TP Transformation d'une souche d'E. coli (HB 101)

par le plasmide pGLO

CIVEL / (JOFFIN) - ABM

Objectifs :

- Réaliser la transformation de bactérie, en leur faisant ‘‘ingérer’’ un plasmide.

- Utilisation d’un kit commercial Biorad®

- Utilisation de milieux artisanaux type Paul Éluard

Activités :

- Préparation des milieux de culture nécessaire et revification de la souche d’E. coli.(2 méthodes)

- Réalisation de la transformation

- Mise en culture, pour visualiser l’efficacité de la manipulation

Gène de la ………………

Gène de la

Gène du ………………

bétalactamase

Protéine fluorescente avec promoteur/opérateur de l’opéron arabinose

Répresseur de l’opéron arabinose

Origine de réplication (site EcoR1)

Pour 8 groupes !

TP biorad (B) TP sauce Paul Éluard (PE)

Jour 1

Préparation de 8 milieux LB (B) Couler 16 milieux LB (PE)

Ensemencement des bactéries sur 8 milieux LB (PE) + 8 milieux LB (B)

+ Autoclavage du reste du milieu LB Préparer et Couler 16 milieux LB Amp (PE)Préparer et Couler 8 milieux LB Amp/Ara

(PE)

Jour 2

Préparation des 8 autres milieux LB (B) et des 16 milieux LB Amp (B), et des 8 milieux LB Amp/Ara (B)

Réaliser les tubes ''transformation'' et ''control''

- Ensemencer les boites LB Amp (B) + LB Amp/Ara (B), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (B) et

LB (B), avec le tube ''control''.

- Ensemencer les boites LB Amp (PE) + LB Amp/Ara (PE), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (PE) et

LB (PE), avec le tube ''control''.

Incuber à 37°C

(à reproduire) B PE

Jour 3 E coli + pGLO E. C oli - pGLO E coli + pGLO E. coli - pGLOLB

AmpLB

Amp/AraLB Amp LB LB Amp

LB Amp/Ara

LB Amp LB

Résultats

Pour 8 groupes !

TP bioRad (B) TP sauce Paul Éluard (PE)

Jour 1

Préparation de 8 milieux LB (B) Couler 16 milieux LB (PE)

Ensemencement des bactéries sur 8 milieux LB (PE) + 8 milieux LB (B)

Pas d'autoclavage / Travail

sous PSMPréparer et Couler 16 milieux LB Amp

(PE)Préparer et Couler 8 milieux LB

Amp/Ara (PE)Préparation des 8 autres milieux LB

(B) et des 16 milieux LB Amp (B), et des 8 milieux LB Amp/Ara (B)

Jour 2

Réaliser les tubes ''transformation'' et ''control'' - Ensemencer les boites LB Amp (B) +

LB Amp/Ara (B), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (B) et

LB (B), avec le tube ''control''.

- Ensemencer les boites LB Amp (PE) + LB Amp/Ara (PE), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (PE) et

LB (PE), avec le tube ''control''.

Incuber à 37°C

(à reproduire)

B PE

Jour 3 E coli + pGLO E. coli - pGLO E coli + pGLO E. coli - pGLOLB

AmpLB

Amp/AraLB

AmpLB

LB Amp

LB Amp/Ara

LB Amp

LB

Résultats

Préparation des milieux de culture (Biorad®)

Milieu de base LB

Utiliser le bain d’eau (bouillonnant ?)Bien agiter, bien homogénéiser

Préparation des milieux de culture (Biorad®)

Ampicilline et Arabinose

Stérilement !

Préparation des milieux de culture (Biorad®)

Ampicilline et Arabinose

Volume dans les boites :12 mL

Préparation des milieux de culture (Paul Eluard®)

- À partir des milieux Columbia, couler 16 milieux LB

- Puis préparer les milieux LB/Amp et LB/Ara + Amp, de façon similaire à la méthode Biorad®

Transformation (Biorad®)

Conservation dans la glace

Conservation dans la glace

Transformation (Biorad®)

Choc thermique : 42°C, 50 secondes, puis dans la glace

Conservation dans la glace

Rappels…

transformation

conjugaison

transduction