DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

• Diagnostic de sujets atteints : diagnostic de certitude

• Diagnostic chez les porteurs sains (maladies récessives)• permet le conseil génétique• diagnostic des femmes porteuses

• Diagnostic prénatal

• Diagnostic préimplantatoire

• Diagnostic prédictif

COMPLEXITE DU CHAMP D’APPLICATION

• Très nombreuses maladies génétiques – très nombreux gènes

• Phénotypes parfois mal définis

• Anomalies spécifiques d’une maladie – Stratégies d’étude spécifiques

• Capacité de réponse d’un patient à une molécule thérapeutique : Phamacogénétique

Méthodes utilisées pour le diagnostic génotypique

1 – Recherche de mutations ponctuelles- mutation connue- screening d’un gène : séquençage, DHPLC, HRM

2 – Recherche d’amplifications de triplets

3 - Recherche de délétions

DIAGNOSTIC DIRECT

DIAGNOSTIC INDIRECT

Dans un microtube :

-ADN à amplifier ou

matrice : 50ng à 500ng

-les 2 amorces

-dNTP

-Taq Polymérase

-tampon avec Mg++

Volume final : 20 l à 100 l

Appareil : Thermocycler

1– recherche directe de la mutation déjà identifiée dans la famille

  A – PCR - restriction

B – ASO Allele specific oligonucleotide

1 - PCR + DOT BLOT (dépôt sur membrane)

2 - hybridation par oligosondes spécifiquesde la séquence normalede la séquence mutée

ASO

The line-probe assay (LiPA)

Biotinilated primer

C – ARMS test

ou allele specific PCR

PEO : Penthaethylene oxide units

marquage fluorescentFAMHEXTET

-La sonde commune peut être marquée avec un fluochrome différent dans les PCR multiplex

- Chaque sonde spécifique doit avoir une taille différente

D – test OLA

Oligonucleotide ligation assay OLAApplication de la technique OLA à la recherche des principales mutations du gène CFTR (mucoviscidose)

2 – recherche de mutations dans un gène : screening

- Séquençage

- DHPLC

- HRM

Séquençage

4 mélanges sont préparés:

- le fragment qui doit être séquencé

- un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce

- les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)

- l'ADN polymérase

(vecteur)

L'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacements d'un nucléotide donné

exemple: synthèse du brin complémentaire, et arrêt aléatoire par un ddGTP quand il y a une Cytosine sur la séquence

Séquenceur à plaques

DHPLC

Dans des conditions de dénaturation partielle, le temps de rétention sur colonne de chromatographie liquide est différent pour les homoduplexes et les hétéroduplexes.

HRM

Après PCR en présence d’un intercalant fluorescent cette technique permet, en appliquant unemontée en T° très progressive, de discriminer des variants.

La dénaturation provoque la baisse de la fluorescencepuis son extinction quand la dénaturation est complète.

Chaque séquence a donc une courbe de fusion quilui est propre.

Une modification de cette courbe signale la présence d’une anomalie.

2 – Recherche d’amplifications de triplets

- par PCR

- Possibilité d’amplifier jusqu’à 80 répétitions

- Hommes - si > 80répétitions = pas de signal

- femmes – un seul signal = sujet homozygote ou sujet présentant une mutation complète

Exemple du X Fragile

(CGG)50

EcoRI EcoRI

(CGG)500

EcoRI EcoRI

EagI

EagI

sonde

sonde

FMR1

FMR1

Par Southern blot

N N PM PM MT MT

Coupure EcoRI + EagI et SOUTHERN BLOT

5,2 kb

2,8 kb

MUTE

NORMALX INACTIF

NORMAL X ACTIF

PREMUTEX ACTIF

PREMUTEX INACTIF

3- Recherche de délétions

2-1 Délétions de petite taille

PCR simple ou multiplexSouthernMLPAQMPSF

2-2 Délétions des télomères : MLPA

3-3 Délétions de grande taille : CGH array

- Par PCR

Recherche de délétions par PCR multiplex

Exemple de la myopathie de Duchenne et de Becker

Diagnostic délétions : Myopathie de Duchenne

Détection de délétions par la technique de Southern

QMPSFQuantitative Multiplex PCR of Short

Fluorescent Fragments

Peak size normalizationbased on endogenous peak of control gene

Visual analysis

stabilization Forward primer Reverse primer stabilizationtail+6FAM Target specific sequences tail

Primer designMultiplex PCR reaction : same stringent PCR conditions

1A

2A

1B

2B

Fragment Analysis

DenaturationTarget 1 fragment

Target 2 fragment

1A

1B

2B

2A

PCR

Control

Patient

ZIC2 TGIF SIX3 SHH SHH Ctrl gene SHH SIX3 TGIF ZIC2

Control - Patient

MLPA (1)Multiplex Ligation dependant PCR

Amplification

Peak size normalization

Ratio =

R = 1.5 duplicationR = 1 normalR = 0.5 deletion

Primer X Target specific Stuffer Primer Y binding site sequences sequence binding site

Probe designSynthetic oligonucleotide M13 derived

oligonucleotide

1A

2A

1B

2B

Target 1

1A 1B

Target 1

Multiplex hybridization and ligationNo ligation of mismatched

probes

2A 1B

Target 2

2A 2B

Patient peakControl peak

Fragment Analysis

Control

Patient

PCR with universal primers X and Y

No exponential amplification

of non ligated probes

X Y

Délétions de grande taille CGH array

Délétion en 2q12.3 de 2,5 Mb

DIAGNOSTIC INDIRECT

INDICATIONS

- gène localisé dans le génome mais non cloné

- gène connu, mais mutation non identifiée

- exemple de la myopathie : recherche des filles vectricesdélétion non détectable chez les filles (sauf PCRq)

PRINCIPE

- identification du chromosome porteur du gène muté à l’aidede marqueurs polymorphiques situés à proximité du gène- liaison génétique

CONTRAINTES- disposer d’un enfant atteint- risque de recombinaison

Liaison génétique

Gène N Gène M

A1

B2

D4 D1

C3

B4

A3

C2

Gène M

D4

C3

B4A1

Marqueurs polymorphiques utilisés : microsatellites

1 -2 1 -2 2 -2 1 -1

Allèle 1

Allèle 2