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Sérodiagnostic de la Syphilis

VDRL-TPHA

Par : S / Abdessemed

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INTRODUCTION• Le diagnostic sérologique repose sur la

mise en évidence des anticorps induits par l’infection et retrouvés dans le sérum.

• Le sérum est traité pour retirer certaines substances qui peuvent gêner la technique ce qui aboutit à une certaine dilution

• Le patient doit être de préférence à jeun

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Les réactions sérologiques

Réaction à antigènenon tréponémique (Ag cardiolipidique)

Réaction à antigènetréponémique

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:VDRL( veneral disease research laboratory)

Principe:

Réaction d’agglutination passive sur lame en verre.

Antigène utilisé est d’origine cardiolipidiqueconstitué de microcristaux de cholestérol sur lesquels sont adsorbés les molécules de cardiolipide = Haptène de Wasserman.

Des particules de charbon sont piégés dans la combinaison Ac-Ag pour faciliter la lecture.

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Matériel et réactifs

Sérum frais. Eau physiologique. Antigène VDRL près à l’emploi. Matériel:

CentrifugeuseMicropipettes réglables ( 5-50µL)Plaques en verre Portoir pour tubes à hémolyse Agitateur rotatif de KlineContainer de déchets contaminés Eau de Javel

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Mode opératoire:

Réaction qualitative Réaction quantitative

( dépistage) (dépistage positif)

Deux types de réactions

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Réaction qualitative

Distribuer 50µL de sérum sur chaque puit de la plaque en verre.

Ajouter 16µL d’Antigène VDRL.

Placer la plaque sur l’agitateur de Kline pendant 8mn.

Lire immédiatement au microscope.

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Puits

Témoin + Témoin - Témoin

Ag VDRL

Sérum

inconnu

Sérum 50 µl de S + 50 µl de S - 50µL d’eau

physiologique

50 µl de

sérum

inconnu.

Antigène

VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl

Placer sur un plateau rotatif (agitateur de kline) pendant 8

minutes.

Lecture + - -

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Pas d‘agglutination

Agglutination : +

Lecture

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Lecture

Agglutination : +++

Agglutination : ++

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Réaction quantitative

Lorsque la réaction qualitative est positive on réalise la même réaction avec une série de dilution du sérum au (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,1/32…) avec de l’eau physiologique.

Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction positive nette.

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Puits

1 2 3 4 5

Eau

physiologique 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl

Dilution 1 / 2 1 / 4 1 / 8 1 / 16 1 / 32

Sérum à

analyser

En µl

50

reporter reporter

50

reporter 50 reporter 50 jeter 50µl

dans l’eau de

Javel

Ag VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl 16µl

agitation pendant 8 minutes.

Lecture

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TPHA: ( Treponema pallidum hemagglutination assay)

Principe: Réaction d’hemmagglutination passive réalisée

sur des microplaques.

L’Antigène utilisé est un lysat de tréponemapallidum adsorbé sur des hématies.

Le dépistage consiste à tester le sérum à la dilution de 1/80.

Des dilutions sont effectuées pour le titre dans le cas du dépistage positif.

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Matériel et réactifs

Sérum frais Coffret de réactif pour TPHA:o Hématies testso Hématies contrôleso Diluanto Témoin positifo Témoin négatif

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o Centrifugeuse o Micropipette réglable (5 -50 µL),( 50 –200 µL)

o Pipette multicanaux o Plaque de microtitration à fond en U

o Portoir pour tubes à hémolyseo Container de déchets contaminés

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Mode opératoire:

Deux types de réactions

Réaction qualitative Réaction quantitative

( dépistage) (dépistage positif)

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Technique qualitative • 1. chaque échantillon va utiliser 3 puits de la

plaque.• 2. Déposer 190µl de diluant et 10 µl de sérum

dans le puit 1.• 3. Avec une pipette, mixer le contenu du puit

1 et en transférer 25µl aux puits 2 et 3.• 4. Homogénéiser complètement le réactif

TPHA et le contrôle TPHA. Ajouter 75 µl de contrôle TPHA au puit 2 et 75 µl de réactif TPHA au puit 3.

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• 5-Agiter doucement la plaque jusqu’ à obtenir un mélange homogène de manière à être sur d’éviter une contamination croisée.

• 6. incuber la plaque pendant 45 à 60 minutes à 18-25°C. Pendant l’incubation, garder la µplaque bien à l’abri de sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations.

• 7. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci-dessus respectées.

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Cupule

A B C

Diluanten µl

190

Sérumen µl

10 25 *25 *

HS en µl 75

HNS en µl 75

Lecture + + +

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Puit 1 : voile uniforme couvrant tout le puit→ Fortement positif.Puit 2 : voile couvrantle 2/3 du puit →

Moyennement positif.Puit 3 : voile couvrantle 1/3 du puit →

Faiblement positifs.Puit 4 : Anneau très serré à bord nets (absence de voile) → Négatif.

Lecture des résultats

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Résultats Cupules échantillons Cupules de contrôle

Fortement positif Aspect de voile couvrant uniformément le fond de la cupule

Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact

Faiblement positif Aspect de voile couvrant approximativement 1/3 du fond de la cupule

Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact

indéterminé Aspect de voile montant clairement un anneau central distinct (voile non uniforme)

Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact

Négatif Aspect de bouton compact montrant clairement un petit anneau central clair

Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact

Non spécifique Réaction positive Réaction positive

Interprétation des résultats

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Technique quantitative • 1. Chaque échantillon va utiliser 8 puits de

la plaque labellisés de A à H.• 2. Déposer 25µl de diluant dans les puits de

B à H uniquement.• 3. Transférer 25µl de sérum dilué au 1/20

dans les puits A et B uniquement.• 4. Prendre 25 µl du sérum dilué du puit B et

effectuer des doubles dilutions du sérum des puits B et H inclus et éliminer les 25 µl de sérum du puit H.

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• Ajouter 75µl de réactif TPHA au puit A à H inclus.

• 6. Agiter doucement la plaque jusqu’à obtenir un mélange homogène.

• 7. Incuber la plaque pendant 45 à60 minutes à 18-25°C. pendant l’incubation, garder la plaque bien à l’abri des sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations.

• 8. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci-dessus respectées.

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Cupule

A B C D E F G H

Diluant

en µl25 25 25 25 25 25 25

Sérum

1/20 en µ

l

25 25 * 25* 25* 25* 25* 25* 25**

HS en µl 75 75 75 75 75 75 75 75

Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240

Lecture + + + + + - - -

Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ).

* : reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche.

**: jeter 25 µl dans l'eau de javel.

25

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Absorption non spécifique • 1. Déposer 100µl de l’échantillon dans un

petit tube et ajouter 400µl de contrôle TPHA.

• 2. Bien mélanger le tube

• 3. Centrifuger le tube 15 minutes à 1000 rpm et tester le surnageant par la méthode qualitative.

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• 4. Remarque : l’échantillon est maintenant à 1/5 ; ceci doit être pris en compte lors de la préparation des dilutions.

• 5. Si le résultat est de nouveau non spécifique, l’échantillon doit être testé par une autre technique telle que le FTA-ABS.

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