/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 31, 1, pp. 183-198, 1974 \ 83

Printed in Great Britain

Evolution enzymatique destissus foetaux et placentaires de Rat en carence

teratogene de riboflavine

Par G. POTIER DE COURCY, S. DESMETTRE-MIGUET,M. R. MACQUART-MOULIN ET T. TERROINE

Centre de Recherches sur la Nutrition du C.N.R.S. 9,rue Emile, 92-Bellevue-Meudon, France

SUMMARY

Enzymic changes of foetal and placental tissues of the ratin teratogenic riboflavin deficiency

The electrophoretic pattern of alkaline phosphatase was studied in teratogenic riboflavindeficiency in the whole foetus, chorioallantoic placenta and visceral yolk-sac of the rat inorder to follow the course of their differentiation from day 13 to day 20 of gestation. Lactic-dehydrogenase (LDH) isozymes were chosen in the case of foetal organs (heart, intestine andkidneys) as a more sensitive test. A fluorometric analysis of alkaline phosphatase was alsoperformed to evaluate more precisely quantitative modifications brought on by maternalriboflavin deficiency in the placenta and the whole foetus.

The importance of alkaline phosphatase in rat yolk-sac was indicated in the last period ofgestation by the presence of a specific rapid isozyme band from the 16th to the 21st day,simultaneously with a greater complexity of the electrophoretic picture of this membrane.Placenta and foetus, on the other hand, were shown to possess two common bands but thoseconcerned with the foetus appeared later and were related to the onset and increase ofossification. In the foetal organs, differentiation of LDH isozymes appeared specific for eachorgan studied; while the heart tissue showed five bands on the 16th day, kidney arrived atthis stage only on the 21st day, indicating a slower maturation of this tissue.

At the end of gestation riboflavin deficiency delayed the appearance of rapid isoenzymesof alkaline phosphatase in the whole foetus and of LDH in the foetal kidneys, suggesting asimilar delay in the course of metabolic differentiation of the skeleton and kidney tissues.Deficiency had no effect upon placental isoenzyme development but in this organ it greatlyreduced the biochemical alkaline phosphatase activity, especially on day 13. This resultsuggests the participation of the enzyme in the general hypotrophy of the foetus by a decreasein nutrients carried by the placenta. On the other hand, the decline in the alkaline phosphataseactivity of the whole foetus is related to the delayed appearance of mineralization.

INTRODUCTION

Les effets morphologiques de la carence en riboflavine avec Galactoflavineconcernent principalement le systeme osseux (Warkany & Nelson, 1942) et lacroissance ponderale des foetus. Une deviation du metabolisme foeto-maternelpeut done se produire au niveau du transfert placentaire en abaissant le niveaude ce transfert (Sullivan, 1970) et/ou au niveau meme des sites de calcification.

184 G. POTIER DE COURCY ET COLL.

Pour tester ces deux possibilites, nous avons utilise comme critere de l'integ-rite metabolique du complexe foeto-placentaire la phosphatase alcaline, enzymequi semble liee a la fois aux processus de l'ossification (Jibril, 1967), notammentau stade embryonnaire (Teller, Merker & Gunther, 1971) et au transfert desnutriments par le placenta (Padykula, 1958; Hempel & Geyer, 1969).

L'etude des isoenzymes apporte l'avantage sur celle de l'enzyme totale depermettre d'apprecier l'etat de differenciation (Markert & Moller, 1959) et dematuration des tissus et par consequent de leur controle genetique (Moss, 1970).Elle parait done tout specialement indiquee comme instrument d'analyse dansle foetus pour deceler d'eventuelles anomalies de differenciation, notamment aucours d'avitaminoses teratogenes.

II n'est pas encore certain que la phosphatase alcaline possede dans chaqueorgane plusieurs isoenzymes (Moss, 1970). De plus, son apparition dans l'em-bryon se fait assez tardivement et sa presence dans les organes foetaux de Ratest presque inexistante en deca du 18eme jour de gestation. Nous avons doneutilise comme critere de differenciation des organes les isoenzymes de la lactico-deshydrogenase (LDH) beaucoup plus connues sur le plan biochimique etgenetique (Fine, Kaplan & Kuftinec, 1963).

MATERIEL ET METHODES

Les rattes Wistar C.F. sont elevees en pieces conditionnees. Elles sont misesau male entre 180 et 250 g et le jour 0 ou premier jour de la gestation estdetermine par la presence de spermatozoides dans le vagin.

Les rattes gestantes temoins regoivent un regime semi-synthetique completcomportant pour 100 g: 25 g de caseine devitaminee (supplemented par laL-cystine), 57 g de saccharose, 2,5 g de cellulose, 10 g de lipides, 4 g de melangesalin H.M.W. et 1 g de melange vitaminique NBC. Les meres carencees recoiventdu jour de l'accouplement au sacrifice le meme regime mais prive de riboflavineavec adjonction de Galactoflavine a raison de 1,5 mg pour 100 g de regime. Lachute d'appetit de 25 % due a la carence n'etant pas teratogene (Berg, 1965) etne provoquant que de minimes alterations biochimiques (Potier de Courcy,1968), l'usage de 'temoins restreints' a ete ecarte.

Les sacrifices ont lieu par decapitation. Seuls sont conserves pour les determ-inations les foetus presentant en fin de gestation des malformations manifestes.Avant le 18eme jour, on elimine les embryons dont le poids presente moins de30 % de difference avec les temoins, estimant sur la base des determinationsulterieures que leurs chances d'etre malformes sont minimes. Les tissus, aprespesee, sont homogeneises dans la glace et a vitesse controlee. Les etapes suivantesde preparation des tissus sont resumees dans le tableau 1.

La purification partielle realisee sur les extraits destines a l'etude de laphosphatase alcaline est derivee de la methode initiate de Morton (1954)modifiee par Saini & Posen (1969).

Evolution enzymatique 185

Tableau. 1. Differentes etapes de preparation des extraits enzymatiques

HomogeneisationTris 0,01 M pH 7,4

PDilution: 1/2 a 1/3 —

Centrifugation20min4°C-14500£

Surnageant

Electrophorese LDH

Purification1-Butanol 2 vol/1 poids de tissu frais

Agitation: 30min25°C

Centrifugation20 min 4 °C 14500 g

Surnageant

DialyseTris 0,01 M pH 7,4 18 H 4 °C

Dosage fluorometrique PA*

* PA, Phosphatase alcaline.

Electrophorese PA*

Le dispositif d'electrophorese utilise est de type cylindrique vertical avec poursupport un gel unique de polyacrylamide a 5,5 % (Szylit, 1968) en tampon Tris(0,03 M) - acide borique (0,0125 M) a pH 8,5. Les bains d'electrophorese sontconstitues d'un tampon Tris-borique (0,1 M) pH 8,3.10 /A d'extrait enzymatique,additionnes de 40 /A de saccharose a 40 % sont deposes au sommet du gel etsoumis a un courant continu a tension constante (200 V) avec une intensiteinitiate de 2,5 mA/tube. L'electrophorese dure 30 a 40 min avec le bleu debromophenol comme indicateur.

Les isoenzymes de la LDH sont reveles par precipitation du paranitrobleu detetrazolium sous forme de formazan en presence de NAD, avec le lactated'NH4 comme substrat. Les bandes de la phosphatase alcaline sont concretiseesen presence d'une quantite egale (10 mg/100 ml) de /?-naphtyl phosphate acidede Na et de Fast-Blue BB dans un tampon Tris 0,1 M a pH 9,8 contenant duMgCl2 comme activateur. La revelation se fait a 37 °C pendant 45 min.

Le dosage fluorimetrique de la phosphatase alcaline suit la methode mise aupoint par Moss, Campbell, Anagnostou-Kakaras & King (1961), permettantd'utiliser le meme substrat que pour la revelation electrophoretique, le naphtylphosphate. La reaction enzymatique se deroule a 37 °C pendant 5 min, etcommence par additions de 5 jul d'extrait enzymatique, dilues de 1/5° a 1/100°

186 G. POTIER DE COURCY ET COLL.

1 cm

1 cm

B

Fig. 1. Effets de la carence en riboflavine sur le niveau d'ossification des foetus(clarification a Palizarine). A g. temoins, a dr. carences. (A), 17e jour: absence totaledes premiers points d'ossification (cotes, clavicule, mandibule). (B), 22e jour: retard dudeveloppement osseux (raccourcissement de la machoire inferieure, absence descubitus et radius gauches, des tibias, et perones, torsion des cotes et de la colonnevertebrate).

Evolution enzymatique 187

SM FOE

Fig. 2. Evolution des isoenzymes de la phosphatase alcaline des annexes et du foetus.Effets de la carence en riboflavine sur le foetus. SM, serum maternel; PL, placenta;VO, vesicule ombilicale; FOE, foetus. Serie temoin: A, 14e, B, 16e, C, 18e, D, 21e

jour de gestation. Foetus carences: C, 18e, D', 21e jour de gestation. 1, 2, X, 3:numerotation arbitraire des bandes. O: bande restee a I'origine. Sens de la migration:vers l'anode ( + ).

188 G. POTIER DE COURCY ET COLL.

21'

Fig. 3. Evolution des isoenzymes de la LDH des organes foetaux en fin de gestation.Effets de la carence en riboflavine. C, coeur; /, intestin; RT, reins temoins; RC, reinscarences. Sous chaque gel est indique le jour de la gestation. Les isoenzymes sontnumerotees de 1 (vers l'anode +) a 5.

selon le stade de la gestation et le tissu. La lecture se fait dans un fluorimetreFarrand.

Les proteines sont dosees sur homogenat frais par la methode de Lowry,Rosenbrough, Farr & Randall (1951).

RESULTATS

1. Etat des meres et de la portee

Les rattes carencees n'ont pris en fin de gestation que 10 % de leur poids dedepart et leur taux de resorption est de 2,4 contre 1 chez les temoins. Le poidsdes foetus carences est inferieur de 43 % a celui des temoins en fin de gestationalors que celui des annexes ne baisse que de 25 %. Les malformations apparentes,de type classique, affectent surtout les membres et la machoire inferieure tandisque les anomalies touchant les tissus mous restent inferieures a 3 %. La clarifi-cation a l'alizarine (Fig. 1) montre l'absence des points d'ossification chez lefoetus carence en riboflavine au 17eme jour et plusieurs anomalies du squeletteau 22eme jour.

Evolution enzymatique 189

9,5 10 10,5 11pH du milieu d'incubation

11,5

Fig. 4. pH optimum de l'activite de la phosphatase alcaline placentaire en fonctiondelaquantitede substrat du milieu d'incubation (MgCl2:0,05 M, 37 °C). • , O.lOmivi;D, 0,25 niM; A, 0,50 HIM; O, 1 ITIM; • , 2 IHM de /?-naphtyl phosphate. On observeque le pH optimum augmente avec la quantite de substrat et le pouvoir d'hydrolyse.

2. Analyse electrophoretiqueA. Phosphatase alcaline

Des le 14eme jour, il existe deux bandes bien marquees dans le placenta(Fig. 2 A), la plus rapide (2) migrant a la hauteur de celle du serum maternel.Alors que les deux isoenzymes de la phosphatase alcaline placentaire nesubissent pas de modification d'intensite au cours de la gestation (Fig. 2 A, B, C),le facies de la vesicule ombilicale evolue en se diversiflant jusqu'au 18eme jour.Au 16eme jour deja (Fig. 2C), elle possede les bandes placentaires et embryon-naires 3 et 2 mais egalement deux 'isoenzymes' supplementaires specifiques, unetres rapide et large que nous appelons bande 1, et une legere et fine, la bande Xqui apparait dans les echantillons les plus nettement reveles. Au 18eme jour, ces2 bandes apparaissent dans certains echantillons de placenta et de serummaternel (Fig. 2C).

Dans l'embryon, les bandes 3 et 2 n'apparaissent qu'a partir du 16eme jour,d'abord faiblement puis en augmentant jusqu'a la fin de la gestation (Fig2B, C, D).

La carence en riboflavine n'a de repercussion que sur les 'isoenzymes' dufoetus: elle provoque un retard d'apparition de la bande 2 et une attenuationdes 2 bandes en fin de gestation (Fig. 2C, D).

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Evolution enzymatique 191

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Fig. 5. Evolution de l'activite de la phosphatase alcaline du placenta total: # — #temoins, O O carences. Les lignes verticales represented l'ecart-type de lamoyenne.

B. LDH

Des le 16eme jour de gestation, les 5 isoenzymes de la LDH du cceur sontpresentes dans nos echantillons avec une predominance des bandes 2 et 3;quant a Tintestin, il n'a jamais plus de 3 bandes. Le rein par contre, possede 5isoenzymes comme le cceur mais ne les acquiert que progressivement (Fig. 3 C,I, RT).

Seule Telectrophorese du rein est modifi.ee par la carence (Fig. 3RC). Au21 erne jour, les isoenzymes 1 et 2, les plus rapides, n'ont pas apparu. II seproduit precedemment un retard d'apparition de la bande 3 (17eme jour) et atous les stades une diminution d'intensite des isoenzymes presentes.

3. Etude quantitative de la phosphatase alcaline

La phosphatase alcaline a une activite qui croit en meme temps que son pHoptimum lorsque la quantite de substrat present augmente (Motzok & Branion,1959). La figure 4 donne Failure des courbes obtenues pour le placenta et con-firme dans le cas du Rat cette propriete. Pour la concentration de 0,5 mM denaphtyl phosphate choisie pour nos mesures, le pH optimum est de 9,5 pour leplacenta alors qu'il est de 9,25 pour l'embryon et la vesicule ombilicale.

Le Km determine d'apres la methode de Lineweaver & Burk (1934) et entenant compte des observations de Motzok & Branion (1959) est constant aucours de la gestation, mais il est different selon le tissu (Fig. 5). De 0,38 mM denaphtol pour le placenta. II passe a 0,27 pour l'embryon et a 0,19 pour lavesicule ombilicale. Ces valeurs sont plus elevees que celles donnees par Moss

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Evolution enzymatique 193

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1 4 ° I 5 C I 6 C 1 7 e 1 8 C 19 20 21 14L 15Jour de gestation

1 6 C 1 7 C 1 8 e 1 9 e 2 0 e 2 1 '

Fig. 6. Evolution de l'activite de la phosphatase alcaline foetale en fonction du stadede la gestation. A: activite totale (M de naphtol/H). B: activite specifique (M denaphtol/H/mg de proteines). • • Foetus temoins, O A foetus carences(avec l'ecart-type de la moyenne).

et coll. (1961) pour les autres organes de mammiferes, situees entre 0,100 et 0,167nw de naphtol.

L'activite de la phosphatase alcaline du placenta est tres forte des le 14emejour lorsqu'elle est rapportee au g. de tissu frais (767/*M/H) OU au rag deproteines (6,13 mM/H). Elle subit quelques variations ensuite mais faibles(Tableau 2). L'activite enzymatique totale de l'organe varie beaucoup plus,passant de 43 mM de naphtol au 14eme jour a 620 au 21eme. C'est egalementsur l'activite totale de l'enzyme que la carence en riboflavine a le plus d'effet.Toujours significatives, les differences entre les activities des placentas temoinset carences vont de 21 a 51 %, l'ecart le plus grand se situant au 14eme jour degestation, mais le stade du 20eme jour etant marque comme pour le foetus parune activite particulierement basse de la phosphatase alcaline (Fig. 5).

L'activite enzymatique du foetus augmente rapidement a partir du 16eme jourmais se stabilise a partir du 18eme jour en ce qui concerne l'activite specifique(Fig. 6) alors que l'activite totale du foetus continue a augmenter fortementjusqu'au 21 erne jour (709 /m. de naphtol/H).

L'activite de l'enzyme foetale est tres fortement freinee par la carence enriboflavine quel que soit le stade considere. Elle est particulierement reduite le20eme jour de la gestation ou elle est inferieure en quantite totale de 73 % a lanormale (Fig. 6). C'est a ce stade egalement que le poids du foetus carence estle plus bas, relativement au temoin (46 %).

EMB 31

194 G. POTIER DE COURCY ET COLL.

DISCUSSION

L'analyse electrophoretique de la phosphatase alcaline montre deux bandesbien marquees et distinctes dans le placenta et la presence de ces deux memes'isoenzymes' dans l'embryon et la vesicule ombilicale en fin de gestation. Cesdonnees posent le probleme de la pluralite des isoenzymes phosphatasiques etde leur specificite dans les tissus considered.

Le fait que nous ayons trouve un Km et un pH optimum differents pour laphosphatase alcaline du foetus et du placenta est un argument (Motzok &Branion, 1959) contre l'identite d'origine et de nature des deux enzymes commele soutiennent, tout au moins pour rhomme, Ghosh & Fishman (1969) ens'appuyant sur les proprietes biochimiques differentes des deux enzymes, etPosen (1967) par etude immunologique. II a cependant ete etabli recemmentque c'etait le genotype du foetus humain et non de la mere, qui determinait lephenotype de la phosphatase alcaline placentaire (Robson & Harris, 1965) etque sa localisation etait presque exclusivement trophoblastique en fin degestation chez la Souris (Sherman, 1972) et par consequent dans un tissud'origine embryonnaire. Le probleme de la specificite de la phosphatase alcalinefoetale par rapport a celui du placenta reste done pose.

Par contre la vesicule ombilicale possede, outre les 'isoenzymes' placentaireset fcetales, une bande propre tres rapide du 16eme au 21eme jour de la gestation.On sait que cette annexe joue le role de placenta pour le Rat avant la mise enfonction de la circulation chorio-allantoidienne, mais que meme plus tard, elleest capable de capter des macromolecules (Johnson & Spinuzzi, 1966) du typede la B12 ou du complexe B12-facteur intrinseque (Padykula, Deren & Wilson,1966) et de transferer les anticorps maternels au foetus (Brambell & Halliday,1956). L'apparition d'une bande specifique le 16eme jour dans nos echantillons,de meme que la complexity croissante de l'image electrophoretique de l'endo-derme vitellin au 18eme jour correspondent tres exactement sur un plan quali-tatif, aux donnees histochimiques et biochimiques de Padykula (1958) et fontune fois de plus resortir l'importance physiologique de la vesicule ombilicaleinterne chez les Rongeurs en fin de gestation.

Bien que les isoenzymes de la phosphatase alcaline foetale apparaissenttardivement (17eme, 18eme jour) dans notre etude, alors que Johnson (1965)decele des bandes phosphatasiques dans l'embryon de Rat des le 11 erne jour degestation, la date d'apparition des 'isoenzymes' foetales que nous trouvonscorrespond bien au debut de l'ossification (Jost, Moreau & Fournier, 1960),comme le montrent les essais de clarification a l'alizarine. Cette simultaneite estune preuve supplementaire de la participation etroite de l'enzyme au processusde la mineralisation des cartilages (Teller et ah 1971).

Les isoenzymes de la LDH sont d'autre part un indicateur de l'etat de matura-tion (Koskimies, 1967), et du metabolisme dominant des tissus (Everse, Berger& Kaplan, 1970). Or, notre analyse des organes foetaux montre que le cceur,

Evolution enzymatique 195dont Porganogenese est terminee le 15eme jour de la gestation (Overman &Beaudoin, 1971) possede bien, le lendemain, la gamme complete des isoenzymesde la LDH avec, deja, une predominance des bandes rapides H(2 et 3), le placanttres tot dans la vie intra-uterine au niveau de la naissance (Markert & Ursprung,1962) et meme de l'adulte (Wiggert & Villee, 1964). Quant au rein foetal,1'evolution progressive de son facies electrophoretique nous fait dire qu'iln'atteint qu'au 21eme jour sa maturite fonctionnelle. Le cceur et le rein du foetusse situent d'autre part parmi les organes a caractere aerobie si Ton pense, commeEverse et ah (1970), que les bandes rapides (H) indiquent une predominancede la voie oxydative, alors que l'intestin reste dans notre etude, comme a Petatadulte (Markert & Ursprung, 1962) un tissu a metabolisme anaerobie nepossedant toujours que des bandes lentes (M).

La carence en riboflavine provoque un retard d'apparition ou une attenuationdes bandes d'electrophorese dans le cas de la LDH du rein foetal et de la phos-phatase embryonnaire. Cette modification de la phosphatase alcaline suggereune diminution de la synthese de l'enzyme foetale et confirme sur le planphysiologique le retard d'ossification du foetus observe a l'aide de la clarification.Dans le cas de la LDH du rein, il se produit une inhibition specifique de lasynthese des sous unites polypeptidiques H et done probablement une non-derepression dans cet organe du gene responsable de cette synthese (Koskimies,1967). La deficience en riboflavine retarde done la differentiation metaboliquedu rein.

La sensibilite des isoenzymes aux modifications d'ordre qualitatif (phosphatasealcaline de la vesicule ombilicale) ou fonctionnel (phosphatase alcaline foetale etLDH renale) n'est pas apparue dans celles du placenta restees totalement stablesau cours de la gestation normale et teratogene. II n'est done pas etonnant queShepard, Lemire, Aksu & Mackler (1968) notent par determination histo-enzymologique l'absence de modification de P activite de la phosphatase alcalineplacentaire dans la meme carence teratogene en riboflavine.

Par contre, le dosage fluorimetrique de l'enzyme indique que l'activite totalede la phosphatase placentaire decuple entre le 14eme et le 21eme jour, et queson activite specifique double pendant cette meme periode. Cette progressionsignifie que le volume des transferts operes par la phosphatase alcaline duplacenta augmente avec la gestation, beaucoup plus que le poids de l'organe.Cela s'explique par la demande accrue du foetus en phosphates, pendant laperiode d'intense ossification.

Mais la phosphatase alcaline placentaire presente une activite tres elevee bienavant Possification (70 fois celle du foetus en activite/g au 14eme jour). Sapresence dans le placenta a ete reliee au transfert ou au metabolisme de plusieurssubstances, dont le glycogene et PARN (Christie, 1967), les lipides et lesnucleoproteines (Hafez, 1964). Or, si une baisse du glucose foetal peut engendrerdes malformations chez le Rat (Hannah & Moore, 1971) ou qu'au contrairePadministration de composes riches en energie previent en partie l'apparition

13-2

196 G. POTIER DE COURCY ET COLL.

des malformations dans l'embryon de Poulet (Landauer & Sopher, 1970), onpeut se demander dans quelle mesure la forte chute de l'activite phosphatasiqueobservee par nous et done du transfert de ces metabolites ne conduit pas aprovoquer la genese des malformations observees en avitaminose B2.

La carence freine fortement l'activite de l'enzyme dans le foetus a tous lesstades de la gestation et principalement au 20eme jour, stade auquel les foetusmalformes prennent un retard considerable qui ne sera plus rattrape jusqu'a lanaissance. Grainger, O'Dell & Hogan (1954) observent de meme dans les tibiasde rats nouveau-nes une chute de 2,5 fois de la phosphatase alcaline. JafFe (1971)en carence folique cette fois, attribue a un desequilibre de la balance ionique etune chute d'activite des phosphatases une partie des anomalies squelettiques desmembres observees chez le foetus au cours de cette avitaminose.

RESUMEL'evolution des isoenzymes de la phosphatase alcaline a ete suivie au cours de la carence

teratogene en riboflavine avec Galactoflavine du 14eme au 21eme jour de la gestation pourevaluer le degre de differenciation des foetus de Rats temoins et malformes et de leurs annexes.Pour les organes foetaux, l'image electrophoretique de la LDH, plus sensible et plus precoce,lui a ete preferee. En outre, dans le cas de la phosphatase alcaline du placenta et du foetus,nous y avons ajoute le mesure fiuorimetrique de l'activite de l'enzyme car les variations d'ordrequantitatif semblaient importantes au cours de la carence.

Voici l'essentiel des donnees apportees par notre analyse:1. Du point de vue general des animaux temoins nous relevons: (a) l'importance metabolique

de la vesicule ombilicale interne du Rat dont l'image electrophoretique atteint sa complexitemaximale du 16eme au 18eme jour de gestation avec la presence d'une bande specifique acet organe; (b) le parallelisme entre 1'evolution des isoenzymes et de l'activite de la phos-phatase alcaline du foetus et le degre d'ossification de celui-ci; (c) la difference de chronologiedans la differenciation metabolique des organes foetus, tres precoce dans le coeur et l'intestin,beaucoup plus progressive dans le cas du rein.

2. La carence en riboflavine agit en freinant fortement l'activite de la phosphatase alcalinedu foetus et du placenta et en abaissant le niveau de synthese de certaines isoenzymes rapidesde la LDH renale et de la phosphatase alcaline du foetus entier, ce qui signifie: une baisse duvolume des elements transferee au foetus par la phosphatase alcaline placentaire, en particulierau 14eme jour de la gestation; un retard du niveau d'ossification du foetus; un retard specifiquede differenciation et de maturation du rein foetal.

Nous exprimons nos vifs remerciements au Dr Ch. W. Mushett, des Laboratoires MerckSharp et Dohme (New Jersey) qui nous a tres aimablement procure la galactoflavine.

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(Recu le 23 mars, revise le 3 juillet 1973)