Quelques exemples de nos travaux

C. RenardUMR SQPOV, Avignon

Fév 2010

Plan

• Les pectines: définition et structure• Méthodes d'étude des pectines• Les pectines en tant qu'additifs• Les enzymes pectolytiques• Les pectines in situ: • Quelques exemples de nos travaux

– Modification des homogalacturonanes– Quelques mots sur les polyphénols– Extraction de polyphénols de marc de pomme– Extraction de jus par microondes

- Association spontanée et rapide polyphénols-paroi cellulaire

- Affinité entre les tannins et les pectines- Influences de DP (tannins) et de DM (pectines)- Modification de l’extractibilité des polysaccharides

- Possibilité de mesurer l’interaction par la Calorimétrie Isothermale de Titration

Interaction

Préparation d’homogalacturonanessubstitués

• Pour étudier leurs interactions avec les polyphénols

• Homogalacturonanes par hydrolyse acide

• Substitution par halogénures d’alkyles

• Test: calorimétrie isothermale de titration

Expériences et Résultats

1002,4221HG-TBA

71,34,6656,5HG

97,93,6994,9Pectates

/3,58/Pectines

Rendement en Gal-A (%)

Teneur en Gal-A (mmol/g)

Rendement pondéral

(%)

Pectines:Pectines:Pectines commerciales de pommesPectines commerciales de pommes

PectatesPectates

SaponificationSaponification

HomogalacturonanesHomogalacturonanes

Hydrolyse acideHydrolyse acide

HGHG--TBATBA

NeutralisationNeutralisation

HG HG modifimodifiééss

AlkylationAlkylation

Methylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1 10

Ratio molaire MeI/Gal-A

Deg

réde

mét

hyla

tion

(%)

Ethylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1

Ratio molaire EtBr/Gal-A

Deg

réd'

éthy

latio

n(%

)10

Buthylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1

Ratio molaire BuBr/Gal-A

10

Deg

réde

pro

pyla

tion

(%)

Deg

réde

but

hyla

tion

(%)

Propylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1

Ratio molaire ProBr/Gal-A10

Methylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1 10

Ratio molaire MeI/Gal-A

Deg

réde

mét

hyla

tion

(%)

Ethylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1

Ratio molaire EtBr/Gal-A

Deg

réd'

éthy

latio

n(%

)10

Buthylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1

Ratio molaire BuBr/Gal-A

10

Deg

réde

pro

pyla

tion

(%)

Deg

réde

but

hyla

tion

(%)

Propylation

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1

Ratio molaire ProBr/Gal-A10

--

Efficacité de la substitution

• Influence de l’halogénure,

• Encombrement de la chaîne d’alkyle,

• Relation linéaire jusqu’au ratio 1 (alkylant/Gal-A),

• Insolubilité des molécules hautement substituées.

Sans diminution de la longueur de chaîne

• HPSEC

HG-TBA

HG-Me1

HG-Et6

HG-Pr12

13 min8 min

10,82,02//7,6686,3800,236PPH purifiés

10,90,160,141,970,8569,8222,899PPH Extraits acétonique

5,60,240,080,770,536,3/146,48Pomme

DHCAc. PCGAc. chlorECAT PCADP

Concentration (mg/g de matière sèche)RendtPCA (%)Quantité (g)

Poudre de pommes Poudre de pommes lyophilislyophilisééeses

PolyphPolyphéénols extraitsnols extraits

PolyphPolyphéénols purifinols purifiééss

Extraction Extraction

PurificationPurification

Analyse par HPLCAnalyse par HPLC

HexaneMéthanolEau-Acétone

SPE C18

Préparation des polyphénols

Mesure de l’interaction par ITC

microcalorimètre isothermale de titration

ITC; Résultat obtenu en 2008, Procyanidines DP 35, 3mM,Pectine DM 70, 1,5 mM

HG HG-Me DS 41 HG-Bu DS 74

35°C

Avec les HGs: pic exothermique à 1/10

Pourquoi les polyphénols?

• Caractères organoleptiques– amertume et astringence– couleur : natifs, oxydés– relations structure/propriétés des polyphénols– rôle de la matrice

• Propriétés nutritionnelles• Evolution des polyphénols au cours des procédés

– transferts depuis le fruit– modifications des structures

• oxydations , condensations• enzymatiques, chimiques: échelles de temps

De la matière première au produit

Matière première

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

Pressage

Cidre

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

Clarifications

Fermentation

Broyage

Raffinage

Cuisson

Une démarche commune

• Observation– Une observation qui ne « cadre pas » avec la théorie

générale– Une question finalisée qui conduit à des interrogations

fondamentales• Modélisation

– Elle permet d'analyser des phénomènes réels et de prévoirdes résultats à partir de l'application d'une ou plusieurs théories à un niveau d'approximation donné.

– Modélisation « ad hoc »: boite noire (statistique), basée sur des modèles descriptifs ou théoriques

• Validation– Répéter l’observation initiale en faisant varier les leviers

identifiés par le modèle– Le modèle permet-il de prévoir l’effet des modifications du

procédé?

0 10 20 30 40 50

Temps de rétention (min)

Abs

orba

nce

280

nm

(-)-épicatéchine

benzylthioéther de (-)-épicatéchine

toluène-thiol

0 10 20 30 40Temps de rétention (min)

Abs

orba

nce

(280

nm

)

Procyanidols

Thiolyse(dépolymérisation)

1. Identification des unités constitutives

2. Détermination du degrémoyen de polymérisation

3. Quantification et estimation de la pureté

OHOH

HO O

OHOH

OHOH

HO O

OHOH

OHOH

HO O

OHOH

OHOH

HO O

OHOH

OH

OH

OH

OHO

HO 8

4

64

OHOH

HO O

OHOH

OHOH

HO O

OHOH

OHOH

HO O

OHOH

OHOH

HO O

OHOH

OH

OH

OH

OHO

HO 8

4

64

Pour la caractérisation de procyanidines

La réaction de thiolyse

Flavanyl-C4-carbocation

H+

O

OHOH

HO

OHOH

O

OHOH

HO

OHOH

SCH2

O

OHOH

HO

OHOH

O

OHOH

HO

OHOH

OHOH

HO

OHOH

O

SH

CH2

2extension

units

terminalunit terminal unit

(flavanol)

+

2

2O

OHOH

HO

OHOH

+

Benzylthioetheradduct

Procyanidin

(Adapted from Thompson et al., 1972)

Quantification par HPLC

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 10 20 30 40 50Retention time (min)

Abs

orba

nce

(280

nm

)

1

7

6

5

4

3

2 A

X

X

X

X X X X

X

Beforethiolysis

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 10 20 30 40 50Retention time (min)

Abs

orba

nce

(280

nm

)

1

2' 97

6

5'

4

2

10

Afterthiolysis

8

B

• Avant– Procyanidols– Acides hydroxycinnamiques

• Après– Flavanols et dérivés

benzylthioethers– Dérivés méthylés

Pourquoi le marc de pomme

• Un co-produit abondant et mal valorisé– France: 200 KT pommes à cidre– Marc: environ 5%– Utilisation: extraction des pectines, alimentation des

animaux

Les ultrasons

Bumble bee150 Hz

Prpoagation des sons en milieu liquide: le phénomène de cavitation

Conséquences de la cavitation

Implosion des bulles: micro-réacteuravec des conditions de T° et P extrèmes

Peut-on utiliser la cavitation en extractions?

• Extraction – à partir de marc de pomme industriel– par des solvants compatibles alimentaire

• Dosage – Polyphénols totaux (Folin)– Polyphénols spécifiques (HPLC après thiolyse)

1. Sans ultrasons2. Avec ultrasons

Maximum50% EtOH/H2O (v/v)

TPC (ECatechin g/L) = f (% EtOH)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

0% 20% 40% 60% 80% 100%EtOH

TPC Eq.catechin

(g/L)

Essais préliminaires- 1

• Solvant (ratio Ethanol / H2O)– 10g marc/ 100mL solvant

Rapport liquide / solideConcentration

Volume récupérée

Quantité effective d’extrait

X

Solids and Liquids volumes recovered after filtration step function of solid/liqui ratio

y = 617,22xR2 = 0,9989

y = 396,83x2 - 325,24x + 99,698R2 = 0,988

0,00

20,0040,0060,00

80,00100,00120,00

140,00160,00180,00

200,00

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%

Ratio S/L

Volu

me

(mL)

LiquidSolid

TPC Ecatechin (g/L) = f (ratio S/L)y = -8,1354x2 + 8,1092x

R2 = 0,9984

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%Ratio S/L

TPC Eq.catechin (g/L)

Quantity of extract recoveredR2 = 0,9986

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%ratio S/L

Eq. Catechin (g)

=

Rapport choisi15% (w/v)

Extraction assistée par ultrasons

• Conditions fixées– EtOH/H2O (50/50, v/v)– Ratio S/L (w/v): 15%– Ultrasonic bath: PEX 3

• (REUS, Contes, France)

• Plan d’expérience– Puissanced des US (W/g)– Température (°C)– Durée d’extraction

Plan d’expérience

Box-Wilson (composite centré)

• 6 expériences au centre

• 8 expériences aux « coins »

• 6 expériences en étoile

20 expériences au total

00 + 1+ 1-- 11

-- 11

+ 1+ 1

00

00

-- 11

+ 1+ 1

Valeurs utilisées et résultat PPT

- α- 1

0+ 1+ α

Niveau

9,916,025,034,040,1

Temp.(°C)

515304555

Durée (min)

0,0580,0750,1000,1250,142

Puissance US

(W/g)

Variables et leurs niveaux

0,87100020

0,84800019

0,83200018

0,83800017

0,86900016

0,80100015

0,9701,681790014

0,658-1,681790013

1,17501,68179012

0,6330-1,68179011

0,985001,6817910

0,84300-1,681799

1,1041118

1,05611-17

0,7691-116

0,7831-1-15

0,865-1114

0,897-11-13

0,673-1-112

0,626-1-1-11

Eq.Catechin[g/L]

Duréemin

Temp.°C

PuissanceW/g

No.

Exploitation des résultats

• Modèle statistique – Modèle linéaire généralisé– Equation prennant en compte des effets linéaires,

quadratiques et interactions

• Equation– TPC = 0.844 + 0.021 P + 0.145 T + 0.086 t + 0.018 P2 +

0.015 T2 – 0.017 t2- 0.002 P.T + 0.002 P.t + 0.018 T.tAvec, P: Puissance US

T: Températuret: durée d’extraction

– Calcul des conditions optimales45 min40.1°C0.142 W/g

DuréeTemp.Puissance US

Pour une concentration en PPT maximale

Exploitation graphique

• Graphique de Pareto– Choix des variables

• Calcul des surfaces de réponse

p = 0.05

Polyphénols spécifiques

• Mêmes extractions– Dosage des polyphénols dans les extraits par LC-DAD après

thiolyse– Quantification aux différentes longueurs d’onde

• Flavanols: 280 nm (fluo)• Dihydrochalcones: 280 nm• Acides hydroxycinnamiques: 320 nm• Flavonols : 350 nm

– Calcul des équations et surfaces de réponse

0,1620,0273,9700,1960,22500020

0,1500,0233,9730,1950,22300019

0,1600,0253,7060,2020,23200018

0,1620,0253,7270,1990,22700017

0,1590,0263,8750,1990,22800016

0,1510,0233,9430,1930,22000015

0,1800,0294,2260,2530,2831,681790014

0,1340,0193,5560,1320,154-1,681790013

0,1760,0274,3220,2810,31801,68179012

0,1520,0222,9260,1380,1620-1,68179011

0,1620,0243,8190,1940,224001,6817910

0,1530,0243,9600,1940,22000-1,681799

0,1750,0314,0090,2970,3281118

0,1540,0304,2670,2740,30311-17

0,1440,0233,9340,1710,1961-116

0,1450,0233,8980,1720,2001-1-15

0,1480,0214,6180,1650,195-1114

0,1530,0233,7700,2120,239-11-13

0,1380,0193,4020,1260,149-1-112

0,1440,0212,8660,1430,169-1-1-11

PhloridzinPhloretin

Xyloglucoside

DP° PCAPolymericFlavan-3-ols

MonomericFlavan-3-ols

Extraction timeTemp.US

PowerNo.

DihydrochalconesFlavan-3-ols

280 nmVariables-

0,1010,0090,04800020

0,0960,0070,04300019

0,1010,0080,05100018

0,0980,0080,05000017

0,0990,0080,04400016

0,0960,0070,04200015

0,1080,0090,0611,681790014

0,0780,0070,039-1,681790013

0,1110,0090,05801,68179012

0,0780,0100,0370-1,68179011

0,0900,0070,055001,6817910

0,0710,0080,04600-1,681799

0,1150,0080,0541118

0,1100,0080,04711-17

0,0880,0070,0391-116

0,0880,0060,0371-1-15

0,1040,0070,049-1114

0,0940,0080,048-11-13

0,0780,0070,040-1-112

0,0750,0120,049-1-1-11

Flavo-nolsp-coumaroyl-quinic Acid

ChlorogenicAcid

Extraction timeTemp.US PowerNo.

350 nm325 nmVariables-

Variables d’influence

0.75070.11

0.52830.43

0.35020.96

0.47710.55

0.78990.07

0.001021.28

0.000139.42

0.000087.30

0.01089.75

p-valueF-ratioFlavonols

350 nm

0.04825.06

0.04825.06

0.35770.93

0.88180.02

0.12442.81

0.46340.58

0.69580.16

0.52440.44

0.13132.70

p-valueF-ratio

p-Coumaroyl-quinic acid

0.34161.00

0.34161.00

0.39900.78

0.79520.07

0.77710.08

0.71330.14

0.23671.58

0.01189.43

0.48490.53

p-valueF-ratioChlorogenic acid

325 nm

0.01239.29

0.19591.92

0.78730.08

0.32531.07

0.62220.26

0.32531.07

0.000071.34

0.000233.80

0.53880.40

p-valueF-ratio

PhloretinXyloglucoside

0.42190.70

0.24461.53

0.38060.84

0.38450.83

0.88350.02

0.42390.70

0.006411.76

0.01269.20

0.47820.54

p-valueF-ratioPhloridzin

0.005012.85

0.006411.80

0.97000.00

0.67080.19

0.11422.99

0.67940.18

0.001817.83

0.000064.67

0.16092.29

p-valueF-ratioDP° Procyanidins

0.00020.2393

0.002516.07

0.78540.08

0.23931.57

0.10943.09

0.34750.97

0.0000283.02

0.0000423.10

0.16492.25

p-valueF-ratio

Polymeric Flavan-3-ols

0.000624.61

0.005312.56

0.83910.04

0.14352.52

0.09953.30

0.32571.07

0.0000246.42

0.0000383.05

0.27401.34

p-valueF-ratio

MonomericFlavan-3-ols

280 nm

0.69070.17

0.69720.16

0.79230.07

0.39670.78

0.43350.67

0.63780.24

1.19691.91

0.05814.58

0.10943.09

p-valueF-ratioYield

0.23581.59

0.87200.03

0.88540.02

0.13872.59

0.20291.86

0.12132.87

0.000061.27

0.0000174.20

0.08433.67

p-valueF-ratioTPC

X2X3X1X3X1X2X3²X2²X1²X3X2X1

Interaction effectsQuadratic effectsMain effectsVariables

Exemple des flavonols

• Graphique de Pareto

• Equation et conditions optimales:Flavonols = 0.098 + 0.004 P + 0.011 T + 0.007 t – 0.005 P2

+ 0.002 P.T – 0.001 P.t – 0.001 T2 + 0.001 T.t – 0.001 t2

55 min37.8°C0.117 W/g

DuréeTemperatureUS Power

Comparaison avec / sans US

• Dans les conditions optimalesComparison of extraction methods

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00time (min)

TPC Eq.Catechin

(g/L)

> 20%

Mécanisme

• Déstruction des structures – cavitation sur les surfaces exposées

• Exemple (carvi)

Initial seedConventionnal Extraction 300 min. 69°C – Yield 1,6%

Sono-extraction 30 min. 20°C - Yield = 1,7%

Extraction de jus par microondes

• Thèse Aurélie Cendrès

• Prune (abricot, raisin)

Fruits frais et non transforméplacés dans le micro-onde

Chauffage par micro onde de l’eau intrinsèque des fruits

Génération d’un phénomène d’hydrodiffusion de l’intérieur

l’extérieur du fruitLe jus atteint l’extérieur du

fruit et tombe par gravitéRécupération directe du jus

sans étape supplémentaire

Reflex

« Easy Wave »

Computer

Graduatedcylinder

PTFE grid

Microwaveoven

Fruits

TemperatureSensor

Chronograph

Column

Fruit juice

Ovenopening

Oven opening

Principe

En pratique

Sonde (dans le fruit)

Jus

Et les produits

Est-ce que ça se boit?

Je n’aime pas J’aime

0 9

Test par les membres du laboratoire (7 femmes, 6 hommes, 21-55 ans)

Raisin5.5

Prune 5.4

Abricot 3.3

Augmentation de la puissance appliquée: Extraction plus rapide mais rendement plus faible.Le facteur limitant est la surchauffe des fruits

1.5 W.g-1

1 W.g-1

0.5 W.g-1

0

200

400

600

0 5 10 15 20Time (min)

Yie

ld(m

l.kg-

1)Impact de la puissance appliquée

Une formule adaptée: y=a/(1+(x/x0)^b) décrit bien la forme de l’extractionLes coefficients:

b=trouvé à environ –2, forme généralea= plateau: volume maximal extraitx0=point d’inflexion: point où la vitesse maximale est atteinte

0

100

200

300

0 200 400 600 8000

5

10

15

20 Coef x0 manip2Coef a manip1Coef a manip2

Coef x0 manip1

Le modèle permet de mieux quantifier les impact des modifications de la puissance appliquée sur l’extraction.On devrait extraire plus et plus vite, or on extrait moins: surchauffe.

puissance

Coef a Coef xo

Modélisation de l’extraction

Observation du phénomène

• Extraction à partir de fruits frais

Time (min)

160

0

40

80

120

0 10 20 30

Volume (ml) & Temperature (°C)

0

4

8

12

16Vitesse maximale

Hydrodiffusion

Vitesse (ml/min)

12 34

• Extraction à partir de fruits congelés

-50

0

50

100

150

200

10 20 300

4

8

12

16

-50

Temps (minutes)

0

50

200

10 20 300

4

8

12

16

Formation de points chaudsFonte de la glace

Hydrodiffusion

Volume (ml) & Temperature (°C) Vitesse (ml/min)

12

3

Que se passe-t’il avec des fruits initialement congelés?

Composition des produits

4

0

1

2

3

Prune Abricot Raisin

4

0

1

2

3

Prune Abricot Raisin 0

10

20

30

40

Prune Abricot Raisin0

10

20

30

40

Prune Abricot Raisin

Polyphénols (g/L) Anthocyanes (mg/L)

0

40

80

120

160

200

Prune Abricot Raisin

Sucres (g/L)

0

40

80

120

160

200

Prune Abricot Raisin

Sucres (g/L)

0

4

8

12

16

Prune Abricot Raisin

Acides (g/L)

0

4

8

12

16

Prune Abricot Raisin

Acides (g/L)

Des comportements différents des polyphénolsselon leur répartition dans le fruit

Polyphénols de la chair (flavanols, acides hydroxycinnamiques)

Polyphénols de l’épiderme (anthocyanes et flavonols)

0

0,5

1

1,5

2

0 50 100 150 200 250Juice fraction (ml)

0

0,5

1

1,5

2

0 50 100 150 200 250Juice fraction (ml)

Rat

io o

f con

cent

ratio

n

0

0,5

1

1,5

2

0 50 100 150 200 250

Rat

io o

f con

cent

ratio

n

Juice fraction

Extraction microonde

• Mécanismes d’extraction– Frais: chauffage du centre vers l’extérieur, moteur de

l’hydrodiffusion– Congelé:

• déstructuration liée à la formation de cristaux de glace• Fonte (points chauds puis conduction thermique)• Hydrodiffusion après décongélation

• Des questions en suspens:– Volume de vapeur produites (en fonction de la puissance

appliquée)– Optimisation des rendements: éviter la surchauffe?– Oxydation enzymatique: oui, non, quelles conditions?