TPHA 200 72503 500 72504

KITS POUR LA DETECTION QUALITATIVE ET SEMI-QUANTITATIVE DES ANTICORPS ANTI-TREPONEMA PALLIDUM DANS LE SERUM OU LE PLASMA HUMAIN PAR HEMAGGLUTINATION PASSIVE

883683 - 2014/12

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TABLE DES MATIERES

1. UTILISATION PREVUE ............................................................................. 2 2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST ....................................................... 2 3. PRINCIPE DU TEST ................................................................................. 2 4. REACTIFS ............................................................................................... 3 5. AVERTISSEMENTS ET MESURE DE PRECAUTION ................................. 3 6. ECHANTILLONS ...................................................................................... 5 7. PROCÉDURE .......................................................................................... 5 8. LIMITES DU TEST .................................................................................... 9 9. CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES .......................................... 10 10. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUE. ....................................................... 12

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1. UTILISATION PREVUE Ces kits sont destinés à être utilisés pour la détection qualitative et semi-quantitative des anticorps dirigés contre Treponema pallidum dans le sérum et le plasma humain. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des donneurs de sang et comme aide pour le diagnostic des patients pour lesquels une infection par la Syphilis est soupçonnée.

2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST La Syphilis est une infection chronique évoluant au travers d'étapes distinctes : primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire. Ces étapes présentent divers symptômes cliniques, produisant typiquement les chancres initiaux puis l'éruption syphilitique suivie de longues périodes d'inactivité. Une infection non traitée peut éventuellement entraîner des problèmes cardiovasculaires et une neurosyphilis. L’infection est causée par un spirochète, Treponema pallidum, transmis généralement par contact sexuel bien que la Syphilis puisse également être transmise par transfusion de sang contaminé. Il peut également y avoir une transmission intra-utérine. Le tréponème s’étant avéré pratiquement impossible à cultiver en milieu synthétique, le diagnostic de l'infection repose généralement sur la détection des anticorps dans le sang, qui apparaissent peu après l'infection initiale et peuvent persister pendant des années. Les tests pour la Syphilis se divisent en quatre catégories : l'examen microscopique direct; les tests de dépistage des anticorps tréponémiques; les tests de dépistage des anticorps non tréponémiques et les tests directs de dépistage des antigènes. A cause des longues périodes d'inactivité et de la nature non spécifique des tests non tréponémiques, les méthodes détectant les anticorps spécifiques anti-tréponème dans les échantillons de patients sont de plus en plus utilisées pour le dépistage. Le test TPHA est l'un de ces tests.

3. PRINCIPE DU TEST Les kits TPHA font appel à des hématies aviaires spécialement conservées sensibilisées par des antigènes de T. pallidum (souche de Nichols), qui se lieront aux anticorps spécifiques présents dans le sérum ou plasma du patient. Ces cellules sont en suspension dans un milieu contenant des substances destinées à éliminer les réactions non spécifiques. Les réactions positives sont indiquées par l’agglutination de ces hématies et les réactions négatives par la formation d’un précipité de ces hématies en forme de bouton ou de petit anneau. Bien que ce kit soit destiné essentiellement à un usage qualitatif, il est également possible de titrer le taux d’anticorps par dilution de raison 2. L’interprétation de l’agglutination se fait par une lecture visuelle ou à l’aide d’un lecteur de plaque capable de discerner les différents types d’agglutination.

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4. REACTIFS

4.1. Description

Identification de l’étiquetage Description

Présentation/Préparation 72503 72504 200 tests 500 tests

R1 Test Cells

Cellules Test Suspension d’hématies aviaires sensibilisées par des antigènes de T. pallidum, contenant de la S.A.B. (albumine de sérum bovin)

2 flacons 7,8 ml

2 flacons 20 ml

R2 Control Cells Cellules Contrôle Suspension d’hématies aviaires, contenant de la S.A.B.

2 flacons 7,8 ml

1 flacon 20 ml

R3 Diluent Diluant Solution saline contenant du sérum de lapin

2 flacons 20 ml

1 flacon 125 ml

R4 Positive Control

Contrôle Positif Sérum humain contenant des anticorps anti-T. pallidum, négatif en Ac VIH 1/2, Ac VHC et Ag HBs et dilué en tampon Phosphate

1 flacon 1 ml

1 flacon 1 ml

R5 Negative Control Contrôle Négatif Sérum de lapin en tampon Phosphate

1 flacon 1 ml

1 flacon 1 ml

4.2. Conditions de conservation et de manipulation La trousse doit être conservée à +2-8°C. Stocker les flacons verticalement. Ne pas congeler. Chaque élément de la trousse conservé à +2-8°C peut être utilisé jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le coffret. Après ouverture et en l’absence de contamination, les réactifs R1, R2, R3, R4 et R5 conservés à +2-8°C sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.

5. AVERTISSEMENTS ET MESURE DE PRECAUTION Pour utilisation en diagnostic in vitro par un professionnel de santé.

5.1. Précautions relatives à la santé et à la sécurité § Ce coffret doit être manipulé uniquement par du personnel qualifié formé

aux procédures de laboratoire et familier avec leurs risques potentiels. Porter des vêtements protecteurs appropriés, gants et protection des yeux/visage et manipuler de manière appropriée selon les bonnes pratiques de laboratoire requises.

§ La trousse contient des composants du sang humain. Les composants

d’origine humaine utilisés dans la préparation des réactifs ont été testés et trouvés non réactifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B (Ag HBs) et en anticorps anti VIH-1/anti VIH-2 et anti-VHC. Aucune méthode

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d’analyse connue ne peut offrir une complète assurance que des agents infectieux sont absents. Par conséquent, tous les dérivés du sang humain, réactifs et échantillons humains, doivent être manipulés comme s’ils étaient capables de transmettre une maladie infectieuse, en suivant les précautions universelles recommandées pour les pathogènes sanguins comme définies par les réglementations nationales, régionales et locales.

§ Projections Biologiques : les projections de matériel humain doivent être

traitées comme potentiellement infectieuses. Les projections ne contenant pas d’acide doivent être immédiatement décontaminées (incluant la zone de projection, le matériel et toute surface contaminée ou équipement) avec un désinfectant chimique approprié qui doit être efficace pour les risques potentiels relatifs aux échantillons impliqués (communément une dilution à 1:10 d’eau de Javel, 70-80% d’Ethanol ou Isopropanol, un iodophore tel que 0,5% Wescodyne™ Plus, etc.), et séchées. Les projections contenant de l’acide doivent être absorbées (essuyées) de manière appropriée ou neutralisées, la zone lavée avec de l’eau et séchée; le matériel utilisé pour absorber la projection peut nécessiter d’être jeté dans une poubelle pour risque biologique. Ensuite la zone doit être décontaminée avec un des désinfectants chimiques.

NOTE : Ne pas mettre des solutions contenant de l’eau de Javel dans l’autoclave !

§ Jeter tous les échantillons et le matériel utilisés pour réaliser le test

comme s’ils contenaient un agent infectieux. Les déchets de laboratoire, chimiques ou biologiques doivent être manipulés et jetés selon les réglementations locales, régionales et nationales.

§ La fiche de données de sécurité du produit est disponible sur www.bio-

rad.com.

5.2. Précautions relatives au protocole 5.2.1. Préparation

La qualité des résultats dépend du respect des bonnes pratiques de laboratoire suivantes : • Ne pas mélanger ou associer des réactifs de lots différents au cours d’une même

série. • Ne pas utiliser des réactifs dont la validité est expirée. • Avant utilisation, sortir les réactifs de la boîte et attendre 30 minutes que les réactifs

s'équilibrent à température ambiante (18-30°C).

5.2.2. Réalisation • Ne pas changer le mode opératoire. • Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque échantillon.

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6. ECHANTILLONS Les échantillons de sérum ou plasma (EDTA, Citrate de Sodium, Héparine et ACD) ne doivent pas contenir des cellules sanguines ni de contamination microbienne évidente. Ils peuvent être stockés entre +2-8°C jusqu’à 7 jours avant d’être testés. Les échantillons devant être conservés plus longtemps devront être congelés à -20°C minimum. Les échantillons congelés devront être décongelés et bien homogénéisés avant le test. Eviter les congélations / décongélations répétées (au-delà de 5 cycles de congélation / décongélation). Les échantillons qui ont été traités par chauffage à 56°C pendant 3 heures peuvent être utilisés. Les échantillons contenant jusqu’à 100 mg/l de bilirubine, 36 g/l de triglycéride et 10 g/l d’hémoglobine n’affectent pas les résultats. Il est cependant recommandé de ne pas utiliser des échantillons de sérum ou de plasma hyper lipémiques et hyper hémolysés. Si les échantillons doivent être expédiés, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents étiologiques et les transporter préférablement congelés.

7. PROCÉDURE Remarque : Les Contrôles Positifs et les Contrôles Négatifs du kit (R4 et R5) doivent être utilisés dans chaque série de tests.

7.1. Equipements nécessaires mais non fournis • Eau distillée ou complètement déminéralisée • Eau de javel et bicarbonate de soude • Papier absorbant • Gants à usage unique • Lunettes de protection • Tubes à usage unique • Pipettes automatiques ou semi-automatiques réglables ou fixes pouvant

distribuer 10 µl, 25 µl, 75 µl et 190 µl • Agitateur de microplaque • Microplaque à 96 puits (plaque à fond en U) – Code 83375 (5 plaques) • Conteneur de déchets contaminés

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7.2. Mode opératoire 7.2.1. Test Qualitatif

3 puits de la plaque à fond en U sont nécessaires pour chaque échantillon. Le kit TPHA 500 (Code produit 72504) est destiné au dépistage d’un grand nombre d’échantillons mais ne contient seulement qu’un faible volume de Cellules Contrôle (R2). Il est conçu de manière à ce qu’en première intention, les échantillons ne soient testés qu’avec des Cellules Test (R1), les Cellules Contrôle n’étant utilisées que pour les tests répétés avec les échantillons positifs au premier test.

a. Dilution des échantillons et Contrôles (1 :20) Ajouter 190 µl de Diluant (R3) dans un puits. Ajouter 10 µl d’échantillon ou de Contrôle Positif (R4) ou Contrôle Négatif (R5) dans le même puits. Bien homogénéiser.

b. Test Transférer 25 µl de Contrôle dilué ou d’échantillon dilué de la première étape de dilution (a) dans le puits de test. Transférer 25 µl de Contrôle dilué ou d’échantillon dilué de la première étape de dilution (a) dans le puits de contrôle. Remettre en suspension les Cellules Test (R1) et les Cellules Contrôle (R2) en agitant le flacon. Bien vérifier qu’elles ont été complètement remises en suspension. Ajouter 75 µl de Cellules Test (R1) dans le puits de test et 75 µl de Cellules Contrôle (R2) dans le puits de contrôle. La dilution finale de l’échantillon est de 1: 80. Bien homogénéiser le contenu des puits. Incuber à température ambiante (15-30°C) sur une surface sans vibration pendant une durée minimum de 45 minutes. Déterminer s’il y a eu agglutination. Celle-ci est stable pendant au moins trois heures si on ne touche pas à la plaque.

7.2.2. Test semi-quantitatif 9 puits d’une microplaque en U sont nécessaires pour chaque échantillon. Un puits pour la dilution de l’échantillon ou du contrôle et 8 puits restants pour la titration. Remarque : Les Contrôles Positifs et Négatifs (R4 et R5) doivent être utilisés dans chaque série de tests en suivant la procédure quantitative donnée ci-dessous.

a. Dilution des échantillons et Contrôles (au 20ème) Ajouter 190 µl du Diluant (R3) dans un puits. Ajouter 10 µl d’échantillon ou de Contrôle Négatif (R5) ou Contrôle Positif (R4) dans le même puits. Bien homogénéiser.

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b. Titration Laisser le 1er puits vide et ajouter 25 µl de Diluant (R3) dans chacun des 7 puits restants.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 190µl (R3) + 10 µl d’échantillon ou (R4) ou (R5)

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

Dilution d’échantillon ou de Contrôles

8 puits pour la titration

Transférer 25 µl du Contrôle ou échantillon dilué de la 1ère cupule dans le puits vide et dans le 2ème puits. Homogénéiser. Diluer en série le long de la ligne de puits en jetant les 25 µl excédentaires du puits final.

c. Test Mélanger doucement les Cellules Test (R1) afin d’assurer une remise en suspension complète. Distribuer 75 µl de Cellules Test (R1) dans chaque cupule. La plage de dilution finale des échantillons après addition de la suspension de cellules est de 1 à 80 – 1 à 10240. Bien mélanger.

0 1 2 3 4 5 6 7 8

190µl (R3) + 10 µl

d’échantillon ou (R4) ou

(R5)

25 µl de

contrôle dilué

25 µl de R3 +

25 µl de

contrôle dilué

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

25 µl de R3

Dilution d’échantillon ou de Contrôles

8 cupules pour la titration

25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl

Jeter les 25 µl excédentaires

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Incuber à température ambiante (15 à 30°C) sur une surface sans vibration pendant 45 minutes minimum. Déterminer s’il y a eu agglutination. Celle-ci est stable pendant au moins trois heures si on ne touche pas la plaque. Le titre de l’échantillon est l’inverse de la plus haute dilution ayant donné une agglutination.

7.3. Contrôle qualité Les contrôles du kit doivent donner des résultats corrects ; le Contrôle Négatif (R5) est négatif et le Contrôle Positif (R4) est positif. Lorsque le Contrôle Positif (R4) du kit est titré, le point de fin de titrage est compris entre 1 :640 et 1 :5120.

7.4. Interprétation des résultats / Critères de validation du test

Cellules Test Cellules Contrôle

Fortement positif Couche régulière de cellules couvrant le fond du puits

Bouton négatif

Faiblement positif

Couche régulière de cellules couvrant environ 1/3 du fond du puits

Bouton négatif

Indéterminé Couche de cellules nettement manquante au centre

Bouton négatif

Négatif Cellules formant un dépôt en forme de bouton compact, souvent avec un petit centre transparent

Bouton négatif

Réaction non-spécifique Réaction positive Réaction

positive

0 1 2 3 4 5 6 7 8

190µl (R3) + 10 µl

d’Echantillon ou (R4) ou

(R5)

25 µl de

contrôle dilué + 75µl de

R1

25 µl de

dilution + 75 µl de R1

25 µl de

dilution + 75 µl de R1

25 µl de

dilution + 75 µl de R1

25 µl de dilution + 75 µl de R1

25 µl de

dilution + 75 µl de R1

25 µl de dilution + 75 µl de R1

25 µl de dilution + 75 µl de R1

1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 Dilution d’échantillon ou de Contrôles

8 puits pour la titration

Négatif Equivoque Positif

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Un échantillon pour lequel les Cellules Test sont non réactives doit être considéré comme négatif au T. pallidum. Une réactivité inférieure à un résultat équivoque est considérée comme négative. Que l’échantillon donne un résultat équivoque ou positif, il doit être considéré comme positif, et la procédure de test répétée comme ci-dessus, en double, en ajoutant la suspension de Cellules Contrôle (R2) dans une série de puits et les Cellules Test (R1) dans l’autre. Si dans au moins l’un des puits avec les Cellules Test (R1), le résultat est équivoque ou positif, l’échantillon devrait être considéré comme positif au T. pallidum. Pour les réactions non-spécifiques, si l’agglutination est plus importante avec les Cellules Test (R1) qu’avec les Cellules Contrôle (R2), l’échantillon est donc considéré comme positif et doit être répété comme indiqué ci-dessus. Lorsque l’échantillon donne une agglutination plus importante ou équivalente avec les Cellules Contrôle (R2) alors l’échantillon doit être absorbé en utilisant la procédure suivante.

7.5. Absorption des réactions non-spécifiques (Procédure à utiliser si l’on détecte une agglutination avec à la fois les Cellules Test et Contrôle)

1. Ajouter 10 µl d’échantillon à 190 µl de Cellules Contrôle remises en suspension, bien homogénéiser et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. 2. Centrifuger à 1500 g pendant 3 min minimum pour déposer les cellules. 3. Ajouter 25 µl du surnageant provenant de l’étape 2 dans 2 puits. 4. Mélanger doucement les Cellules Test et Contrôle afin d’assurer une remise en suspension complète. Ajouter 75 µl de Cellules Test (R1) dans le 1er puits. Ajouter 75 µl de Cellules Contrôle (R2) dans le 2e puits. 5. Bien homogénéiser et incuber à température ambiante pendant 45 min minimum. 6. Lire et interpréter les résultats comme ci-dessus.

8. LIMITES DU TEST Aucun test ou standard de référence n’est disponible pour chaque stade de la maladie. Ainsi, le diagnostic de la Syphilis repose essentiellement sur des tests sérologiques, exigeant des résultats à la fois non tréponémiques et tréponémiques. Aucun test de diagnostic ne peut garantir que des échantillons ne contiennent pas des anticorps anti-T.pallidum même à des taux très faibles, comme c’est le cas au premier stade de l’infection. Par conséquent, un résultat non réactif n’empêche pas la possibilité d’exposition à la Syphilis ou d’une infection par la Syphilis. Tous les tests tréponémiques ont tendance à rester réactifs après une infection tréponémique ; ainsi, ils ne doivent pas être utilisés pour évaluer la réponse au

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traitement. En raison de la persistance de la réactivité (probablement durant toute la vie du patient), les tests tréponémiques ne permettent pas au clinicien de diagnostiquer une rechute ou une réinfection chez un patient qui aurait eu des résultats réactifs. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser d’autres tests : Syphilis Total Ab, Syphilis IgM EIA et RPR.

9. CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES

9.1. Fidélité de Mesure L’étude de Fidélité de mesure a été réalisée en testant 3 échantillons (1 échantillon négatif, 1 échantillon faible positif et 1 échantillon positif) en 10 réplicats durant le même essai (Répétabilité) et en duplicat pendant 5 jours sur 2 lots différents et avec une lecture faite par 2 opérateurs (Fidélité intermédiaire). Répétabilité : les 3 échantillons ont donné des résultats identiques lorsque répétés 10 fois au cours du même essai. Fidélité Intermédiaire et Reproductibilité inter lot : les 3 échantillons ont donné des résultats identiques lorsqu’ils ont été testés dans les différentes conditions (40 réplicats).

9.2. Performances cliniques Les performances du test TPHA ont été évaluées en testant des échantillons de donneurs de sang non sélectionnés, de patients ayant consultés dans un centre pour maladies sexuellement transmissibles, de patients positifs pour l’agent de la syphilis et à l’aide d’échantillons positifs pour des agents infectieux sans relation avec la syphilis. Les études ont été réalisées sur 2 sites de banques de sang ainsi que sur le site de Bio-Rad

9.2.1. Spécificité 5032 échantillons collectés de façon prospective sur les 2 différents sites ont été étudiés. Les échantillons étaient soit des sérums (3626) soit des plasmas prélevés sur EDTA K2 (539) soit des plasmas prélevés sur Héparine de Lithium (867). Ils ont été testés sur une période de moins de 7 jours après le prélèvement et comparés aux résultats des tests de dépistage utilisés dans les laboratoires.

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Tableau 1 : population de donneurs de sang

Site Nombre

Echantillons Initiaux

Reactifs (IR)

Echantillons Répétés

Réactfs (RR)

Spécificité (%)

Intervalle de Confiance à 95%

Site # 1 2519 18 7 99.72% (2512/ 2519) 99.43% – 99.89%

Site # 2 2513* 20 7 99.72%

(2505 / 2512) 99.43% – 99.89%

total 5032

38 (8 positifs ,

30 Indéterminés

)

14 (3 positifs,

11 Indéterminé

s)

99.72% (5017/5031) 99.53% – 99.85%

*Un échantillon vrai positif a été retiré des calculs La spécificité globale sur la population de donneurs de sang est de 99.72% (5017/5031) avec un intervalle de confiance à 95% de [99.53%- 99.85%]. Parmi les 14 échantillons faux positifs, 11 ont été trouvés indéterminés répétables. Une étude rétrospective a été également réalisée sur 201 échantillons congelés issus de patients ayant consultés dans un centre pour maladies sexuellement transmissibles ou bien de panels commerciaux et trouvés négatifs pour la syphilis. La spécificité sur ces échantillons a été évaluée à 99.5% (200/201) avec un intervalle de confiance à 95% de [97.3%- 100%].

9.2.2. Sensibilité L’étude de sensibilité a été étudiée sur 435 échantillons rétrospectifs (sérum congelés) provenant du laboratoire du centre pour maladies sexuellement transmissibles ou bien de panels commerciaux. Ces échantillons ont été caractérisés comme étant positifs à l’aide de tests d’immuno-essais, d’immunofluorescence, de tests RPR/VDRL ou bien de tests TPHA en fonction de leur provenance. Tous ces échantillons ont été re-testés à l ‘aide d’un test TPHA marqué CE et avec le test Bio-Rad TPHA 500 (72504). La sensibilité sur cette population est de 100% (435/435) avec un intervalle de confiance à 95% de [99.2%-100.0%].

9.3. Sensibilité analytique La sensibilité analytique a été estimée l’aide du standard international OMS pour la syphilis ref NIBSC 05/532. En utilisant la méthode semi-quantitative, la sensibilité a été trouvée à 0.05UI/ml.

9.4. Spécificité analytique – Réactions croisées 210 échantillons potentiellement interférents comprenant soit des anticorps contre des agents responsables de maladies infectieuses (Cytomégalovirus, Virus Epstein Barr, Virus Varicelle Zona, virus de la rubéole, virus de l’Hépatite C, virus de l’Hépatite B, virus VIH 1/2, virus HTLV 1/2, Toxoplasma gondii, agent de la Dengue, de la Malaria et de la leptospirose), des échantillons provenant de femmes enceintes et de femmes multipares, ou de patients atteints de désordres

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immunitaires (auto-anticorps (SLE), facteurs rhumatoïdes) ont été évalués avec le test TPHA. Quatre échantillons trouvés vrais positifs ont été retirés des calculs. Un échantillon a été trouvé positif répétable avec le test TPHA. La spécificité observée sur cette population ciblée est de 99.5% (205/206) similaire à la spécificité trouvée sur les échantillons cliniques.

9.5. Effet pro-zone

L'existence d’un possible effet pro-zone a été étudiée en testant 3 échantillons à titres élevés (>1 :20480) à différentes dilutions. L’équivalence de résultats observée entre les échantillons dilués et non dilués indique l’absence d’effet pro-zone.

10. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE. 1. Daguet G.L. - Diagnostic Biologique de la Syphilis. Technique et Biologie,

1995 ; 120 :5-30. 2. Houng H. - Syphilis: new diagnostic directions. Intern. J. STD and AIDS 1992;

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among the fluorescent treponemal antibody absorption test, the microhemagglutination assay for Treponema pallidum antibodies, and the hemagglutination treponemal test for syphilis. J. Clin. Microbiol., 1981 ; 14 : 441 – 445.

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Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/12

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