Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble

ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES

EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES

ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES

EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du

Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble

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ExposéExposé

La cytogénétique et l’épigénétique des cancers

La méthylation des gènes suppresseurs de tumeur et les méthodes d’étude

Les épendymomes de l’enfant Les neuroblastomes de l’enfant Conclusions et Perspectives

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La génétique et les cancersLa génétique et les cancers

Le cancer est une maladie génétique acquise Altération au niveau de gènes suppresseurs de

tumeur (GSTs) et oncogènes Altérations inactivatrices

Délétion Mutation Translocation

Hypothèse de Knudson Sélection d’un clone plus robuste Avantage prolifératif

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L’épigénétiqueL’épigénétique

Altérations qui1. ne changent pas la séquence de l’ADN

2. sont transmises au cours des divisions cellulaires

3. sont potentiellement réversibles. Deux modifications principales:

1. Acétylation et méthylation des histones

2. Méthylation de l’ADN

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Définition: L’addition d’un groupement méthyl au niveau du

carbone 5 d’une cytosine dans un dinucléotide CpG

Les méthyltransférases (DNMT1, DNMT3a et DNMT3b)

La méthylation de l’ADNLa méthylation de l’ADN

N

NH2

O N

C

C

C

C

C

Cytosine

Démethylase

S-adenosylhomocysteine

ADN Méthyltrasferase

S-adenosylmethionine

N

NH2

O N

C

C

C

C

CH3

5-mC

5-méthylCytosine

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La méthylation de l’ADNLa méthylation de l’ADN

Les dinucléotides CpG sont peu fréquents dans l’ADN sauf dans les « îlots »CpGs

Plus grande part des « îlots » sont retrouvés dans la région promotrice des gènes

La méthylation pourrait entraîner la répression de la transcription de l’ADN

deux mécanismes possibles

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Mécanisme 1: la région promotriceMécanisme 1: la région promotrice

Cytosine non méthylée

Cytosine méthylée

Promoteur

Séquence codante

Facteurs de transcription

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Mécanisme 2: l’acétylation des histonesMécanisme 2: l’acétylation des histones

Histone déacétylée

Histone

Histone acétylée

CpG non méthylée

CpG méthylée

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Méthylation et les processus physiologiquesMéthylation et les processus physiologiques

Rôle important dans l’embryogenèse 4-6% de toutes les cytosines sont méthylées

chez l’adulte Fonction normale comme

Inactivation des rétrotransposons Inactivation du X Empreinte parentale

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Méthylation et carcinogenèseMéthylation et carcinogenèse

Hypométhylation globale Inactivation des gènes suppresseurs de

tumeur par hyperméthylation Nombreuses études dans les tumeurs de

l’adulte

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Intérêts de la méthylationIntérêts de la méthylation

Compréhension des mécanismes du développement tumoral

Cible thérapeutique Utilisation comme marqueur diagnostique et

pronostique (suivi clinique)

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Le profil de méthylationLe profil de méthylation

Le gène ne doit pas être méthylé dans le tissu normal

Un type histologique donné ne peut pas être caractérisé par la méthylation d’un seul gène

Établissement difficile d’un profil spécifique d’une tumeur

Cancers de l’enfant et épigénétique

Cancers de l’enfant et épigénétique

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Les cancers de l’enfantLes cancers de l’enfant

Rares Morbidité et mortalité élevées Caractéristiques particulières

Histologie différente Comportement souvent très agressif Souvent bonne réponse au traitement

Maladie du développement Altérations épigénétiques moins étudiées

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Epigénétique et tumeur solide de l’enfantEpigénétique et tumeur solide de l’enfant

P16MGMT

RARBDAPK

APCCASP8

RASSF1A

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

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Epigénétique et tumeurs solides de l’enfantEpigénétique et tumeurs solides de l’enfant

1. Rétinoblastome

Rb1: rétinoblastomes unilateraux et sporadiques

Zeschnigk et al., J Med Genet. 36:793-4, 1999.

2. Ostéosarcome RASSF1A, TIMP3, MGMT, DAPK, p16: 93%

Hou et al, Cancer 106 :1602-9, 2006.

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Méthode d’étude: les gènes étudiésMéthode d’étude: les gènes étudiés

19 gènes suppresseurs de tumeur : Gènes impliqués dans le cycle cellulaire (Rb1, p14 ARF,

p15INK4b, p16INK4a) Gènes impliqués dans l’apoptose (RASSF1A, DAPK,

CASP8, DRC1, DRC2, FLIP) Gènes de la réparation de l’ADN (MGMT) Gènes impliqués dans l’angiogenèse, adhésion cellulaire

et le remodelage tissulaire (APC, ECAD, TIMP3) Autres (RAR , FHIT, BLU, INI1, NF2)

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Méthode d’étude: les gènes étudiésMéthode d’étude: les gènes étudiés

DAPK MGMT

INI1NF2

EP300

APC

RB

BLU

FHIT

P16

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Méthode d’étudeMéthode d’étude

« Methylation specific PCR » (MSP) réalisée en deux étapes:

1. Traitement avec le bisulfite de sodium

2. PCR avec des amorces spécifiques

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Le traitement bisulfiteLe traitement bisulfite

Échantillon d’ADN: 5’-CATGCGGTCGACGT-3’

ADN modifié:

Echantillon non méthylé: 5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’

Echantillon méthylé: 5’-UATGCGGTCGACGT- 3’

M MM

Traitement Bisulfite:

Toutes les cytosines non méthylées sont transformées en uraciles.

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Methylation-specific PCRMethylation-specific PCR

Echantillon non méthylé:

5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’

MSP avec les amorces Non methylé (U) et methylé (M)

Amorce U: 3’- ATACACCAACTACA-5’

Echantillon méthylé:

5’-UATGCGGTCGACGT- 3’

U

Amplification

ADN traité

M

Pas d’amplification

Echantillon non méthylé

Amorce M: 3’-ATACGCCAGCTGCA-5’

U

Pas d’amplification

ADN traité

M

Amplification

Echantillon méthylé

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Methylation-Specific PCRMethylation-Specific PCR

Avantages: Sensible Facile

Inconvénient: Non quantitative

Méthylation et épendymomesMéthylation et épendymomes

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Les épendymomes Les épendymomes

Troisième tumeur du SNC chez les enfants Pas de marqueur biologique connu Facteurs pronostiques: âge et résection

chirurgicale Pas de réponse à la radiothérapie et à la

chimiothérapie

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Ependymomes et cytogénétiqueEpendymomes et cytogénétique

Perte du chromosome 22q dans 23% des cas

Perte du chromosome 6q dans 15% des cas Gain du 1q (20%) et altération du 17p (rare) Mais 40% des ependymomes n’ont pas

d’anomalie chromosomique Pas d’association avec survie ou réponse au

traitement

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Nos hypothèsesNos hypothèses

Méthylation comme mécanisme d’inactivation des gènes localisés dans le bras long du chromosome 22 (INI1, NF2, TIMP3, EP300)

Profil épigénétique particulier Relation entre la méthylation et la survie

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Matériel Matériel

27 épendymomes intracrâniens

7 papillomes du plexus choroïde

3 cortex adultes

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RésultatsRésultats

0

10

20

30

40

50

60

70

80

%

EPENDYMOME

PAPILLOME DU PLEXUS CHOROIDE

29/49


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Months

Sur

viva

l Pro

babi

lity Casp8 Méthylé

Casp8 Non Méthylé

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Months

RASSF1A Méthylé

RASSF1A non méthylé

30/49


31/49

DiscussionDiscussion

Peu d’études réalisées Différents gènes étudiés Possibilité d’une relation avec l’âge du

patient et la localisation tumorale Enfant ≠ adultes Intra-crâniennes ≠ rachidiennes

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Les voies de l’apoptose Utilisation possible:

le diagnostic différentiel la détection précoce d’une rechute

Autres gènes à étudier

Méthylation et neuroblastomeMéthylation et neuroblastome

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Les neuroblastomesLes neuroblastomes

Le neuroblastome est la tumeur extra crânienne solide la plus fréquente chez les enfants de moins de 5 ans

La présentation clinique est très variable: de la régression spontanée à l’évolution métastatique rapide

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CytogénétiqueCytogénétique

La ploïdie L’amplification de NMYC La délétion du chromosome 1p et du 11q La trisomie du chromosome 17q

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Classification des neuroblastomes Classification des neuroblastomes

Tableau 1. Groupes de risque de neuroblastomes selon les facteurs biologiques

Caractéristique Type 1 Type 2 Type 3

Ploïdie Triploïde Diploïde Diploïde

NMYC Non amplifié Non amplifié Amplifié

Délétion 1p Non Incertain Oui

Stades Majoritaires 1, 2 ou 4S 3 ou 4 4

Survie >90% 25-50% 5%

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Nos hypothèsesNos hypothèses

Méthylation : mécanisme d’oncogenèse dans les neuroblastomes

Profil de méthylation caractéristique des neuroblastomes

Profil particulier en fonction des différents stades cliniques

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MatérielMatériel

45 tumeurs primitives

17 rechutes

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0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

RASSF1A TIMP3 CASP8 DcR1 DcR2 BLU

Tumeur PrimitifRechute

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StadeNombre de patients (%)

Ampl NMYC

Nombre moyen de gènes méthylés

CASP8 BLU

124s

7 (15)12 (27.5)3 (7.5)

1/22 1.95 2/22 3/22

34

6 (12.5)17 (37.5)

10/23 3.3 14/23 11/23

41/49


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Time (months)

Su

rviv

al

pro

ba

bil

ity

CASP8 methylated

CASP8 Non methylated

p = 0,0648

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Time (months)

Su

rviv

al

pro

ba

bil

ity

NMYC Amplified

NMYC Non Amplified

p-value 0,0001

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METHYLATION OF TUMOR SUPPRESSOR GENES IN NEUROBLASTOMA: THE RASSF1A GENE IS ALMOST ALWAYS METHYLATED IN PRIMARY TUMORS.

Pediatric Blood and Cancer

En cours de soumission après revision du manuscrite.

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CASP8 La méthylation inhibe l’expression du gène dans des lignées

cellulairesTeitz et al., Nat Med 6:529–35, 2000.

La voie TRAIL Différence de profil de méthylation entre les ganglioneuromes et les

neuroblastomes Rétablissement de ces gènes après traitement avec des agents

déméthylantsBanelli et al., Cancer Lett 228:37-41, 2005.

RASSF1 Méthylé dans 100% des lignées cellulaires Corrélation avec la méthylation de CASP8 Possibilité d’un sous-type de neuroblastomeYang et al., Clin Cancer Res 10:8493-500, 2004.

Conclusions et PerspectivesConclusions et Perspectives

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ConclusionsConclusions

Étude de la méthylation de l’ADN dans les épendymomes et les neuroblastomes

Suggestion d’un profil spécifique Dans le cas des épendymomes:

Altération épigénétique dans les voies d’apoptose présente dans les tumeurs bénignes (papillome du plexus choroïde)

Dans le cas des neuroblastomes: Altérations liées au stade clinique dans les

neuroblastomes Possibilité d’une relation avec l’évolution tumorale

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PerspectivesPerspectives

Plus grand nombre de tumeurs Autres tumeurs Application de méthodes quantitatives ADN dans le sang et le liquide

céphalorachidien Collaboration avec d’autres centres et

comparaison avec les données cliniques et génétiques

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PerspectivesPerspectives

Méthylation comme marqueur diagnostique et/ou pronostique

Utilisation thérapeutique agents déméthylants association de la méthylation et la résistance au

traitement

RemerciementsRemerciements

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RemerciementsRemerciements

Les directeurs de thèse: Mr Plantaz et Mme Favrot

Les rapporteurs: Mr Chastagner et Mr Dellatre

Mlle Florence de Fraipont Le gouvernement du Brésil (CNPq) “Ministère de la

Science” Les techniciennes du laboratoire et l’UF

Cancérologie et Biothérapie Le Service de Pédiatrie du CHU de Grenoble

LES QUESTIONSLES QUESTIONS

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TUMEUR CEREBRALESTUMEUR CEREBRALES

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LEUCEMIESLEUCEMIES

Chez les adultes les méthylations plus fréquentes : p15INK4B et p16INK4A dans les LAL et LAM.

Chez l’enfant: Beaucoup moins d’études Méthylation de p15 dans moins de 50% des LAL Méthylation de p16 m’est pas très important

Réarrangement MLL lié aux LALs du jeune enfant et caractérisé par l’hyperméthylation et non trascription de FHIT

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MÉTHODES QUANTITATIVESMÉTHODES QUANTITATIVES

Figure 1. Un exemple de pyroséquençage.

Les cytosines non méthylées (C) sont mesurées par le pyroséquençage comme la quantité relative de T dans un site CpG, et les cytosines méthylées (mC) sont mesurées comme la quantité relative de C dans un site CpG.

D’après: http://www. Biotagebio.com Pyrosequencing TM

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PUCES À ADNPUCES À ADNFigure 1. Vue schématique de l’analyse de la méthylation par MSO.

L’ADN génomique est traité avec le bisulfite et amplifié par PCR pour une région CpG d’intérêt. Le produit amplifié est étiqueté avec un colorant fluorescent Cy5 et hybridé à une sonde oligonucléotide liée à la surface d’une vitre. À gauche, une sonde oligonucléotide est désignée pour former une liaison parfaite avec une cible d’ADN portant un allèle non méthylé. À droite, la sonde est désignée pour se lier parfaitement avec une cible d’ADN méthylé.

CG

GC

TG

AC

GC

TG

AC

Cy5

5’

GC

AC

GC

AC

Cy5

5’

CG

CG mCG

UG mCG

TG CG

CG

UG

TG

mCG

mCG

CG

Allèle non méthylé Allèle méthylé

5’ 5’

Traitement de Bisulfite

PCR

Etiquetage fluorescent ethybridation des oligonucl’eotide

C6 Amino-linker

probe

CG

GC

TG

AC

GC

TG

AC

Cy5

5’

GC

AC

GC

AC

Cy5

5’

CG

CG mCG

UG mCG

TG CG

CG

UG

TG

mCG

mCG

CG

Allèle non méthylé Allèle méthylé

5’ 5’

Traitement de Bisulfite

PCR

Etiquetage fluorescent ethybridation des oligonucl’eotide

C6 Amino-linker

probe

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Rousseau et al.(2003) Neuropathology and Applied Neurobiology 29: 574–583

p16

p15

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CpGs methyléesMethyl binding proteins

Groupe AcétylHMT Groupe Methyl

La méthylation et la chromatineLa méthylation et la chromatine

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Agents déméthylantsAgents déméthylants

58/49

Agents déméthylantsAgents déméthylants

Réactivation des gènes hyperméthylés par ces composants in vitro

Résultats cliniquement significatifs dans les myélodysplasies, leucémies aigues myéloïdes (LAM) et leucémies myéloïdes chroniques (LMC)

Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble

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