Une nouvelle technique d'immunomicroscopie electronique - Applications a l'etude des antigenes de la...
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Colloque franco-belge de M.E.. mai 1988 BAS-RELIEF OBTAINED FROM A STEREO-PAIR : AN USEFUL METHOD FOR THE VISUALIZATION OF TRIDIMENSIONNAL STRUCTURE. Dominique PLOTON, Adrien BEORCHIA. Noel BONNET, Monique MENAGER, Jean-Jacques ADNET and Edith PUCHELLE. Laboratoire d'Histologie - Unit~ INSERM u31q - UFR de M~decine, Reims, France. Bas-relief is a ~ell-kno~n method used in photography to enhance the contrast of prints. It consists in the reelisation of a transparent contact film positive From a negative ~hich is then put and slightly shifted on the negative. Simultaneous print of these t~o films creates bas-relief effect due to the fact that contour oF each object is limited with a line oF inverted contrast. As previously demonstrated this procedure greatly enhances the contrast of the object by giving a pseudo 3D-el'fect (M. GREGORY et el. J. Elec. Mic. Tech. 5, 203-20g (lgB7)). We used a similar procedure as an aid for the visualization ol' the real 3D structure of tilted biological objects observed with high-voltage electron microscope within thick-sections. Bas-relief is obtained as follows: a transparent contact Film positive of one negative of the stereo-pair is put on the second negative of the stereo-pair. Then two points o~ the films, localized on the tilt-axis, are chosen. The positive and negative images of these t~o points are then perfectly super-imposed. In those conditions we obtained a bas-relie~ oF the structure which is net due to a random shift but, at the opposite, is only due to the parallax resulting from the tilt in the microscope. Thus the shado~s and highlights obtained greatly facilitates the direct comprehensive study of the 30 structure of the object without using a stereo-viewer. Several applications of this procedure to various biological objects ~ill be shown and compared with stereo-pairs observed ~ith stereo-viewer. Moreover computer modelisstion and mathematic interpretation of this bas-relief eFFect ~ill be shown end discussed. LOCALISATION DES GENES RIBOSOMIQUES PAR HYBRIDATION IN SITU A L'AIDE D'UNE SONDE SULFONEE. N. GAS, M.C. AZUM, J. NOAILLAC-DEPEYRE et M.A. DUPONT, Laboratoire de Biologie Cellulaire , Centre de Biochimie et G~n~tique Cellulaires du C.N.R.S., 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex (France). La localisation de g~nes par hybridation in situ utilise g~n~ralement des sondes radio- actives rep~rables par autoradiographie. Cette technique, tr~s sensible, permet la localisation de g~nes peu ou pas r~p~tds. Ndanmoins, sa mise en oeuvre est relativement longue et ndcessite un traite- ment statistique du marquage observ~ sur les plaques m~taphasiques. Nous avons d~velopp~ un protocole utilisant une sonde d'ADN dont les cytidines sont sulfon~es. Les hybrides sont recherch~s par des anticorps monoclonaux eux-m~mes localis~s par des immunoglobulines coupldes a la phosphatase alcaline. Des essais effectu~s sur filtre de nitrocellulose indiquent une sensibilitd de ddtection de l'ordre de 0,1 pg. Cette technique a permis la recherche des g~nes ribosomiques au niveau des chromosomes de cellules d'ovaire de Hamster chinois (CHO) en culture. L'~tude caryotypique a ~td rdalis~e apr~s digestion par la trypsine et coloration par le Giemsa. L'utilisation conjointe de ces deux techniques a permis une caract~rlsation de la lign~e utilis~e par 1- la mise en ~videz~ce de remaniements chromo- somiques par rapport aux lign~es d~j~ d~crites et 2- la localisation des g~nes ribosomiques. De~ essals sont en cours visant ~ utiliser ces sondes froides sur des sections ultrafines destindes & la mlcroscopie dlectronique. UNE NOUVELLE TECHNIQUE D'IMMUNOMICROSCOPIE ELECTRONIQUE. APPLICATIONS A L'ETUDE DES ANTIGENES DE LA JONCTION DERMO-EPIDERMIQUE IMPLIQUES DANS L~$ DERMATOSES BULLEUSES AUTO-]MMUNES. Catherine Prost (1) (2) et Louis Dabenret (2). (l) D~panement d'His|ologie (2) Unit6 INSERM U 312 - H6pital Henri Mondor - 94010 Cr~tcil Cedex.France. L'antlg~ne de la pemphigoide bulleuseetde rdpidermolyse bulleuseacquisedens la jonction dermo.~pidermiqueportent le nora des dermatoses bulleuses duns lesquelles iis sont la cible d'auto-anticorps.Ainsi la ]ocalisationde ces antigonus duns ia jonction dermo-,~pidermique,supcrposable cells des auto-ant/corps,peut 61re6tudi6een immunomicroscopie 61ectronique(]ME) direclement ~ partir de la peaudes patientsen utilisant des anticorps unti.immunoglobufines humalnes, marqu6s i la peroxydese de raifort. Tr~s pen d'6tudescependant ant dt~ pub]ides.Nous rapportonsceils r~alJsde[I panir de 48 patients, 32 ayantd~s d6p~s d'anticorps de classe ]gG et 16 de classe ]gA. Carte6rude,repr('sentant]a plus large s~dejamais publide a 6I~ possible, gdice h la miss au point d'une nouvelle techniqued' ]ME. Une biopsie de 6 nun de diam~tre est coup(~e en trenches de 0,7 mm d'dpaisseur,faciles il manipuler, grace ~, un microtome manuel, sansfixation, ni cong~lation pr6a]able. Cinq fragments aJnsi obtenussont laves ! H ~4°C duns 10 cc de milieu de Hanks, prefixes IH ~ 4°C clansdu paraformald~hyde tamponn6 tl 4% et Jz nouveau lav6s i/2 H dens ]e zni]ieu de Hanks.4 fragments sont slots incub#.s22 H ~ 4°C sous agitation respectivementduns les immunserums suivants, dilu,Js au 1/10 dens le milieu de Hanks: anticorpsde chEvre anti-chains lourde humaine .,. et Ix (Laboratoires Biosys)et anticorpsde lapin anti-C3 humain (Lahoratoires Dako). Le demier fragment de chaque biopsie, incul~ dens le milieu de Hanks seu] sen de contr61e. La r~v~ladondes peroxydeses clans]e milieu de Graham et Kamovsky se fair apr~s la fixation duns le fixateur de Karnovsky. Apr~s post-fixation par l'acide osmique, lea fragments sont inclus en r#.sine Epoxy afin d'obtenir des coupes semi-fines de grands surface,etune meiileure s61ection de ia zone il dtudieren coupes ultra-fines. Ce]les-ci sont examin6es sanscoloration avec un microscope ~leclxonique EM 301, Quatre diff,~renteslocalisationsdes antigonus-cibles d'auto-anticorpsduns la jonction dermo.dpidermique ant ~t~ ainsi observdes:une 1 ° dunsla lamina iucida sur le versantdpidermique de lajoncfion, une 2° sm ]a lamina dense, une 3° sous la lamina densa respecfivementchez 50, 25 et 25% des sujets ayantdes d~p~tsd' ]gG et une 4° situdede pan et d'autre de la lamina densauniquementchez les patientswant des d~p~tsd' IgA. Au total, cette 6tude confirme la Iocalisadon respectivement dens la lamina lucida et sous la lamina densa des antig~nes de la pemphigoidebulleuse et de l'~pidermolyse bulleuse acquise. Elle precise la fr~luencejusqu'~ maintenant sous-estim~e de l'atteinte de i'antig~ne de l'6pidermolyqse bulleuse acquise. Enfin ella d~montre l'existence d'autres antig~nes de la jonction dermo-6pidennique cibles d'auto.anticorps, m~connusjusqu'ici, clansla lamina densa et de part et d'aulze de la lamina densa. 11a
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Colloque franco-belge de M.E.. mai 1988
BAS-RELIEF OBTAINED FROM A STEREO-PAIR : AN USEFUL METHOD FOR THE VISUALIZATION OF TRIDIMENSIONNAL STRUCTURE. Dominique PLOTON, Adrien BEORCHIA. Noel BONNET, Monique MENAGER, Jean-Jacques ADNET and Edith PUCHELLE. Laboratoire d'Histologie - Unit~ INSERM u31q - UFR de M~decine, Reims, France.
Bas-rel ief is a ~e l l -kno~n method used in photography to enhance the contrast of pr ints. I t consists in the reel isation of a transparent contact f i lm posit ive From a negative ~hich is then put and sl ight ly shifted on the negative. Simultaneous pr int of these t~o f i lms creates bas-rel ief e f fect due to the fact that contour oF each object is l imi ted wi th a line oF inverted contrast. As previously demonstrated this procedure greatly enhances the contrast of the object by giving a pseudo 3D-el ' fect (M. GREGORY et el. J. Elec. Mic. Tech. 5, 203-20g (lgB7)).
We used a s imi lar procedure as an aid for the visual izat ion ol' the real 3D structure of t i l ted biological objects observed w i th high-vol tage electron microscope wi th in thick-sect ions. Bas-rel ief is obtained as fo l lows: a transparent contact Film posit ive of one negative of the stereo-pair is put on the second negative of the stereo-pair. Then two points o~ the f i lms, localized on the t i l t -ax is , are chosen. The posit ive and negative images of these t~o points are then per fect ly super-imposed. In those condit ions we obtained a bas-relie~ oF the structure which is net due to a random shi f t but, at the opposite, is only due to the paral lax resulting from the t i l t in the microscope. Thus the shado~s and highl ights obtained great ly fac i l i ta tes the direct comprehensive study of the 30 structure of the object w i thou t using a s tereo-v iewer .
Several appl ications of this procedure to various biological objects ~ i l l be shown and compared wi th stereo-pairs observed ~ i t h s tereo-v iewer .
Moreover computer modelisst ion and mathematic in terpretat ion of this bas-rel ief eFFect ~ i l l be shown end discussed.
LOCALISATION DES GENES RIBOSOMIQUES PAR HYBRIDATION IN SITU A L'AIDE D'UNE SONDE SULFONEE. N. GAS, M.C. AZUM, J. NOAILLAC-DEPEYRE et M.A. DUPONT, Laboratoire de Biologie
Cellulaire , Centre de Biochimie et G~n~tique Cellulaires du C.N.R.S., 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex (France).
La localisation de g~nes par hybridation in situ utilise g~n~ralement des sondes radio- actives rep~rables par autoradiographie. Cette technique, tr~s sensible, permet la localisation de g~nes peu ou pas r~p~tds. Ndanmoins, sa mise en oeuvre est relativement longue et ndcessite un traite- ment statistique du marquage observ~ sur les plaques m~taphasiques. Nous avons d~velopp~ un protocole utilisant une sonde d'ADN dont les cytidines sont sulfon~es. Les hybrides sont recherch~s par des anticorps monoclonaux eux-m~mes localis~s par des immunoglobulines coupldes a la phosphatase alcaline. Des essais effectu~s sur filtre de nitrocellulose indiquent une sensibilitd de ddtection de l'ordre
de 0,1 pg. Cette technique a permis la recherche des g~nes ribosomiques au niveau des chromosomes
de cellules d'ovaire de Hamster chinois (CHO) en culture. L'~tude caryotypique a ~td rdalis~e apr~s digestion par la trypsine et coloration par le Giemsa. L'utilisation conjointe de ces deux techniques a permis une caract~rlsation de la lign~e utilis~e par 1- la mise en ~videz~ce de remaniements chromo- somiques par rapport aux lign~es d~j~ d~crites et 2- la localisation des g~nes ribosomiques.
De~ essals sont en cours visant ~ utiliser ces sondes froides sur des sections ultrafines
destindes & la mlcroscopie dlectronique.
UNE NOUVELLE TECHNIQUE D'IMMUNOMICROSCOPIE ELECTRONIQUE. APPLICATIONS A L'ETUDE DES ANTIGENES DE LA JONCTION DERMO-EPIDERMIQUE IMPLIQUES DANS L~$ DERMATOSES BULLEUSES AUTO-]MMUNES. Catherine Prost (1) (2) et Louis Dabenret (2). ( l) D~panement d'His|ologie (2) Unit6 INSERM U 312 - H6pital Henri Mondor - 94010 Cr~tcil Cedex. France.
L'antlg~ne de la pemphigoide bulleuse etde rdpidermolyse bulleuse acquise dens la jonction dermo.~pidermique portent le nora des dermatoses bulleuses duns lesquelles iis sont la cible d'auto-anticorps. Ainsi la ]ocalisation de ces antigonus duns ia jonction dermo-,~pidermique, supcrposable cells des auto-ant/corps, peut 61re 6tudi6e en immunomicroscopie 61ectronique (]ME) direclement ~ partir de la peau des patients en utilisant des anticorps unti.immunoglobufines humalnes, marqu6s i la peroxydese de raifort. Tr~s pen d'6tudes cependant ant dt~ pub]ides. Nous rapportons ceils r~alJsde [I panir de 48 patients, 32 ayant d~s d6p~s d'anticorps de classe ]gG et 16 de classe ]gA. Carte 6rude, repr('sentant ]a plus large s~dejamais publide a 6I~ possible, gdice h la miss au point d'une nouvelle technique d' ]ME.
Une biopsie de 6 nun de diam~tre est coup(~e en trenches de 0,7 mm d'dpaisseur, faciles il manipuler, grace ~, un microtome manuel, sans fixation, ni cong~lation pr6a]able. Cinq fragments aJnsi obtenus sont laves ! H ~4°C duns 10 cc de milieu de Hanks, prefixes IH ~ 4°C clans du paraformald~hyde tamponn6 tl 4% et Jz nouveau lav6s i/2 H dens ]e zni]ieu de Hanks. 4 fragments sont slots incub#.s 22 H ~ 4°C sous agitation respectivement duns les immunserums suivants, dilu,Js au 1/10 dens le milieu de Hanks: anticorps de chEvre anti-chains lourde humaine .,. et Ix (Laboratoires Biosys) et anticorps de lapin anti-C3 humain (Lahoratoires Dako). Le demier fragment de chaque biopsie, incul~ dens le milieu de Hanks seu] sen de contr61e. La r~v~ladon des peroxydeses clans ]e milieu de Graham et Kamovsky se fair apr~s la fixation duns le fixateur de Karnovsky. Apr~s post-fixation par l'acide osmique, lea fragments sont inclus en r#.sine Epoxy afin d'obtenir des coupes semi-fines de grands surface,et une meiileure s61ection de ia zone il dtudier en coupes ultra-fines. Ce]les-ci sont examin6es sans coloration avec un microscope ~leclxonique EM 301, Quatre diff,~rentes localisations des antigonus- cibles d'auto-anticorps duns la jonction dermo.dpidermique ant ~t~ ainsi observdes: une 1 ° duns la lamina iucida sur le versant dpidermique de lajoncfion, une 2 ° sm ]a lamina dense, une 3 ° sous la lamina densa respecfivement chez 50, 25 et 25% des sujets ayant des d~p~ts d' ]gG et une 4 ° situde de pan et d'autre de la lamina densa uniquement chez les patients want des d~p~ts d' IgA.
Au total, cette 6tude confirme la Iocalisadon respectivement dens la lamina lucida et sous la lamina densa des antig~nes de la pemphigoidebulleuse et de l'~pidermolyse bulleuse acquise. Elle precise la fr~luence jusqu'~ maintenant sous-estim~e de l'atteinte de i'antig~ne de l'6pidermolyqse bulleuse acquise. Enfin ella d~montre l'existence d'autres antig~nes de la jonction dermo-6pidennique cibles d'auto.anticorps, m~connus jusqu'ici, clans la lamina densa et de part et d'aulze de la lamina densa.
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