entre les zones rurales et les zones

urbaines pourrait expliquer cela. Cependant une prévalence presque similaire a été observée


pour G. intestinalis (24,83 %) par Ouermi et al. au Burkina Faso (Ouermi et al., 2012). Une

enquête effectuée en zone rurale au Zimbabwe avait aussi donné des résultats similaires pour

ce parasite fréquemment rencontré avec 23 % de portage (Simango et Dindiwe, 1987). Ce qui

dénote de conditions d’hygiène médiocres ainsi que l’insuffisance en traitement des eaux de

boisson dans ces villages. G. intestinalis a été généralement considéré comme le micro-

organisme le plus fréquemment mis en cause dans les épidémies à partir d'eau destinée à la

consommation humaine aux Etats-Unis, (Barwick et al., 2000). Un chercheur a décrit trois

épidémies de giardiose qu’il a liées soit à une déficience du traitement de potabilisation, soit

une eau souterraine non traitée, ou encore une déficience du système de distribution (Quihui-

Cota et al., 2008). En témoigne une étude chez les enfants de 2 à 41 mois atteints de

gastroentérite aigue, qui a montré des prévalences très faibles (7,6 % pour G. intestinalis ; et

1,08 % pour Entamoeba) (Simpore et al., 2009) ; puisque les nourrissons ne sont autorisés à

boire de l’eau sauf le lait maternel. Cependant, la méconnaissance des génotypes responsables

ne permettant pas de prendre des mesures idoines de prévention, car si les génotypes animaux

sont en cause, les sujets traités se seraient plus vite réinfestés, étant donné la promiscuité avec

certains animaux réservoirs (chien, chat, …) et l’absence d’action préventives côté animal. Ce

qui pourrait justifier en outre, cette forte prévalence de l’espèce.

La répartition par école a montré une forte disparité pour E. histolytica / dispar, T. intestinalis

(P<0,05 pour ces espèces). Les écoles du Centre-ouest ont cumulé les plus fortes prévalences,

dénotant de mauvaises conditions d’hygiène individuelle, collective, l’insuffisance d’eau

potable, et dans une certaine mesure du manque de latrine pour certains ménages (tableau V).

L’helminthe le plus représenté a été Hymenolepis nana. Ces observations ont été déjà faites au

cours d’autres études réalisées par Simporé et collaborateurs d’une part et d’autre part par

Karou et collaborateurs respectivement sur l’étiologie des gastroentérites aigues chez les

enfants de 2 à 41 mois et chez des personnes âgées de 5 mois à 72 ans au Burkina Faso

(Simpore et al., 2009; Karou et al., 2011). La prévalence (6,8 %) dans la présente étude est

relativement basse par rapport aux résultats obtenus (10,2%) en 2002 dans des zones

hydroagricole du Burkina Faso (Dianou et al., 2004). Cette différence s’explique par le fait

que les zones hydroagricoles sont plus favorables aux helminthes. Le taux d’infestation par

école a montré des disparités énormes (P=0,002) avec notamment une école (de Tio A,

Centre-ouest) qui a présenté presque le triple (18,9%) de la moyenne d’infestation de cet

helminthe. Une explication possible est l’absence totale de latrine domestique dans tous les

ménages enquêtés de ce village (tableau III). Aussi, la deuxième école la plus infestée par H.


nana en est une autre du Centre-ouest (Goundi B) qui a présenté 11,1% de portage. Les

conditions du milieu, certaines habitudes alimentaires et les comportements de ces

populations expliquent en partie cette situation. En effet, les populations des deux villages les

plus infestés, qui appartiennent à la province du Sanguié, ont des aliments très riches en

viande de porc, hôte définitif de H. nana. Des marchés spéciaux de porc au four ont souvent

lieu. Ainsi, si la cuisson n’est pas bien faite, des ténias infestants subsisteraient et infesteraient

les consommateurs de la viande.

Le polyparasitisme (tableau VI) a été très important avec un taux global de coïnfection de

49,2%, avec cependant des disparités selon la région, voire selon le village (P<0,05). En

Turquie un taux proche (44,8 %) a été observé chez les enfants, taux fortement corrélé avec

l’anémie (Yentur et al., 2014). Le polyparasitisme semble lié au sexe (les sujets masculins

plus touchés, 86%) et à la classe de l’élève de façon significative (P<0,05). L’analyse des

données du polyparasitisme a montré que le biparasitisme a représenté 31,7 %, le

triparasitisme 13,8% et les sujets hébergeant 4 à 5 parasites ont représenté 3,6 % de la

population. Dans la majorité des cas retrouvés, les sujets polyparasités souffrent de

biparasitisme ou triparasitisme à protozoaires. En effet, L’association entre G. intestinalis et

E. histolytica / dispar a montré une significativité statistique (P<0,05). Les co-infestations G.

intestinalis avec respectivement E. coli (34%), T. intestinalis (27,7%) et H. nana (7,4%) bien

que aussi importantes n’ont pas été statistiquement significatives. Les écoles Goundi B et Tio

A (Centre-ouest) sont celles qui ont eu les prévalences les plus élevées en polyparasitisme. La

présence d’association parasitaire montre le très faible niveau d’hygiène sanitaire, alimentaire

et fécale ainsi que les conditions de vie défavorables de ces sujets polyparasités. La

prédominance des espèces de protozoaires s’explique par le fait que les parasites concernés

ont le plus souvent des modes d’infestations semblables. Ils reflètent les conditions de vie et

de l’environnement avoisinant de la population, qui fait que ceux qui en sont porteurs

représentent des sujets à risque (Basualdo et al., 2007).

Bien que différente selon les écoles, l’infestation par G. intestinalis n’a pas montré de

différence statistiquement significative selon le site. E. histolytica / dispar est associé au

niveau scolaire de l’élève avec une différence statistique significative (P=0,006), montrant

paradoxalement une prévalence élevée parmi les élèves de CM1 (76,1%) par rapport à ceux

de CE2 (49,0%) (Tableau VIII). De même, la prévalence de T. intestinalis a augmenté de

façon significative en fonction de la présence de latrine domestique (P=0,002), laissant

apparaitre que la présence de latrine au domicile de l’élève favorisait l’infestation à T.


intestinalis. Ce qui pourrait se justifier par une mauvaise utilisation des toilettes et une

insalubrité (non assainissement) de ces lieux de défécation. Aussi, le manque d’hygiène des

mains après l’utilisation des toilettes pourraient justifier cet état de fait.

Les données recueillies ont indiqué que globalement la différence d’infestation entre les

groupes d’âge n’est pas significative (p>0,05).

Sur la détection de G. intestinalis PCR en temps réel :

La PCR en temps réel a été réalisée sur des échantillons positifs et négatifs à G. intestinalis

(kyste) à la suite d’une détection par microscopie ordinaire de deux prélèvements de selles en

deux jours successifs chez les écoliers. C’est la première étude de caractérisation moléculaire

de ce parasite au Burkina Faso.

Les résultats de la PCR en temps réel ont été différents de ceux de la microscopie. En effet, 22

cas (23,4 %) initialement positifs à la microscopie se sont révélés négatifs à la PCR. Ainsi,

77,3 % (N=75) des résultats de la microscopie ont été confirmés par la PCR. Cette différence

a été très significative (P=0,003), donnant un taux de détection par la PCR relativement faible

par rapport à la microscopie prise comme base ici. Ce résultat est en contradiction avec le

principe selon lequel la PCR en temps réel pour G. intestinalis est plus sensible que la

microscopie (Verweij et al., 2003; Elsafi et al., 2013). Bien qu’ayant détecté par PCR des cas

de G. intestinalis parmi des échantillons initialement négatifs à la microscopie, Verweij et al.

avaient aussi obtenu 102 (98,1%) positifs par PCR en temps réel sur 104 échantillons

contenant des kystes de G. intestinalis (Verweij et al., 2003). Une sensibilité plus faible (93,4

%) a été observée en ciblant des séquences du gène de la petite sous unité de l’ARNr (même

gène ciblé dans cette étude) comme indiqué par Verweij Jaco en 2003 (Boadi et al., 2014).

L’absence de détection constatée à la PCR pour les 22 échantillons initialement positifs en

microscopie et qui traduise une absence d’ADN cible, pourrait s’expliquer par une lyse des

kystes suivie d’une possible dégradation de l’ADN du parasite par les DNases contenues dans

les selles durant la conservation (Kuk et al., 2012) qui a été à -80°C durant six mois (02

Février à Août 2015) puis à -20°C en moins d’une semaine jusqu’à l’extraction. Aussi, le

même auteur avait déjà fait mention d’inhibiteurs qui se trouveraient dans les selles. Dans

cette étude, nous n’avons pas purifié les kystes avant l’extraction faute de moyen, alors que

d’autres auteurs le préconisent (Bertrand et al., 2005). La non purification préalable des

kystes pourrait expliquer l’absence d’amplification de l’ADN qui serait inhibée par les


produits de dégradation de l’hémoglobine présents dans les selles (bilirubine, acides biliaires,

ions minéraux) (Kuk et al., 2012). Notons que les techniques de biologie moléculaire

présentent les avantages majeurs d'augmenter de façon considérable la rapidité, la sensibilité

et la spécificité de détection des micro-organismes, mais sont en contrepartie sensibles à un

grand nombre de composés inhibiteurs pouvant alors entraîner une sous-estimation des kystes

ou un résultat faussement négatif.

Une autre justification possible serait une surestimation des cas positifs de G. intestinalis lors

de la microscopie, avec notamment d’éventuels faux positifs. A ce niveau, nous précisons que

les échantillons présentant des kystes ont été vérifiés à toutes les fois par au moins deux

personnels du Laboratoire expérimenté. Aussi, le kyste de ce protozoaire est très facilement

identifiable au microscope par un technicien averti, comme c’est le cas de ceux qui ont

participé à l’activité.

D’ailleurs, quelque fois, nous n’avons identifié que de rares kystes de G. intestinalis mais

seulement après la concentration des selles par la technique de Ritchie décrite plus haut en

matériels et méthodes. Concernant la PCR en temps réel de G. intestinalis, Bertrand et

collaborateurs ont trouvé que pour une concentration initiale de 1,8.102 kystes.200µL-1,

seulement 33 % de réactions positives étaient observées (Bertrand et al., 2004; Bertrand et

Schwartzbrod, 2007).

En outre nous sommes tentés de nous interroger sur l’éventuelle insuffisance de lyse des

kystes. Le kyste de G. intestinalis a une paroi très épaisse et difficile à lyser. Mais la reprise

de l’extraction de cas négatifs a donné de l’ADN non amplifié, donc nous permettant de

minimiser cet aspect sur la lyse de la paroi.

Globalement, les résultats de la PCR n’ont varié ni selon le site, ni selon l’âge, ni selon le

sexe, ni selon la classe fréquentée par l’élève, ni selon le niveau d’instruction du parent, ni

selon la présence de latrine à domicile, ni selon la disponibilité d’eau potable ; pour toutes ces

variables aucune différence statistiquement significative n’a été observée (P>0,05). Ce qui est

similaire aux résultats obtenus à la microscopie pour la même espèce.

Les plus faibles taux de positivité à la PCR sont observés surtout dans la région du Plateau-

central où les résultats de 3 écoles sur 4 ont subi une baisse d’au moins 4 cas, alors qu’au

Centre-ouest, seule une école a présenté un faible taux de positifs. Ceci confirme les cas


positifs observés à la microscopie au Centre-ouest et ainsi la forte prévalence en giardiose

obtenue.

Des 5 échantillons contenant les kystes de G. intestinalis qui ont été conservés avec du formol

avant d’être congelés, 1 seul s’est révélé négatif par la PCR en temps réel. Ce résultat nous

suggère que cette méthode peut être considérée comme une alternative à la congélation qui est

tributaire d’une disponibilité permanente d’électricité cependant non effective dans nos pays.

Des études plus approfondies sur ce sujet pourraient mieux nous éclairer.

Nous n’avons pas inclus un grand nombre d’échantillon négatif pour G. intestinalis à l’issue

de la microscopie, afin de nous donner la possibilité de contrôler ces résultats supposés

négatifs, par cette technique plus sensible qu’est la PCR en temps réel. Egalement, nous

n’avons pas inclus les formes trophozoïtes du parasite. Cependant, cette non inclusion est due

à l’idée initiale de réaliser un génotypage de kystes de G. intestinalis sur les échantillons que

nous avions pu collectés depuis le mois de Février 2015 chez les élèves que nous ne pouvions

plus toucher au moment de la réalisation de la PCR (vacances scolaires). En effet, c’est pour

des raisons financières que nous avons limité ce travail à la détection de ce parasite par PCR

en temps réel.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES


CONCLUSION ET PERSPECTIVES

En milieu scolaire dans les zones rurales au BF, les parasitoses intestinales restent très

fréquentes, le type de parasite rencontré pouvant être variable d’un village à un autre.

Globalement 81,6 % des élèves enquêtés dans les huit villages étaient infestés par les parasites

intestinaux, dont la majorité étaient des protozoaires intestinaux (E. histolytica / dispar, E.

coli, G. intestinalis, T. intestinalis). La région du Centre-ouest a présenté une forte prévalence

(89 %) en parasitose intestinale comparée à la région du Plateau-central (74,4 %).

Dans la présente étude, nous avons utilisé deux méthodes de diagnostic de l’espèce parasitaire

G. intestinalis : la microscopie, supposée être le standard d’or bien que moins sensible, et la

PCR en temps réel, une technique de pointe de biologie moléculaire non accessible en routine,

très sensible même si dans cette étude, nous n’avons pu apporter la preuve. Elle nous a permis

de confirmer 77,3% des résultats et soulevé des doutes sur 22,7 % des cas positifs obtenus à la

microscopie.

Nos données vont dans le sens d’une meilleure prise en compte de l’épidémiologie locale

avec dans certaines zones, une plus grande importance à accorder aux protozoaires et/ou aux

helminthes dans les stratégies thérapeutiques. Une politique d’assainissement à grande

échelle, un contrôle vétérinaire régulier au niveau des animaux domestiques et un meilleur

accès aux soins permettraient de diminuer la prévalence de ces maladies qui pèsent sur l’état

de santé des enfants. Cela passe par la connaissance de la carte de distribution spatiale des

principaux foyers de transmission de ces protozooses.

Les résultats obtenus dans cette étude nous ouvrent les perspectives suivantes :

Envisager une étude moléculaire plus large pour contrôler la qualité (sensibilité et spécificité)

de la microscopie et pour le génotypage de Giardia intestinalis dans notre pays en incluant un

grand nombre d’échantillons négatifs.

Recommandations /suggestions

Au projet VGTS, de prendre en compte les infections bactériennes dans les prochaines

prospections ou études d’impact à mi-parcours.

Au Ministère de la Santé, d’organiser des études de résistances parasitaires aux

antiparasitaires notamment les antihelminthiques vu la fréquence de distributions de ces

médicaments dans notre pays, et vu les notifications de résistance dans certains Pays.

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Janvier 2015.

https://dhsprogram.com/publications/publication-FR256-DHS-Final-Reports.cfm

http://www.dpd.cdc.gov/

http://www.who.int/

ANNEXE


ANNEXES

Annexe 1 :

Fiche de collecte d’échantillons de selles chez les écoliers

Identification de l’élève :

Fiche No :………………………………ID ménage/élève :……………………………

Sexe de l’élève enquêté : Masculin Féminin NP

Classe fréquentée :……………… CE2 CM1

Région :……………………Province…………………….Village……………………

Ecole :……………………………………..Date de l’enquête :………………………

Echantillons de Selles : oui non

Indicateurs anthropométriques courants de l’état nutritionnel :

Date de naissance : ____/____/______

Age(Années) : 8-10 10-12 12-14 NP

Poids :………………………………………Taille :……………………………

Caractéristiques socio-culturelles :

Ethnie :………………………………………………………………………….

Niveau d’instruction du chef de ménage :………………………………………

Profession du chef de ménage :…………………………………………………

Connaissance des maladies parasitaires liées au manque d’hygiène et des agents

responsables :

Connaissances du péril fécal : Oui Non PR

Présence de latrines : Oui Non VM

Défécation dans des latrines : Oui Non PR

Disponibilité d’eau potable :

Disponibilité permanente d’eau……………… Oui Non

Etat de santé de l’enfant:

Présence de symptômes : Oui non NSP ; Si oui, date de début : ____/____/______

Est-ce que l’enfant fait la diarrhée ? Oui non NSP Nombre de selles/jour :………

Initiation traitement antiparasitaire : Oui Non NSP PR

Dénomination du médicament :………………………date dernière prise :……………….

Est-ce qu’il y a des animaux dans le ménage ? 1: absent 2: poules 3: chien

4: chèvre 5: âne 6: vache 7: autre…………. 99: PR

Analyse de Laboratoire :

Parasite(s) identifié(s) :………………………………………………………………………

Commentaire :………………………………………………………………………………


Annexe 2:

Technique de concentration selon Ritchie modifiée :

2 g de selles a été diluée dans 20 ml d'eau formolée à 10%, puis tamisée sur un chinois.

Nous avons recueilli 2 ml du filtrat dans un tube dans lequel nous avons ajouté 1 ml d'éther.

Nous avons bouché le tube et avons agité de façon à obtenir une émulsion homogène.

Nous avons ensuite centrifugé les tubes pendant 2 minutes à 2000 tr/mn.

Nous avons obtenu trois couches dont une couche aqueuse, une couche épaisse contenant des

débris et une couche éthérée légèrement jaunâtre.

Nous avons vidé le tube brusquement, et alors examiné entre lame et lamelle le culot.

Annexe 3 :

Technique de Kato-Katz :

Réalisation : Après avoir tamisé la selle, on a rempli le trou de la plaque calibrée appliquée

sur la lame ; ensuite nous avons retiré la plaque puis écrasé la selle par la cellophane imbibée

au préalable de solution de Kato (trempés au moins 24 heures). La cellophane est alors

retournée sur un papier filtre. Après un temps d’éclaircissement de 30 à 50 minutes à la

température ambiante, la préparation est lue à l’objectif X10.

Annexe 4 :

Protocole d’extraction de l’ADN par le kit « DNA-Sorb-B, Sacace Biotechnologies® » :

1. La solution de lyse et la solution de lavage (en cas de stockage à +2-8C) devraient être

réchauffées à 60-65C jusqu'à la disparition des cristaux de glace.

2. Préparer le nombre nécessaire de tubes de polypropylène de 1.5 ml.

3. ajouter à chaque tube 300 ul de solution de lyse. Etiqueter les tubes

4. ajouter 100 ul de l’échantillon dans le tube approprié.

5. Vortex vigoureux des tubes avant d’incuber pendant 5 min à la température de 65°C.


6. Centrifuger tous les tubes à 5 000 r/min pendant 5 sec.

Si l'échantillon n'est pas complètement dissous, il faut re-centrifuger le tube durant 5 min à 12

000 r/min et transférer le surnageant dans un nouveau tube pour l'extraction d'ADN.

7. Vortex vigoureux du sorbant et ajout de 20µl à chaque tube.

8. Vortex pendant 5-7 sec et incuber tous les tubes pendant 3 min à la température ambiante.

Répéter cette étape.

9. Centrifuger tous les tubes pendant 30 sec à 5000g (r/min) et à l'aide d'une micropipette avec

un embout anti-aérosol, enlever soigneusement et jeter le surnageant de chaque tube sans

déranger le culot. Changer les bouts entre les tubes.

10. ajouter 300 µl de la solution de lavage 1 à chaque tube. Vortexer vigoureusement et

centrifuger durant 30 sec à 8000 g (r/min). Enlever et jeter le surnageant de chaque tube.

11. Ajouter 500 µl de la solution de lavage 2 à chaque tube. Vortexer vigoureusement et

centrifuger pendant 30 sec à 8000 g. Enlever et jeter le surnageant de chaque tube.

12. Répéter l'étape 12 et incuber tous les tubes avec le bouchon ouvert pendant 5 min à 65°C.

13. resuspendre le culot dans 50 µl de l’éluent (DNA-eluent). Incuber pendant 5 min à 65°C et

à vortex périodiquement.

14. Centrifuger les tubes pendant 1 min à 12 000 g.

15. Le surnageant contient l'ADN prêt pour l'amplification.

Annexe 5 :

Protocole d’extraction par la méthode de Sarkari, B. modifiée

1. 200 μl de la suspension de kystes en eau distillée ou PBS, ajouter à 200 μl de Triton X100

(2% ou 3%) sont chauffés pendant 30 min à 72ºC.

2. Centrifuger et recueillir le surnageant

3. A 200 µl de l’échantillon (surnageant), on a ajouté 200 μl de la solution de lyse ;

4. Ajouter 10 μl de protéinase K puis incubation toute une nuit à 37ºC.


5. Centrifuger et recueillir le surnageant ;

6. Ajouter 200µl de NaCl 5M au surnageant et vortexer pendant 15 secondes. Isoler les

protéines précipitées par centrifugation à 13000 rpm pendant 5 min.

7. Transférer 500μl du surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Ajouter 1 ml d'éthanol

absolu (T° ambiante). Laissez précipiter l'ADN en agitant les tubes délicatement à la

main. Isoler l'ADN par centrifugation à 13000 rpm pendant 1 minute ; puis jeter le

surnageant.

8. Laver deux fois avec 800µl d'éthanol 70% frais (préalablement conservé à -20°C).

Vortexer, et centrifuger à 13000 rpm pendant 1 min puis jeter le surnageant.

9. Eliminer le reste d'éthanol en égouttant les tubes sur du papier absorbant, puis les sécher à

bouchon ouvert sur incubateur.

10. Dissoudre l'ADN dans 50µl de Tampon d’élution (TE) et vortexer pendant 30 secondes

puis incuber.

11. Utiliser 2µl d'ADN pour la quantification au Nanodrop.

12. Conserver l’ADN à -20°C.

Annexe 6 :

Amorces et sondes de G. intestinalis utilisés (Applied Biosystem) :

Cible Code d’accès Fonction Séquence (5’ – 3’)

G.

intestinalis

2338334 Amorce sens GAC GGC TCA GGA CAA CGG TT

2338334 Amorce anti sens TTG CCA GCG GTG TCC G

Sonde FAM–CCC GCG GCG GTC CCT GCT AG-BHQ

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