vetagro sup campus veterinaire de lyon
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VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2012 - Thèse n°
COMPARAISON DE DIFFERENTS LIQUIDES DE
FLOTTATION EN COPROSCOPIE DES RUMINANTS
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 21 décembre 2012
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
RICHARD Fabienne
Née le 30 décembre 2012
à Vichy(03)
1
VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2012 - Thèse n°
COMPARAISON DE DIFFERENTS LIQUIDES DE
FLOTTATION EN COPROSCOPIE CHEZ LES RUMINANTS
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 21 décembre 2012.
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
RICHARD Fabienne
Née le 30 décembre 2012.
à Vichy
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3
LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT
Civilité Nom Prénom Unités pédagogiques Grade
M. ALOGNINOUWA Théodore Unité pédagogique Pathologie du bétail Professeur
M. ALVES-DE-
OLIVEIRA Laurent Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences
Mme ARCANGIOLI Marie-Anne Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences
M. ARTOIS Marc Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
M. BARTHELEMY Anthony Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
Contractuel Mme BECKER Claire Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences
M. BELLI Patrick Unité pédagogique Pathologie morphologique et
clinique des animaux de compagnie
Maître de conférences
Contractuel
Mme BELLUCO Sara Unité pédagogique Pathologie morphologique et
clinique des animaux de compagnie Maître de conférences
Mme BENAMOU-SMITH Agnès Unité pédagogique Equine Maître de conférences
M. BENOIT Etienne Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur
M. BERNY Philippe Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur
Mme BONNET-GARIN Jeanne-Marie Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur
Mme BOULOCHER Caroline Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
M. BOURDOISEAU Gilles Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
M. BOURGOIN Gilles Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
M. BRUYERE Pierre Unité pédagogique Biotechnologies et pathologie
de la reproduction
Maître de conférences
Contractuel
M. BUFF Samuel Unité pédagogique Biotechnologies et pathologie
de la reproduction Maître de conférences
M. BURONFOSSE Thierry Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences
M. CACHON Thibaut Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
Contractuel
M. CADORE Jean-Luc Unité pédagogique Pathologie médicale des
animaux de compagnie Professeur
Mme CALLAIT-
CARDINAL Marie-Pierre Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
M. CAROZZO Claude Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
M. CHABANNE Luc Unité pédagogique Pathologie médicale des
animaux de compagnie Professeur
Mme CHALVET-
MONFRAY Karine Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences
M. COMMUN Loic Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences
Mme DE BOYER DES
ROCHES Alice Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences
Stagiaire
Mme DELIGNETTE-
MULLER Marie-Laure Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur
M. DEMONT Pierre Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
Mme DESJARDINS
PESSON Isabelle Unité pédagogique Equine Maître de conférences
Contractuel Mme DJELOUADJI Zorée Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
Mme ESCRIOU Catherine Unité pédagogique Pathologie médicale des
animaux de compagnie Maître de conférences
M. FAU Didier Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur
Mme FOURNEL Corinne Unité pédagogique Pathologie morphologique et
clinique des animaux de compagnie Professeur
M. FRANCK Michel Unité pédagogique Gestion des élevages Professeur
M. FREYBURGER Ludovic Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
M. FRIKHA Mohamed-
Ridha Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences
4
M. GENEVOIS Jean-Pierre Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur
Mme GILOT-FROMONT Emmanuelle Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur
M. GONTHIER Alain Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
Mme GRAIN Françoise Unité pédagogique Gestion des élevages Professeur
M. GRANCHER Denis Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences
Mme GREZEL Delphine Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
M. GUERIN Pierre Unité pédagogique Biotechnologies et pathologie
de la reproduction Professeur
Mme GUERIN-FAUBLEE Véronique Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
Mme HUGONNARD Marine Unité pédagogique Pathologie médicale des
animaux de compagnie Maître de conférences
M. JUNOT Stéphane Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
M. KECK Gérard Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur
M. KODJO Angeli Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
Mme LAABERKI Maria-Halima Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
Stagiaire M. LACHERETZ Antoine Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
Mme LAMBERT Véronique Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences Mme LE GRAND Dominique Unité pédagogique Pathologie du bétail Maître de conférences
Mme LEBLOND Agnès Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
Mme LEFRANC-POHL Anne-Cécile Unité pédagogique Equine Maître de conférences
M. LEPAGE Olivier Unité pédagogique Equine Professeur Mme LOUZIER Vanessa Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences
M. MARCHAL Thierry Unité pédagogique Pathologie morphologique et
clinique des animaux de compagnie Professeur
Mme MIALET Sylvie Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Inspecteur en santé
publique vétérinaire
(ISPV) Mme MICHAUD Audrey Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences
Stagiaire M. MOUNIER Luc Unité pédagogique Gestion des élevages Maître de conférences M. PEPIN Michel Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
M. PIN Didier Unité pédagogique Pathologie morphologique et
clinique des animaux de compagnie Maître de conférences
Mme PONCE Frédérique Unité pédagogique Pathologie médicale des
animaux de compagnie Maître de conférences
Mme PORTIER Karine Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
Mme POUZOT-NEVORET Céline Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
Stagiaire Mme PROUILLAC Caroline Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences Mme REMY Denise Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur
M. ROGER Thierry Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur
M. SABATIER Philippe Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Professeur M. SAWAYA Serge Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
Mme SEGARD Emilie Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
Contractuel Mme SERGENTET Delphine Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences
Mme SONET Juliette Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences
Contractuel M. THIEBAULT Jean-Jacques Unité pédagogique Biologie fonctionnelle Maître de conférences M. VIGUIER Eric Unité pédagogique Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur
Mme VIRIEUX-
WATRELOT Dorothée
Unité pédagogique Pathologie morphologique et
clinique des animaux de compagnie
Maître de conférences
Contractuel M. ZENNER Lionel Unité pédagogique Santé Publique et Vétérinaire Professeur
5
REMERCIEMENTS
A Monsieur le Professeur CHAYVIALLE Jean-Alain
De la faculté de Médecine de Lyon
Qui nous a fait l’honneur de présider notre jury de thèse
Hommages respectueux.
A Monsieur le Professeur ZENNER Lionel
De VetAgroSup, campus vétérinaire de Lyon
Pour m’avoir encadrée et conseillée dans la réalisation de cette thèse
Sincères remerciements.
A Madame le Docteur ARCANGIOLI Marie-Anne
De VetAgroSup, campus vétérinaire de Lyon
Pour son aide, ses conseils et pour avoir accepté de participer à notre jury de thèse.
Sincères remerciements.
A Madame POIREL Marie-Thérèse et aux membres de l’unité de Parasitologie de
VetAgroSUp
Pour son aide lors des manipulations et de la lecture des lames, sa disponibilité et sa
gentillesse.
Sincères remerciements.
Aux membres de l’unité de Pathologie du Bétail de VetAgroSup
Pour leur aide dans la réalisation de ce travail.
Sincères remerciements.
A Mademoiselle Jeanne CHANUDET
Qui a conduit son travail de thèse en parallèle du mien,
Aux laboratoires départementaux vétérinaires de France
Pour leur réponse qui nous ont aidés dans l’orientation de ce travail.
Sincères remerciements.
Aux éleveurs qui ont collaboré à la réalisation de ce travail
Pour votre disponibilité, votre accueil.
Sincères remerciements.
6
A mes parents,
Pour votre amour, votre soutien et votre confiance,
Pour avoir toujours été à l’écoute de mes problèmes,
Pour m’avoir toujours encouragé,
Je vous aime très fort
A ma grand-mère Aline,
Pour ton amour et ton soutien.
A ma grand-mère Jeanne,
Pour tout l’amour dont tu as su nous entourer,
Tu me manques chaque jour.
A ma sœur Isabelle, Pour le soutien apporté, pour les passions partagées,
Pour ce séjour à Paris et tous les moments partagés,
Pour les fous rires,
Merci.
A ma sœur Séverine,
Pour ton écoute, ta confiance, ta gentillesse,
Pour ta petite étincelle de folie qui me rend toujours le sourire,
Merci.
A mon frère Régis,
Pour tous les jeux partagés,
Pour toujours m’avoir ramené sur terre quand je me perdais en explications inutiles,
Pour m’avoir aidé et soutenu surtout dans la réalisation de cette thèse,
Merci
Et à Floriane, ma belle-sœur,
Pour ta présence, ton écoute
Pour toutes ces discussions, ces rires,
Merci
A mes nièces Lana, Maely et Louane,
Mes petites princesses,
Je vous aime très fort.
A mon parrain Pierre
Pour ton affection, ta présence et ton soutien toutes ces années,
Merci
A mes oncles et tantes, Pour votre affection, votre soutien,
Merci
A mes amis,
Pour votre soutien, et tous les bons moments passés ensembles
7
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES ......................................................................................................... 7
TABLE DES FIGURES ........................................................................................................... 15
TABLE DES TABLEAUX ...................................................................................................... 16
LISTE DES ABBREVIATIONS ............................................................................................. 17
INTRODUCTION :.................................................................................................................. 19
Partie 1 : Revue des différentes méthodes de coprologie........................................................ 21
I. Les parasites gastro-intestinaux recherchés chez les ruminants adultes ...................... 23
A. Les trématodes .......................................................................................................... 23
1. Fasciola hepatica ............................................................................................... 23
a) Espèces cibles ................................................................................................. 23
b) Cycle évolutif ................................................................................................. 23
c) Excrétion des œufs.......................................................................................... 24
d) Impact sur le diagnostic par coproscopie ....................................................... 24
2. Calicophoron daubneyi ...................................................................................... 24
a) Espèces cibles ................................................................................................. 24
b) Cycle évolutif ................................................................................................. 24
c) Excrétion des œufs.......................................................................................... 25
d) Impact sur le diagnostic par coproscopie ....................................................... 25
3. Dicrocoelium lanceolatum ................................................................................. 25
a) Espèces cibles ................................................................................................. 25
b) Cycle évolutif ................................................................................................. 25
c) Excrétion des œufs.......................................................................................... 26
d) Impact sur le diagnostic par coproscopie ....................................................... 26
8
B. Les nématodes .......................................................................................................... 26
1. Importance et répartition géographique ............................................................. 26
2. Etiologie ............................................................................................................. 27
a) Principales espèces ......................................................................................... 27
b) Cycle ............................................................................................................... 27
3. Excrétion des œufs et coproscopie ..................................................................... 28
a) Excrétion ......................................................................................................... 28
b) Aspect des œufs .............................................................................................. 28
C. Les protozoaires ....................................................................................................... 29
1. Les espèces d’Eimeria ........................................................................................ 29
2. Cycle ................................................................................................................... 29
3. Présentation en coproscopie ............................................................................... 29
II. Généralités sur la coprologie chez les ruminants ......................................................... 30
A. Objectifs et indications ............................................................................................. 30
1. La lutte antiparasitaire au sein des élevages ....................................................... 30
2. Développement des antiparasitaires ................................................................... 31
B. Matériel et prélèvement ............................................................................................ 31
1. Matériel .............................................................................................................. 31
2. Prélèvements ...................................................................................................... 32
a) Réalisation du prélèvement ............................................................................ 32
b) Conservation du prélèvement ......................................................................... 32
C. Coprologie qualitative/ coprologie quantitative ....................................................... 33
1. Appréciation qualitative ..................................................................................... 33
2. Appréciation quantitative ................................................................................... 34
3. Appréciation semi-quantitative .......................................................................... 35
9
III. Les méthodes de concentration. ............................................................................... 35
A. La concentration par sédimentation ......................................................................... 36
1. Méthode .............................................................................................................. 36
a) Historique ....................................................................................................... 36
a) Variation sur le liquide de dilution ................................................................. 37
b) Modification des temps de sédimentation ...................................................... 37
c) Etape supplémentaire ...................................................................................... 37
d) Modification du matériel ................................................................................ 37
2. Avantages ........................................................................................................... 38
3. Inconvénients ..................................................................................................... 38
B. La concentration diphasique ..................................................................................... 38
1. Principes physico-chimiques impliqués ............................................................. 38
2. Méthode .............................................................................................................. 39
a) Historique ....................................................................................................... 39
b) Variantes ......................................................................................................... 40
3. Avantages ........................................................................................................... 40
4. Inconvénients ..................................................................................................... 40
C. Concentration biologique ......................................................................................... 40
1. Matériel .............................................................................................................. 41
2. Technique ........................................................................................................... 41
3. Indications .......................................................................................................... 41
D. Concentration par flottation ..................................................................................... 42
1. Méthode .............................................................................................................. 42
a) Historique ....................................................................................................... 42
b) Variation sur l’examen ................................................................................... 43
10
c) Variation sur le temps ..................................................................................... 43
2. Les liquides de flottation .................................................................................... 43
a) Le chlorure de sodium .................................................................................... 44
b) Solution de saccharose .................................................................................... 44
c) Nitrate de sodium............................................................................................ 45
d) Le sulfate de zinc ............................................................................................ 45
e) Sulfate de magnésium ..................................................................................... 46
f) Iodomercurate de potassium ........................................................................... 47
g) Chlorure de zinc associé au chlorure de sodium ............................................ 48
h) Chlorure de calcium ........................................................................................ 48
i) Glycérine ........................................................................................................ 48
IV. Conclusion ................................................................................................................ 49
Partie 2 : Etude Expérimentale ................................................................................................. 51
I. Introduction .................................................................................................................. 53
II. Matériel et méthodes .................................................................................................... 53
A. Recueil de données et d’échantillons ....................................................................... 53
1. Prise de contact ................................................................................................... 53
a) Envoi des questionnaires ................................................................................ 53
b) Collecte des prélèvements .............................................................................. 53
2. Zones et période ................................................................................................. 54
a) Période de collecte .......................................................................................... 54
b) Zones .............................................................................................................. 54
3. Modalités de prélèvement .................................................................................. 54
B. Composition du questionnaire .................................................................................. 54
C. Réalisation des coproscopies .................................................................................... 55
11
1. Choix des liquides et préparation ....................................................................... 55
2. Technique de coproscopie .................................................................................. 55
a) Protocole de flottation .................................................................................... 55
b) Réalisation de gamme ..................................................................................... 56
3. Procédures expérimentales ................................................................................. 57
D. Analyses statistiques ................................................................................................ 57
III. Résultats ................................................................................................................... 58
A. Etude des données obtenues par le questionnaire .................................................... 58
1. Liquide de flottation ........................................................................................... 59
a) Quels liquides ? .............................................................................................. 59
b) Densité du liquide ........................................................................................... 59
c) Tarif ................................................................................................................ 60
2. Interprétation de la coproscopie ......................................................................... 61
3. Temps de manipulation ...................................................................................... 62
4. Mesures de protection ........................................................................................ 62
a) Port de protection individuelle ....................................................................... 62
b) Mesures d’évacuation des déchets .................................................................. 63
B. Résultats des expériences ......................................................................................... 65
1. Aspect qualitatif ................................................................................................. 65
a) Aspect des œufs .............................................................................................. 65
b) Facilité de lecture ............................................................................................ 68
2. Analyse statistique .............................................................................................. 69
a) Œufs de Calicophoron daubneyi .................................................................... 69
b) Œufs de strongles digestifs ............................................................................. 71
c) Oocystes d’Eimeria ........................................................................................ 73
12
3. Etude de la sensibilité des liquides ..................................................................... 75
a) Détection des éléments parasitaires les plus fréquents ................................... 75
b) Détection des œufs de Dicrocoelium lanceolatum ......................................... 76
4. Comparaison de deux densités pour le sulfate de zinc ....................................... 77
a) Facilité de lecture ............................................................................................ 78
b) Détection des éléments parasitaires ................................................................ 78
IV. Discussion ................................................................................................................ 79
A. But du travail ............................................................................................................ 79
B. Influence du liquide de flottation sur le résultat ....................................................... 80
1. Choix des liquides testés .................................................................................... 80
2. Comparaison des résultats .................................................................................. 81
a) Détection des œufs de trématodes .................................................................. 81
b) Détection des œufs de strongles digestifs ....................................................... 83
c) Les oocystes d’Eimeria .................................................................................. 83
C. Biais .......................................................................................................................... 84
1. Technique de flottation ....................................................................................... 84
2. Homogénéité de la technique ............................................................................. 85
3. Echantillonnage .................................................................................................. 85
4. Prélèvement ........................................................................................................ 86
CONCLUSION ........................................................................................................................ 89
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 91
Annexe 1 : Protocole de sédimentation d’après la méthode de Faust et Ingalls ...................... 97
Annexe 2 : Protocole de Concentration diphasique selon la méthode de Bailenger ................ 98
Annexe 3 : Protocole de flottation : méthode historique de Bass et Fülleborn ....................... 99
Annexe 4 : Protocole de flottation : Méthode de Janesko et Urbanyi .................................... 100
13
Annexe 5 : Protocole de flottation : méthode de Janesko-Urbanyi modifiée par Bailanger .. 101
Annexe 6 : Protocole de régénération du Iodomercurate de potassium ................................. 102
Annexe 7 : Protocole de flottation : méthode de Faust .......................................................... 103
Annexe 8 : Questionnaire ....................................................................................................... 104
Annexe 9 : Préparation des liquides de flottation .................................................................. 105
Annexe 10 : Protocole de coproscopie par flottation ............................................................. 106
Annexe 11 : Protocole de comptage en lame de Mc Master .................................................. 107
14
15
TABLE DES FIGURES
Figure 1 : Œufs de strongles digestifs .................................................................................................................... 28
Figure 2 : Cellule de Mac Master ........................................................................................................................... 34
Figure 3 : Schéma de la répartition des phases dans le tube après concentration ............................................... 39
Figure 4 : Dispositif de Baermann ......................................................................................................................... 41
Figure 5 : Carte des laboratoires ayant répondus ................................................................................................. 58
Figure 6 : Répartition des différents liquides de flottation dans les LVD ............................................................... 59
Figure 7 : Réponse concernant la densité du liquide ............................................................................................. 60
Figure 8 : Tarif d'une coproscopie simple .............................................................................................................. 61
Figure 9 : Utilisation de protection individuelle par les laboratoires usant du iodomercurate de potassium ....... 63
Figure 10: Laboratoires déclarant des mesures de gestion des déchets ............................................................... 65
Figure 11 : Œuf de Calicophoron daubneyi dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c)
sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium .......................................................... 66
Figure 12 : Œuf de strongles digestifs dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c)
sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium .......................................................... 66
Figure 13 : Oocystes d'Eimeria dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de
magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium ........................................................................... 67
Figure 14 : Œuf de Dicrocoelium lanceolatum dans les différents liquides : a) Saccharose, b) sulfate de
magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium ...................................................................... 67
Figure 15 : lame réalisée au sulfate de zinc .......................................................................................................... 68
Figure 16 : évolution de la cristallisation des lames de chlorure de sodium ......................................................... 68
Figure 17 : présentation de l'estimation des oeufs de Calicophoron daubneyi ..................................................... 70
Figure 18 : présentation des résultats des œufs de strongles digestifs ................................................................. 72
Figure 19 : présentation des résultats des oocystes d’Eimeria .............................................................................. 74
Figure 20 : observation de la dilution fécale dans les 2 solutions de sulfate de zinc ............................................. 78
16
TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1: Détection des œufs de Calicophoron daubneyi __________________________________________ 69
Tableau 2 : Détection des œufs de strongles digestifs ______________________________________________ 71
Tableau 3 : détection des oocystes d’Eimeria _____________________________________________________ 73
Tableau 4 : moyenne des comptages en lame de Mc Master ________________________________________ 75
Tableau 5 : résultat des comptages sur lamelle totale ______________________________________________ 75
Tableau 6 : comptages des œufs de Dicrocoelium lanceolatum ______________________________________ 76
Tableau 7: Comptage d'œufs de Dicrocoelium lanceolatum _________________________________________ 77
Tableau 8 : Comparaison du comptage des éléments parasitaires selon la densité du sulfate de zinc ________ 78
17
LISTE DES ABBREVIATIONS
LVD : laboratoires vétérinaires départementaux
OPG : œufs par gramme de fèces
18
19
INTRODUCTION :
Les affections parasitaires chez les ruminants ont deux impacts :
un impact sur la santé et le bien être des animaux comme dans tout autre espèce
un impact économique car un animal parasité va moins bien valoriser la ration qui
lui est apportée, et des organes peuvent être saisis lors de l’abattage.
De ce fait, la prévention du parasitisme est un enjeu majeur pour les élevages. Elle repose le
plus souvent sur la mise en place de traitement annuel ; cependant ces traitements restent
vains si on ne commence pas par une prévention sanitaire, passant par une bonne gestion des
pâtures et un bon diagnostic.
En parasitologie, un outil diagnostique rapide et simple est la coproscopie. Il en existe
diverses techniques qui seront évoquées en première partie de ce travail. Notre étude
s’intéressera particulièrement à la technique de coproscopie par flottation et aux différents
liquides qui peuvent être utilisés dans ce but. L’expérimentation permettra de déterminer la
sensibilité des liquides de flottation utilisés pour la détection de différents éléments
parasitaires dans les selles.
Les parasites ayant un impact majeur en matière d’économie et de santé chez les ruminants
sont ceux du système digestif et de ses annexes, nous orienterons donc la recherche sur ces
helminthes (à savoir les strongles digestifs, les douves, les trichures), et sur certains
protozoaires, les coccidies. Chacun de ces parasites présente des particularités dans son cycle
dont il est essentiel de tenir compte, tant dans l’éventualité d’un traitement que dans le
raisonnement conduisant à la réalisation d’un prélèvement en vue d’un examen
coproscopique.
En parallèle de cette étude sur le diagnostic des parasitoses des ruminants adultes, un travail
sur le diagnostic coproscopique des infestations par les protozoaires chez le veau a été réalisé
par Jeanne CHANUDET qui s’est intéressée aux colorations à réaliser pour faciliter ce
diagnostic.
20
21
Partie 1 : Revue des différentes
méthodes de coprologie
22
23
I. Les parasites gastro-intestinaux recherchés chez les ruminants
adultes
Les parasites du système digestif et de ses annexes, chez les ruminants, sont principalement
des helminthes et des protozoaires. Parmi les helminthes, on distingue des parasites de la
classe des trématodes et des nématodes.
Nous allons dans cette première partie présenter de façon succincte ces parasites en nous
concentrant surtout sur les particularités de leur cycle qui ont un impact sur leur diagnostic
par coproscopie.
A. Les trématodes
Il existe trois principales maladies dues à une infestation par des trématodes chez les
ruminants dans nos contrées :
- la fasciolose, due à la présence et au développement de Fasciola hepatica dans le
parenchyme hépatique puis dans les canaux biliaires des Ruminants.
- La dicrocoeliose, due à la présence et au développement dans les canaux biliaires des
Ruminants de Dicrocoelium lanceolatum
- La paramphistomose, due à la présence et au développement de Calicophoron
daubneyi dans le tube digestif des ruminants.
1. Fasciola hepatica
a) Espèces cibles
Il est important de noter que de nombreuses espèces sont affectées par Fasciola hepatica. Ce
parasite affecte les Ruminants mais aussi les Equidés et les Suidés bien que ces deux
dernières espèces soit moins sensibles (53).
Il peut également contaminer l’homme par la consommation de végétaux crus provenant de
milieux contaminés. L’expression clinique est plus fréquente chez l’homme que chez les
animaux (54).
b) Cycle évolutif
Ce parasite présente un cycle dixène avec pour hôte définitif les espèces cibles vues
précédemment et pour hôte intermédiaire une limnée : Galba truncatula. Les particularités du
cycle de ce parasite impliquent la présence d’eau en nature dans l’environnement pour que le
cycle s’accomplisse.
La période prépatente de ce parasite est de 3 mois et la phase exogène dure également 3 mois.
La présence de métacercaires dans le milieu extérieur est la plus importante au printemps et à
24
l’automne. Les formes immatures, libérées après ingestion des métacercaires, migrent depuis
l’intestin jusqu’au parenchyme hépatique puis dans les canaux biliaires.
Ces considérations globales sur le cycle sont surtout importantes dans le cadre d’une action
préventive de la fasciolose (9) mais ont aussi un impact important sur le diagnostic par
coproscopie.
c) Excrétion des œufs
Les œufs sont excrétés dans le milieu extérieur, dans les fèces, environ 3 mois après
l’infestation (période prépatente).
Ils sont de grande taille (80µm*140µm), operculés, ovoïdes et bruns à jaunâtres (7).
La ponte est peu abondante dans cette espèce et surtout intermittente dans le temps.
d) Impact sur le diagnostic par coproscopie
La longueur de la période prépatente fait que la présence des œufs dans les bouses sera
souvent tardive par rapport à un épisode clinique. En effet le plus souvent ce sont les stades
immatures qui sont à l’origine de la majorité des lésions, pendant leur migration depuis
l’intestin vers le parenchyme hépatique.
Ceci et le caractère faible et intermittent de la ponte tend à envisager le diagnostic
coproscopique essentiellement dans les cas de fasciolose chronique ou pour connaître le statut
de l’élevage dans le cadre d’un traitement global. En effet la présence d’un œuf sur une
coproscopie conduit à considérer l’infestation du cheptel dans sa globalité.
La dernière chose à prendre en considération est le fait que les œufs sont lourds et gros, ce qui
influence la réalisation de l’examen dans les diverses techniques de coproscopie.
2. Calicophoron daubneyi
a) Espèces cibles
Ce parasite a pour cible les différentes espèces de ruminants domestiques et sauvages.
b) Cycle évolutif
Ce parasite présente un cycle dixène proche de celui de Fasciola hepatica tant par la nécessité
de l’eau, la similarité des périodes prépatente et exogène et enfin par l’hôte intermédiaire qui
est là encore un mollusque amphibie.
25
Dans ce cas, les formes immatures se développent dans la sous-muqueuse de l’intestin grêle
ou de la caillette puis elles effectuent une migration rétrograde jusqu’au rumen ou au réseau
lors du passage à la forme adulte. Les adultes peuvent survivre plusieurs années dans les pré-
estomacs (2, 20).
c) Excrétion des œufs
Les œufs sont excrétés dans le milieu extérieur dans les fèces environ 3 mois après
l’infestation (période prépatente).
Les œufs sont également de grande taille (entre 120 et 180µm), operculés, avec une paroi fine
et lisse mais sont plutôt gris à verdâtres (7).
Contrairement à Fasciola, les adultes de Calicophoron daubneyi sont prolifiques, bien que la
ponte reste variable dans le temps.
d) Impact sur le diagnostic par coproscopie
La coproscopie n’aura pas d’intérêt lors de forme aiguë puisque comme dans le cas de
Fasciola ce sont les formes immatures qui sont à l’origine des lésions. Mais cet examen reste
intéressant pour connaître le statut de l’élevage dans le cadre d’un traitement global. En effet
la capacité de survie des adultes dans les pré-estomacs permet une accumulation d’année en
année des parasites en l’absence de traitement sans que des cas cliniques apparaissent
nécessairement. Un suivi par coproscopie de l’élevage permettra donc de déterminer la
nécessité d’un traitement.
Par ailleurs la ponte étant plus importante, la sensibilité de cet examen est plus élevée pour
Calicophoron daubneyi que pour Fasciola hepatica. Il est cependant important de conduire
un examen précis afin de ne pas risquer de confondre les œufs de ces 2 parasites très proches.
3. Dicrocoelium lanceolatum
a) Espèces cibles
Ce parasite peut infester tous les ruminants, et principalement les ovins (bien qu’on observe
de plus en plus de cas chez les bovins), et les autres herbivores.
b) Cycle évolutif
Ce parasite présente un cycle trixène avec pour hôte définitif les espèces cibles vu
précédemment et 2 hôtes intermédiaires : un escargot xérophile et la fourmi. Ce cycle n’a pas
besoin d’eau, et l’on retrouve d’ailleurs plus souvent ce parasite en zone sèche.
26
La période prépatente de ce parasite est de 2 mois et la phase exogène dure de 4 à 6 mois. Les
adultes peuvent survivre 2 à 5 ans chez les ovins. Les formes cliniques sont rares et plutôt
chroniques avec des symptômes peu spécifiques, la présence de lésions en elle-même peut
avoir un impact économique puisque les éleveurs sont sanctionnés sur le paiement des
animaux en cas de lésions hépatiques découvertes à l’abattoir.
c) Excrétion des œufs
Les œufs sont excrétés dans le milieu extérieur dans les fèces environ 2 mois après
l’infestation (période prépatente).
Ils sont de petite taille par rapport aux précédents trématodes étudiés (40µm) mais cela reste
des œufs lourds. Ils sont foncés et operculés et 2 masses germinatives rondes sont souvent
distinguables au microscope (7)
d) Impact sur le diagnostic par coproscopie
L’impact clinique de ce parasite se faisant plutôt sur le long terme avec accumulation des
parasites, il a été défini un seuil d’infestation au-delà duquel il est considéré comme essentiel
de traiter. Ce seuil est à 300 opg pour les ovins et 30 à 40 opg pour les bovins (3).
Cependant l’excrétion est très variable dans le temps et parfois faible, ce qui diminue la
sensibilité diagnostique de cet examen. On conseille donc de réaliser des prélèvements sur
plusieurs animaux, étalés dans le temps (49).
B. Les nématodes
Les principaux nématodes ayant un impact pathogène au niveau digestif chez les ruminants
adultes appartiennent à l’ordre des Strongylida.
1. Importance et répartition géographique
Les strongles sont des parasites que l’on retrouve dans chaque espèce de ruminants dés le
moment où les animaux pâturent. Ils affectent également les ruminants sauvages. Enfin ils
sont cosmopolites.
Leur impact sur la santé des animaux est surtout présent chez les jeunes animaux (première ou
deuxième saison de pâture), les animaux plus âgés développant avec le temps une certaine
immunité face à ces parasites (11). L’impact économique est cependant majeur, les
27
strongyloses entraînent en effet des pertes de production importantes en qualité et quantité
tant dans les cheptels allaitants que laitiers (22).
2. Etiologie
a) Principales espèces
Parmi cet ordre, nous avons 5 espèces d’importance majeure avec des localisations différentes
au sein du tube digestif.
- Parasites de la caillette :
Le principal parasite de la caillette est chez les bovins Ostertagia ostertagi, chez les ovins et
caprins Teladorsagia circumcincta. Chez les bovins, Ostertagia ostertagi représente environ
90% des strongles digestifs.
- Parasites de l’intestin grêle :
Le genre des Trichostrongylus est d’importance majeure chez les ovins et caprins et est non
négligeable chez les bovins. Nous noterons qu’il est cependant plus commun chez les bovins
de trouver des strongles des genres Cooperia et Nematodirus au niveau de l’intestin grêle.
- Gros intestin :
Au niveau du gros intestin, chez toutes les espèces de ruminants on retrouve essentiellement
les strongles du genre Oesophagostomum.
b) Cycle
Ce sont des parasites monoxènes dont l’hôte définitif est un ruminant, ils peuvent
éventuellement avoir un hôte facultatif qui assure leur conservation dans le milieu extérieur.
Le parasite connaît 5 stades évolutifs entre l’œuf et l’adulte. L’excrétion des œufs se fait dans
les fèces, une fois dans le milieu extérieur, il connait 3 évolutions et c’est le troisième stade
larvaire qui est infestant. La phase exogène est variable selon les conditions climatiques
(exemple pour Ostertagia : 3 à 10 jours à 22°C, 3 à 4 semaines à 12-15°C).Une fois ingérée la
larve 3 évolue au stade larve 4.
Pour certains parasites (Ostertagia et Oesophagostumum) on peut à ce stade avoir une phase
d’hypobiose, dans la paroi de l’organe cible, suite aux réactions immunitaires de l’hôte qui
bloquent les parasite au stade larvaire 4(11, 27). Sinon ils continuent leur évolution en stade 5
puis adulte. La période prépatente sans hypobiose est de 3 semaines en moyenne.
28
Dans le cas d’ostertagiose, les larves entrées en hypobiose ont tendance à émerger de façon
massive en fin d’hiver ou début de printemps ce qui entraîne de nombreuses lésions et une
présentation clinique dénommée Ostartagiose de type 2.
3. Excrétion des œufs et coproscopie
a) Excrétion
Il faut noter que l’excrétion des œufs est limitée par l’immunité de l’hôte (4, 11, 21), ce sont
donc les jeunes animaux qui excréteront le plus d’œufs et seront à l’origine des pâtures les
plus contaminées. L’excrétion est maximale chez les animaux primo-infestés et quasi nulle
chez les animaux plus âgés.
Au printemps, les animaux se contaminent grâce aux larves 3 résiduelles dans la pâture (qui
sont d’autant plus présentes que le climat hivernal a été humide sans être trop froid), et ré-
infestent peu à peu la pâture, ce qui conduit à une contamination plus importante des pâtures
et donc des animaux. Cela conduit à une excrétion maximale d’œufs par les animaux en été.
b) Aspect des œufs
Nous n’avons pas particulièrement insisté sur les particularités des différentes espèces de
strongles digestifs essentiellement en raison de l’impossibilité de les distinguer à partir des
œufs.
En effet les œufs de strongles ont tous le même aspect excepté ceux du genre Nematodirus
(fig.1).
Figure 1 : Œufs de strongles digestifs
Nématodirus
Autres strongles
29
Leur contenu est granuleux, gris et leur taille va de 40µm à 100µm. Pour les différencier il
convient de réaliser une coproculture (34).
Pour la coproscopie, on réalisera de préférence un examen individuel et en saison de pâture.
C. Les protozoaires
Les protozoaires chez les ruminants occasionnent une clinique aiguë plutôt chez les jeunes
(veaux, agneaux, chevreaux) (12, 43, 53), parmi les pathogènes on rencontre dans ce cas
différents genres : Eimeria, Cryptosporidium et Giardia. Cet aspect de la parasitologie des
ruminants chez les jeunes et de son diagnostic est abordé par Jeanne CHANUDET dans un
travail de thèse conduit en parallèle de celui-ci.
Cependant la présence d’Eimeria chez les ruminants adultes, et particulièrement chez des
bovins de plus de 6 mois, peut conduire à une spoliation importante responsable d’un mauvais
aspect général des individus (poil piqué, croissance faible) et ce genre de protozoaires est
facile à distinguer en coproscopie simple.
1. Les espèces d’Eimeria
Il existe 13 espèces d’Eimeria chez les bovins dont 3 sont pathogènes :
- Eimeria bovis : localisée au niveau du colon et du rectum
- Eimeria zuernii : même localisation
- Eimeria alabamensis : localisée au niveau de l’intestin grêle.
2. Cycle
Les Eimeria sont des parasites monoxènes, ils se développent dans les cellules épithéliales des
organes digestifs. Les oocystes sont les formes excrétées qui vont subir dans le milieu
extérieur une sporulation si les conditions de température, d’humidité et d’oxygène sont
favorables, ils présentent alors 4 sporocystes renfermant chacun 2 sporozoïtes.
3. Présentation en coproscopie
Les oocystes font quelques µm. Si l’examen est réalisé rapidement après le prélèvement, les
oocystes ne seront pas sporulés, ils apparaîtront alors avec une morula. La taille et la forme
peut permettre l’identification de l’espèce. Si les conditions de sporulation ont été
rencontrées, la disposition des sporocystes et le nombre de sporogonies sont également des
éléments de diagnose.
30
II. Généralités sur la coprologie chez les ruminants
La coproscopie est la méthode de base du diagnostic en parasitologie. Elle permet de détecter
(et éventuellement compter) les éléments parasitaires excrétés dans les fèces par les parasites
du tube digestif.
A. Objectifs et indications
1. La lutte antiparasitaire au sein des élevages
Comme nous l’avons signalé en introduction le parasitisme des ruminants et la lutte
antiparasitaire associée ont un impact majeur en terme économique dans les élevages (8,11,
55) :
Un animal parasité ne profite pas de sa ration alimentaire complètement. On a, par
ce biais, un gaspillage d’aliment puisque pour atteindre un même poids l’animal
parasité aura besoin de plus d’aliment.
Au niveau clinique, selon l’âge et le degré d’infestation de l’individu, on verra une
expression clinique aiguë à chronique qui entraînera une altération de l’état général
de l’animal. Les soins vétérinaires nécessaires au soutien puis au rétablissement de
l’animal ont une importance mais l’impact majeur va être le temps et l’aliment
nécessaire à la remise en état de l’animal. Dans certains cas on arrive à une perte
de l’animal car les traitements de support et antiparasitaire sont trop tardifs.
Le traitement antiparasitaire est globalement dans les élevages une constante du
budget puisque les traitements sont effectués de façon systématique pour les
strongyloses digestives, pour la fasciolose et de plus en plus souvent pour la
paramphistomose.
On a une perte de revenu lors de la vente de l’animal puisqu’il sera de poids
moindre que ce que l’on pourrait espérer.
Certaines infestations parasitaires se traduisent par une altération des organes et
entraînent une saisie lors de l’abattage (exemple de Fasciola Hepatica dont les
lésions entraînent une saisie du foie) avec diminution du paiement de l’animal dans
certains cas.
Dans les publications la coproscopie est souvent indiquée dans le cadre d’une médecine
individuelle. C’est un examen rapide que le vétérinaire peut réaliser au sein de son cabinet s’il
possède un minimum de matériel et d’expérience. En matière de médecine de population de
nombreuses techniques alternatives ont été développées au cours des années notamment en
élevage laitier où il existe une sérologie sur lait de tank qui permet d’évaluer le statut
parasitaire d’un troupeau.
31
La coproscopie peut être un examen de groupe mais il faut être particulièrement logique dans
le choix des groupes lors des prélèvements : communauté de pâture, âge. Il est aussi
intéressant de raisonner le moment du prélèvement lors d’un suivi (animaux en cours de
pâture pour les strongyloses, réflexion par rapport aux périodes prépatentes pour les
trématodoses).
La réalisation de ces analyses de suivi peut permettre de dresser un plan parasitaire de
l’élevage et en particulier de pouvoir détecter des pâtures à parasitisme plus ou moins
prononcé et assurer ainsi une rotation raisonnée des pâturages qui est une part importante de
la lutte antiparasitaire (35,40).
2. Développement des antiparasitaires
Dans un premier temps, nous pouvons noter que les études conduites pour connaître
l’efficacité d’une molécule antiparasitaire font appel à la coproscopie pour connaitre
l’infestation des animaux avant traitement et estimer l’efficacité du traitement après (25). La
coproscopie est en effet dans ce cas la technique la plus intéressante bien que les résultats
puissent être difficiles à bien interpréter dans le cas des trématodoses en raison de la longueur
de la période prépatente comme l’ont souligné Grimshaw et al (30).
Il existe des techniques diagnostiques reposant sur les réactions immunitaires développées par
l’hôte lors d’une interaction avec les parasites (51). Il est possible de réaliser des sérologies
sur sang ou dans le cas d’élevage laitier sur lait de tank. Bien que le coût d’une sérologie ne
soit pas un facteur limitant face à la coproscopie, elle ne présente aucun intérêt pour contrôler
l’efficacité d’un traitement puisque la réponse immunitaire peut mettre jusqu’à plusieurs mois
avant de diminuer suite à une infestation.
On peut de plus souligner l’importance d’un contrôle du statut parasitaire des élevages face à
la systématisation des traitements et au développement de résistance des parasites face à
certains antiparasitaires dans une période où le nombre de molécules autorisées dans le
traitement d’animaux de production est de plus en plus faible, et où le public souhaite
consommer des produits les plus naturels possibles ce qui, dans le cas des viandes, implique
le moins de traitement possible (55).
B. Matériel et prélèvement
1. Matériel
La coproscopie nécessite un matériel assez simple ce qui en fait un examen réalisable en
cabinet (1, 7).
Il faut le matériel nécessaire au mélange et à la dilution des fèces : mortier, pilon, verres à
pied, pipettes, agitateur, tubes à essai et tamis.
32
Il est intéressant de posséder une centrifugeuse pour accélérer les manipulations et il faut
enfin le matériel pour l’observation : un microscope avec objectif *4, *10, *100 et objectif à
immersion ainsi que les lames et lamelles associées.
Selon la technique d’examen envisagée, du matériel supplémentaire pourra être nécessaire.
(Voir paragraphe C.)
2. Prélèvements
a) Réalisation du prélèvement
Les prélèvements doivent être réalisés dans le rectum des animaux ou juste après l’émission
pour limiter les contaminations par le milieu extérieur (nématodes libres ou larves de diptère
par exemple). Ils sont la plupart du temps obtenus lors d’une palpation transrectale et donc
conditionnés dans le gant de fouille retourné et noué.
Selon le but de l’examen coproscopique, on peut envisager de réaliser un prélèvement à partir
de bouses de différents animaux. Il faut alors veiller à réaliser des lots selon la recherche
envisagé : animaux de même âge, de statut semblable et de pâture commune.
b) Conservation du prélèvement
Comme nous l’avons dit précédemment le prélèvement est souvent conditionné dans un gant
en plastique. Ceci peut être suffisant si l’examen est réalisé au sein du cabinet vétérinaire.
Cependant s’il est nécessaire de faire parvenir le prélèvement à un laboratoire, il est
nécessaire de prendre quelques précautions. Il faut veiller à ce que l’emballage contenant le
prélèvement ne soit pas imbibé par le prélèvement, pour cela on peut soit reconditionner le
prélèvement dans un tube fermé hermétiquement (vissé de préférence) soit entourer le
prélèvement de film plastique.
Il faut par ailleurs veiller à ce que les commémoratifs, accompagnants tout prélèvement lors
d’envoi dans un laboratoire, ne soient en aucun cas détériorés avant l’arrivée au laboratoire.
Il est important que l’examen soit réalisé dans un temps limité après l’émission du
prélèvement afin de limiter l’évolution des éléments parasitaires, qui rendrait leur diagnose
plus difficile, mais dans le cas où l’examen serait différé il est essentiel de préserver le
prélèvement dans des conditions optimales.
Il existe des modes de conservation qui permettent de ralentir l’évolution des éléments
parasitaires. Il est possible de conserver le prélèvement à température basse, ainsi la
réfrigération ralentit l’évolution de façon réversible (2°C à 8°C) et permet de conserver un
prélèvement jusqu’à une semaine.
33
On peut également congeler les prélèvements mais cela peut détruire des éléments parasitaires
ou enfin on peut les diluer dans de l’eau formolée à 8% (7).
C. Coprologie qualitative/ coprologie quantitative
La présence d’œufs de parasites au sein d’un prélèvement de fèces n’est pas interprétable sans
les données cliniques et épidémiologiques associées.
Nous avons vu dans la première partie de ce travail que tous les parasites n’excrètent pas de
façon similaire, ainsi la présence d’un seul œuf de Fasciola sur une lame examinée au
microscope n’a pas la même signification que la présence d’un seul œuf de strongles. Les
strongles présentent effectivement une excrétion proliférative et sont des parasites
cosmopolites. Il est donc usuel de rencontrer des œufs de strongles sur un examen
coprologique. Ceci conduit à réfléchir sur la façon d’interpréter la présence d’œufs dans un
prélèvement et sur la façon d’apprécier leur nombre (1, 11).
1. Appréciation qualitative
Si l’on réalise une coproscopie qualitative, on cherche simplement la présence des œufs de
parasites en identifiant au mieux le parasite. Cette technique est considérée comme suffisante
dans le cas de Fasciola Hepatica et de Dicrocoelium lanceolatum (3, 8). Ces parasites
présentant une excrétion limitée et intermittente, la présence d’un œuf est synonyme
d’infestation de l’animal et, souvent, on étend cette infestation à l’élevage.
En ce qui concerne les œufs de strongles et les oocystes de coccidies rencontrés, il est difficile
de se fier à une simple appréciation qualitative puisque ce sont des parasites cosmopolites et
prolifératifs.
Parallèlement, l’absence d’œuf au niveau de l’examen n’est dans le cas d’aucun parasite la
preuve de l’absence d’infestation. En effet si l’on considère la production de bouse d’un bovin
par jour, le fait que l’on effectue un prélèvement ponctuel de quelques grammes et que sur ce
prélèvement environ 5g soient examinés (après homogénéisation), on peut envisager ne pas
avoir d’œufs dans l’échantillon examiné malgré une infestation de l’animal.
L’appréciation qualitative présente un intérêt limité du point de vue de son interprétation
finale c’est pourquoi elle est souvent associée à une technique quantitative ou au moins semi-
quantitative que nous allons maintenant envisager.
34
2. Appréciation quantitative
La technique de coproscopie quantitative permet de déterminer le nombre d’œufs présents par
gramme de fèces d’un prélèvement. Elle fait appel à un matériel supplémentaire : la cellule de
Mac Master et repose sur une dilution systématique des matières fécales (celle à 1/15ème
étant
la plus fréquemment rencontrée) (32).
Figure 2 : Cellule de Mac Master
Elle est le plus souvent employée avec une concentration par flottation. On dépose 0.5ml du
liquide obtenu par la dilution des selles dans le liquide de flottation dans chaque chambre de
la cellule (fig.2).
Les œufs viennent se coller sous le verre supérieur et sont alors dénombrés dans chaque
colonne de chaque chambre.
Le nombre d’œufs par gramme de fèces est donné par la formule :
[(n1+n2)/2]*100
n1 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 1
n2 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 2
Cette méthode s’avère intéressante pour évaluer les infestations d’autant plus que certains
auteurs dont Mage et Dorchies (41) pensent qu’il est possible de mettre en relation le nombre
d’œufs comptés avec le niveau d’infestation (bien qu’aucune relation mathématique n’ait été
proposée). Cependant pour des œufs de faible niveau d’excrétion, la lecture en Mac Master
limite la détection des œufs.
7.5cm
1cm 1.8cm
Epaisseur sous
chambre : 0.15cm
Volume sous
grille : 0.15ml
Volume
chambre : 0.5ml
Chambre
35
Il faut noter qu’il est important de procéder en parallèle à l’examen d’une lame obtenu par
flottation car en cas d’absence d’œufs sur la cellule de Mac Master, il est intéressant de
réaliser un contrôle sur la lame simple puisque le seuil de dénombrement est de 50opg avec
cette dilution.
C’est donc une méthode qui demande du temps et un matériel supplémentaire. Une bonne
alternative entre les 2 méthodes exposées consiste en la réalisation d’un examen semi-
quantitatif.
3. Appréciation semi-quantitative
Un comptage est réalisé sur la lame simple de coproscopie après concentration et permet
d’évaluer l’importance de l’infestation. A cet effet on définit des seuils de comptage qui
permettent l’évaluation de l’infestation avec une estimation non par gramme mais par 5
grammes de fèces (quantité généralement utilisée dans la méthode de concentration). Cette
estimation s’avère souvent suffisante en parasitologie des ruminants.
A titre d’exemple nous allons ici exposer les seuils utilisés au sein de l’unité de Parasitologie
du campus vétérinaire de VetAgroSup :
Présence : moins de 10 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
+ : de 10 à 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
++ : de 100 à 200 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
+++ : de 200 à 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
++++ : plus de 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
Maintenant que nous avons vu le matériel nécessaire à l’examen et les méthodes nécessaires à
l’interprétation, nous allons détailler les différents procédés visant à concentrer les éléments
parasitaires.
III. Les méthodes de concentration.
L’examen direct d’une goutte de fèces diluée peut permettre dans certains cas l’observation
d’éléments parasitaires. Cependant comme nous l’avons vu dans le paragraphe sur la méthode
qualitative de coproscopie, cet examen ne se fait que sur une portion réduite de fèces qui
contient, en plus des éléments parasitaires, de nombreux autres composants. Dans le cas des
ruminants, nous avons notamment à faire face à de nombreux débris végétaux digérés ou non
(pollens, spores, herbe), en plus de cellules mortes. Il s’avère donc nécessaire, afin d’avoir
une bonne sensibilité de cet examen, de concentrer les éléments parasitaires afin de pouvoir
en observer un nombre maximum au microscope.
36
Différentes méthodes de concentration ont été proposées au cours des années, et nous allons
voir dans cette partie ces diverses techniques et leurs intérêts.
Les méthodes de concentration font appel à deux phénomènes physico-chimiques :
la densité relative des éléments parasitaires par rapport à celle du réactif de
dilution,
l’équilibre hydrophile-lipophile des éléments parasitaires lesquels tendent à flotter
lorsque leur lipophilie prédomine ou à sédimenter si c’est leur hydrophilie qui est
dominante.
Ces deux forces sont des caractères spécifiques pour chaque parasite mais elles peuvent être
modifiées par les caractéristiques du liquide (pH) ou par une réaction entre les groupements
de la surface des œufs et les constituants du réactif (métaux lourds).
Les méthodes exposées par la suite peuvent être combinées pour éliminer un plus grand
nombre de débris.
A. La concentration par sédimentation
Le principe est de réaliser une dilution des selles dans une solution aqueuse de densité faible.
Les parasites se déposent, les particules alimentaires non digérées et les cadavres microbiens
surnagent ou restent en suspension. La concentration est facilitée par l’hydrophilie des
éléments parasitaires. Cette technique présente l’avantage de partir d’une masse volumineuse
de selle et d’être simple avec l’utilisation d’un matériel basique. Cependant c’est une
technique longue, demandant de nombreuses manipulations.
1. Méthode
a) Historique
La méthode de sédimentation est basée sur la méthode décrite par Faust et Ingalls en 1946
citée par Bailenger (5) qui utilise une solution aqueuse de glycérine à 0.5% comme diluant,
elle est décrite dans l’annexe 1.
Cette méthode est déjà en elle-même une variante de la méthode primitive de Faust qui
utilisait simplement de l’eau du robinet comme liquide de dilution.
Les manipulations sont longues puisqu’il faut laisser 3 fois le temps de sédimenter qui est de
30 à 45 minutes.
37
De nombreuses autres variantes de cette méthode ont été proposées impliquant soit un autre
liquide de dilution soit un protocole différent. Ces différentes variantes sont proposées dans le
but d’améliorer la détection des œufs de parasites.
a) Variation sur le liquide de dilution
En 1947, Jahnes et Hodges proposent une variante de la méthode sédimentation de Faust et
Ingalls (5), basée sur la constatation que l’alcool éthylique à 10% offre un rendement deux
fois supérieur à l’eau glycérinée dans la détection des œufs de Schistosome. Les œufs ne sont
pas endommagés par le liquide et peuvent éclore par addition de quelques gouttes d’eau au
sédiment.
En 1956, Euzéby propose une variante en utilisant de l’eau additionnée de détergent (teepol,
1%) pour réaliser la sédimentation (cité par Bailenger (1)).
b) Modification des temps de sédimentation
Happish et Boray diminuent les temps de manipulation par l’utilisation d’une trompe à vide
pour éliminer le surnageant après chaque sédimentation (31). Chaque sédimentation dure 3
minutes.
Barrody et Most (cité par Bailenger (5)) décrivent cette technique avec pour réactif de l’eau
ordinaire à 40°C. Les centrifugations se font pendant 30 secondes à 1500 tours/mn. Après
chaque centrifugation, le surnageant est rejeté et remplacé par le réactif, les centrifugations
sont répétées jusqu’à ce que le surnageant soit clair (généralement 2 à 3 centrifugations
suffisent).
c) Etape supplémentaire
Boray et Pearson (cité par Happish et Boray (31)) proposent après une sédimentation avec de
l’eau d’ajouter une étape de coloration au bleu de méthylène du culot avant l’examen au
microscope. Cette coloration permet de faire ressortir les œufs non colorés parmi les débris
(colorés)
d) Modification du matériel
Nous pouvons noter parmi les variantes utilisant un matériel différent celle de Happich et
Boray (31) qui fait intervenir une trompe à eau pour évacuer le surnageant par vide ou la
technique de sédimentation en longs tubes de verre de Grégoire et al (citée par Raynaud (46)).
Cette méthode fait intervenir une colonne de verre de 2.10m de hauteur et de 1cm de diamètre
intérieur qui est fixée verticalement par trois supports à pinces à un mur, un robinet de verre
rectiligne (ouverture de 3mm, rétréci à 2mm à son ouverture inférieure). Les deux composants
sont réunis par un joint de caoutchouc.
38
2. Avantages
L’avantage de cette technique est de demander un matériel simple et peu coûteux ce qui en
fait un examen facile à réaliser en pratique courante. La plupart des techniques ont été
adaptées à la réalisation de coproscopie quantitative.
Chaque variante est faite en vue d’améliorer la technique. La variante de Jahnes et Hodges a
été adopté pour ces résultats favorables dans la recherche des œufs de schistosomes.
Le raccourcissement des temps de sédimentation permet à ces techniques d’être plus
facilement utilisable en routine.
Le rajout de l’étape de coloration permet une distinction plus facile des œufs, en particulier
ceux de Fasciola hepatica et de Calicophoron daubneyi.
L’utilisation d’un matériel précis permet d’améliorer la sensibilité et la rentabilité de la
technique de sédimentation, qui en général ne permet de détecter que 50% des éléments
parasitaires (46). Les variantes de Happish et Boray et de Grégoire et coll sont décrites
comme spécifiques du diagnostic des infestations par Fasciola hepatica par Raynaud (46).
3. Inconvénients
Le principal inconvénient de la méthode de base était le temps de manipulation très long qui
différait donc le résultat de l’analyse. Cependant les modifications apportées qui permettent
de diminuer les temps de manipulation ont tendance à faire appel à un matériel
supplémentaire. Dans le cas de la sédimentation en tube long, le principal obstacle à sa
réalisation est la complexité du dispositif (inutilisé de nos jours pour ce qui concerne la
méthode de Grégoire).
Enfin cette méthode efficace pour concentrer les gros œufs se révèle de faible rendement dans
la concentration des œufs de nématodes et de protozoaires.
B. La concentration diphasique
1. Principes physico-chimiques impliqués
La concentration diphasique fait intervenir 3 phénomènes dont l’essentiel est la mise en
présence de 2 phases non miscibles (aqueuse et lipophile) ce qui crée, pour chacune des
particules fécales (parasites, débris alimentaires, microbes), un coefficient de partage leur
permettant de s’orienter en fonction de leur équilibre hydrophile-lipophile. Il en résulte une
élimination des éléments à prédominance lipophile et par conséquent, une concentration des
particules à tendance hydrophile.
39
Le second principe envisagé est l’action dissolvante des réactifs qui supprime certains des
constituants fécaux.
Enfin comme dans toutes les méthodes de concentration envisagées, la densité des œufs joue
également un rôle important pour connaître la phase intéressante.
Cette méthode permet donc de concentrer les éléments parasitaires dans le culot de
sédimentation en favorisant leur hydrophilie. On a ainsi pu étudier l’influence de facteurs
susceptibles d’accroître cette hydrophilie, ce qui a autorisé des modifications raisonnées de la
méthode de base.
2. Méthode
a) Historique
La méthode de base évoquant le principe de concentration diphasique a été mis au point par
Telemann en 1908 (cité par Bailenger (5)). Il s’agit de délayer les selles avec un mélange
composé à parties égales d’éther et d’acide chlorhydrique concentré puis à tamiser l’émulsion
fécale et enfin à centrifuger. Les éléments parasitaires sont concentrés dans le sédiment. La
méthode de base présente de nombreux désagréments : les vapeurs lors de la manipulation
d’acide chlorhydrique concentré, les altérations que le réactif fait subir aux kystes et à certains
œufs.
Le protocole présenté en annexe 2 dérive de la méthode de Telemann et a été proposé par
Bailenger (5).
Figure 3 : Schéma de la répartition des phases dans le tube après concentration
La récupération du sédiment nécessite l’élimination des 3 phases supérieures (fig.3). Le cas
de la seconde phase est particulier. Ce sont les débris qui forment un anneau qu’il faut
décoller de la paroi pour l’éliminer.
40
b) Variantes
En 1955, Blagg et coll (cité par Bailenger (5)) ont proposé une méthode reposant de sur
l’emploi du réactif de Sapero et Lawless avec l’éther. Ce réactif est composé à partir d’une
solution de lugol fraiche et d’une solution nommée solution M.F. (composée de teinture de
merthiolate, de formol et de glycérine).
De nombreux autres protocoles ont été proposés avec des réactifs différents mais des
manipulations semblables. Nous nous attarderons cependant sur la technique proposée par
Bailenger (5).
Des expériences ont été conduites déterminant l’influence du pH sur la concentration des
œufs. Il a ainsi été déterminé que la valeur de pH permettant la meilleure concentration
d’éléments parasitaires (même si elle n’est pas la meilleure pour tous les œufs) est 5 ce qui a
conduit au protocole proposé en annexe 2 avec pour réactif un tampon acéto-acétique ajusté à
pH 5 et l’éther.
3. Avantages
Globalement, les auteurs décrivent les méthodes de concentration diphasique comme simples
et rapides (26). Cette technique est également favorable à la concentration des œufs lourds et
les variantes proposées ont cherché à augmenter la concentration des œufs (recherche d’un pH
optimal par Bailenger) ou à se séparer de composants potentiellement toxiques comme l’acide
chlorhydrique utilisé dans la méthode de Telemann et dont les vapeurs sont déconseillées tant
pour le technicien que pour le matériel de laboratoire.
4. Inconvénients
Cette méthode est peu intéressante dans la recherche d’oocystes de protozoaires ou de petits
œufs d’helminthes soit par une mauvaise concentration soit par la difficulté à repérer ces
éléments parasitaires de petite taille au sein du sédiment.
Excepté la variante proposée par Bailenger, toutes les autres méthodes polyvalentes proposent
d’utiliser des réactifs qui, sans pour autant faciliter la concentration des éléments parasitaires,
peuvent présenter un potentiel nocif : solution M.F. pour Blagg et coll, formol pour Ritchie.
C. Concentration biologique
La méthode de concentration biologique s’intéresse non aux œufs des helminthes mais à leurs
larves. En effet il est possible dans le cas où l’examen coproscopique a été fortement différé
du prélèvement ou dans de mauvaises conditions de conservation du prélèvement, que les
œufs de Nématodes se soient développés et que seules les larves demeurent dans le
prélèvement (10).
41
Ces larves ne sont pas concentrées en général par les méthodes habituelles, ce qui a conduit à
développer une technique de concentration des larves reposant sur leur hygrotropisme et leur
thermotropisme.
1. Matériel
Figure 4 : Dispositif de Baermann
Le matériel utilisé est simple et courant (fig.4) : entonnoir, tamis, gaze, verre à pied. Le
liquide utilisé est de l’eau tiède.
2. Technique
On dispose une gaze dans un tamis métallique que l’on dépose sur un entonnoir relié à une
tubulure en caoutchouc.
On verse de l’eau tiède jusqu’à atteindre un niveau correspondant à la partie inférieure du
tamis.
On dépose les selles dans la gaze. On laisse décanter pendant 1 à 2 heures puis on examine le
filtrat.
3. Indications
Cette technique est utilisée dans la détection des larves de strongles respiratoires chez les
bovins (42).
Tamis +
gaze entonnoir
Verre à
pied
tubulure
42
Elle est, comme nous l’avons dit en introduction, indiquée en cas d’absence d’œufs de
strongles sur une lame obtenue par les autres techniques de concentration et dans le cas d’un
problème de conservation du prélèvement.
Cette technique est globalement à réaliser en complément de la coproscopie simple afin de
confirmer les résultats obtenus. En cas de mauvaise conservation d’un prélèvement, la
réalisation d’une concentration biologique permet d’augmenter de façon importante la
sensibilité de l’examen coproscopique.
D. Concentration par flottation
Cette technique consiste à effectuer une dilution fécale avec un liquide plus dense que les
éléments parasitaires qui surnagent alors. Leur concentration dans le film superficiel est
conditionnée par leur densité inférieure à celle du réactif ainsi que par une prédominance de
leur lipophilie. C’est une technique simple, qui demande peu de matériel et qui permet une
réalisation d’examens en série. Cependant cette méthode est contre-indiquée dans le cas de
selles riches en lipides ou huiles minérales et si l’on recherche des larves ou des kystes de
protozoaires car ils seraient déformés par les réactifs qui sont hypertoniques.
Il existe de nombreuses techniques autant que de réactifs qui seront présentées dans ce
paragraphe.
1. Méthode
a) Historique
La méthode historique est la méthode de Bass et Fülleborn présentée en annexe 3 (cité par
Bailenger (5)).
Le liquide de flottation utilisé est une solution de chlorure de sodium saturée de densité 1.20.
L’examen se réalise après un repos de 45 minutes environ et nécessite de réaliser un
prélèvement de la surface de la dilution fécale.
Cette méthode est, d’après Bailenger, indiquée pour la recherche d’œufs d’Ankylostomes et
d’ascaris. Des études conduites chez les ruminants en particulier ont montré la sensibilité de
ce liquide dans la détection des oocystes de coccidies et des œufs de strongles digestifs.
Toutefois l’utilisation de ce liquide est déclarée contre-indiquée en cas de suspicion de
fasciolose.
De nombreuses variantes de cette technique ont été mises au point au cours des années tant
par la modification du liquide utilisé que par la méthode de lecture associée. La diversité des
43
liquides utilisés ne reflète pas tant la faiblesse diagnostique des liquides que la diversité des
méthodes laboratoires. En effet bien que certains liquides comme nous le verrons plus tard
semblent avoir des possibilités diagnostiques plus élevées que d’autres, le choix du liquide de
flottation utilisé est souvent le reflet d’une habitude et d’une facilité de travail.
b) Variation sur l’examen
Une première variante de la méthode précédente est proposée par Willis en 1921 (cité par
Bailenger (5)).
L’auteur propose effectivement de profiter de l’adhérence des éléments parasitaires au verre
pour les collecter. Concrètement il verse la dilution fécale, après tamisage, dans un tube
cylindrique jusqu’à obtention d’un ménisque. A la surface du tube il dépose une lame (ou
lamelle) dégraissée qui sera ensuite examinée au microscope.
Il est également possible d’envisager un examen quantitatif en lame de Mac Master.
c) Variation sur le temps
Le temps de réalisation de cette méthode peut être raccourci en considérant deux points :
- On considère qu’en pratique 20 minutes suffisent pour que les œufs remontent dans la
suspension
- Il est possible de réaliser une centrifugation après le tamisage à 2000 tours/minute
pendant 3 minutes. (Nous présentons ici une moyenne des données proposées par les
diverses variantes de la méthode de base)
Après avoir vu la méthode de base et les variations possibles concernant le temps de
manipulation et l’examen au microscope, nous allons maintenant voir l’élément à l’origine de
la majorité des variantes proposées : les différents liquides de flottation.
2. Les liquides de flottation
L’utilisation de différents liquides au cours des années par les équipes ayant travaillé sur cette
problématique tient principalement du fait qu’aucun liquide ne s’est avéré efficace à 100%
dans la détection de tous les types d’œufs, ou ne présente pas une facilité de lecture justifiant
un recours général à ce liquide.
Au-delà du réactif de base qui peut changer d’une méthode de flottation à l’autre, la densité
peut également être plus ou moins élevée et détermine le protocole de fabrication du liquide
de flottation.
44
a) Le chlorure de sodium
C’est le liquide utilisé de façon historique. C’est une solution de chlorure de sodium à
saturation (25%, densité = 1.20).
Avantages :
C’est un liquide très facile à réaliser, il est sans impact pour le technicien comme pour
l’environnement et son coût est faible.
Inconvénients :
La densité n’est pas suffisante pour faire remonter les œufs de Trématodes (46). Puisque la
densité atteinte est celle de la solution à saturation il n’y a que peu de façon d’améliorer la
sensibilité de l’examen avec ce liquide.
b) Solution de saccharose
Cette solution a été utilisée par Levine et al (39) dans une étude comparant différentes
méthodes de concentration, mais comparant également la solution de saccharose à celle de
chlorure de sodium.
Les méthodes utilisant une solution de saccharose nous proposent plusieurs proportions pour
la composition de la solution et donc plusieurs densités. La densité de la solution de
saccharose peut varier entre 1.20 et 1.35.
Il est également possible que la solution ne soit pas une dilution simple de saccharose et fasse
intervenir de nombreux autres composants comme le formaldéhyde, du nitrate de sodium
comme dans les solutions utilisées dans l’étude menée par Cringoli et al (18)
Avantages :
C’est également un liquide très facile à réaliser, il est sans impact pour le technicien comme
pour l’environnement. Il présente une excellente sensibilité dans la détection des oocystes de
coccidies (28, 48) et des œufs de strongles digestifs (39).
Par rapport à la solution saturée de chlorure de sodium, Levine et al (39) ne notent pas de
différence de la sensibilité, mais la lecture est facilitée par une moindre cristallisation du
saccharose par rapport au chlorure de sodium
Inconvénients :
Dans l’étude menée en 2004, Cringoli ne note aucune remontée d’œufs de Dicrocoelium avec
les solutions de saccharose utilisées (18).
45
Par ailleurs face à des solutions concentrées en saccharose se pose le problème de la durée de
conservation et de la façon de conserver le liquide afin d’éviter toute contamination.
c) Nitrate de sodium
La solution de nitrate de sodium en tant que liquide de flottation a été utilisée dans plusieurs
études. La solution peut être pure ou comporter d’autre composant comme une association au
saccharose ou au thiosulfate de sodium (18)
Raynaud utilise une solution à saturation présentant une densité de 1.40 (46).
Avantages :
Présentant une densité élevée, le nitrate de sodium présente l’avantage de faire remonter les
œufs de nématodes (39) et de Dicrocoelium lanceolatum (18).
Inconvénients :
La flottation avec le nitrate de sodium fait remonter avec les œufs de nombreux débris qui
rendent difficile la lecture de la lame de flottation et donc l’interprétation de l’examen.
d) Le sulfate de zinc
Ce liquide est pour la première fois utilisé par Faust en 1938 (cité par Bailenger (5)), la
technique fait appel à de nombreuses centrifugations pour éliminer un maximum de débris
végétaux avant l’ajout de la solution dense. Il utilise une solution de densité 1,18. Le
protocole précis est présenté en annexe 7.
Par la suite les méthodes utilisant le sulfate de Zinc ont utilisé des solutions de densité plus
élevée de 1.35 à 1.40.
En 2003, Courouble a réalisé des coproscopie avec une solution de sulfate de Zinc à densité
1.44 dont l’obtention demande plusieurs jours (17).
Avantages :
C’est un liquide peu toxique, de coût moyen.
Il présente une excellente sensibilité pour les œufs de nématodes et les oocystes de coccidies
(46) et est considéré comme un bon liquide dans la détection des œufs de Fasciola hepatica à
une densité proche de 1.40 par Gibson (29). Cette particularité quant à la détection des œufs
de trématodes est améliorée par la possibilité d’augmenter la densité du liquide.
46
Inconvénients :
La densité utilisée dans la méthode de base permet une bonne lecture mais rend inutile
l’utilisation de ce liquide dans la détection d’œufs de Trématodes. Cet inconvénient est
facilement détourné puisqu’il est facile de réaliser une solution de densité supérieure.
L’utilisation du sulfate de Zinc conduit à considérer son élimination. Ce n’est pas un liquide
aussi neutre que le chlorure de sodium ou le saccharose, il convient donc de prendre des
mesures afin de limiter son élimination dans l’environnement.
Son inconvénient majeur provient de la difficulté de lecture des lames de flottation. Ce
liquide entraîne la formation de nombreuses bulles lorsqu’il est utilisé à forte densité, ce qui
demande un effort supplémentaire de concentration au technicien. Il entraîne également au
cours de la flottation la remontée de nombreux débris qui vont contribuer à la difficulté de
lecture de la lame (46)
e) Sulfate de magnésium
La solution de sulfate de magnésium en flottation a été utilisée par Dunn en 1955 (cité par
Raynaud (46)) à saturation (densité = 1.30). La densité de ce liquide peut varier selon les
proportions utilisées de 1.20 à 1.30 au maximum.
Avantages :
Tout comme le sulfate de Zinc, le sulfate de Magnésium accroît la sensibilité de détection des
œufs de Nématodes et des oocystes de coccidies par rapport aux solutions de chlorure de
sodium et de saccharose comme souligné par Bello (6)
Il présente également l’avantage de ne pas cristalliser comme le chlorure de sodium et d’être
de manipulation plus simple que le saccharose.
Inconvénients :
A sa densité la plus élevée, il est décrit comme donnant une lame illisible par l’abondance de
débris par Raynaud (46).
De plus bien que rendant des résultats positifs dans la remontée d’œufs de Dicrocoelium
lanceolatum, ce liquide est considéré comme le moins sensible de ceux conduisant à
l’obtention d’un résultat positif par Cringoli et al (18)
47
f) Iodomercurate de potassium
La solution d’iodomercurate de potassium a été proposée en premier lieu par Janesko et
Urbanyi en 1931(cité par Bailenger (5)). Sa composition utilise de l’iodure de potassium et de
l’iodure de mercure d’après les proportions proposées en annexe 4 ce qui permet d’atteindre
une densité de 1.44
Bailenger a ensuite diminué la concentration de la solution en mercure dans la variante qu’il
propose en 1977(annexe 5) (5). Il démontre en 1977 que la combinaison des atomes de
mercure à certaines molécules de la surface des œufs permet une modification de leur
caractère physico-chimique et donc de leur comportement lors de concentration. Cela favorise
ainsi leur présence en dehors de la phase aqueuse. Il considère de plus que l’intervention du
mercure revêt un aspect qualitatif ce qui permet d’envisager l’abaissement de la concentration
en mercure du liquide.
Avantages :
La densité élevée du iodomercurate de potassium a dans un premier temps été mise en avant
pour sa sensibilité dans la détection des œufs de trématodes et particulièrement pour les œufs
de Fasciola hepatica par Rayanud (45) et de Dicrocoelium lanceolatum (18, 49).
Il permet de plus une bonne lisibilité de la lame puisqu’il limite la remontée des débris
végétaux et ne produit que peu de bulles.
Il est rapporté qu’il est tout aussi précis en ce qui concerne les œufs de nématodes et les
oocystes de protozoaires, et efficace pour toute espèce ; ce qui en fait une méthode
polyvalente (45).
Inconvénients :
Il est important de remarquer que ce liquide entraîne une déformation des œufs qui peut
rendre la lecture difficile. Raynaud en 1970 signale ainsi la difficulté à distinguer les œufs de
Fasciola Hepatica de ceux de Calicophoron daubneyi éventuels et n’écarte cet inconvénient
que par la considération de l’absence d’infestation des ruminants par des paramphistomidés
en Europe du Nord dans les années 70. Cependant de nos jours l’infestation par des ruminants
par les trématodes du genre Calicophoron daubneyi est de plus en plus importante (2, 19) ce
qui rend la question de la distinction des œufs majeure.
Un autre point important et limitant l’usage de ce liquide est son coût. Malgré la technique de
régénération du liquide proposée par Raynaud et Brunault (47) (voir en annexe 6), les
constituants sont des produits coûteux qu’il peut être difficile de se procurer particulièrement
dans le cas d’un laboratoire qui ne réaliserait qu’un nombre modéré de coproscopie par an.
48
Il est de plus essentiel de noter que les composants de ce liquide sont des toxiques et que leur
acquisition et leur manipulation est soumise à une réglementation de plus en plus précise (qui
sera mieux précisée dans la seconde partie de ce travail). Les 2 composants du liquide (iodure
de potassium et iodure de mercure II) sont catégorisés dans la réglementation comme
toxiques (36). Ce liquide présente une potentielle action caustique et allergique, le technicien
peut avoir des fissures au niveau des doigts, qui peuvent s’accompagner d’œdèmes, de prurit
et d’une sensation de chaleur.
Tous ces inconvénients tendent à orienter les laboratoires vers l’abandon de ce liquide au
profit du recours à des liquides plus neutres de sensibilité proche.
g) Chlorure de zinc associé au chlorure de sodium
Les publications faisant mention de l’utilisation de chlorure de zinc l’associent au chlorure de
sodium (18, 22, 46). La solution se compose alors d’une solution de chlorure de zinc saturée
et d’une solution de chlorure de sodium saturée avec un rapport des volumes 1/3.
L’étude de la sensibilité de cette solution chez les ruminants a été réalisée par Cringoli et coll
en 2004 et montre que, bien que permettant la remontée d’œufs de Nématodes, c’est la
solution la moins sensible des 14 testées dans ce cadre. Par ailleurs elle ne permet pas la
remontée d’œufs de Trématodes.
Globalement cette solution n’apparaît pas comme intéressante au niveau de la coproscopie des
ruminants. Son efficacité a cependant été démontrée dans la détection des Ascaris chez les
porcs.
h) Chlorure de calcium
L’utilisation de chlorure de Calcium en liquide de flottation a été réalisée avec des solutions
de densités diverses (entre 1.05 et 1.20). Ce liquide a globalement toujours été utilisé dans des
expérimentations et jamais vraiment en routine. (29)
i) Glycérine
La glycérine utilisée en solution de flottation a été testée à différentes densités en fonction du
parasite recherché. Cependant ce liquide a globalement été abandonné d’une part à cause de
son coût et d’autre part en raison de la déformation des œufs, en particulier ceux de Fasciola
hepatica (Vadja 1922 cité par Gibson (29))
49
IV. Conclusion
La recherche coproscopique chez les ruminants fait face à de nombreuses particularités :
- La petite quantité de fèces examinée
- L’importance des débris cellulosiques dans les selles
- La consistance variable selon les espèces.
- La variabilité des éléments parasitaires.
Ces particularités sont à l’origine de la variété des techniques de coproscopie (33) :
- La concentration par sédimentation qui concentre les éléments parasitaires dans le
culot mais demande du temps et n’est pas toujours très facile de lecture.
- La concentration diphasique qui malgré une bonne sensibilité est compliquée chez les
ruminants vu l’abondance de débris chez les ruminants.
- La concentration par flottation qui est rapide mais demande un choix précis du liquide
dense utilisé pour avoir la meilleure sensibilité de l’examen.
Cette dernière technique est majoritairement utilisée tant dans diverses études que dans les
laboratoires et va donc être celle utilisée durant les expériences réalisées pour ce travail.
50
51
Partie 2 : Etude Expérimentale
52
53
I. Introduction
Le but de ce travail était de comparer différents liquides de flottation couramment utilisés en
coproscopie des ruminants.
Dans un premier temps de ce travail, nous avons cherché à connaître les liquides utilisés dans
les différents laboratoires départementaux de France au travers d’un questionnaire (Annexe
8).
Par la suite, nous avons conduit nos propres expérimentations, en choisissant les liquides
d’après les réponses reçues au questionnaire, afin de tester la sensibilité diagnostique des
différents liquides.
II. Matériel et méthodes
A. Recueil de données et d’échantillons
1. Prise de contact
Dans le cadre de notre travail, nous avons eu l’occasion de communiquer avec les laboratoires
départementaux dans le cadre de notre enquête, avec des vétérinaires ruraux et des éleveurs
dans le but de récolter des échantillons de selles.
a) Envoi des questionnaires
Les laboratoires ont été contactés dans un premier temps par des mails. Le courrier avait pour
but d’expliquer la raison de notre enquête, à savoir le but de notre thèse, et les différentes
méthodes pour répondre et nous faire parvenir les questionnaires en retour. Nous avons
proposé aux laboratoires un document format Word à remplir et à nous retourner par mail ou
fax, et un questionnaire en ligne.
En cas de non réponse à notre premier mail, nous avons relancé les laboratoires par un
nouveau mail puis par fax.
b) Collecte des prélèvements
Nous sommes entrés en contact avec des éleveurs ainsi qu’avec des vétérinaires en leur
demandant de bien vouloir nous faire suivre tout prélèvement qui pourrait s’avérer intéressant
dans le cadre de notre étude. Nous avons également effectué la même démarche auprès de
l’unité de Pathologie du Bétail du campus vétérinaire de VetAgroSup.
54
2. Zones et période
a) Période de collecte
Nous avons contacté les laboratoires départementaux avec le questionnaire définitif durant
l’été 2012. Une première prise de contact avait eu lieu dans le printemps auprès de quelques
laboratoires pour sonder leur disponibilité et le moyen le plus simple de les contacter.
Les prélèvements ont quant à eux été effectués durant la période d’expérimentation à savoir
septembre et octobre 2012.
b) Zones
Nous avons contacté l’ensemble des laboratoires vétérinaires départementaux de métropole
dans la mesure où nous avions pu au moins avoir leur numéro de téléphone.
Les prélèvements ont été faits auprès d’élevages laitiers et allaitants dans les départements du
Rhône, de la Loire et de l’Allier.
3. Modalités de prélèvement
Dans le cadre de ce travail, les prélèvements de selles ont été effectués auprès de ruminants
adultes (plus d’un an), de l’espèce bovine majoritairement. Nous nous sommes rendus dans
les fermes et avons prélevé les bouses au sein du rectum sur les animaux attachés. Comme un
autre travail était conduit sur les fèces des jeunes ruminants, nous avons en parallèle effectué
les prélèvements sur les jeunes et les adultes.
Les prélèvements ont été conservés au froid dans des pots. Les analyses ont été effectuées
dans les 3 à 4 jours suivant le prélèvement.
B. Composition du questionnaire
Le questionnaire avait pour but d’obtenir un maximum de renseignements sur les techniques
des laboratoires départementaux en matière de coproscopie chez les ruminants mais aussi en
matière de coloration dans le cadre de la recherche des protozoaires dans ces espèces.
Le questionnaire était donc composé de 2 parties dans lesquelles des questions ouvertes ou à
choix multiple permettaient de connaitre les méthodes des laboratoires.
Le questionnaire est présenté en annexe 8. Une des premières questions était de connaître le
numéro du département répondant afin de vérifier l’unicité des réponses et d’éviter toute
relance inutile. Par la suite cette information n’a plus été utilisée puisque l’anonymat avait été
garanti aux laboratoires et que cette information n’apportait rien à l’analyse des réponses.
55
C. Réalisation des coproscopies
1. Choix des liquides et préparation
Les liquides ont été choisis en rapport avec l’enquête menée auprès des LVD et d’après ce qui
ressortait de la bibliographie.
Nous avons utilisés 5 liquides pour tester tous les prélèvements :
Le chlorure de sodium, à une densité de 1.20.
Le saccharose, à une densité de 1.26
Le sulfate de magnésium à une densité de 1.27
Le sulfate de zinc, à une densité de 1.36
L’iodomerdurate de potassium, à une densité de 1.44
Les modalités de composition des liquides sont données en annexe 9.
Une solution de sulfate de zinc à une densité de 1.44 a été utilisée sur quelques échantillons.
Nous avons préparé tous les liquides exceptés l’iodomercurate de potassium qui a été préparé
dans l’unité de Pathologie du Bétail qui nous l’a fourni et le sulfate de zinc à densité de 1.44
qui nous a été fourni par le Dr. COUROUBLE.
2. Technique de coproscopie
a) Protocole de flottation
Le protocole a été standardisé pour toutes les coproscopies et utilisé de manière identique
avec chaque liquide de flottation testé (voir annexe 10).
Pour réaliser une flottation simple, 5 g de matières fécales sont pesées (toujours avec la même
balance) et déposées dans un verre à pied en plastique. Vingt ml du liquide de flottation sont
ajoutés puis on délaye le tout jusqu’à obtenir une dilution homogène.
Cette dilution est ensuite passée sur un tamis métallique doublé d’une gaze, nous versons
ensuite 15ml de la dilution fécale dans un tube à centrifugation jusqu’à obtention d’un
ménisque au dessus du tube. Une lamelle est déposée sur le tube.
Nous réalisons une centrifugation des tubes à 1500tours/minute pendant 5 minutes (2 par 2,
toujours dans la même centrifugeuse)
La lamelle est déposée sur une lame porte-objet et lue dans sa totalité.
56
b) Réalisation de gamme
Dans un second temps, nous avons cherché à connaître la sensibilité des différents liquides.
Pour cela nous avons réalisé des gammes de dilution. Nous avons sélectionné un échantillon
pour la présence d’un élément parasitaire à chercher, nous avons réalisé sur ce prélèvement un
comptage en lame de McMaster (méthode présentée en annexe 11).
La variation principale du protocole pour réaliser un comptage en lame de McMaster est la
quantité de liquide de flottation utilisée : 70ml sont utilisés pour diluer les 5g de matières
fécales. Après tamisage de la dilution fécale, 1ml est prélevé pour la lame de McMaster et
15ml sont prélevés pour remplir un tube à centrifugation afin de réaliser une lame de contrôle
en flottation.
La dilution utilisée pour l’obtention de la solution fécale et la lecture des 2 chambres de la
lame de McMaster permet le comptage selon la formule :
[(n1+n2)/2]*100
n1 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 1
n2 : somme des œufs comptés dans chaque colonne de la chambre 2
Si un œuf est absent de la lame de McMaster mais présent en lame de contrôle, le comptage
de cet œuf est déclaré inférieur à 50opg (et non absent simplement)
Nous avons réalisé le comptage sur 5 lames afin d’avoir une moyenne du nombre d’œufs
présents par gramme de fèces.
Les dilutions ont été réalisées entre l’échantillon choisi et de la bouse « saine ». Les fèces
dites saines ont subi 2 examens coproscopiques : un dans le sulfate de zinc et un dans
l’iodomercurate de potassium. Les fèces ont été déclarées saines en cas d’absence sur les
lames de flottation de tout élément parasitaire dans les 2 liquides utilisés
Dans chaque cas, la gamme est répétée 5 fois en utilisant les 5 liquides choisis et nous avons
réalisé 2 dilutions :
- au demi : nous avons délayé 75g de l’échantillon dans 75 g de fèces saines.
- au 10ème
: Nous avons délayé 15g de l’échantillon dans 135g de fèces saines.
57
3. Procédures expérimentales
Nous avons réalisé les coproscopies avec les 5 liquides différents sur 34 échantillons.
L’interprétation de l’examen a été réalisée de façon semi-quantitative suite à la lecture totale
de la lamelle. Nous avons choisi 2 échelles d’interprétation en prenant compte du taux
d’excrétion des différents œufs recherchés.
Les résultats concernant les œufs de Calicophoron daubneyi ont été obtenus après comptage
des éléments et la catégorisation semi-quantitative suivante :
0 : Absence sur la lame.
1 : moins de 5 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
2 : de 5 à 15 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
3 : de 15 à 30 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
4 : de 30 à 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
5 : plus de 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
Les résultats concernant les œufs de strongles digestifs et les oocystes d’Eimeria sont estimés
selon la catégorisation suivante :
0 : Absence sur la lame.
1 : moins de 10 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
2 : de 10 à 100 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
3 : de 100 à 200 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
4 : de 200 à 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
5 : plus de 1000 éléments parasitaires par 5 grammes de fèces.
Les lames réalisées pour la gamme de dilution (5 lames dans chacun des 5 liquides testés)
sont également des lames de flottation dont nous avons lu la lamelle complète. Les résultats
correspondant sont fournis en nombre d’œufs comptés sur la lamelle totale.
Enfin 11 échantillons ont été testés dans les 2 solutions de sulfate de zinc, la lecture de la
lame de flottation est également complète et fournie en nombre d’œufs comptés sur la lamelle
totale.
D. Analyses statistiques
Afin d’analyser les résultats obtenus au cours des coproscopies avec les différents liquides de
flottation, nous allons utiliser le logiciel de statistique R.
Le test utilisé afin de déterminer la p-value est le test de Wilcoxon appliqué à chaque
catégorie d’éléments parasitaires recherchés (grande taille, taille moyenne et petite taille) et en
comparant les liquides utilisés 2 à 2. Pour chaque catégorie étudiée, nous réaliserons donc 10
tests.
58
III. Résultats
A. Etude des données obtenues par le questionnaire
Nous avons dans le cadre de notre enquête contacté 73 laboratoires vétérinaires
départementaux. Nous avons réussi après 3 relances à collecter les réponses de 49 laboratoires
dont 3 n’effectuent plus de coproscopie au sein de leur établissement (fig.5).
Figure 5 : Carte des laboratoires ayant répondus
Nous nous intéresserons dans ce travail à la première partie du questionnaire.
59
1. Liquide de flottation
a) Quels liquides ?
Figure 6 : Répartition des différents liquides de flottation dans les LVD
Notre enquête nous a permis de noter l’utilisation majoritaire du sulfate de zinc comme
liquide de flottation (fig.6).
Concernant l’utilisation du sulfate de magnésium, déclarée par 10 laboratoires, il faut noter
que 4 laboratoires l’utilisent en remplacement du sulfate de zinc en cas de rupture du réactif et
2 laboratoires déclarent également utiliser l’iodomercurate de potassium.
Le chlorure de sodium est utilisé par 5 laboratoires dont 2 utilisent aussi le sulfate de zinc. Le
saccharose est utilisé par 2 laboratoires qui déclarent utiliser un autre liquide.
Enfin 2 laboratoires ont déclaré l’utilisation pour l’un de chlorure de zinc et pour l’autre de
nitrate de sodium.
b) Densité du liquide
Lors de la conception du questionnaire, il nous a semblé pertinent de s’intéresser à la densité
des liquides utilisés puisque c’est la caractéristique qui revient le plus souvent pour justifier
de la capacité du liquide à faire remonter les différents œufs. Sur les 46 laboratoires ayant
répondu, 20 nous ont communiqué la densité des liquides utilisés (fig. 7)
sulfate de zinc; 24
iodomercurate de
potassium; 12
sulfate de magnésium
; 10
NaCl; 5
saccharose; 2
autre; 2
60
Figure 7 : Réponse concernant la densité du liquide
Les densités utilisées pour chaque liquide sont assez variables ce qui correspond à ce que
nous avons rencontré dans la bibliographie :
- Sulfate de zinc : les densités fournies varient de 1.23 à 1.44
- Sulfate de magnésium : 1.26 à 1.29
- Iodomercurate de potassium : 1.38 à 1.44
Nous ne savons pas si les densités déclarées sont mesurées régulièrement par le laboratoire.
c) Tarif
Nous avons souhaité au cours de notre questionnaire avoir une connaissance des tarifs
pratiqués en coproscopie afin d’estimer l’homogénéité des tarifs et d’évaluer l’impact du coup
du liquide sur le coût de la coproscopie.
Nous avons pu estimer le coût du liquide par coproscopie des liquides suivants (36) d’après
les proportions utilisées lors de nos expériences et en considérant l’utilisation de 20ml du
liquide pour une coproscopie:
- Chlorure de sodium (densité = 1.20) : environ 0.21€
- Saccharose (densité = 1.26) : environ 1.67€
- Sulfate de Magnésium (densité = 1.27) : environ 1.80€
- Sulfate de Zinc (densité = 1.36) : environ 1.26€
- Iodomercurate de potassium : environ 7.70€.
Nous pouvons remarquer que le coût calculé pour une coproscopie à partir des tarifs proposés
par le fournisseur ne montre pas de grande différence pour 3 liquides : sulfate de zinc, sulfate
de magnésium et saccharose. Le chlorure de sodium apparait comme moins cher (environ 7 à
8 fois moins cher), cependant ce qui ressort le plus est le coût élevé du iodomercurate de
potassium (près de 6 fois plus élevé). Nous avons alors cherché à savoir si ces différences de
tarifs se reportaient sur le coût de la coproscopie.
0 5
10 15 20 25
densité
répondu
61
Figure 8 : Tarif d'une coproscopie simple
Les tarifs pratiqués au sein des LVD (fig. 8) démontrent une certaine hétérogénéité sans
impact du liquide utilisé. Nous retrouvons en effet les différents liquides utilisés dans toutes
les catégories de tarif. Nous pouvons cependant nous interroger sur certaines données tant
certains tarifs déclarés sont faibles (moins de 5€) en considérant qu’au-delà du coût du
liquide, ces tarifs prennent aussi en compte le temps du technicien.
2. Interprétation de la coproscopie
Nous avons voulu connaître le mode d’interprétation réalisé par les laboratoires à savoir une
interprétation qualitative, semi-quantitative ou quantitative.
La majorité des laboratoires réalise un examen quantitatif (43 sur 46) soit seul (20
laboratoires) soit couplé à une interprétation qualitative (20 sur 43).
Certains laboratoires déclarent effectuer une interprétation quantitative et semi-quantitative
(3), et enfin 2 laboratoires réalisent une lecture qualitative et semi-quantitative.
Les déclarations des laboratoires ne nous permettent pas de savoir si l’interprétation est
fonction de la demande dans les cas où 2 modes de lecture sont déclarés. Nous pouvons
cependant noter que les protocoles de comptages en McMaster associent souvent la réalisation
d’une lame simple afin d’abaisser le seuil de sensibilité de détection des œufs (45)
Tous liquides confondus, nous avons voulu mettre en parallèle le mode d’interprétation et le
tarif pratiqué. Cependant l’observation de ces paramètres a montré quelques incohérences sur
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
moins de 5€ entre 5 et 10€
entre 10 et 15€ plus de 15€
ZnSO4
MgSO4
Iodo
NaCl
Saccharose
62
les informations fournies. Sur 17 laboratoires déclarant une interprétation quantitative et ayant
fournis leur tarif, seulement 8 nous fournissent un tarif de coproscopie simple. Nous n’avons
aucune précision quant à la cumulation des tarifs, ce qui rend impossible cette étude.
Sur les 31 laboratoires nous ayant fourni des tarifs de coproscopie simple et avec Mc Master,
6 proposent le même tarif pour les 2 modalités d’examens. Dans les autres cas le tarif est plus
élevé pour un examen en lame de Mc Master que pour une coproscopie simple.
3. Temps de manipulation
Les durées de manipulation fournies par les laboratoires varient entre 15 min et une journée.
Nous pouvons supposer que cette grande variation est due à une différence de protocole avec
intervention ou non de la centrifugeuse dans l’obtention des lames de flottation, mais il est
également possible que certains laboratoires aient communiqué leur temps de réponse plutôt
que leur temps de manipulation (les coproscopies que nous avons nous-mêmes réalisées
demandant environ 10 minutes de manipulation propre puis environ 10 minutes de lecture de
la lame).
4. Mesures de protection
L’utilisation des liquides requiert à minima des mesures de recyclage afin de ne pas rejeter de
composants chimiques dans l’environnement.
Par ailleurs la manipulation de certains liquides peut présenter un danger pour le technicien, il
convient donc de prendre les mesures appropriées pour limiter les contacts dangereux avec le
liquide.
Seuls 2 laboratoires, parmi les 46 ayant répondu, ne déclarent user d’aucune mesure de
protection que ce soit vis-à-vis du technicien ou de l’environnement.
a) Port de protection individuelle
Nous considérons dans les protections individuelles les gants, les masques et lunettes.
Dans le cadre de toutes les manipulations coproscopiques, le port de gants est conseillé
quelque soit le liquide utilisé. Cette mesure est bien suivie puisque 42 laboratoires déclarent
utiliser les gants lors de la réalisation de cet examen.
En ce qui concerne le port de masque et de lunettes, nous nous intéresserons en particulier aux
laboratoires utilisateurs du iodomercurate de potassium qui a un potentiel toxique élevé
comme nous l’indiquent les fiches sécurité de ses composants (36).
63
Figure 9 : Utilisation de protection individuelle par les laboratoires usant du iodomercurate de potassium
Nous pouvons remarquer (fig. 9) que si le port de gants est plutôt bien respecté, peu de
laboratoires utilisent un masque ou des lunettes en cas de manipulation du iodomercurate de
potassium, alors que le iodure mercurique qui le compose est déclaré toxique par inhalation et
par contact oculaire.
En ce qui concerne les autres liquides utilisés, l’usage de masque et lunettes est tout aussi
faible (2 utilisent un masque parmi les laboratoires utilisant le sulfate de zinc, aucune
protection supplémentaire pour les autres) cependant la fiche sécurité de ces produits ne
déclare pas une toxicité des composants.
b) Mesures d’évacuation des déchets
Disposition réglementaire :
La gestion des déchets est une problématique collective et est réglementée par les articles
législatifs qui ont été réunis majoritairement dans le code de l’environnement. Les
dispositions en matière de gestion de déchets ont été réunies en un guide par le CNRS en
2009 (16). Les déchets rencontrés dans le cadre du diagnostic vétérinaire sont soumis au plan
régional pour l’élimination des déchets d’activités de soins d’après le décret n°96-1009 du 18
novembre 1996 et le code de la santé publique (14). Ce plan permet dans chaque région de
déterminer les établissements producteurs de ce type de déchets, la nature et la quantité de ces
déchets et leur gestion.
Les déchets suite à la réalisation d’une coproscopie sont la lame d’examen, la dilution fécale,
et éventuellement le reste de l’échantillon.
L’élimination des lames et de l’échantillon suit la gestion des déchets de soins à risques
infectieux en temps que matériel en verre contaminé et est donc soumise aux arrêtés du 7
septembre 1999 et à la circulaire DH/DGS/ n°98-554 du 1 septembre 1998 relative à la
collecte des objets piquants, tranchants souillés. Ces textes régissent les modalités de collecte
0
2
4
6
8
10
12
14
port de gants masque lunettes
différence par rapport au nombre total2
nombre de laboratoire usant de protection
64
dans des containers adaptés (Norme NF X 30-500, décembre 1999) et l’élimination de ces
déchets (incinération dans des centres agréés).
Concernant les liquides et la dilution fécale en particulier, les textes réglementant
l’élimination des déchets chimiques sont nombreux :
- Dispositions générales relatives à la prévention du risque chimique : Code du Travail,
art. R. 231-54 à R. 231-59-2 (15)
- Arrêté du 21 février 1990 modifié – Titres IV et V – Emballage – Étiquetage,
définissant les critères de classification et les conditions d’étiquetage et d’emballage
des préparations dangereuses.
- Arrêté du 20 avril 1994 modifié, relatif à la déclaration, la classification, l’emballage
et l’étiquetage des substances dangereuses.
- Dispositions particulières sur le stockage et l’élimination des déchets susceptibles
d’engendrer des effets préjudiciables pour la santé de l’homme et l’environnement :
Code de l'Environnement, art.L. 541-1 à 50 (13)
- Règlement sanitaire départemental : section 2 Art. 29, alinéa 2 / Déversements
délictueux (par assimilation).
En ce qui concerne les liquides (excepté l’iodomercurate de potassium), ils sont considérés
dans la réglementation comme de faible risque chimique. Il faut les collecter dans des
contenants réservés à cet usage, hermétiques, et destiner ces contenants à un circuit de
traitements adaptés.
Le cas du iodomercurate de potassium est particulier. D’une part, en raison de son coût, il
sera le plus souvent récupéré puis régénéré (voir protocole en annexe 6).
D’autre part au niveau de la réglementation sur les produits chimiques, il est classé dans une
autre catégorie, celle des déchets de produits très toxiques, à cause de son composant
mercurique. Il faut gérer l’élimination des récipients des composants de base, la collecte du
liquide usagé doit être réalisée dans des récipients hermétiques étiquetés, eux-mêmes placés
dans un bac ou une caisse adapté(e) empli(e) d’un lit d’absorbant. Il faut s’assurer de la
compatibilité du contenant avec le contenu (à l’aide des fiches de données de sécurité des
produits, …).
La gestion des déchets de ce liquide a un coût supérieur aux autres liquides (de 0,23 à 0,84 € /
kg sans fourniture des conteneurs pour la majorité des liquides contre un coût approximatif de
1,83 à 6,10 € / kg pour les déchets toxiques).
65
Mise en pratique dans les laboratoires
Sur les 46 laboratoires ayant répondu, 27 ont déclaré prendre des mesures particulières
d’évacuation des déchets.
Figure 10: Laboratoires déclarant des mesures de gestion des déchets
Nous pouvons observer (fig.10) que concernant l’iodomercurate de potassium, la majorité des
laboratoires l’utilisant déclare avoir des mesures particulières quant à son élimination.
En ce qui concerne les laboratoires ne déclarant pas avoir de mesure particulière d’élimination
des déchets, nous pouvons nous interroger sur la pertinence de la formulation de la question
(recyclage au lieu de mesures de gestion des déchets) puisque les laboratoires sont soumis aux
mesures réglementaires précédemment citées.
B. Résultats des expériences
Comme nous l’avons expliqué auparavant, le dépouillement des résultats du questionnaire
nous a permis de déterminer les liquides que nous comparerions en coproscopie. Nous nous
sommes intéressés au nombre d’éléments parasitaires concentrés par chaque liquide, mais
également à l’aspect de ces éléments et à la facilité de lecture de la lame de flottation en
fonction du liquide utilisé.
1. Aspect qualitatif
a) Aspect des œufs
Lors de nos expériences, nous avons eu l’occasion de pouvoir préciser plus spécialement
l’espèce parasite que simplement par sa taille. Nous avons ainsi pu observer des œufs de
Calicophoron daubneyi, de Dicrocoelium lanceolatum, de divers strongles dont Nématodirus
et les diverses espèces d’Eimeria présentes chez les bovins. Pour chacun de ces œufs, nous
avons réalisé des photos dans les différents liquides afin d’une part de pouvoir comparer leur
0
5
10
15
20
25
30
différence avec nombre de laboratoires
laboratoires déclarant des mesures de gestion des déchets
66
aspect entre les liquides et d’autre part de proposer une référence avec l’aspect de l’œuf selon
le liquide.
Figure 11 : Œuf de Calicophoron daubneyi dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c)
sulfate de magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium
Les œufs de Calicophoron daubneyi ont la particularité de présenter des différences de
remplissage ou de coloration selon le liquide envisagé (fig.11).
Figure 12 : Œuf de strongles digestifs dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de
magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium
a b c
e d
a b c
d e
67
Figure 13 : Oocystes d'Eimeria dans les différents liquides : a) Chlorure de sodium, b) Saccharose, c) sulfate de
magnésium, d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium
Figure 14 : Œuf de Dicrocoelium lanceolatum dans les différents liquides : a) Saccharose, b) sulfate de magnésium,
d) sulfate de zinc, e) iodomercurate de potassium
L’observation dans les différents liquides ne nous a montré aucune différence d’aspect pour
les œufs de strongles, les oocystes d’Eimeria ou les œufs de Dicrocoelium lanceolatum
(fig.12, 13 et 14).
Nous n’avons malheureusement pas eu l’occasion d’observer des œufs de Fasciola hepatica
dans nos échantillons.
a b c
d e
a b c
d e
68
b) Facilité de lecture
Lorsque nous avons voulu évaluer la facilité de lecture selon le liquide, 2 paramètres nous
sont apparus à prendre en compte : la présence de bulles et la présence de débris.
Nous avons dans ce cadre réalisé pour chaque lame une évaluation de ces paramètres.
Il s’avère que la présence de bulles et de débris est, pour chaque échantillon, maximale en
sulfate de zinc ce qui peut rendre la lecture de la lame difficile (fig.15).
Figure 15 : lame réalisée au sulfate de zinc
Les autres liquides font apparaître une présence semblable des bulles comme des débris et
sont globalement de lecture plus confortable. Cependant on peut noter l’importance dans
certains cas de réaliser une lecture rapide après réalisation de la lame. C’est particulièrement
le cas des coproscopies réalisées en chlorure de sodium, liquide qui cristallise rapidement
après dépôt de la lamelle sur la lame (fig.16). La cristallisation gène effectivement la lecture.
Figure 16 : évolution de la cristallisation des lames de chlorure de sodium
Œuf de Calicophoron
daubneyi
Ookyste d’Eimeria
0 minute 15 minutes 30 minutes
69
2. Analyse statistique
a) Œufs de Calicophoron daubneyi Tableau 1: Détection des œufs de Calicophoron daubneyi
échantillon Nacl Saccharose Sulfate de
magnésium
Sulfate
de zinc
Iodomercurate
de potassium
1 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
3 1 1 0 1 0
4 1 1 0 1 1
5 0 1 0 0 1
6 0 0 1 0 0
7 0 0 0 1 1
8 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 4
10 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 1
12 0 0 0 0 0
13 0 0 0 0 1
14 0 0 0 1 4
15 0 1 0 1 1
16 0 1 1 0 4
17 0 0 1 0 1
18 0 0 0 1 4
19 0 1 0 1 1
20 0 1 0 1 4
21 0 0 0 1 2
22 0 0 0 0 0
23 1 1 1 4 5
24 0 0 0 1 4
25 0 0 0 1 2
26 0 0 0 1 4
27 0 0 0 2 4
28 0 0 1 2 4
29 0 0 1 2 5
30 0 0 0 2 4
31 0 0 0 0 1
32 0 0 0 0 1
33 0 0 0 1 4
34 0 0 0 1 3
70
Les tests réalisés donnent une p-value significative dans la comparaison des résultats obtenus
entre :
- Le sulfate de zinc et l’iodomercurate de potassium (p=4.779*10-5), le sulfate de zinc
et le sulfate de magnésium (p=0.0007217), le sulfate de zinc et le saccharose
(p=0.002843) et enfin le sulfate de zinc et le chlorure de sodium (p=0.0001741).
- L’iodomercurate de potassium et le sulfate de magnésium (p=1.218*10-5),
l’iodomercurate de potassium et le saccharose (p=3.88*10-5) et l’iodomercurate de
potassium et le chlorure de sodium (p=1.157*10-5)
L’observation des résultats (tab.1 et fig.17) nous confirme les indications fournies par la p-
value. Les résultats obtenus montrent une plus faible concentration et donc détection des œufs
de grande taille en cas d’utilisation de sulfate de magnésium, de saccharose et de chlorure de
sodium par rapport aux résultats obtenus avec le sulfate de zinc et l’iodomercurate de
potassium.
Figure 17 : présentation de l'estimation des oeufs de Calicophoron daubneyi
La différence observée entre l’iodomercurate de potassium et le sulfate de zinc provient d’une
différence de dénombrement dans la majorité des échantillons : sur 28 positifs, 18 le sont en
sulfate de zinc et en iodomercurate, 8 le sont en iodomercurate mais pas en sulfate de zinc, et
2 le sont dans un autre liquide mais pas en iodomercurate.
Il semble que les œufs de grande taille soient détectés mais comptés en moins grand nombre
avec le sulfate de zinc qu’avec l’iodomercurate de potassium.
71
b) Œufs de strongles digestifs
Tableau 2 : Détection des œufs de strongles digestifs
échantillon Nacl Saccharose Sulfate de
magnésium
Sulfate
de zinc
Iodomercurate
de potassium
1 3 3 3 3 3
2 1 1 1 1 1
3 1 1 1 1 1
4 1 2 1 1 1
5 3 4 2 2 4
6 4 4 3 3 2
7 2 2 4 3 2
8 1 1 2 2 2
9 3 4 2 2 3
10 2 2 2 1 2
11 1 1 1 1 1
12 1 1 1 0 2
13 1 1 1 1 1
14 1 2 1 1 2
15 1 2 1 1 1
16 2 2 1 1 2
17 1 1 1 1 1
18 2 4 3 2 3
19 1 1 1 1 1
20 1 1 1 2 1
21 1 1 1 1 2
22 1 1 1 1 1
23 2 2 2 2 2
24 2 2 1 1 2
25 2 2 1 1 2
26 1 1 2 1 2
27 2 2 2 2 2
28 1 2 2 2 2
29 1 2 2 2 2
30 1 1 1 1 1
31 1 1 1 1 1
32 0 0 0 0 0
33 0 0 0 1 0
34 1 1 1 1 1
72
L’étude statistique des résultats expérimentaux concernant les éléments parasitaires de taille
moyenne ne donne une p-value significative que dans 3 cas :
- Entre le saccharose et le chlorure de sodium (p=0.004157)
- Entre le sulfate de zinc et le saccharose (p=0.02918)
- Entre le chlorure de sodium et l’iodomercurate de potassium (p=0.03016)
La p-value dans le cas de la comparaison entre sulfate de zinc et saccharose et dans le cas du
chlorure de sodium et du iodomercurate de potassium, bien qu’inférieur à 0.05, est supérieure
à 0.01 ce qui amène à s’interroger sur la valeur de la signification de la différence mise en
évidence.
Nous allons pour cela nous attarder sur la représentation graphique des données (fig.18).
Figure 18 : présentation des résultats des œufs de strongles digestifs
L’observation de la représentation graphique des résultats montre une moyenne sensiblement
différente entre les liquides précédemment cités. Mais elle nous pousse aussi à nous interroger
sur l’absence de preuve de différence entre les 2 liquides apparemment les plus sensibles
(saccharose et iodomercurate de potassium) et le sulfate de magnésium.
73
c) Oocystes d’Eimeria
Tableau 3 : détection des oocystes d’Eimeria
échantillon Nacl Saccharose Sulfate de
magnésium
Sulfate
de zinc
Iodomercurate
de potassium
1 4 3 4 3 3
2 1 2 2 2 1
3 1 1 1 2 1
4 1 1 1 2 1
5 1 2 2 1 1
6 1 2 2 2 2
7 1 2 2 1 1
8 1 2 1 1 2
9 1 2 1 1 2
10 2 2 2 2 1
11 2 2 2 2 1
12 1 2 4 2 1
13 2 2 2 2 2
14 2 2 1 2 1
15 2 2 1 2 1
16 2 2 2 2 1
17 1 2 2 1 1
18 2 2 1 2 1
19 2 2 2 2 1
20 2 2 2 2 1
21 2 2 2 2 1
22 2 2 2 2 2
23 2 2 2 2 1
24 2 2 2 2 1
25 2 2 2 2 1
26 1 1 2 2 1
27 2 2 2 2 1
28 1 2 2 2 1
29 1 2 2 2 1
30 2 2 1 1 1
31 1 1 1 1 1
32 1 1 1 1 0
33 1 1 1 1 1
34 1 1 2 1 1
74
Les tests de Wilcoxon réalisés fournissent une p-value significative dans le cas de la
comparaison entre l’iodomercurate de potassium et tous les autres liquides :
- Avec le sulfate de zinc : p=8*10-5
- Avec le sulfate de magnésium : p=1.55*10-4
- Avec le chlorure de sodium : p=3.082*10-4
- Avec le saccharose : p=2.985*10-6
Toutes ces valeurs de p-value sont considérées comme hautement significatives dans le
domaine statistique, elles sont par ailleurs confirmées par l’observation des données (tab.3 et
fig.19). L’appréciation semi-quantitative du nombre d’œufs en iodomercurate de potassium
s’avère bien inférieure qu’avec les 4 autres liquides.
Figure 19 : présentation des résultats des oocystes d’Eimeria
La p-value s’avère également significative dans la comparaison entre les résultats obtenus en
saccharose et chlorure de sodium (p=0.007). L’observation des données (fig.19) est en accord
avec cette différence puisque la moyenne de l’estimation est plus élevée en saccharose qu’en
chlorure de sodium.
75
3. Etude de la sensibilité des liquides
Au cours des examens coproscopiques, nous avons pu détecter quelques échantillons
présentant une diversité de parasites intéressante à utiliser pour réaliser les gammes de
dilution. Nous en avons sélectionné 2 pour lesquels nous avons effectué les comptages en
cellule de Mc Master (moyenne présentée pour chaque catégorie d’œufs, tab.4)
Tableau 4 : moyenne des comptages en lame de Mc Master
Calicophoron
daubneyi
Dicrocoelium
lanceolatum
Strongles
digestif
Eimeria
Echantillon A <50 opg <50 opg 70opg 80opg
Echantillon B 140opg <50opg 80opg 290opg
Nous avons choisi de réaliser les dilutions à partir de l’échantillon B qui présente le plus
grand nombre d’éléments parasitaires par gramme de fèces.
a) Détection des éléments parasitaires les plus fréquents
Tableau 5 : résultat des comptages sur lamelle totale
La réalisation de gamme de dilution dans les différents liquides montre des résultats similaires
(tab.5) à ceux obtenus lors de l’analyse statistique précédente :
- Concernant les œufs de Calicophoron daubneyi, le sulfate de magnésium, le
saccharose et le chlorure de sodium sont de moindre sensibilité que le sulfate de zinc
76
et l’iodomercurate de potassium, de plus le nombre d’œufs détectés de Calicophoron
daubneyi est plus important avec l’iodomercurate de potassium qu’avec le sulfate de
zinc.
- Concernant les œufs de strongles digestifs, la réalisation de la gamme ne montre pas
de différence entre les liquides. La sensibilité des 5 liquides étudiés apparaît donc
comme proche dans le cadre du diagnostic de strongylose.
- Concernant les oocystes d’Eimeria, nous pouvons observer la confirmation des
données obtenues dans l’étude statistique précédemment réalisée à savoir que
l’iodomercurate de potassium apparaît comme détectant un nombre moins grand
d’oocystes alors que le saccharose semble être le liquide permettant le plus grand
dénombrement de ces oocystes.
Ces gammes nous permettent d’envisager l’impact du prélèvement sur le résultat de la
coproscopie puisque sur les 5 examens réalisés sur le même échantillon, nous pouvons
observer pour un même liquide une variabilité du comptage, qui parfois conduit à une
interprétation différente de l’examen (de présence à plus) mais sans relever d’une
différence importante du nombre d’œufs comptés.
b) Détection des œufs de Dicrocoelium lanceolatum
Les œufs des parasites de la classe des trématodes sont tous considérés comme lourds et l’on
peut envisager le comportement des œufs de Dicrocoelium lanceolatum comme semblable à
ceux de paramphistomes. Nous n’avons pas eu suffisamment d’échantillons positifs avec ce
type de parasite pour les inclure dans l’étude statistique mais la réalisation de gamme de
dilution pour ce parasite permet d’observer une tendance de ce comportement. En tenant
compte de la faible excrétion de ces œufs dans les conditions naturelles, il ne nous a pas
semblé pertinent d’aller au-delà d’une dilution au demi.
Tableau 6 : comptages des œufs de Dicrocoelium lanceolatum
Sulfate de zinc Iodomercurate de potassium
Sulfate de magnésium
Chlorure de sodium
Saccharose
pure Dilution/2 pure Dilution/2 pure Dilution/2 pure Dilution/2 pure Dilution/2
4 0 0 0 1 0 0 0 0 0
0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 1 0 0 0 0 0 0 1
Au cours de ces gammes, les œufs de Dicrocoelium lanceolatum ont été détectés dans tous les
liquides, sauf le chlorure de sodium, au moins une fois (tab.6). La gamme réalisée ne montre
pas vraiment de tendance de sensibilité d’un liquide puisque seuls les comptages réalisés en
sulfate de zinc semblent probant.
77
Les comptages dans les autres liquides, et en particulier en iodomercurate de potassium,
peuvent être reliés à un biais d’échantillonnage que nous remettrons plus en question au cours
de la discussion à venir, d’autant plus que lors de détection de ces œufs avec d’autres
échantillons, la sensibilité semblait similaire entre le sulfate de zinc et l’iodomercurate de
potassium (tab.7) puisque la détection s’effectuait en sulfate de zinc et en iodomercurate de
potassium.
Tableau 7: Comptage d'œufs de Dicrocoelium lanceolatum
Sulfate de
zinc
Iodomercurate
de potassium
Sulfate de
magnésium
Chlorure de
sodium
saccharose
Echantillon 12 0 3 0 0 0
Echantillon 13 0 2 0 0 0
Echantillon 14 3 0 1 0 0
Echantillon 15 4 0 0 0 0
Echantillon 16 2 2 0 0 0
Echantillon 17 2 1 0 0 0
Echantillon 19 3 1 0 0 0
Echantillon 20 0 1 0 0 0
Echantillon 22 0 2 0 0 0
Echantillon 24 0 1 0 0 0
Echantillon 25 0 1 0 0 0
Echantillon 27 2 0 0 0 0
Echantillon 28 2 0 0 0 0
Echantillon 29 2 1 0 0 0
Echantillon 30 4 2 0 0 0
Nous retrouvons donc avec les œufs de Dicrocoelium lanceolatum (de taille moyenne : 40µm
environ) le même comportement que pour les œufs de grande taille, comportement semblant
plus lié à la densité de l’élément parasitaire qu’à sa taille même. Dans ce cas précis, la faible
excrétion de Dicrocoelium lanceolatum a pour conséquence de ne pas détecter de différence
de sensibilité entre le sulfate de zinc et l’iodomercurate de potassium, qui sont les liquides les
plus sensibles quant à la détection de ces œufs.
4. Comparaison de deux densités pour le sulfate de zinc
Il nous a été permis au cours des expériences d’obtenir un liquide constitué de sulfate de zinc
heptahydraté dont la densité s’élève à 1.44. Il nous a semblé intéressant d’étudier les
différences apportées par l’augmentation de densité.
Nous avons alors réalisé les coproscopies pour 11 échantillons avec les 2 solutions de sulfate
de zinc de densité différente et avons étudié outre la détection des éléments parasitaires, la
lisibilité des lames.
78
a) Facilité de lecture
Nous avons dans un premier temps pu observer au cours des manipulations que les dilutions
fécales filtrées apparaissaient plus claires avec la solution de densité 1.44 qu’avec la solution
de densité 1.36 (fig.20).
Figure 20 : observation de la dilution fécale dans les 2 solutions de sulfate de zinc
Par ailleurs lors de l’observation des lames, nous avons pu constater que pour un même
échantillon, la présence de débris était moins importante avec la solution à 1.44 (cohérent
avec l’aspect du filtrat) mais également que la présence de bulles était diminuée dans cette
solution. Il apparaît donc que l’augmentation de la densité de la solution de sulfate de zinc
soit un moyen intéressant de remédier à la difficulté de lecture associée à ce liquide.
b) Détection des éléments parasitaires
Onze échantillons ont été testés à l’aide des 2 solutions de sulfate de zinc de densité 1.36 et
1.44. Le nombre réduit d’échantillon ne permet pas une analyse statistique des données, nous
ne pouvons donc en conclure qu’une tendance quant à l’impact de la densité d’une solution
sur la concentration des éléments parasitaires.
Tableau 8 : Comparaison du comptage des éléments parasitaires selon la densité du sulfate de zinc
Dilution fécale avec la solution
de sulfate de zinc de densité 1.36
Dilution fécale avec la solution
de sulfate de zinc de densité 1.44
79
Nous allons essayer, malgré le faible échantillonnage, de détecter l’influence d’une densité
plus élevée sur le dénombrement des différents éléments parasitaires déjà étudiés grâce aux
résultats obtenus (tab.8)
Concernant les œufs de trématodes rencontrés (Calicophoron daubneyi et Dicrocoelium
lanceolatum), nous n’observons pas de supériorité d’une solution par rapport à l’autre.
Concernant les œufs de strongles digestifs, nous observons des comptages différents dans les
2 solutions pour un même échantillon, cependant ces différences ne sont pas toujours les
mêmes : le comptage est parfois supérieur avec le sulfate de zinc à 1.36 (échantillons 2, 3, 4,
5, 9 et 11) et parfois avec la solution à 1.44 (échantillons 6, 7 et 8). Nous ne pouvons donc
pas conclure quant à un possible impact de la densité sur le dénombrement des œufs de
strongles digestifs.
Enfin en ce qui concerne les oocystes d’Eimeria, le nombre détecté dans le sulfate de zinc de
densité 1.44 est toujours inférieur à celui détecté dans celui à 1.36 quelque soit l’échantillon,
il semble donc qu’une densité élevée de la solution de flottation soit de faible intérêt dans la
recherche d’oocyste d’Eimeria.
Maintenant que nous avons vu les différents résultats obtenus, nous allons nous intéresser à
leur cohérence avec les données de la bibliographie.
IV. Discussion
A. But du travail
Le but de ce travail était de comparer le dénombrement et la facilité de lecture des
coproscopies de ruminants selon le liquide utilisé en flottation. Régulièrement les résultats de
coproscopie chez les ruminants sont rendus de façon semi-quantitative avec une
catégorisation visant à évaluer le niveau d’infestation des animaux.
Pour déterminer les niveaux de discordance de cette interprétation entre les liquides utilisés,
nous avons réalisé des séries de coproscopie sur échantillons différents mais également une
gamme de dilution pour évaluer la sensibilité des liquides par rapport à certains œufs. Mais
avant cela, il a fallu déterminer les liquides à utiliser. Cela est passé par une réflexion entre les
laboratoires des unités de Parasitologie et de Pathologie du Bétail de VetAgroSup mais
également par une enquête auprès des laboratoires départementaux de France.
L’analyse des résultats précédemment exposés va nous permettre, parallèlement à l’étude des
données bibliographiques de déterminer l’impact du liquide sur le dénombrement des œufs, la
lecture de la lame d’examen, les manipulations nécessaires et enfin sur le coût de l’examen.
80
B. Influence du liquide de flottation sur le résultat
1. Choix des liquides testés
Les 5 liquides utilisés dans les examens coproscopiques ont été choisis selon les résultats
obtenus par le questionnaire envoyé auprès des laboratoires départementaux.
Trois liquides apparaissaient comme les plus utilisés : le sulfate de zinc, le sulfate de
magnésium et l’iodomercurate de potassium. Parmi ces 3 liquides nous avons pu remarquer
que le sulfate de magnésium a été déclaré par plusieurs laboratoires en complément ou en
substitution (en cas de rupture) d’un des 2 autres liquides.
De la même façon, le 4ème
liquide le plus déclaré était le chlorure de sodium (5) qui est, pour
3 laboratoires, déclaré avec un autre liquide. Enfin le dernier liquide choisi, à savoir le
saccharose, est dans les 2 cas le second liquide déclaré.
Pour pallier à l’utilisation de plusieurs liquides, nous avions ajouté une question concernant
l’utilisation d’un autre liquide que celui utilisé en routine en cas de demande particulière.
Cependant les réponses à cette question se sont souvent révélées hors propos puisque les
laboratoires qui ont répondu de façon positive à cette question font mention d’une autre
technique (Test rapide de détection de giardia, ou technique de Baerman en vue de la
détection de larves de strongles respiratoires). Nous n’avons donc malheureusement pas de
précision, dans les cas de déclaration de 2 liquides, quant à la raison pour laquelle les
laboratoires utilisent plusieurs liquides, excepté les cas de substitution du liquide habituel par
le sulfate de Magnésium en cas de rupture de stock (précision fournie en cas d’utilisation de
sulfate de zinc et de magnésium).
Nous ne connaissons pas non plus la raison du choix du liquide pour tous les laboratoires.
Nous pouvons supposer que l’utilisation du iodomercurate de potassium par les 12
laboratoires l’ayant déclaré tient probablement à une habitude d’usage si l’on tient compte du
coût des composants, ainsi que de son potentiel toxique pour le manipulateur.
Nous devons ici préciser que lors d’entretien téléphonique avec certains laboratoires, il nous
avait été répondu que l’iodomercurate de potassium était interdit d’usage. Hors lors de nos
recherches en matière de réglementation (52), excepté des mesures de protection et de gestion
des déchets plus importantes compte tenu de la toxicité des composants du liquide, nous
n’avons trouvé aucun texte interdisant son usage dans le cadre d’un diagnostic coproscopique.
Nous pouvons supposer que le potentiel toxique de ce liquide et les politiques actuelles de
réglementation de l’usage de cette catégorie de produits sont les raisons pour lesquelles son
interdiction est supposée.
81
Il nous est apparu après dépouillement des résultats qu’il aurait été intéressant de faire
préciser les raisons du choix de la solution employée, nous avions cependant volontairement
limité le nombre de questions afin d’avoir un questionnaire le moins rébarbatif possible.
2. Comparaison des résultats
Lors de l’analyse des résultats obtenus au cours des expériences, nous avons séparé l’étude
des coproscopies selon le type d’éléments recherchés : œufs de trématodes, œufs de strongles
digestifs et oocystes d’Eimeria. Cette séparation est usuellement réalisée dans les études
concernant les techniques de coproscopies puisque la densité des éléments parasitaires joue un
rôle majeur dans leur concentration.
Afin de comparer nos résultats aux données bibliographiques rencontrées, nous allons
conserver ces 3 catégories d’études.
a) Détection des œufs de trématodes
Au cours de notre étude, nous avons pu déterminer que les liquides présentant la plus grande
sensibilité de détection des œufs de Trématodes étaient le sulfate de zinc et l’iodomercurate
de potassium.
Ces données sont en accord avec les différentes études réalisées au cours des années en ce qui
concerne la supériorité de ces 2 liquides sur les 3 autres testés (18, 45, 49).
Cependant nous pouvons remettre en question certaines conclusions de Raynaud, il affirme en
effet dans son article que l’utilisation du sulfate de zinc et de magnésium n’est pas
envisageable aux densités que nous avons utilisés (1.36 pour le sulfate de zinc, 1.28 pour le
sulfate de magnésium) car les lames obtenues sont trop peu lisibles à cause des débris
présents. Nous accordons que la lecture des lames en sulfate de zinc peut être difficile tant par
la présence de bulle et de débris que par le fait que les débris ont surtout tendance à se
rassembler en amas, cependant il est tout de même possible de détecter les différents éléments
parasitaires tant par leur taille que par leur contenu. De plus pour pallier à l’importance de
débris il est envisageable d’étaler ce qui s’est accumulé sous la lamelle sur la lame porte-objet
afin d’éclaircir la lame.
Par ailleurs l’ensemble de nos observations ne nous ne conduit pas à rejoindre l’avis de
Raynaud en ce qui concerne le sulfate de magnésium. Toutes les lames réalisées avec ce
liquide ont montré un fond très clair et une faible quantité de débris qui ne gênait aucunement
la détection des éléments parasitaires, ce liquide est même recommandé dans la recherche
d’’autres éléments parasitaires par Bello (6) en raison d’une plus grande facilité de lecture par
rapport au sulfate de zinc.
82
En ce qui concerne le côté dénombrement même, l’analyse statistique réalisée au paragraphe
II.B.1.a, concerne essentiellement les œufs de Calicophoron daubneyi qui ont été rencontrés
dans tous les échantillons positifs.
L’analyse statistique a révélé une différence significative dans le dénombrement entre le
sulfate de zinc et l’iodomercurate de potassium. L’observation des données conduit à
envisager un nombre d’œufs de Calicophoron daubneyi plus élevé en cas de concentration à
l’aide de l’iodomercurate de potassium qu’avec le sulfate de zinc. Cette observation est en
accord avec les données fournies par Cringoli et al (18), Raynaud (46) et Rinaldi et al (49).
Cependant le sulfate de zinc à la densité utilisée (1.36) était considéré par Raynaud de
sensibilité faible dans la détection de ces œufs. Les études menées par d’autres auteurs
(Gibson (29), Cringoli et al, Rinaldi et al) confirment la sensibilité du sulfate de zinc à une
telle densité dans le cadre de la détection des œufs de Trématodes tout en admettant la
difficulté de lecture liée à la présence importante de bulles et de débris sur la lame de
flottation.
En ce qui concerne les œufs de Dicrocoelium, que nous avons pu étudier grâce à quelques
échantillons mais aussi grâce à la réalisation des gammes de dilution, nous avons remarqué
qu’il ne semblait pas apparaître de différence de sensibilité entre le sulfate de zinc et
l’iodomercurate. En réalité la réalisation de la gamme seule laisserait penser que le sulfate de
zinc présenterait une plus grande sensibilité quant à la détection de ces œufs que
l’iodomercurate de potassium. Cependant les observations réalisées au cours des autres
coproscopies n’avaient pas laissé apparaître une telle tendance, ce qui nous a poussés à
adjoindre ces résultats à ceux de la gamme afin de limiter les risques d’erreur
d’interprétation.
Les études menées auparavant concernant ces œufs font mention d’une plus grande sensibilité
du iodomercurate de potassium que du sulfate de zinc à la densité 1.36 (18). Dans cette même
étude il est fait mention de l’utilisation d’une solution de sulfate de zinc de densité supérieure
(1.44) mais qui entrainerait une déformation des œufs. Lors de l’observation des échantillons
dans les 2 solutions de sulfate de zinc qui étaient à notre disposition, nous n’avons observé
aucune différence de taille, de coloration ou de forme des œufs en fonction de la densité du
liquide utilisé. Courouble déclare dans son étude rencontrer un nombre supérieur
d’échantillons positifs pour ce parasite avec le sulfate de zinc à 1.44 que l’autre équipe
utilisant l’iodomercurate de potassium (17), cependant la réalisation des expériences par 2
équipes différentes peut être à l’origine de nombreux biais, il ne fait pas mention de
déformation des oeufs.
83
Il apparaît au travers de notre travail, en ce qui concerne les œufs de Calicophoron daubneyi,
que la sensibilité la meilleure pour leur détection est obtenue avec le sulfate de zinc et
l’iodomercurate de potassium, et qu’entre ces 2 liquides le dénombrement est plus important
avec l’iodomercurate de potassium ce qui peut conduire à un ajustement des conclusions de
l’examen selon le liquide utilisé. Cependant la présence de trématodes sur une coproscopie est
souvent une raison suffisante pour justifier le traitement d’un cheptel au regard de leur
excrétion intermittente et relativement faible.
b) Détection des œufs de strongles digestifs
Les examens réalisés et l’étude statistique de leurs résultats ont montré une interprétation
considérée comme significativement différente entre :
- Le chlorure de sodium et le saccharose
- Le sulfate de zinc et le saccharose
- Le chlorure de sodium et l’iodomercurate de potassium.
La différence de sensibilité apparente entre le chlorure de sodium et le saccharose est un point
que l’on retrouve dans différentes études conduites par Bello (6), Cringoli (18), Levine et al
(39) sans avoir une différence significative d’un point de vue statistique. Dans notre cas nous
avons une différence significative qui ressort de l’analyse statistique sans pour autant qu’elle
paraisse évidente à l’observation des données. En mettant en parallèle ces différentes données,
nous pouvons envisager une sensibilité proche des liquides et donc une interprétation peu
différente selon le liquide utilisé.
Cependant l’intérêt en particulier de la solution de saccharose dans la concentration des œufs
de strongles digestifs avait été prouvé par Egwang et Slocombe (24) tout en tenant compte de
tous les paramètres techniques pouvant influencer cette concentration (centrifugation ou non,
temps, matériel) Ce liquide est par ailleurs neutre pour l’environnement et de réalisation aisée,
ce qui le rend d’autant plus intéressant dans la réalisation de coproscopie, tout autant dans le
cadre d’un cabinet vétérinaire que d’un laboratoire. La gestion des déchets n’est en effet que
peu problématique avec un tel liquide et le coût est modéré.
c) Les oocystes d’Eimeria
L’analyse des résultats concernant le dénombrement des oocystes d’Eimeria dans les
différents liquides testés a montré une nette infériorité de l’iodomercurate de potassium. En
effet la catégorisation de l’examen vis-à-vis de ces éléments parasitaires en iodomercurate se
trouve régulièrement à un niveau inférieur à celui obtenu avec les autres liquides.
Par ailleurs il est également ressorti lors de l’utilisation du sulfate de zinc à densité de 1.44,
que le dénombrement des oocystes était inférieur à cette densité par rapport au dénombrement
dans le sulfate de zinc à 1.36.
84
Ces observations sont en accord avec les données bibliographiques. En effet il a été observé
que dans un liquide de densité supérieure à 1.40, le dénombrement des coccidies était plus
faible que dans des liquides de densité moindre (21). Ceci peut également expliquer
l’utilisation par les laboratoires de 2 liquides distincts en diagnostic de routine.
L’observation des données concernant les autres liquides ne montre pas de différence majeure
et la gamme réalisée ne laisse pas apparaître de différence de sensibilité. Cependant l’analyse
statistique donne pour résultat une différence significative entre le chlorure de sodium et le
saccharose. L’observation des données montre que la moyenne de dénombrement est plus
faible en chlorure de sodium qu’en saccharose mais aussi qu’en sulfate de zinc et de
magnésium.
C. Biais
Les incohérences rencontrées entre les observations et les données de la bibliographie peuvent
se justifier de plusieurs façons. Comme nous l’avons précisé dans la première partie de ce
travail, l’excrétion d’œufs est différente pour tous les parasites du système digestif,
l’infestation des individus est différente selon l’âge de l’individu et le parasite recherché.
Mais nous rencontrons également un risque de biais au niveau de l’échantillonnage puisque
d’une part un prélèvement ne concerne qu’une faible part des selles produites
quotidiennement par un ruminant et d’autre part sur ce prélèvement, seuls quelques grammes
sont examinés. Le même échantillon a été testé dans les 5 liquides, au sein du même
laboratoire en suivant un même protocole.
1. Technique de flottation
Nous avons vu dans la première partie de ce travail que les techniques de concentration des
éléments parasitaires dans les fèces étaient nombreuses. Le choix de s’intéresser à la
concentration par la flottation se justifie par plusieurs points :
- C’est une technique qui permet la concentration de tout type d’éléments parasitaires en
une fois. Les techniques de sédimentation ou les méthodes diphasiques ont tendance à
cibler un type de parasite. Ainsi plusieurs études ont montré que les méthodes de
sédimentation montraient une grande sensibilité dans la détection des œufs de
trématodes, mais restent spécifiques de ces œufs (Raynaud et al (48), Duthaler et al
(23))
- C’est actuellement la technique la plus utilisée en laboratoire ou en pratique
vétérinaire de routine de part sa multivalence.
Nous avons laissé de côté les autres techniques de concentration en raison de leur spécificité
et du fait que la comparaison entre les différentes techniques de concentration ont fait l’objet
de nombreuses autres études.
85
2. Homogénéité de la technique
Un des points principaux lorsque l’on veut comparer des techniques de diagnostic est de
vérifier l’homogénéité des techniques. Cela a été mis en évidence par Levecke et al (38). Ils
ont souligné que, même si la sensibilité entre deux techniques était la même, la différence de
protocole pouvait être en elles même à l’origine d’une différence dans le dénombrement. Il a
donc fallu lorsque nous avons décidé du protocole d’expérience, choisir une méthodologie
répétable. Pour cela tous les prélèvements ont été pesés sur la même balance dont la tare était
vérifiée avant chaque pesée et chaque dilution a été centrifugée dans la même centrifugeuse
pendant le même temps et à la même vitesse.
Les prélèvements à mélanger au liquide de flottation sont déposés dans un verre à pied
gradué. L’ajout du liquide se fait en suivant la graduation. Ainsi environ 20ml du liquide de
flottation sont ajoutés, cependant la précision de la graduation étant de 5ml, on ne peut écarter
une imprécision à ce stade des manipulations.
Par la suite les dilutions fécales sont filtrées toujours de façon similaire et le filtrat est
transféré dans un tube de centrifugation dont la taille est standardisée, ainsi la quantité
examinée est toujours la même.
Nous avons ainsi cherché à éliminer tous les biais pouvant être reliés à la technique utilisée
que ce soit par le matériel, les quantités mais aussi par l’opérateur, puisque toutes les
manipulations ont été réalisées par la même personne.
3. Echantillonnage
Les échantillons de selles ont été prélevés dans différents élevages d’Allier, de Loire et du
Rhône, tant allaitants que laitiers.
Les animaux prélevés dans le cadre de ce travail avaient plus d’un an et avaient accès aux
pâtures. Ils n’avaient pas reçu de traitement antiparasitaire durant les 6 derniers mois.
Nous n’avons pas réalisé de catégorisation des échantillons selon l’âge des animaux car de
cette façon nous avions, de façon naturelle, différents niveaux d’excrétion. Comme nous
l’avons expliqué dans le paragraphe I de la partie 1, l’excrétion des œufs par certains parasites
est dépendante de l’immunité de l’hôte (cas des strongles digestifs en particulier). En
choisissant d’examiner toutes les classes d’âge sans faire de distinction pour la recherche d’un
type d’œufs en particulier, nous avons pu avoir des échantillons à faible teneur en éléments
parasitaires qui étaient à même de nous donner une indication quant à la sensibilité du liquide
utilisé.
Nous avons diversifié au maximum notre collecte d’échantillons afin d’obtenir le plus
possible d’éléments parasitaires différents, nous n’avons cependant pas eu l’occasion
86
d’observer d’œufs de Fasciola hepatica dans les coproscopies. Ce fait s’explique plus par la
particularité de l’excrétion des œufs que par l’échantillonnage en lui-même. L’excrétion des
œufs de Fasciola hepatica est intermittente et faible, ce qui rend la sensibilité d’un examen
coproscopique faible vis-à-vis de ce parasite (sans en diminuer l’intérêt comme ce fut montré
par Roberts et Suhardono (50) ou par Salem et al (51)).
La période d’échantillonnage peut également occasionner un biais puisque la recherche de
strongles digestifs ne sera réalisée que sur animaux en pâture (11) et la recherche d’œufs de
trématodes et en particulier de Fasciola hepatica sera plus instructive en période d’excrétion
maximale soit dans l’hiver en considérant à la fois la période prépatente de ces parasites et les
infestations les plus tardives (2, 8)
4. Prélèvement
Les protocoles de coproscopie usuels ne prévoient l’analyse que de quelques grammes de
fèces. Dans notre cas 5g de fèces étaient examinés, alors que les échantillons récoltés
pouvaient peser jusqu’à 200g de fèces.
La faiblesse de la quantité de fèces examinées est une des principales critiques que l’on peut
faire aux techniques de coproscopie chez les ruminants. C’est une des raisons pour lesquelles
il existe un tel nombre de techniques différentes, mais ce paramètre conduit surtout à réfléchir
à comment tirer le meilleur profit de l’examen d’une petite partie de l’échantillon.
Cela passe dans un premier temps par une homogénéisation de l’échantillon avant d’effectuer
le prélèvement pour examen. En mélangeant l’échantillon, le risque que le prélèvement réalisé
ne soit pas représentatif de l’échantillon obtenu est diminué. Cette homogénéisation est plus
ou moins facile à réaliser selon le conditionnement de l’échantillon (gant ou pot) et la quantité
fournie. Il est cependant primordial de ne pas omettre cette étape.
Certains auteurs conseillent de diluer une grande quantité de fèces dans l’eau puis après de
mélanger une partie de cette dilution au liquide de flottation (Cringoli et al (18)). Cependant
ce procédé ne nous semble pas assurer une répartition homogène des œufs, puisque même de
faible sensibilité, l’eau est tout de même un liquide permettant une concentration des œufs par
flottation et tout prélèvement dans la dilution risque donc d’être tout aussi biaisé que le
prélèvement dans un échantillon sans dilution préalable. Cette étape est proposée dans les
techniques conjuguant sédimentation et flottation puisque la dilution dans l’eau a pour
objectif l’élimination d’un maximum de débris avant de mélanger le filtrat obtenu avec une
solution de flottation plus dense (37).
Nous ne pouvons pour pallier à ce biais de prélèvement que suivre les conseils de Bosquet et
al (9) à savoir dans le cadre d’un individu, la répétition des coproscopies sur plusieurs jours et
dans le cadre d’un élevage un suivi parasitaire avec prélèvement de plusieurs individus, tout
en gardant en tête les particularités d’excrétion des différents parasites. La réalisation de
87
mélange de fèces d’animaux d’un lot est à envisager de façon très réfléchie comme le
souligne Pitre (44). En effet en cas de parasitisme faible des animaux, cela pourra passer
inaperçu du fait de la dilution que réalise ce mélange. Par ailleurs, lors d’une coproscopie
positive, il reste difficile de dire si tous les animaux ont le même niveau de parasitisme ou si
éventuellement un des animaux est plus infesté ce qui conduit alors à réaliser des examens
individuels.
88
89
CONCLUSION
90
91
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97
Annexe 1 : Protocole de sédimentation d’après la méthode de Faust et
Ingalls
Réactif :
Solution aqueuse à 0.5% de glycérine
Technique :
Dilution :
Triturer 5g de fèces dans la solution aqueuse à 0.5% de glycérine.
Tamisage :
Eliminer les détritus les plus volumineux en faisant passer la dilution sur une gaze
préalablement humidifiée (que l’on dispose en une ou plusieurs épaisseurs) ou sur
un tamis métallique, selon l’importance des débris, dans un entonnoir placé au-
dessus d’un verre à sédimentation, de 350ml environ.
Sédimentations multiples :
Remplir le verre où est collectée la suspension fécale avec de l’eau glycérinée.
Après une heure, décanter le liquide surnageant.
Remplir à nouveau le récipient avec de l’eau glycérinée
Laisser sédimenter pendant 45 minutes puis décanter.
Remettre en suspension dans de l’eau glycérinée
Laisser sédimenter pendant 30 minutes et décanter une dernière fois.
Examen :
Faire 3 prélèvements de 0.1ml dans le dépôt à des niveaux différents : surface,
liquide et fond.
98
Annexe 2 : Protocole de Concentration diphasique selon la méthode de
Bailenger
Réactif :
Tampon acéto-acétique à pH=5
- Acétate de sodium cristallisé : 15 g
- Acide acétique : 3.6 ml
- Eau distillée : 1000 ml
- Ajuster à pH=5 avec de l’acide acétique
Ether
Technique :
Dilution :
Délayer 2 à 3g de fèces dans environ 10 fois leur volume de solution tampon
Laisser sédimenter pendant moins d’une minute
Eliminer le sédiment (gros débris)
Décantation :
Placer la dilution fécale dans un tube à centrifuger
Emulsionner par agitation avec un volume égal d’éther
Centrifugation :
Centrifuger à 2000 tours/minute pendant 1 à 3 minutes.
Après centrifugation 4 phases sont présentes, seul le culot nous intéresse. Il faut
donc rejeter les 3 couches supérieures.
Examen :
Secouer le tube à centrifuger pour décoller le sédiment.
Si le sédiment est trop épais, il est possible d’ajouter quelques gouttes d’eau pour
le diluer, mais normalement le sédiment est convenable pour un examen direct sur
lame.
99
Annexe 3 : Protocole de flottation : méthode historique de Bass et
Fülleborn
Réactif :
Solution saturée de chlorure de sodium (25% environ, D=1.20)
Technique :
Dilution :
délayer avec soin 10g de selles dans 200ml de la solution saturée de chlorure de
sodium.
Flottation :
Passer la suspension homogène sur un tamis métallique et laisser au repos pendant
45 minutes environ
Examen :
à l’aide d’une anse métallique, faire en surface plusieurs prélèvements que l’on
dépose sur une lame pour procéder à l’examen microscopique.
100
Annexe 4 : Protocole de flottation : Méthode de Janesko et Urbanyi
Réactif :
Solution d’iodomercurate de potassium
Biiodure de mercure : 100g
Iodure de potassium : 74g
Eau distillée : 265ml
Faire dissoudre l’iodure de potassium dans le plus faible volume possible d’eau, puis ajouter
peu à peu et tout en agitant le biiodure de mercure. Après dissolution, diluer avec le reste de
l’eau. La solution doit atteindre une densité de 1.44
Technique :
Dilution :
Délayer 2g de selles (selon la consistance) avec 30ml du réactif
Tamisage :
Tamiser sur un tamis métallique
Flottation :
Centrifuger à 2500 tours pendant 3 minutes.
Examen :
Avec une anse métallique, prélever plusieurs gouttes à la surface du liquide et les
déposer sur une lame
Examiner entre lame et lamelle.
101
Annexe 5 : Protocole de flottation : méthode de Janesko-Urbanyi
modifiée par Bailanger
Réactif :
Solution d’iodomercurate de potassium
Biiodure de mercure : 10g
Iodure de potassium : 53g
Eau distillée :100ml
Faire dissoudre l’iodure de potassium dans le plus faible volume possible d’eau, puis ajouter
peu à peu et tout en agitant le biiodure de mercure. Après dissolution, compléter à 100ml avec
de l’eau distillée. La solution doit atteindre une densité de 1.44.
Technique :
Dilution :
Délayer les selles dans de l’eau distillée dans les proportions de 1g pour 15ml.
Tamisage :
Tamiser sur un tamis métallique et en remplir un tube à centrifuger
Centrifugation :
Centrifuger à 3000tours/min pendant 3 minutes
Eliminer la phase liquide
Flottation :
Délayer soigneusement le culot dans le réactif en l’ajoutant doucement d’abord
puis en quantité suffisante pour remplir le tube
Centrifuger 2 à 3 minutes aux environs de 2000 tours/minute.
Examen :
Avec une anse métallique, prélever plusieurs gouttes à la surface du liquide et les
déposer sur une lame
Examiner entre lame et lamelle.
102
Annexe 6 : Protocole de régénération du Iodomercurate de potassium
Réactif :
Iodure II de mercure pur
Iodure de potassium pur
Oxyde de calcium
Charbon animal
Acide chlorydrique
Phénolphtaléine
Technique de régénération
Verser 100g d’oxyde de calcium par litre de iodomercurate de potassium à
régénérer.
Mettre en agitation jusqu’à suspension parfaite, 3 fois de suite, à 30 minutes
d’intervalle
Laisser reposer une nuit.
Aspirer le surnageant puis le filtrer sur filtre 4µm.
Rajouter 2 litres d’eau (pour 10 litres au départ) dans le sédiment et procéder
comme en 2.
Filtrer l’ensemble (surnageant + sédiment) sur filtre 4µm.
Rajouter à l’ensemble du filtrat 15g de charbon animal par litre de solution à
régénérer.
Mettre en agitation comme en 2 et laisser reposer 2 heures
Filtrer sur filtre 4µm.
Au filtrat :
- Ajuster le pH neutre avec de l’acide chlorydrique pur (au virage de la
phénolphtaléine)
- Ajuster la densité à 1.44 en gardant les proportions de la solution mère (111g
de iodure de potassium pour 150g de iodure II de mercure)
.
103
Annexe 7 : Protocole de flottation : méthode de Faust
Réactif :
Solution de sulfate de Zinc (33%, D=1.18)
Technique :
Dilution :
Triturer soigneusement ensemble une partie de selles avec dix parties d’eau tiède.
Tamisage :
Faire passer 10ml environ de dilution fécale à travers une couche de gaze humide
disposée dans un entonnoir qui plonge dans un tube à centrifuger.
Centrifugations multiples :
Centrifuger pendant 45 à 60 secondes à 2300 tours/minute ; décanter le liquide
surnageant.
Reprendre le culot de centrifugation par 2 à 3ml d’eau ; centrifuger pendant 45 à
60 secondes à 2300 tours/minute.
Répéter 3 à 4 fois, jusqu’à ce que le liquide surnageant soit clair. Le rejeter une
dernière fois.
Flottation :
Mettre le sédiment en suspension dans 3 à 4ml de la solution aqueuse de sulfate de
zinc. Remplir le tube avec la solution de sulfate de zinc, à un demi-pouce environ
du bord.
Ne pas agiter.
Centrifuger pendant 45 secondes à 60 secondes à 2300tours/minute.
Examen :
Avec une anse métallique, prélever plusieurs gouttes à la surface du liquide et les
déposer sur une lame aussitôt après la centrifugation.
Examiner entre lame et lamelle.
104
Annexe 8 : Questionnaire
METHODES UTILISEES POUR LE DIAGNOSTIC COPROLOGIQUE CHEZ LES
RUMINANTS.
Nous sommes étudiantes vétérinaires et dans le cadre de notre thèse d’exercice vétérinaire nous cherchons à
connaitre les méthodes utilisées en coprologie chez les ruminants dans les laboratoires départementaux.
Merci de votre participation à cette étude.
Quel est votre département ? : ……………
Quels sont vos tarifs en parasitologie ?
- Coprologie simple (qualitative) : …………………… €
- Coprologie quantitative (mac master) : ………………. €
- Recherche spéciale : de giardia : ………….. € de cryptosporidies : ………………. €
Méthode de flottation
a) Quel liquide de flottation utilisez-vous en routine (merci de préciser sa densité) :
Iodomercurate de potassium Sulfate de zinc Sucrose
Chlorure de sodium Chlorure de zinc Autre (précisez) : …………………...
b) Réalisez-vous une coproscopie : Qualitative Semi-quantitative Quantitative
c) Quelle est la durée d’une coproscopie simple ? ……………….
d) Quelles mesures de sécurité et hygiène sont en place lors de la manipulation des liquides :
Port de gants Port de masque Manipulation sous hotte Recyclage
Autre : ……………………………………………………………….
e) En cas de demande diagnostique précise, utilisez-vous d’autres liquides :
OUI NON si oui lesquelles : …………………………………
Colorations des protozoaires en coproscopie
a) Quelles colorations utilisez-vous en routine :
Ziehl-Neelsen modifié Heine Saccharose Lugol
MIF Autres : (précisez) ………………………………………………….
b) Quelles colorations utilisez-vous lors d’une demande spécifique (précisez le type de parasite recherché)
Ziehl-Neelsen modifié …………………. Heine ………………….. Saccharose
…………..
Lugol …………….. MIF …………. Autres : (précisez)
…………………………………….
c) Quelle est la durée d’une coloration : ………………………..
d) Quelles sont les raisons qui vous ont fait choisir les colorants :
Coût Facilité de préparation Type de parasite recherché Facilité de lecture
e) Si vous utilisez la coloration de Zieh-Neelsen modifié, quelles sont les durées et la concentration des
produits pour chaque étape :
Fixation méthanol : ………….. min
Décoloration acide sulfurique : …… %, tps:……
Coloration fuchsine phéniquée : ………. min
Recoloration vert de Malachite : ………… sec
105
Annexe 9 : Préparation des liquides de flottation
Chlorure de sodium (densité = 1.20):
- Diluer du Chlorure de Sodium dans l’eau dans les proportions de 320g pour 1L
(solution à saturation)
- Mettre en agitation jusqu’à obtention d’une solution limpide
- Conserver en bouteille à température ambiante
Saccharose (densité = 1.26):
- Diluer du saccharose dans l’eau dans les proportions de 200g pour 150ml. (ce
liquide a été préparé en petite quantité à chaque fois pour des raisons de
conservation)
- Mettre en agitation jusqu’à obtention d’une solution limpide.
- Conserver au réfrigérateur.
Sulfate de Magnésium (densité = 1.27):
- Diluer du sulfate de magnésium dans l’eau dans les proportions de 300g pour 1L
(solution à saturation)
- Mettre en agitation jusqu’à obtention d’une solution limpide
- Conserver en bouteille à température ambiante
Sulfate de Zinc (densité = 1.36):
- Diluer du sulfate de Zinc heptahydré dans l’eau dans des proportions de 1kg pour
1L
- Mettre en agitation jusqu’à obtention d’une solution limpide
- Conserver en bouteille à température ambiante
Pour le Sulfate de Zinc et le Sulfate de Magnésium, des récipients sont prévus pour la
récupération.
106
Annexe 10 : Protocole de coproscopie par flottation
Réactifs :
Solution de chlorure de sodium à densité 1.20
Solution de saccharose à densité 1.26
Solution de sulfate de Magnésium à densité 1.27
Solution de sulfate de Zinc à densité 1.36 et à 1.44
Solution d’iodomercurate de potassium à densité 1.44
La réalisation des différents liquides est expliquée en annexe 8.
Technique :
Prélèvement :
- Homogénéiser l’échantillon
- Prélever 5g de fèces
Dilution :
Délayer les selles dans 20 ml de réactif.
Tamisage :
Tamiser sur un tamis métallique recouvert d’une gaze
Remplir un tube à centrifuger avec 15ml du filtrat obtenu jusqu’à former un
ménisque au dessus du tube.
Flottation:
Recouvrir le tube d’une lamelle
Centrifuger à 1500tours/min pendant 5 minutes
Examen :
Déposer la lamelle sur une lame
Examiner au microscope
107
Annexe 11 : Protocole de comptage en lame de Mc Master
Réactif :
Solution de sulfate de Zinc à densité 1.37
Technique :
Prélèvement :
- Homogénéiser l’échantillon
- Prélever 5g de fèces
Dilution :
Délayer les selles dans 70 ml de réactif.
Tamisage :
Tamiser sur un tamis métallique recouvert d’une gaze
Prélever 1ml pour réaliser la lame de McMaster et 15ml pour réaliser une lame de
contrôle par flottation
Lame de McMaster :
Prélever 1ml de la dilution fécale et déposer 0.5ml dans chaque chambre de la
lame
Compter les œufs présents dans la grille des 2 chambres
Appliquer la formule [(n1+n2)/2]*100 pour obtenir le nombre d’œufs par gramme
de fèces
Lame de flottation:
Remplir un tube à centrifugation de 15ml de dilution fécale et le recouvrir d’une
lamelle
Centrifuger à 1500tours/min pendant 5 minutes
Déposer la lamelle sur une lame
Examiner au microscope.
En cas de présence d’éléments parasitaires qui étaient absents en lame de Mc
Master, on estime que leur nombre est inférieur à 50 éléments par gramme de
fèces.
RICHARD FABIENNE
TITRE : Comparaison de différents liquides de flottation en coproscopie
chez les ruminants
Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 21 décembre 2012
RESUME :
Dans le cadre du diagnostic parasitaire, individuel ou d’un troupeau, la coproscopie est un examen
intéressant de part sa facilité de mise en œuvre et son coût. La méthode de concentration des éléments
parasitaires la plus utilisée est celle par flottation, qui peut être réalisée avec de nombreux liquides ne présentant pas tous la même sensibilité.
Une enquête auprès des laboratoires vétérinaires départementaux nous a permis de déterminer les
liquides les plus utilisés : sulfate de zinc, iodomercurate de potassium, sulfate de magnésium, chlorure de sodium et saccharose. Nous avons réalisé des coproscopies avec ces 5 liquides sur des prélèvements
récoltés auprès de différents élevages. Nous avons comparé l’estimation du nombre d’éléments
parasitaires mais aussi la facilité de lecture selon le liquide utilisé et le coût du liquide. Il apparaît que l’iodomercurate de potassium est le plus sensible dans la détection des œufs de
trématodes et le moins sensible pour la détection des oocystes d’Eimeria ; il présente également un
coût élevé et son potentiel toxique implique des mesures de protection particulières. Les solutions de
saccharose et de chlorure de sodium sont très intéressantes dans la détection des œufs de strongles digestifs et des oocystes d’Eimeria, mais ne présentent pas d’intérêt pour les œufs de trématodes. Le
sulfate de zinc présente une bonne sensibilité dans la détection des différents éléments parasitaires et
son coût en font un liquide de choix en coproscopie des ruminants.
MOTS CLES : - Fèces
- Flottation - Réactifs - Bétail - Parasites
- Ruminants
JURY :
Président : Monsieur le Professeur Jean-Alain CHAYVIALLE
1er Assesseur : Monsieur le Professeur Lionel ZENNER
2ème Assesseur : Madame la maître de conférence Marie Anne ARCANGIOLI
DATE DE SOUTENANCE : 21 décembre 2012
ADRESSE DE L’AUTEUR :
Le bourg
03120 BARRAIS-BUSSOLLES