ANAEROBIES STRICTES Civel / Joffin / Karczinski - Microbiologie / ABM2.

ANAEROBIES STRICTESANAEROBIES STRICTES

Civel / Joffin / Karczinski - Microbiologie / ABM2

1. Présentation

1. Présentation

1.1. Définition

Incapable de cultiver en présence de dioxygène atmosphérique (20%) : car il est toxique (bactéricide ou bactériostatique)

1. Présentation

1.2. Mise en évidence

Culture sur milieux simples : VF, HL ou CTA glucosé (culture au fond des tubes),Cultures comparées sur des milieux en aérobiose et anaérobiose (GS)

1. Présentation

1.3. Toxicité de l’O2

En présence d’Oxygène, il y a formation de radicaux libres : - Péroxydes (ex : H2O2)- Ion superoxyde : O2

.-

= oxydants puissants dégradant les protéines et acides nucléïques

Origine des péroxydes :métabolisme (respiration, coenzymes respiratoires …)

Comment les éliminer ?Catalase, péroxydases, superoxyde dismutase

2. Méthodes d’étude des bactéries anaérobies strictes


La culture nécessite : - incubation en atmosphère anaérobie (absence d’O2) - des milieux de culture dépourvus d’O2


2.1.1. Anaérobiose des milieux de culture :

Conditionnement : - des tubes à section étroite - des milieux gélosés où l'oxygène diffuse mal - des milieux sous paraffine ou vaseline - des milieux conditionnés sous atmosphère gazeuse artificielle (azote)

Régénération : Procédé de dégazage le plus simple : ébullition 30 min à 100°C

2.1. Anaérobiose


2.1.1. Anaérobiose des milieux de culture :

2.1. Anaérobiose

Incorporation de molécules réductrices dans le milieu :Ces molécules ne doivent pas être toxiques pour les micro-organismes.

CYSTÉINE ou morceaux d'organes contenant de la CYSTÉINE (Cervelle, rein, foie...).La cystéine est réductrice : 2 molécules de cystéines s'unissent par un pont disulfure en libérant 2 e- : ½ O2 + 2 R-SH --> R-S-S-R + H2O 2 cystéines cystine

Thioglycolate de sodium (retrouvé dans les milieux pour hémocultures) appelé aussi acide mercaptoéthanoïque de formule HS-CH2-COOH.

On utilise aussi du glucose (pouvoir réducteur ?)


2.1.2. L’atmosphère anaérobie :Enceintes anaérobies : Jarre, sachets anaérobies (GASPACK)

2.1. Anaérobiose


2.1.2. L’atmosphère anaérobie :Enceintes anaérobies : Jarre, sachets anaérobies (GASPACK)

2.1. Anaérobiose

Principe : Ils fournissent une atmosphère appauvrie en O2 et enrichie en CO2. - L’anaérobiose est réalisée par réduction de l’ O2 par de l’hydrogène en présence de palladium Pd : H2 + ½ O2 --> H2 O

- La génération de l'hydrogène est obtenue par réaction d'ions H+ de l'acide citrique sur des ions hydrure : H- + H+ --> H2

- Les ions hydrures sont obtenus à partir du borohydrure de sodium mis en milieu aqueux : BH4

- Na+ --> BH3 + H- + Na+

- En règle générale, un dégagement de dioxyde de carbone est réalisé en même temps car il favorise la culture de ces bactéries. Par l’action de l’acide citrique sur de l’hydrogénocarbonate : H+ + HCO3

- à CO2 + H2 O


2.1.2. L’atmosphère anaérobie :

2.1. Anaérobiose

Les systèmes commercialisés comme GasPack®, sont formés d'un sachet contenant 2 comprimés contenant :

- 1 fournissant l’hydrogène : le borohydrure de sodium et de l'acide citrique : BH4

- Na+ à H-

R-COOH à H+ H2 + ½ O2 à H2 O

- 1 fournissant le CO2 : contient de l'hydrogénocarbonate de sodium et de l'acide citrique (comme dans les comprimés effervescents) : HCO3

- Na+ à HCO3-

R-COOH à H+ CO2 + H2 O

L'addition d'eau permet la réaction


2.1.2. L’atmosphère anaérobie :

2.1. Anaérobiose

- Témoin d’anaérobiose : Bleu de méthylène : indicateur redox : - bleu lorsqu’il et oxydé par l’O2, - blanc lorsqu’il est réduit c.a.d. en anaérobiose.

Remarques : - Système Generbag Mérieux (sachets en plastique transparent). Peu coûteux, mise sous anaérobiose rapide, observation de l’isolement sans ouvrir l’emballage.- Merck commercialise un système analogue à base de fer comme réducteur (qui fixe l’O2 sous forme d’oxyde de fer).- Generbag utilise un nouveau système sans catalyseur et sans eau (utilisé à Paul Eluard)


2.1.3. Cas particuliers d’atmosphère :

- atmosphère microaérophile : sachets spéciaux ou générateur d’H2 et de CO2 sans catalyseur (réaction plus lente, qui laisse de l’O2)

- Atmosphère à 10% de CO2 : à la bougie ou sachet générateur de CO2, ou étuves à CO2…

2.1. Anaérobiose


2.2.1. Etat Frais : 3 méthodes - Effilure de la pipette Pasteur (bouchée à la paraffine) - État-Frais luté - État-Frais classique effectué rapide

2.2. Examen microscopique


2.2.2. Coloration de Gram et Moeller :

Orientation de l’identification : - Clostridium : grands bacilles rectangulaires sporulés - Flore de Veillon : si autre morphologie

2.2. Examen microscopique


2.3.1. L’isolement : 2 procédés

- Isolement en profondeur (séries de 6 VF pour une souche pure / 12 pour un mélange)… Ancienne technique / utilisée pour conserver les souches

- Isolement en surface : sur GS frais ou GS + PV, ou mieux sur Schaedler au sang (incubé en anaérobiose)

2.3. Milieux de culture


2.3.2. Les milieux de culture :

Milieux riches + Facteurs de croissance : (hémine, vitamine K1, vitamine K… ) Ils contiennent souvent du sang (apporte la catalase)…

En anaérobiose : régénération des milieux, apport de substances réductrices, atmosphère anaérobie.

Milieux liquides ou solides





Bouillon ou glose VF ou VL (Viande-Levure) : pour ANS peu exigent, Clostridium

Bouillon ou gélose TGY (Trypticase Glucose, Yeast) : un peu plus riche - peptones et extrait de levure - glucose - thioglycolate de sodium (réducteur) (- Agar)




Milieu de Rosenow : milieu très riche mais cher - peptones + extraits de viande - chlorure de sodium : isotonie, échanges ioniques

- glucose : énergie et pouvoir réducteur

- chlorhydrate de cystéine (réducteur pour le maintient de l’anaérobiose)

- indicateur d'Andrade (fuchsine acide : rouge si acide, vert si basique)

- tampon : marbre blanc (carbonate de calcium neutralisant les ions acide :

CaCO3 à CO32- + 2 H+ à H2O + CO2)

- morceau de cervelle (riche en cystéine, les bactéries cultivent à côté du morceau de cervelle)

La lecture de ce milieu est très empirique : gaz visible par décollement du bouchon de paraffine, fermentation du glucose (virage au rouge), réduction du milieu (virage au vert et à l'incolore).




Bouillon ou gélose de Schaedler : le plus employé - peptones + extraits de viande - minéraux - glucose : énergie et pouvoir réducteur

- chlorhydrate de cystéine (réducteur pour le maintient de l’anaérobiose)

- tampon : TRIS (neutralise les H+)7 - Hémine - vitamine K3 (- Agar)

(Bouillon ou gélose Wikins Chalgren : enrichie en ménadione, hémine et levure)




Milieux sélectifs :

GS + Kanamycine + Vancomycine (Bacteroïdes et autres Gram –)

GS + ANC : bG+ non sporulés et CG+

Gélose TSC (Tryptone Sulfite Cyclosérine) : ClostridiumTryptones, Citrate de fer, disulfite, cyclosérine (ATB), agar, eau

Gélose de Willis : Clostridium (visualisation de la lécithinase)Columbia, lactose, rouge neutre, jaune d’œuf…

On peut aussi sélectionner les spores par chauffage à 80°C, 10 minutes.


2.4.1. Milieux classiques pour l’identification :

2.4. Techniques d’identification

Type respiratoire : VF (ou 2 Schaedler différemment incubées)Bouillon nitrateMillieu au sulfiteIndole (en bouillon VL)

Type respiratoire

Culture en aérobiose

Culture en anaérobiose

AS + -AAF + +AnS - +


2.4.2. Microgalerie :


API 20 ATrès proche de la galerie API 20 E(inoculation avec un bouillon Schaedler)

Glucides, Uréase, Indole, esculinase, gélatinase…


2.4.2. Microgalerie : Rapid ID 32A



2.4.2. Microgalerie :


API 32 AEnsemencement très riche4h d’incubationRecherche uniquement enzymatique(uréase, ADH, arylamidases…)


2.4.3. Chromatographie phase gazeuse :


Identification et dosage des produits de fermentationIdentification et dosage des produits volatils (AG)Obtention de profils (chromatogrammes)


Ex : CPG sur Clostridium difficile



2.4.4. Antibiotype :


L’antibiotypie est l’étude de la résistance aux inhibiteurs (antibiotiques).Cette méthode consiste à étudier la culture des anaérobies en présence de disques d’inhibiteurs : - antibiotiques (Kanamycine, Penicilline, Colimycine, Erythromycine, Rifampicine, Vancomycine) - Autres molécules (biles, vert brillant)

(Anaérodiscs bioMérieux)


2.4.4. Toxinotypie :


Utilisée pour C. botulinum.Caractérisation de la toxine sécrété et identification de la souche sécrétrice.

3. Les différentes bactéries anaérobies strictes


IntroductionLa taxonomie des anaérobies strictes n'est pas aussi évidente qu'il n'y paraît.

En effet, une bactérie cultivant habituellement en aérobiose peut devenir anaérobie stricte par perte de gènes essentiels à la vie aérobie. Il n'est donc pas surprenant de trouver des Streptococcus ou des Lactobacillus anaérobies strictes !

L'habitude est de distinguer les sporulés sous la dénomination de "flore tellurique" des autres anaérobies strictes. On verra que le qualificatif de tellurique est très certainement faux.


3.1. Les bacilles G+ AnS : Clostridium de la flore ‘‘tellurique’’

Clostridium : bacilles, G+, AnS, sporulables.

On parle de flore tellurique c'est à dire du sol.

Ce ne sont pas des hôtes normaux du sol... En effet les Clostridium sont des hôtes des matières fécales et les retrouver dans le sol peut être dû à la contamination fécale bien plus qu'au saprophytisme !

Clostridium tetani


3.1.1. Clostridium botulinum et le Botulisme :

a) La bactérie : très répandu dans les intestins des animaux (porc, homme) et retrouvé dans le sol où il survit longtemps sous forme de spore. (contamination possible des fruits et légumes)



a) La bactérie : très répandu dans les intestins des animaux (porc, homme) et retrouvé dans le sol où il survit longtemps sous forme de spore. (contamination possible des fruits et légumes)

b) La maladie : le botulisme BPS - Intoxination alimentaire (ingestion d'une toxine dans les aliments) - Redoutable car mortelle : la toxine bloque la transmission des PA du neurone au muscle (nv : AcétylCholine) déclenchant une paralysie flasque. → trouble de l'accomodation et muscles intrinsèques de l'oeil : mydriase → atteinte des muscles bucco-pharyngés (dysphagie) avec paralysie de la déglutition, difficultés d'élocution



b) La maladie : le botulisme

- La toxine est thermolabile - Il existe 6 à 7 types immunologiquement différents de toxines.

Conditions de la production de toxine : anaérobiose, concurrence limitée par d'autres bactéries, absence de nitrites, pH neutre à alcalin. 2 produits sont concernés : les conserves mal stérilisées et les jambons crus


3.1.1. Clostridium botulinum et le Botulisme :Paralysie flasque



c) Méthode d’étude : A partir de l'aliment ou à partir d'un prélèvement du malade ou du cadavre.On peut rechercher la bactérie, mais on recherche plutôt la toxine par toxinotypieLa toxinotypie est l'identification d'une toxine par des techniques immunologiques.

Le principe de base est de tester une dilution du produit sur un animal en ajoutant des solutions d'Ac neutralisatrices de types différents de toxine (A à F)



c) Méthode d’étude : toxinotypie

1) Broyat de l’aliment (toxine ?)

2) Répartition en tubes :Filtrat (toxine ?) + anti A à anti F

3) Incubation 30 min, 37°C



c) Méthode d’étude : toxinotypie

1) Broyat de l’aliment (toxine ?)

2) Répartition en tubes :Filtrat (toxine ?) + anti A à anti F

3) Incubation 30 min, 37°C

4) Injections à des lots d’Ax

5) Bilan des survivants



Ex de résultats :1) - Témoin mort / Témoin chauffé vivant - produit + anti-toxine A,C,D,E,F : morts - produit + anti-toxine A : vivant

→ Conclusion : toxine botulinique de type B



Ex de résultats :2) Témoin mort Témoin chauffé mortproduit + anti-toxine A,B,C,D,E,F : morts

3) Témoin mort Témoin chauffé vivantproduit + anti-toxine A,B,C,D,E,F : morts

Conclusion : - toxine ou toxique thermolabile différent de la toxine botulinique OU - toxine trop concentrée (diluer le filtrat) - 2 toxines botuliniques ensemble.

Conclusion : toxine ou toxique thermorésistant différent de la toxine botulinique



d) Traitement :

e) Prophylaxie :

Sérothérapie : Injection d’anticorps antitoxine (polyvalent ou monovalent)Anatoxinothérapie : injection d’anatoxine (pour s’immuniser)

- Traitement des jambon au sel nitrité (+ saumurage), - Animaux à jeun à l’abattage - Stérilisation industrielles contrôlée des conserves - Consommation : élimination des conserves suspectes (bombées, odeur) + cuisson importante

+ Guerre bactériologique : Assassinat pendant la 2ème guerre mondiale…



Remarque :

Usages thérapeutiques de la toxine botulique :

La toxine botulinique (commercialisée notamment sous la marque Botox, contraction de l'anglais Botulin toxin désormais utilisée comme nom commun)

→ traitement des maladies neurologiques comportant une trop grande activité musculaire (contractions et mouvements anormaux, crampes, spasticité, dystonie).

→ Elle est aussi employée en cosmétique, par exemple pour réduire les

rides faciales ou la transpiration excessive.


3.1.2. Clostridium tetani et le Tetanos :

(Vient de ‘‘tétanisation’’)

a) Bactérie :Bacilles Gram +, sporulables



(Vient de ‘‘tétanisation’’) 100 cas, environ, en France, chaque année BPS

b) La maladie : Intoxination (succédant à une infection à C. tetani) - Infections localisées à la porte d’entrée (plaies, échardes, morsures… Contaminées par de la terre ou des excréments d’animaux) - Surinfections après des soins dentaires, des brulures, des opérations abdominales…

- Redoutable (mortelle) - Multiplication de la bactérie au point d’entrée, sécrétion de la toxine, toxine qui gagne le SNC et bloque la transmission des PA inhibiteurs : Donc, Paralysie rigide !


Le tétanos est classiquement décrit sous plusieurs formes.

Exemples : "Rictus sardonicus" avec paralysie faciale (à gauche). Paralysies généralisées (à droite haut), déjà peinte au 15ème siècle. Paralysie néonatale à droite bas)

Exemples de DML (souris IV)

en pg (10-12 g)

botulinique ou tétanique

50 pg

diphtérique 70 000 pg

streptolysine O 200 000 pg

LPS (la souris est peu sensible)

20 000 000 pg

venin de vipère 25 000 000 pg

curare 25 000 000 pg

entérotoxine de C. perfringens

3 000 000 pg

cyanure de sodium 200 000 000 pg

http://www.gefor.4t.com/arte/fotos/tetanos.jpg



Il existe un seul type immunologique de la toxine.

c) Méthode d’étude :

La recherche de la bactérie est rarement pratiquée car les signes sont clairs (connus depuis Hippocrate : contractures musculaires…)

d) Traitement :sérothérapie soins intensifs (des plaies / attention aux surinfections)

e) Prophylaxie :vaccination par anatoxine (obligatoire en France)


3.1.3. Clostridium perfringens :

a) Bactérie immobile et capsulée

BPOb) La maladie : infections sous-cutanées possibles, Mais aussi la myonécrose. Le caractère très gazogène de cette bactérie et l'altération profonde des tissus provoquée ont nommé cette affection gangrène gazeuse.

Un traumatisme est nécessaire : fractures, chirurgies orthopédiques ou abdominales, injections médicamenteuses (toxicomanes), maneuvres abortives.

L'action de la bactérie est si puissante (enzymes, toxines...) qu'il est parfois impossible de faire quoi que ce soit... La mort survient alors en moins de 24 heures


3.1.3. Clostridium perfringens :b) La maladie : la myonécrose = gangrène gazeuse.



b) La maladie : Intoxication alimentairesAbsorption d’un aliment fortement contaminé par des sporesC. Perfringens A : producteur d’une enterotoxineLes spores germent et resporulent : Toxine produite pendant la sporulation, dans l’intestin



c) Méthode d’étude :

Clostridium perfringens produit de l'hydrogène sulfuré d'odeur caractéristique à partir des acides aminés soufrés ou à partir de substrats minéraux comme les sulfites.

Il fermente le lactose.


3.1.3. Clostridium perfringens :c) Méthode d’étude :

Tous les C. perfringens élaborent une toxine α qui est une phospholipase de type C : (lécithine → diglycéride + phosphoryl choline)

Le Clostridium perfringens de type A, principal agent pathogène chez l'homme, est le plus grand producteur.

Cette phospholipase provoque hémolyse et lécithinase l'hémolyse peut présenter 2 zones : 1 zone d'hémolyse nette étroite et 1 zone d'hémolyse floue importante autour de la précédente.


3.1.3. Clostridium perfringens :c) Méthode d’étude :

Culture sur :TSC : Tryptone, sulfite, cycloserine (+ Fer3)Willis : Jaune d’œuf + RN



d) Traitement : Sérothérapie : Mais la fixation rapide de la toxine dans les tissus le rend très discutable. Des Antibiotiques sont actifs sur Clostridium perfringens : béta-lactamines, métronidazole.

Remarque : d'autres Clostridium donnent des maladies très similaires sinon identiques. (C. septicum)


3.1.4. Clostridium difficile et Colites : BPO

Portage sain : dans les matières fécales (>70% des nouveaux nés, 3% chez l’adulte au niveau des intestins, colon et rectum...) + Chez Animaux ! - L'administration d'antibiotiques peut rompre l'équilibre de la flore intestinale et conduire au développement de Clostridium difficile.

- Inflammation du colon, diarrhée aqueuse et muqueuse très abondante pouvant être mortelle (20 % des diarrhées post-antibiothérapie). + éventuellement une colite pseudomembraneuse = fausses membranes (débris cellulaires et de fibrine)


3.1.4. Clostridium difficile et Colites :

colite pseudomembraneuse Des toxines sont en cause : - toxine A : entérotoxine : nécrose des cellules épithéliales de l'intestin et hémorragies intestinales (PM = 500 kg mol-1)

- toxine B : cytotoxine : effet cytotoxique : arrêt de multiplication cellulaire, arrondissement par destruction du réseau d'actine par l'intermédiaire de l'inactivation de la protéine rho, détachement du support. (PM = 250 kg mol-1)



Perturbation de la flore intestinale

(ex : antibiothérapie)

Colonisation par C. difficile(Origine endo ou exogène)

Production des toxines A + B

Colite Pseudo-MembraneuseDiarrhées

(agent disséminateur)

Portage sain(dissémination)

asymptomatique

+ recherche par techniques,

immunologiques…



Diagnostic :

Isolement possible mais délicat (bactérie commensale et fragile)On recherchera surtout les toxines : Test de cytotoxicité (technique de référence) : sur cellules en culture, recherche d’effet cytopathogène


3.2. La flore de Veillon (anaérobies strictes non sporulables)

Les bactéries :



3.2.1. Classification

Bacilles gram + non sporulés

bacilles réguliers ± allongés :

Eubacterium, Lactobacillus bacilles corynémorphes :

Bifidobacterium, Propionobacterium,

Actinomyces

Coques gram + Peptostreptococcus bactéries le plus souvent très proches de Streptococcus

Bacilles gram négatif Bacteroidaceae : Bacteroides, Fusobacterium etc

Coques gram négatifs Veillonaceae

Spirochètes Treponema anaérobies strictes comme T. vincentii





bacilles réguliers ± allongés :Eubacterium, Lactobacillus

bacilles corynémorphes :Bifidobacterium, Propionobacterium, Actinomyces

Coques gram + Peptostreptococcus bactéries le plus souvent

très proches de Streptococcus













Spirochètes Treponema anaérobies strictes comme T.

vincentii



3.2.2. Habitat / pouvoir pathogène

Non retrouvées dans le milieu extérieur. Commensales des muqueuses des animaux et de l’homme (intestin, vagin, ORL…)BPO

Infections putrides polymicrobiennes (nécroses nauséabondes)Association : Ans + AS - Infections abdominales (appendicites, péritonites) : Bacteroides fragilis + Escherichia coli… - Angine de Vincent : Fusobacterium + Treponema vincentii(fuso-spirochetienne) - Infections génitales : Mobiluncus + Gardnerella… - Infections pulmonaires, buccales, septicémies…

Angine fuso-spirochétienne de Vincent ou Angine ulcéro-nécrotique accompagnée d'une fièvre élevée et d'une réaction ganglionnaire de voisinage. Le diagnostic est bactérioscopique avec la présence d'une bactérie de type Fusobacterium et d'une bactérie de type spirochète. Le traitement de cette angine est simple à base de pénicilline G.

Examen de gorge et examen direct après coloration de Gram (X 1000)



3.2.2. Habitat / pouvoir pathogèneBPOInfections putrides polymicrobiennes

Infections septicémiques monomicrobiennesFusobacterium (suite à une angine)Bacteroides (suite à une infection abdominale)Actinomyces (suite à une infection bucco-dentaire)Peptostreptococcus (suite à un avortement)

L’agent pathogène de la flore de Veillon est : Bacteroides fragilis



3.2.3. Diagnostic

Enrichissement : Bouillon de Schaedler

Isolement sur milieux riches : Schaedler au sang frais (non sélectif), pour le rendre sélectif, on ajoute : kanamycine, vancomycine, acide nalydixique et colimycine

Identification : - Type respiratoire, - API 20 A - étude de la sensibilité aux inhibiteurs (pour les Gram -)

groupe glucoseacide

butanoïque en CPG

culture en présence de bile (5 mg)

culture en présence de vert brillant (100 µg)

pigmentation

I Bacteroides du groupe fragilis

fermenté - + - -

II genre Prevotellafermenté - - - V

III genre Porphyromonas

non fermenté (-) - - +

IV Bacteroides autres que fragilis

non fermenté - V - -

V genre Fusobacterium

non fermenté + - + -

étude de la sensibilité aux inhibiteurs (pour les Gram -)

Annexe : les infections dues aux AnS

étude de la sensibilité aux inhibiteurs (pour les Gram -)

Exotoxines (Toxines Vraies) Endotoxines ou LPS

Organismes producteurs

Gram + et Gram - Gram -

BiochimiqueProtéines

(souvent en 2 sous-unités)

LPSglycophospholipide de la

membrane externe

FonctionnelleNeurotoxines, Toxines cytotoniques, Toxines cytotoxiques, Active sur le

métabolisme, Détruisant les membranes…Immunotoxines

Mode d’action cellulaire :

Activation de récepteurs. Action intracellulaire ou membranaire

Action plus générale. Moins spécifique.

Mécanisme actif ou passif

Excrétion par les bactériesLibération à la mort des bactéries (composant la membrane externe)

Toxicité Action à faible dose Action à dose plus forte

immunogénicité Souvent forte Assez faible

Transformation en anatoxines

possible impossible

Action de la températue

Thermolabile (sauf entérotoxines staphylocociques)

(thermostable)

Annexe : Les toxines (endo et exo)

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