BIOCHIMIE, 1974, 56, 554-558.

Une mdthode pour identifier des traces de protdines pures (*).

Jean-Pierre SALLF_,I, Arnaud DuPuY D'ANGEAC et Helmut VOGEL.

Centre de Recherches de Biochimie Macromol~culaire (CNRS), Groupe de Recherches U-67 (INSERM), B.P. 5051, 34033 Montpellier (France).

(5-11-1973).

Summary. - - A method is proposed for the identification of peptide chains isolated in small amounts. The ratio of two specific amino acids, one labelled with 3H, the other with t4C, is measured in the polypeptide chain as well as in several peptides (derived from the polypeptide chain). The experimental values are compared with the values expected on the basis of the sequence of the chain. The method has been applied to the identifcation of human hemoglobin ~ and V chains.

PRINCIPE. PROCEDURE.

L ' ident i f ica t ion de traces de protOines dOtecta- bles seulement pa r marquage radioact i f peut se faire pa r au torad iographie de cartes pept id iques . Nous prOsentons ici une al ternative. Elle compor te comme 6tapes opOratoires une incubat ion de cel- lules avec deux acides aminOs marqu6s, des chro- matographies du lysat cellulaire, une hydrolyse spOcifique des chalnes po lypept id iques isolees suivie d 'une pur i f ica t ion chromatograph ique des pept ides obtenus, enfin des comptages radioact ifs .

On par t de l 'hypothOse de l ' identi t6 de la chaine po lypep t id ique inconnue avec une chaine dont la s6quence ou du moins la composi t ion en acides amin6s ainsi que celle de cer tains de ses pept ides sont connues. On choisi t deux acides amin6s qui existent h la lois dans la chaine po lypep t id ique entiOre et dans les produi ts spOcifiques d 'hydro lyse de cette chalne que l 'on compte obtenir. Cette der- nibre condi t ion ne sera habi tue l lement rempl ie que si les f ragments pept id iques que ron pr6pare ne sont pas lrop petits. Une coupure aux r6sidus, d 'o rd ina i re peu nombreux, de mOthionine par le b romure de cyanogOne pour ra souvent convenir .

On proc~de par double marquage total des pro- t6ines au cours de leur synth~se. L 'un des acides aminOs choisis est iritiO, l 'autre marqu6 au 14C. L ' ident i f icat ion de la chaine po lypep t id ique incon- nue avec une chalne connue consiste h 6tablir, tant pour la chaine inconnue entibre que pour ses pro- dulls d 'hydrolyse , que le rappor t entre les activit6s des deux acides aminOs est b ien celui auquel on s 'at tend dans le cas des molOcules de rOfOrence.

(*) Contribution N ° 96 du Centre.

Soit une chaine po lypep t id ique P, scindOe en, mettons, deux fragments d6finis, Pl et p~. On con- nait les nombres d 'acides aminOs A et B (m I en n i) dans P, Pl et P2. D'autre part , soil une chalne expOrimentale Q marqu6e aux posi t ions des deux acides amines 3H-A et 14C-B. La chaine polypept i - dique expOrimentale et ses par t ies pept id iques sont purifi6es en mOme temps que les molOcules cor respondantes ¢ froides ~ utilisOes comme en- t ra ineurs .

Une chaine po lypep t id ique inconnue est iden- t ique ~ la chaine de r6fOrence si l '6galit6 suivante est satisfaite pour la chalne entiOre ainsi que pour ses f ragments :

DPMA 1 m i A

DPMB K n i B DPM signifiant dOsint6grations par minute. La valeur de K expr ime le rappor t des activitOs spO- cifiques des acides amings marquOs.

A par t i r de cctte identit6, on peut soit mesure r le rappor t mi /n i et mont re r qu ' i l se r app roche du rappor t thOorique calcul6 (tableau I), soit 6tablir la constance des K de la chaine entiOre et de ses f ragments en mcsuran t l ' a ccord entre ces valeurs de K et sa valeur thOorique [1]. Quand la va leur de K est supOrieure h la va leur thgorique, il y a excOs en acide amino B ou dOfaut en acide amin6 A. L ' inverse vaut pour les valeurs de K infO- r ieures h la valeur th6orique. Dans les deux cas, si le pept ide recherch6 est pr6sent, il est m61ang6 avec un ou plusieurs pept ides parasi tes.

La mOthode est compl6tOe par l ' examen de la constance de l 'act ivi t6 spOcifique h t ravers les

556 J.-P. Salle[, A. D u p u y d'Angeac et H. Vogel.

pics optiques, obtenus par spectrophotom6tr ie h 280 nm, des mol6cules utilis6es comme entra ineurs . Si l 'aetivit6 sp6cifique de la prot6ine ou du pept ide exp6r imentanx est constante h travers le pic opti- que de la prot6ine ou du pept ide de r6f6rence, l ' ident i t6 r igoureuse de leur compor tement ehro- matographique est 6tablie ~2] et de ce fait la grande probabil i t6 de leur identit6.

ETUDE STATISTIQUE :

Soient :

P : la prot6ine de r6f6rence,

Q : la prot6ine exp6rimentale,

X : un compos6 parasite,

k : le nombre de peptides sur lesquels porte la eomparaison,

mi, n i : les nombres d 'acides amin6s marqu6s dans le peptide n ° i de la prot6ine P,

m't, n ' i : id. pour la protbine Q,

m" i, n" i : id. pour la prot6ine X,

N : le hombre d 'acides amin6s dans la prot6ine P,

L : le hombre d 'acides amin6s darts nne prot6ine ou un peptide quelconque,

p v : l a probabil i t6 a priori pour l 'acide amin6 n o . "¢~

: l ' e r reur relative exp6rimentale pour les rap- ports m ' i / n ' i.

Si les rapports Val ine/S~rine de la prot6ine exp6rimentale Q cor respondent aux rapports cal- cul6s de la prot6ine de r6f6rence P (aux erreurs d 'exp6rience prbs), la pr6sence d 'une autre pro- t6ine parasi te X, s imulant par ses rappor ts Val/Ser la chaine P, n 'est pas exclue (toujours aux erreurs exp6rimentales pros).

Dans les condi t ions d 'exp6rience, ut i l isant une lign6e cellulaire sp6cifique, un nombre res t re int de prot6ines est synth6tis~ en quanti t6s appr6- ciabtes. Pour nous mettre dans les condi t ions ]es plus d6favorables h l ' ident i f icat ion de P = Q, nous supposerons que n ' impor te quelle prot6ine X risque d'6tre aussi synth6tis6e en quanti t6 signi- ficative. Il faut donc rechercher la probabi l i t6 - - ou la concent ra t ion - - , dans un m61ange de pro- t6ines al6atoires, d 'une chaine polypept id ique parasi te X poss6dant les propri6t6s suivantes :

1) Une charge et un poids mol6culaire voisins ou ident iques h celui de P.

2) Un peptide i dont le rappor t entre les acides amin6s marqu6s m " l / n " i se situe dans l ' in terval le

mi /n i (1 ~ e).

Une prot6ine al6atoire de longueur N e s t une chaine fictive dont les N posi t ions sont occup6es selon le hasard par des acides amin6s pour lesquels les probabil i t6s a priori sont d6finies par la << prot6ine moyenne >> [31. Si l 'acide amin6 i poss6de une prohabil i t6 a priori Pi, la probabil i t6 pour que la chaine de longueur :L con t ienne exac- tement 1 r6sidus de cet acide amin6 est

L ! P (1, L) -- pi 1 (1 -Pi) L-1 (1)

1 ! ( L - 1) !

Cette d is t r ibut ion b inomina le a son ma x i mum pour lma x = Lpi avec une hauteur Pmax =

l+ 1/2 . (2 ~ Ira,x)--1/2 et une largeur (6cart type) = -m,x , Une repr6sentat ion approchan t eette d is t r ibut ion est fournie par un rectangle de m6mes d imens ions (largeur et hauteur) et de m6me position. Darts ]e cadre de cette approximat ion, il existe pour toute ehaine de longueur L une probabi l i t6 Pm,x pour que la teneur en acide amin6 ~ soit repr6sent6e

par une des valeurs de l ' in terval le lma x ÷ 1 lf2 - - - m a x

avee lma x = pv L.

Puisque le rappor t exp6rimental r = m ' i / n ' i ne peut 6tre d6termin6 qu 'avec des e r r e u r s - t y p e d 'ordre ~, il existe toujours plus ieurs eombina isons de mi" e t ni" pour la prot6ine parasi te dont le rap- port tombe dans l ' in terval le r (1 ± e).

Pour estimer le hombre moyen de ces combi- naisons, ces fract ions sont repr6sent6es darts un plan cart6sien dont l 'abscisse est le d6nomina teur et l 'o rdonn6e le num6rateur . Les rapports de ces nombres cutters forment ainsi un r6seau << eubique simple >> de points. Toutes les fract ions de m6me valeur num6r ique se s i tuent sur une droite passant par l 'o r ig ine et de pente r.

Les rapports qui nous int6ressent sont inclus dans un secteur de ce p]an limit6 par :

1) les d r o i t e s y : r x ( 1 + e) e t y = rx ( l - e ) ;

2) les abscisses lmax -]1/2-.1.~ et ]max ~- ]1/2max eor- r e spondan t aux valeurs probables d 'un des acides amin6s marqu6s ;

3) les ordon6es eor respondant aux valeurs pro- babies de l 'autre aeide amin6 marqu6.

L 'a i re de eette surface (Fig. 1) est donn6e par

S r (1 +- r~)a/~ 4 ] 1 / 2 (II) - m a x

Cette surface s 'expr ime en unit6s eor respondant au carr6 de la distance entre deux points fract ion, elle repr6sente done le nombre de possibilit6s chereh6es pour r6aliser un rappor t dans l ' in ter- valle dfi aux erreurs exp6rimentales.

P renons le cas d6favorable off le pept ide exp6- r imenta l poss6de le rappor t m ' i / n ' i le plus banal

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4.

I d e n t i f i c a t i o n de t r a c e s de p r o t d i n e s . 557

(vois in de ce lu i de la p r o t 6 i n e m o y e n n e ) . Dans ce cas la p robab i l i t 6 de t r o u v e r un p e p t i d e p a r a s i t e est m a x i m a l e , /L s a v o i r

4 })max 1. | maxo_ S :~ ~ r 1/2 (1 -4- r2) a/2 _l-1/2max e (III)

2 ~ Avec r = 1, lm~ ~ = 4, e = 0,08, on ob t i en t une

p robab i l i t 6 de 0,32. Si la c o m p a r a i s o n p o r t e su r k

~ Yirx(1 - £ )

_v2 t~°,+ tmox tm°x tmox tmox "X

Fro. 1. - - Etablissement dtt nombre de rapports entre deux acides amines marquds, rapports qui entrent en ligne de compte comme caraetdrisant d'd.oentuels pepti- des parasites. L'abseisse reprdsente les hombre par ehaine d 'un aeide amind marqud, l 'ordonn6e les nombres de l 'autre.

pep t ides , la p r o b a b i l i t 6 - - ou la c o n c e n t r a t i o n d ' u n e p r o t 6 i n e a lda to i re s i m u l a n t tons les k rap- po r t s est de l ' o r d r e de :

4 e )k ~ r (1 + r2) l '~- (IV) ( P . . . . 1 Pmax2 S)k ~ (

2 lmax 7G t

Avec k = 3, r = 1, lma x ~--- 4, e = 0,08, on ob t i en t u n e p robab i l i t 6 de 0,03. Nous avons t ra i t6 le cas off n ' i m p o r t e que l le p r o t 6 i n e est syn th6 t i s6e et oO les r a p p o r t s des ac ides amin6s m a r q u 6 s darts les p e p t i d e s de la p r o t 6 i n e de r6 f6 rence P c o r r e s p o n - den t aux t eneu r s les p lus p r o b a b l e s en a c i d e s amin6s . Si les r a p p o r t s dans la p r o t 6 i n e P son t p lus ex t r emes , a u t r e m e n t d i t p lus ca rac t6 r i s t i ques , les c h a n c e s de t r o u v e r u n e p r o t d i n e p a r a s i t e X d i m i n u e n t 6 g a l e m e n t (III) .

D ' a u t r e par t , si les p r o t 6 i n e s p a r a s i t e s t o m b e n t dans u n e c lasse qu i r e s s e m b l e h la p r o t 6 i n e P (si ce sont p a r e x e m p l e d ' au t r e s g lobines) , les c h a n c e s p o u r que les r a p p o r t s so ien t s emblab l e s a u g m e n - tent .

Aussi la m 6 t h o d e ne se p r o n o n c e - t - e l l e que sur la p r 6 s e n c e de la c h a i n e p o l y p e p t i d i q u e r e c h e r - ch6e ou d 'une chalne homologue . Elle ne p e r m e t q u ' a c c i d e n t e l l e m e n t de f a i r e la d i s t i n c t i o n en t r e c h a i n e s p o l y p e p t i d i q u e s 16gbrement d i f f6rentes .

A P P L I C A T I O N .

Nous avons app l iqu6 la p r6 sen t e m 6 t h o d e h r i d e n t i f i c a t i o n de la syn th6se d ' h 6 m o g l o b i n e foetale h u m a i n e [1]. A cet effet on contr61e, no t am- men t , l ' i den t i t6 de la c h a i n e (5 de l ' h 6 m o g l o b i n e adu l te et de la c h a i n e v de l ' h 6 m o g l o b i n e foetale, isol6es se lon les p roc6d6s i nd iqu6s dans ]a pub l i - c a t i on pr6ci t6e . La l o n g u e u r de ces cha ines , les e m p l a c e m e n t s des rds idus de m 6 t h i o n i n e , la lon- gueur des p e p t i d e s ob tenus p a r l ' h y d y r o l y s e au b r o m u r e de c y a n o g 6 n e sont f ou rn i s p a r la f igure 2.

~x

Pa i

Pa~

P%

55

55

Chalne ou peptide

Met Met 55 133

Met 55

78

13

91

act sp. a~C-L- Sdrine KTh ~-- act sp. ~H-L- Valine

146

Nombre de r6sidus

Valine

13 4

7

2

18 8

10

Sdrine

11 5

3

3

n 3H-L- Val. DPM 14COL- Sdr K Exp - - n t"C-L- S6r X DPM 3H-L-Val

FIG. 2. - - Longueur ainsi que teneur en L-valine et L-s6rine des chaines et peptides d'h~moglobine utilis~s pour illustrer la mdthode. Caleul de la valeur thdorique (Kth) et expdrimentale (Ko~,) de K.

Act.Spe. : Aetivitd spdeifique. DPM : Ddsint6grations par minute.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4. 36

558 J.-P. Sallei, A. D u p u y d 'Angeac el H. Vogel.

Le t ab l eau I donne , h t i t r e d ' e x e m p l e , les va l eu r s t h6o r iques et e x p 6 r i m e n t a l e s du r a p p o r t v a l i n e / s6r ine .

TABLEAU "[.

Rapport Val/Ser.

Chaines et peptides

pv~ P7:~

Valeurs th6oriques

3 60 2.66 5.00 1.18 0.80 0.67

Valeurs exp6rimenlales

3.50 -4- 0 3 0 2.55 + 0 2 0 4.90 -~- 0.40 1.25 ~- 0.1~ 0.75 + 0.06 0.70 -+- 0.05

Valeurs th6oriques et exp6rimentales du rapport val ine/s6r ine dans les chaines (5 et V d'h&noglobine humaine et dans les produits d 'hydrolyse de ces chalnes obtenns par action du bromure de cyanogbne (cf. ref. 1).

t ides . Ce que la m 6 t h o d e p r o p o s 6 e i c i p e r d sur le p l a n du n o m b r e de p e p t i d e s examin6s , e l le le gagne p a r la p lus g r a n d e p r o b a b i l i t 6 d ' i den t i f i c a - t i on de c h a q u e p e p t i d e p a r t i c u l i e r .

Toute fo i s , la p r 6 s e n c e d ' impure t6 s , non 61imi- n6es p a r les p roc6d6s d ' i s o l e m e n t employ6s , r i s q u e de r e n d r e i m p o s s i b l e r a p i d e m e n t la d6 tec t ion cer - t a ine du p e p t i d e r e c h e r c h 6 h m e s u r e que la t e n e u r en p e p t i d e s p a r a s i t e s s ' a cc ro l t . La m 6 t h o d e pr6- sen te ne p e r m e t d o n c pas de d i s t i ngue r en t r e l ' ab- s ence d ' u n p e p t i d e et sa p r 6 s e n c e dans un m6- lange. U n e p u r i f i c a t i o n pouss6e des p e p t i d e s e x a m i n e r est i n d i s p e n s a b l e .

Remereiements.

Nous remereions M. Gastone Matioli qui nous a sugg6r6 l'id~e de cette m6thode, et la Fondat ioa pour la Recherche M6dieale Fran~aise, de l 'a ide finanei6re qu 'el le a aeeord6e h notre laboratoire.

Vu la b o n n e c o r r e s p o n d a n c e en t r e les v a l e u r s t h6o r iques et e x p 6 r i m e n t a l e s , on c o n c l u t h l ' i d en - tit6 des p ro t6 ines isol6es avec les c h a l n e s ~ et v d ' h 6 m o g l o b i n e r e s p e c t i v e m e n t .

CONCLUSIO!N.

Dans l ' a n a l y s e d ' u n pep t i de , on p e u t s o u t e n i r que son i d e n t i f i c a t i o n p a r le r a p p o r t q u a n t i t a t i f en t r e deux ac ides amin6s , conf i rm6e p a r la cons- t a n c e d ' u n e ac t iv i t6 sp~c i f ique h t r a v e r s un p i e op t ique , est p lus sfire que p a r u n e p o s i t i o n ch ro - m a t o g r a p h i q u e . En r e v a n c h e , les << f i n g e r p r i n t >> sur p a p i e r ou sur e o l o n n e c a r a c t 6 r i s e n t une p r o - t6ine p a r un n o m b r e b e a u c o u p p lus 61ev6 de pep -

R~SUM~.

La m6ihode d6crite pern~et l ' identification de faibles quantit6s d 'une prot6ine par le rapport quant i ta t i f entre deux acides amin6s marqu6s (3H, 14C), mesur6 sur la prot6ine et sur ses peptides. Nous avons appli- qu6 avec suce6s cette mdthode h l ' identification de chaines 13 et ~/ d 'h6moglohine synth6tis6es en culture de eellules h6mopoi6tiques humaines.

BIBLIOGRAPHIE.

1. Salle'i, J. P. a Zuckerkandl, E. (1974) Biochimie, 56, 547-553.

2. Jones, R. T. (1964) Cold Spring Harbor Syrup. Qnant. Biol., 'Z9, 297-308.

3. Dayhoff, M. O. ~ Hunt, L. T. (1972') in Atlas of Protein Sequence and Structure (M. O. Dayhoff, ed.), Vol. 5, pp. D 355-359, NBR, Washington, USA.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4.