II. LES OUTILS ENZYMATIQUES - meridianaweb.free.frmeridianaweb.free.fr/ABDOL/doc expose/expose...
Transcript of II. LES OUTILS ENZYMATIQUES - meridianaweb.free.frmeridianaweb.free.fr/ABDOL/doc expose/expose...
1
Principaux outils en Biologie Moléculaire:
acides nucléiques, enzymes, notion d’hybridation.
Préparation et marquage des sondes
I. Préparation du matériel biologique
• Extraction et purification de l’ADN• Extraction et purification de l’ARN
– ARN totaux– ARN messagers
2
A - Extraction de l’ADN
- Sang total- Culture cellulaire- Tissu sain / tumeur- Villosités choriales …
3
CAS du SANG TOTAL : tube avec anti-coagulant ( EDTA +++)pas d’héparine !!!
plasmaGlobulesblancs
Globules rouges
Solution hypotonique
+ centrifugation 2
Culot de blancs
Centri 1
1. Élimination du plasma
2. Lyse des globules rouges
3. Culot de globules blancs
Purification de l’ADN au phénol chloroforme: Phénol → phase aqueuse : ADN
→ phase phénolique(éliminée): protéinesChloroforme → phase aqueuse : ADN
→ phase chloroformique (éliminée): traces de phénol résiduel
Ethanol /NaCl → ADN précipité (« méduse »)
Culot de blancs
SDS + protéinase KLyse des membranes et digestion des protéines associées à l’ADN
ADN libre en solution
Méthodes commerciales: pas de réactifs toxiques, solution d’ADN concentrée
Méduse
4
Séchage de la méduseCulot sec repris dans un tampon
Evaluation de la concentration1 unité DO à 260nm = 50µg/ml
Mesure directe de la DO sur ADN dissout
B - EXTRACTION DE L’ARN
- ARN fragiles +++ → RNAses ubiquitaires- conditions stériles (RNAses bactériennes)- cellules ou tissus traités immédiatement
- détergent : SDS- agent dissociant : isothiocyanate de guanidine- solution tampon- agent réducteur : β mercapto-éthanol /DTT
→ inhibition des RNAses, dénaturation des protéines
- séparation ARN/ADN- par précipitation différentielle en fonction du pH- par respect des structures nucléaires (ARN libres ds le cytoplasme)
- purification par traitement à la DNase
5
T T T
T
T
T TT
Oligo dTcellulose
ARN totaux = ARN ribosomaux + ARNm
A A A A ARNm
A A A A ARNm
C% salineimportante
C% salinefaible
Elution des ARNm
Elution des ARNr
T T T
T
T
T TT
Précipitation à l’alcool
Devenir des acides nucléiques extraits
• Exploitation directe avec ou sans amplification : Southern/Northern Blot, PCR, RT-PCR…
• Conservation : – En solution, à 4°C : qq années
– Sous forme précipitée à -20°: plus long terme
6
II. LES OUTILS ENZYMATIQUES
A – Les enzymes de restriction
B – Visualisation des fragments de restriction
C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction- autres…
D – Les autres enzymes
A - ENZYMES DE RESTRICTION
NOMENCLATURENOMENCLATURE
Escherichia co li Ry13
Eco R I 1ière enzyme trouvée chez E coli
Eco R V 5ième enzyme trouvée chez E coli
Providencia StuartiPst I
Endonucléases d’origine bactérienne (défense contre les bactériophages)
7
LES DIFFERENTS TYPES DLES DIFFERENTS TYPES D’’ENZYMES DE RESTRICTIONENZYMES DE RESTRICTION
Type I : coupure aléatoire 1000 à 1500 bases après le site reconnu et libération de qq dizaines de nucléotides
Type II : coupure au niveau de la séquence reconnue
Type III : coupure une vingtaine de paire de bases après la séquence reconnue
En pratique, enzymes de type II +++
Isoschizomères : enzymes ≠ reconnaissant le même site de coupure
LES SEQUENCES RECONNUES (Type II)LES SEQUENCES RECONNUES (Type II)→ courtes (4 - 6 pb +++), palindromiques
COUPURES A BOUTS COHESIFS Ex : EcoR I
5 ’……G A A T T C …….3 ’ 5 ’……. G AATTC……3 ’3 ’……C T T A A G…….5 ’ 3 ’…….. CTTAA G……5 ’
COUPURES A BOUTS FRANCS (BLUNT ENDS) ex : Sma I
5 ’ …….C C C G G G …….3 ’ 5 ’ …….C C C G G G …….3 ’3 ’ …….G G G C C C …….5 ’ 3 ’ …….G G G C C C ……..5 ’
8
Enzyme Bactérie d’origine Séquence cible(coupure à l’*)5' -->3'
Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T
Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G
Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C
Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C
Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T
Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C
Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C
Mbo I Moraxella bovis *G A T C
Pst I Providencia stuartii C T G C A * G
Sma I Serratia marcescens C C C * G G G
Sst I Streptomyces stanford G A G C T * C
Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C
Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A
Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G
Sites = 4 à 6 pbasesCoupure fréquente~ 3kb
Sites = 8 pbasesCoupure rare~ 100-200kb
Fréquence statistiquede la séquence cibleν = 1/4nb de bases
EXEMPLE : COUPURE PAR EcoRI
EcoRI EcoRI EcoRINNGAATTCNN NNGAATTCNN NNGAATTCNN
NNCTTAAGNN NNCTTAAGNN NNCTTAAGNN
NNGOH p AATTCNN NNGOH pAATTCNN NNGOH pAATTCNN
NNCTTAAp OH GNN NNCTTAAp OHGNN NNCTTAAp OHGNN
9
SITES METHYLES
- Influence de la méthylation sur l’expression des gènes.- L’ADN des eucaryotes peut être méthylé au niveau des cytosines CpG. - Certaines enzymes ne reconnaissent pas l’ADN méthylé
→ enzymes sensibles à la méthylation
Ex: HpaII et MspI: isoschizomères (C/CGG) mais HpaIIsensible à la méthylation
→ identité de profil électrophorétique attendue sauf si méthylation fragments de taille différente
C CG GG GC C
HpaII ne coupe pas MspI coupe
C CG GG GC C
Sau 3A site contenu dans Bam HI : sites compatibles
…...G A T C……. …...G G A T C C……. …...C T A G……. ……C C T A G G…...
SITES INCLUS
Intérêt : • ADN1 coupé par Sau 3A, ADN2 coupé par Bam HI• réassociation possible de fragments de restriction ADN1/ADN2• recombinant non clivable par Bam HI sauf si N=G
NN
10
II . LES OUTILS ENZYMATIQUES
A – Les enzymes de restriction
B – Visualisation des fragments de restriction
C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction - autres…
D – Les autres enzymes
Visualisationdes fragmentsde restriction(électrophorèse)
An Introduction to Genetic Analysis
Après colorationau BET
Sens de la migration
11
ADN génomiquenon coupé
ADN génomique
coupé
ADN de phage (50kb)
coupé
12
Nombre de kb(échelle Log)
Migration mm
II . LES OUTILS ENZYMATIQUES
A – Les enzymes de restriction
B – Visualisation des fragments de restriction
C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction - autres…
D – Les autres enzymes
13
CARTE DE RESTRICTION
Coupure d’un ADN linéaire ou d’un plasmide par une enzyme de restriction
Séparation des fragments obtenus par électrophorèse
Evaluation du nombre et de la taille des fragments générés
→ L’usage de plusieurs enzymes seules ou combinées et l’étude des profils électrophorétiques obtenus permet de localiser les sitesde restriction et de définir une « carte de restriction »
Profils électrophorétiques obtenus après coupure et migration
Les fragments de 3, 7 et 10 kbobtenus en simple coupure ont également un site de coupure
pour l’autre enzyme3 kb = 2 kb+1 kb7 kb = 6 kb+1 kb10 kb = 8 kb+2 kb
17 kb
Exemple de carte de Exemple de carte de restrictionrestriction
14
Autre application desenzymes de restriction
→ génération d’ADNrecombinant par ligationdes extrémités cohésives
ADN ADN plasmidiqueplasmidiqueGène à insérer
ligation
Coupure par EcoRI
ADN recombinant
Applications nombreuses des enzymes de restriction (diagnostic / recherche):
• identification de mutations créant ou supprimant un site de coupure (hémochromatose, mucoviscidose, drépanocytose)• étude des polymorphismes minisatellites (criminologie)• génération de plasmides recombinants• création de banques génomiques• …
15
II . LES OUTILS ENZYMATIQUES
A – Les enzymes de restriction
B – Visualisation des fragments de restriction
C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction - autres…
D – Les autres enzymes
Les polymérases
- Origine bactérienne
- L’ADN polymérase I (E coli)- activité polymérasique 5’→3’: nécessité d’une amorce 3’OH- activité exonucléasique 5’→3’ et 3’→5’ (activitéproofreading)
16
Les polymérases
• Le fragment de Klenow de la Polymérase I (E coli)– obtenu par protéolyse ménagée de la précédente– mêmes ptés sauf activité exonucléasique 5’→3’
• La Taq polymérase– Origine: Thermus aquaticus → thermostable– Mêmes ptés que le fragment de Klenow– En général, pas d’activité proofreading– +/- qualité hot start
Les polymérases
• Les ARN polymérases– Activité polymérasique 5’→3’– Amorce 3’OH non nécessaire mais présence du
promoteur correspondant indispensable– Pas d’activité proofreading
• La transcriptase inverse– Origine rétro-virale– Activité polymérasique 5’→3’: synthèse d’ADN à partir
d’une matrice ARN– Amorce 3’OH nécessaire– Activité RNase H (destruction de l’ARN des hybrides
ADN/ARN)
17
Autres …
• Nucléases– DNase I:
• Endonucléase ADN db ou sb
• Trous = « nicks » au hasard
– nucléase S1• Endonucléase ADN sb uniquement
• RNases– RNase A : ubiquitaire, très active et résistante,
détruit les ARNsb
– RNase H : destruction des ARN ds les hybrides ADN / ARN
Autres….
• Ligases
– formation des liaisons phosphodiester entre des extrémités 3’OH et 5’phosphate libres
– Extrémités cohésives: ADN ligase d’E coli
– Extrémités cohésives ou franches: T4 DNA ligase
18
Molecular Cell Biology
Autres …
• Kinases et phosphatases- traitement à la phosphatase alcaline
PALextrémité 5’phosphate 5’OH� plus de ligation possible
- T4 polynucléotide kinase : extrémité 5’OH 5’phosphate
� ligation à nouveau possible
19
Enzymes, conclusion …
• Grand choix d’enzymes• Actions diverses
• Usage courant en génétique moléculaire
III . Hybridation molIII . Hybridation molééculaireculaire
20
21
Notion de Tm (Melting Temperature)
- Tm = t°de fusion du DNA
- Température au-delà de laquelle l’ADN passe sous forme simple brin.
- Phénomène coopératif
- Modification de la DO à260 nm
Facteurs agissant sur la valeur du Tm
• Composition en basesTm = 69,3 + 0,41(%G+C)
• Longueur des fragmentsADN long ↔ Tm
• Stringence du milieu (= faible force ionique)milieu stringent ↔ Tm
22
HYBRIDATION MOLECULAIRE
ADNdouble brin
ADNsimple brin
Simple brin
glace
refroidissement progressif
REAPPARIEMENT
HYBRIDATION
Dénaturation- chauffage > Tm- agent dénaturant
Conditions nécessaires àl’hybridation:
- Refroidissement lent
- Reconnaissance d’une séquence strictement complémentaire ↔ absolue spécificité
Rq : Hybrides ADN/ARNpossibles, + stables
23
FACTEURS DE L’HYBRIDATION
- Température de fusion / composition en G + C
- Facteurs influençant l’hybridation
- la C% dC% d’’ADN et le tempsADN et le temps→ probabilité de rencontre
- la température VmaxVmax ↔↔ tt°°= 0,75Tm= 0,75Tm
- la complexitcomplexitéé des séquences
- la force ioniqueforce ioniqueélevée ↔ favorise l’hybridation
L’hybridation peut avoir lieu
1 - en solution (PCR+++)
2 - sur support solide : immobilisation sur membrane (nitrocellulose, nylon), sur verrecolonies bactérienneschromosomescoupe de tissus, cultures cellulaires...
Objectif : détecter la présence d'un acide nucléique d'une séquence donnée par l’utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde
Les différents types d’hybridation
24
SOUTHERN BLOTSOUTHERN BLOTHybridation sur support solide (nitrocellulose)
25
1 . Séparation des fragments de restriction
2. Transfert
3. Hybridation de la sonde
4. Révélation
EcoRI EcoRIFMR 1 exon 1
Sonde StB 12.3(CGG)6-45
EagI
5,2 kB
2,8 kB
ApplAppl°° : : SdSd X fragileX fragile
- Gène FMR1 - Région répétée : triplets CGG (n = 6 à 45)- n très ↑ chez les malades- Southern blot : chez les malades, le fragment révélé par la sonde est de taille augmentée
26
5,2 kB
EcoRI EcoRIFMR 1 exon 1
Sonde StB 12.3(CGG)6-45
EagI
2,8 kB
NORTHERNNORTHERN BLOT BLOT -- distribution ddistribution d’’un ARN un ARN dsds les tissusles tissus-- éévaluation de son abondance relativevaluation de son abondance relative-- ddéétermination de sa taille, des termination de sa taille, des éépissagespissages possiblespossibles
Expression comparée de l’ARNm de PEDF chez le fœtus et l’adulte- Différences notables : cerveau, rein- Expression similaire : cœur, foie, poumon
ExempleExemple
27
Hybridation Hybridation in situin situ sur culture cellulairesur culture cellulaire
�� DDéétection tection du virus d'du virus d' EpsteinEpstein --BarrBarr à l’aide d’une sonde reconnaissant l’ARN (= génome) viral
- coloration bleu foncée des noyaux infectés - contre coloration verte des autres noyaux
Indications : Syndromes lymphoprolifératifs et lymphomes
Hybridation Hybridation in situin situ sur coupe de tissusur coupe de tissu
�� Objectif :Objectif : déterminer quelle sous population cellulaire d’un tissu exprime un ARN donné
Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une hybridation avec une sonde d'un ghybridation avec une sonde d'un gèène impliqune impliquéédans le ddans le dééveloppement embryonnaireveloppement embryonnaire
28
Hybridation Hybridation in situ in situ sur chromosomesur chromosome
ObjectifObjectif : déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se trouve le gène dont on possède la sonde.
En pratique :- préparation des chromosomes (métaphase)- hybridation directement sur les préparations fixées sur lame- sonde marquée au tritium (H3): rayonnement très court, donne donc une localisation fine de la zone émettant la radioactivité. - résultat lu sous microscope : les signaux positifs apparaissent sous forme de grains noirs disposés sur les chromosomes.
Localisation Localisation d'un gd'un g èène de ne de
DrosophileDrosophile
29
Application diagnostique de la FISH: Sd de Williams (microdélétion Ch7)
Chromosome painting → sondes permettant le marquage d’unepaire de chromosomes
30
Multi FISH :Caryotype 24 couleurs
Hybridation sur colonie de bactéries, sur plage de lyse
�� Objectif:Objectif: détecter parmi un grand nombre de bactéries ou de phages recombinants celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherché →→ criblage de banquecriblage de banque
Boîtes avec colonies
-bactéries ou phages-
(milliers àmillions)
Prise d'empreinte(nylon ou
nitrocellulose)
Coussin de NaOH(éclatement cellules +
dénaturation ADN)
Fixation(cuisson ou UV)
Addition de la sonde
HybridationAutoradiographieLocalisation des clones d'intérêt
Lavages
31
Criblage dCriblage d ’’une une banque banque phagiquephagique
Identification du clone d’intérêt
Infection de bactéries pour production
massive du clone recombinant
Isolement du phage recombinant
sur la boite mère
Gène d’intérêt
IV . LES SONDESIV . LES SONDES
32
IV . LES SONDES
A – Définition
B - Les différents types de sondes
C- Obtention des sondes
- clonage
- PCR
D – Marquage des sondes
A A –– DDééfinitionfinition
• Séquence d’acide nucléique simple brin , d’au – 15 nucléotides
• Homologue d’une séquence ARN ou ADN• Hybridation stable et spécifique par
réassociation entre bases complémentaires
33
B B -- DiffDifféérents types de sondesrents types de sondes
• Sonde d’ADN génomique (sélectionnée àpartir d’une banque d’ADN génomique)
• Sonde d’ADNc (sélectionnée à partir d’une banque de cDNA)
• les oligosondes : 20-25 pb +++• les ribosondes :
CC-- ObtentionObtention
• Clonage : fragment d’intérêt inséré dans un vecteur
• PCR• Synthèse chimique
– Oligosonde +++
• Transcription in vitro– Ribosonde : à partir d’un fragment d’ADN
cloné ds un vecteur pourvu d’un promoteur spécifique d’une RNA polymérase
34
D D –– Marquage des sondesMarquage des sondes
1 - l’agent de marquage :
- marquage radioactif
- marquage froid- direct – nucléotide modifié par un fluorophore- indirect – nucléotide marqué par un reporter qui
sera repéré par une molécule affine
2 - stratégies de marquage
- nick translation- multi-amorçage au hasard- marquage des oligonucléotides
Les sondes radioactivesLes sondes radioactives
32P, 35S, 3H
Révélation par autoradiographie
Attention : les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients :
1. nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, maniement des sondes inconfortable, traitement des déchets
2. décroissance rapide du 32P, d'où besoin de marquer les sondes fréquemment (T1/2 = 15 jrs)
Avantage : grande sensibilité
35
D – Marquage des sondes
1 - l’agent de marquage :
- marquage radioactif
- marquage froid- direct – nucléotide modifié par un fluorophore- indirect – nucléotide marqué par un reporter qui
sera repéré par une molécule affine
2 - stratégies de marquage
- nick translation- multi-amorçage au hasard- marquage des oligonucléotides
Les sondes froidesLes sondes froides
- Digoxigénine :révélation par un Ac anti-digoxigénine marqué par
- un fluorochrome- une enzyme : addition d’un substrat chromogène
- Système biotine-streptavidine :sonde biotinyléerévélation par l’avidine /streptavidine(affinité +++ pr la biotine) marquée par
- un fluorochrome- une enzyme
amplification par des systèmes sandwichs divers (Ac anti-avidineégalement marqués)
Marquage indirect
36
Les sondes froides
Fluorophore
Nucléotide portant le marqueur est incorporé directement.
Groupe chimique qui fluoresce quand il est exposé à une longueur d’onde donnée : Fluorescéïne, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas Red
Marquage direct
D – Marquage des sondes
1 - l’agent de marquage :
- marquage radioactif
- marquage froid- direct – nucléotide modifié par un fluorophore- indirect – nucléotide marqué par un reporter qui
sera repéré par une molécule affine
2 - stratégies de marquage
- nick translation- multi-amorçage au hasard- marquage des oligonucléotides en 5’
37
Marquage par Marquage par NickNick--TranslationTranslation
-Traitement de la sonde par la DNAse(conditions ménagées)
- Génération de qq coupures aléatoires(nicks = trous) sb
- Action de la DNApol I : - dégradation de l’ADN au niveau descoupures (activité exonucléase)- repolymérisation avec incorporationde nucléotides marqués (activitépolymérase)
Marquage par Marquage par randomrandom primingpriming
- Dénaturation de la sonde
- Addition d’un cocktail d’hexanucléotides synthétiques → hybridation au hasard
- Les nucléotides hybridés servent d’amorce au fragment de Klenow quireconstitue le brin complémentaireet incorpore des nucléotides marqués
38
Marquage des Marquage des oligonucloligonuclééotidesotides en 5en 5’’