THESE BOUHAOUS Latifa - univ-oran1.dz · 2015. 5. 5. · Remerciements Cette thèse est...

Université d’Oran

Faculté des Sciences – Département de Biologie Laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique

MEMOIRE

En vue de l’obtention du diplôme de

MAGISTER

En Nutrition Clinique et Métabolique

Présenté par

Latifa BOUHAOUS

Thème

Soutenu en 2011 devant le jury

Président

BOUCHENAK M. Professeur, Université d’Oran

Examinateurs

KHEROUA.O. Professeur, Université d’Oran SENHADJI-LAMRI M.Y. Professeur, Université d’Oran

Directeur

KROUF D. Professeur, Université d’Oran

Année Universitaire

2011-2012

Effet d’un extrait aqueux lyophilisé de Globularia alypum sur les teneurs en lipides plasmatiques et hépatiques et le statut

redox, chez des rats rendus hypercholestérolémique

RReemmeerrcciieemmeennttss

Cette thèse est l’aboutissement d’un travail réalisé au Laboratoire de Nutrition

Clinique et Métabolique, à la Faculté des Sciences de l’Université d’Oran.

Je remercie Mme le Professeur BOUCHENAK M, de m’avoir accueillie au sein du

Laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique et pour m’avoir fait l’honneur d’accepter la

présidence du jury. Qu’elle trouve aussi l’expression de mes remerciements pour son

enseignement et aussi l’expression de mon profond respect pour m’avoir fait l’honneur de

présider ce jury.

Que Mr le Professeur KHEROUA O & Mme le Professeur SENHADJI-LAMRI MY

Reçoivent mes sincères remerciements de m'avoir fait l'honneur d'accepter d'être examinateurs

de ce mémoire. Je vous transmets ma profonde gratitude pour le temps que vous avez consacré

à la lecture de ce document ainsi que pour vos remarques.

Je tiens à remercier vivement mon encadreur Mr le Professeur KROUF D, d'avoir

assuré mon encadrement, de son dynamisme, sa disponibilité, son aide, ses précieux conseils et

ses connaissances scientifiques qui m’ont permis d’avancer dans ma recherche scientifique.

Merci tout particulièrement pour ton soutien scientifique mais aussi humain, ta gentillesse et ta

disponibilité.

Je remercie également l'ensemble des membres des équipes du Laboratoire de

Nutrition Clinique et Métabolique de l’université d’Oran pour l'aide qu'ils m'ont apportée et

la sympathie qu'ils m'ont témoignée

A tous mes camarades des promotions 2005, 2006 et 2007.

Abréviations

AGPI : Acides gras polyinsaturé

Apo : Apolipoprotéines

CAT : Catalase

CAS : Caséine

CE : Cholestérol estérifié

CT : Cholestérol total

DHAP : Dihydroxyacétone phosphate

EDTA : Ethylène diamine tétraacétique

ERO : Espèces réactives de l'oxygène

Ga : Globularia alypum

GSH : Glutathion réduit

GSSG : Glutathion oxydé

GSSG-Red : Glutathion réductase

GSH-Px : Glutathion peroxydase

Hb : Hémoglobine

HDL : Lipoprotéine de haute densité

LDL : Lipoprotéine de faible densité

LOX : Lipoxygénases

VLDL : Lipoprotéine de très faible densité

LPL : Lipoprotéine lipase

MDA : Malondialdéhyde

MCV : Maladies cardiovasculaires

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

PL : Phospholipides

SDS : Sodium dodécyl sulfate

SOD : Superoxyde dismutase

TBARS : Substances réactives à l’acide thiobarbiturique

TG : Triglycérides

Communications

Globularia alypum L. lyophilised aqueous extract decreases plasma lipids and enhances liver redox status in rats fed a high cholesterol diet. 10-11 Décembre 2009. BOUHAOUS L., KROUF D., MAZARI N., DIDA N., BOUCHENAK M. 4ème Congrès de la Société Française de Nutrition. Web: www.sf-nutrition.org 10 ET VENDREDI Antioxidant effects of Globularia alypum L. aqueous extract in rats fed a high cholesterol diet. 10-11 Décembre 2009. KROUF D., BOUHAOUS L., MAZARI N., DIDA N., BOUCHENAK M. 4ème Congrès de la Société Française de Nutrition. Web: www.sf-nutrition.org

Liste des tableaux

Tableau 1. Les enzymes antioxydantes ……………………………………………… 12

Tableau 2. Composition des régimes…………………………………………………. 20

Tableau 3. Teneurs des lipides hépatiques ………………………………………….. 29

Tableau 4. Concentrations de certains marqueurs du stress oxydant au niveau

sanguin…………………………………………………………………………

31

Tableau 5. Concentrations des TBARS au niveau plasmatique, lipoprotéique et

urinaire …………………………………………………………………....

31

Tableau 6. Teneurs des TBARS tissulaires ………………………………………….. 33

Tableau 7. Concentrations du GSH au niveau des différents tissus………………….. 33

Tableau 8. Activité tissulaire des enzymes antioxydantes ........................................... 73

Tableau 9. Concentrations en TBARS, GSH et activité des enzymes antioxydantes

au niveau des érythrocytes ……………………………………….............

74

Tableau 10. Evolution du poids corporel ………………………………………............ 72

Tableau 11. Nourriture ingérée ………………….………………………………………

72

Liste des figures

Figure 1. Formation des radicaux libres et leurs conséquences……………………… 7

Figure 2. Mécanisme enzymatique ou non enzymatique à la suite de la peroxydation

lipidique…………………………………………………………………..

8

Figure 3. Rôle du GSH dans l'oxydation des groupements thiols des protéines…….. 13

Figure 4. Préparation de l’extrait aqueux lyophilisé Ga……………………………... 18

Figure 5. Croissance pondérale et nourriture ingérée ……………………………….. 28

Figure 6. Activité de la SOD tissulaire…………………………................................. 35

Figure 7. Activité de la glutathion peroxydase tissulaire……………………………. 36

Figure 8. Activité de la catalase tissulaire………………………………………….... 38

Figure 9. Peroxydation lipidique et défense antioxydante enzymatique (SOD, GPx

et CAT) et non enzymatique (GSH) au niveau des érythrocytes…………

40

Sommaire

1 Introduction …………………………………………………………………...........................

4 Revue bibliographique……………………………………………………………………….

4 I. Hypercholestérolémie et athérosclérose…………………………………………………..

5 I.1. Définition de l’hypercholestérolémie……………………………………………………...

6 I.2 L’athéroscléros…………………………………………………………………………….

6 II. STRESS OXYDATIF-RADICAUX LIBRES……………………………………………

8 II.1. Potentiel redox intracellulaire…………………………………………………………….

9 II.2. Les mécanismes antioxydants…………………………………………………………….

10 II.2.1. Les enzymes antioxydants……………………………………………………………....

10 II.2.1.1. Superoxydes dismutase (SOD)……………………………………………………….

10 II.2.1.2. Glutathion peroxydase (GSH-Px)…………………………………………………….

11 II.2.1.3. Catalase (CAT)………………………………………………………………………..

12 II.2.2 Principaux antioxydants endogènes non enzymatique………………………….............

12 II.2.2.1 Glutathion réduit (GSH)……………………………………………………………….

13 II.2.2.2. L’acide urique………………………………………………………………………...

14 III. Effet des plantes médicinales sur le métabolisme des lipides et le statut antioxydant…….

16 Matériels et Méthodes………………………………………………………………………...

16 Matériels et Méthodes………………………………………………………………………...1

16 1.1. Présentation de la plante Globularia alypum…………………………………………….

16 1.2. Description Botanique ……………………………………………………………………

16 1.2.1 Taxonomi…………………………………………………………………………………

17 1.2.2. Aspect botanique et répartition géographique…………………………………..............

17 1.3. Préparation de l’extrait aqueux de Globularia alypum ………………………………….

18 2 .Animaux et régimes…………………………………………………………………............

19 Prélèvement des échantillons sanguins et des organes……………………………………….3

20 .4 Analyses biochimiques………………………………………………………………………

20 4.1. Détermination des teneurs en hémoglobine (Hb)…………………………………………

21 4.2. Détermination des teneurs plasmatiques en albumine, acide urique et transaminases…..

21 4.2.1. Dosage de l’albumine……………………………………………………………………

21 4.2.2. Dosage de l’acide urique………………………………………………………………..

21 4.2.3. Détermination de l’activité des transaminases plasmatiques…………………………..

22 4.3. Détermination des teneurs en lipides du foie et du plasma………………………………

22 4.3.1. Extraction des lipides totaux hépatiques………………………………………………..

22 4.3.2. Dosage du cholestérol total……………………………………………………………..

22 4.3.3. Dosage des triglycérides ………………………………………………………………..

23 5. Evaluation de certains paramètres du statut redox………………………………………….

23

5.1. Détermination de la peroxydation lipidique par le dosage des substances réactives à

l’acide thiobarbiturique (TBARS)………………………………………………………...

23 5.1.1. Au niveau plasmatique et urinaire………………………………………………………

23 5.1.2. Au niveau des érythrocytes …………………………………………………………….

23 5.1.3 .Au niveau des érythrocytes et des différents tissus……………………………………...

24 5.1.4. Au niveau des lipoprotéines plasmatiques (VLDL-LDL etHDL)……………………….

24 5.2. Détermination défenses antioxydantes…………. ……………………………………….

24

5.2.1. Estimation de l’activité des enzymes antioxydantes au niveau des différents tissus

et des érythrocytes ………………………………………………………………………

24 5.2.1.1. Superoxyde dismutase (SOD)............................... ……………………………...........

24 5.2.1.2. Glutathion peroxydase (GSH-Px)………………………………………………. …..

24 5.2.1.3. Catalase (CAT)………………………………………………………………………

25 5.2.2. Dosage du glutathion réduit (GSH) au niveau des différents tissus et des érythrocytes

25 . Analyse statistique………………………………………………………………………… 6

27 Résultats………………………………………………………………………………………

27 1. Evolution du poids corporel et de la nourriture ingérée…………………………………….

27 2. Teneurs des lipides hépatiques et plasmatiques…………………………………………….

30 3. Teneurs de certains marqueurs du stress oxydant au niveau sanguin………………………

30 4. Déamination de la peroxydation lipidique…………………………………………. ……....

30 4.1. Au niveau plasmatique …………………………………………………………………...

30 4.2. Au niveau des VLDL-LDL et HDL………………………………………………………

32 4.3. Au niveau des urines………………………………………………………………………

32 5. Concentrations des TBARS et du GSH tissulaires………………………………………….

32 5.1. TBARS tissulaires…………………………………………………………………………

32 5.2. GSH tissulaire……………………………………………………………………………..

34 6. Activité des enzymes antioxydantes tissulaires……………………………………………..

34 6.1. Activité de la superoxyde dismutase (SOD) tissulaire……………………………………

34 6.2. Activité de la glutathion peroxydase (GPx) tissulaire……………………………………..

37 6.3. Peroxydation lipidique et teneurs du glutathion réduit (GSH) érythrocytaire……………

39 7. Peroxydation lipidique et teneurs du glutathion réduit GSH érythrocytaire……………….

39 8. Activités des enzymes antioxydantes au niveau des érythrocytes ………………………….

41 Discussion……………………………………………………………………………………...

50 Conclusion……………………………………………………………………………………..

52 Références bibliographique………………………………………………………………….

68 Annexes………………………………………………………………………………………..

INTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTION

Introduction

1

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la première cause de mortalité dans

le monde. De plus, de nombreuses études épidémiologiques menée ces dernières années

ont révélé qu’il existe de multiple facteur de risque de MCV qui agissent le plus souvent

en synergie et sont responsable de l’athérosclérose (Yamamoto et al., 2011). La

prévention et le traitement des MCV ont généré un grand nombreux travaux visant à

modifier les facteurs de risques associés (OMS, 2009). En Algérie, les complications

cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité (TAHINA, 2008).

Une consommation excessive de lipides alimentaire, l’hypercholestérolémie et le

stress augmentent les teneurs sériques en cholestérol total (CT), et surtout en cholestérol-

LDL (C-LDL) (Hakimoglu et al., 2007 ; Wang et al., 2010). Chez l’homme,

l’hypercholestérolémie est caractérisée par un CT>5,17 mmol.L-1, des teneurs en

C-LDL>4,17 mmol.L-1, en C-HDL<0,9 mmol.L-1 et un rapport C-LDL/C-HDL>3,5. Le

rapport C-LDL/C-HDL ou CT/HDL, constitue le meilleur prédicteur d’événements

coronariens (Amarenco & Steg, 2007 ; Ingelsson et al., 2007).

Plus la cholestérolémie est élevée plus les risques de complications

cardiovasculaires augmentent. De plus, l’élévation des teneurs sériques en C-LDL

constitue un facteur de risque majeur de mortalité cardiovasculaires (Li et al., 2007 ;

Hubáček et al., 2008). Les LDL s’accumulent dans le sang et dans la paroi des artères,

favorisant le développement de lésions d’athérosclérose qui seront les causes d’accidents

cardiovasculaires (Jelassi et al., 2008).

L’athérosclérose est accompagnée d'un état inflammatoire artériel chronique et

d'un stress oxydant responsable d'un dysfonctionnement de l'endothélium vasculaire. Ce

stress est soit à l’origine de plusieurs pathologies ou encore un facteur aggravant. Son

implication dans l’hypertension artérielle, l’athérosclérose, le diabète, l’hyperlipidémie,

l’hyperhomocyctéinémie et le dysfonctionnement endothéliale a été démontrée par

plusieurs études effectuées chez l’homme et l’animal (Guzik et al., 2002 ; Loscalzo,

2003 ; Parthasarathy et al., 2008).

Introduction

2

Les LDL contiennent du cholestérol et des phopholipides (PL), ce qui les rend des

cibles privilégiées de la peroxydation lipidique (Koechlin-Ramonatxo, 2006).

L’oxydation de ces lipoprotéines représente un élément important dans la

physiopathologie de l’athérosclérose et augmente le risque de MCV par l’intermédiaire

d’une cascade de réactions biochimiques dont la plupart se situe au niveau de la paroi

artérielle (Lapointe et al., 2006 ; Berrougui et al., 2006 ; Parthasarathy et al., 2008).

Selon l'Organisation mondiale de la Santé (OMS), environ 65-80% de la

population mondiale dans les pays en développement, en raison de la pauvreté et du

manque d'accès à la médecine moderne, dépendent essentiellement des plantes

médicinales traditionnelles. Une attention urgente doit être portée au plus grand nombre

possible des espèces (environ 350 000 plantes sur terre), qui n'ont pas encore été étudiées

pour déterminer scientifiquement leurs propriétés phytochimiques et pharmacologiques

potentielles mais aussi leurs qualités, leurs innocuités et leurs efficacités. Par ailleurs, les

études ethnopharmacologiques indiquent que plus de 1200 plantes sont utilisées à travers

le monde pour leurs activités biologiques et diverses études s'intéressent à leurs effets sur

la prévention/traitement de certaines maladies (Bisht et al., 2009). De plus, les molécules

bioactives contenues dans ces plantes (polyphénols et flavonoïdes) présentent

d’importantes propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires (Aggarwal & Sung, 2009

; Shakibaei et al., 2009).

Nos précédents travaux indiquent que chez le rat hypercholestérolémique l'extrait

aqueux d’Ajuga iva de la région de Béchar semble jouer un rôle important dans la

défense antioxydante en augmentant l'activité des enzymes antioxydantes (superoxyde

dismutase, glutathion peroxydase, glutathion reductase et catalase) et en diminuant les

substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) (Bouderbala et al., 2008). Par

ailleurs, chez le rat diabétique, l’extrait méthanolique des feuilles de Globularia alypum

(Ga) induit un effet bénéfique sur le statut redox en réduisant la peroxydation lipidique et

en stimulation les systèmes de défense antioxydante enzymatique et non enzymatique et

(Zennaki et al., 2009).

Introduction

3

A notre connaissance, il n’existe pas d’études sur l’effet de l’extrait aqueux

lyophilisé de Ga et/ou de ses constituants sur le stress oxydant au cours de

l’hypercholestérolémie. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à mettre en

évidence l’effet d’un extrait aqueux de Ga sur les teneurs des lipides plasmatiques et

hépatique d’une part, et les marqueurs du statut redox, d’autre part chez des rats

consommant un régime enrichi en cholestérol (1%) et des rats témoins soumis à un

régime standard. Pour cela notre étude comporte plusieurs dosages à savoir :

� La détermination des teneurs des lipides plasmatiques et hépatiques.

� L’évaluation au niveau plasmatique des activités enzymatiques des transaminases

et des teneurs en albumine et acide urique.

� L’évaluation de la peroxydation lipidique par le dosage des substances réagissant

avec l’acide thiobarbiturique (TBARS) au niveau tissulaire et érythrocytaire.

� La détermination des défenses antioxydantes enzymatiques par l’estimation des

activités enzymatiques de la superoxyde dismutase (SOD), glutathion peroxydase

(GSH-Px) et catalase (CAT), et non enzymatique par le dosage du glutathion

oxydée (GSH) au niveau des différents tissus et des érythrocytes.

Avant de présenter les résultats, une étude bibliographique succincte est reportée

sur les connaissances acquises à ce jour sur l’hypercholestérolémie, l’athérosclérose, le

stress oxydant et les effets des plantes médicinales sur le métabolisme lipidique et le

statut antioxydant.

REVUE REVUE REVUE REVUE

BIBLIOGRAPHIQUEBIBLIOGRAPHIQUEBIBLIOGRAPHIQUEBIBLIOGRAPHIQUE

Revue Bibliographique

4

I. HYPERCHOLESTEROLEMIE ET ATHEROSCLEROSE I.1. Définition de l’hypercholestérolémie

L’hyperlipidémie en général, et l’hypercholestérolémie en particulier, sont reconnus

comme des facteurs de risque classiques des maladies cardiovasculaires (MCV) (Neil et al.,

2009).

L’hypercholestérolémie correspond à une élévation des teneurs du cholestérol dans le

sang et dont la teneur est supérieure ou égal à 2,5 g.L-1. Elle est très fréquente et expose, au

même titre que d’autres facteurs de risque, tels que le tabac, le diabète et la sédentarité, à la

survenue d’accidents cardiovasculaires (Ménard, 2008).

L’excès de cholestérol dans le sang favorise l’athérosclérose (Assmann et al., 2006 ;

Dimitrova-Sumkovska et al., 2006). Deux constituants nutritionnels, le cholestérol et les

acides gras saturés, sont responsables du développement de l’athérosclérose (Vidon et al.,

2001), ils agissent en augmentant les niveaux circulants des LDL, une des classes de

lipoprotéines les plus athérogènes (Beaumier-Gallon et al., 2001 ; Penumathsa et al., 2007).

Myron, 2007 a confirmé que le C-LDL est le premier facteur de risque de MCV. Par ailleurs,

Adiels et al., 2006 ont indiqué que les LDL petites et denses sont des éléments

caractéristiques de l’hypercholestérolémie.

Le modèle animal est souvent utilisé pour étudier l’hypercholestérolémie

(Moghadasian et al., 2001 ; Bouderbala et al., 2009). Chez le rat, l’hypercholestérolémie est

induite en consommant des régimes riches en triglycérides et en cholestérol (Deepa et al.,

2006). Par ailleurs, le rat soumis à un régime hypercholestérolémique est un bon modèle pour

l’étude des cellules dendritiques vasculaires impliquées dans l’athérogénèse (Ozmen et al.,

2002).


5

I.2. L’athérosclérose

Les anomalies du métabolisme lipidique sont à l’origine de perturbations biologiques

responsables en grande partie du développement de la plaque d’athérome et des pathologies

cardio-vasculaires (Koba et al., 2011). L’hypercholestérolémie joue un rôle important dans le

déclenchement et la progression de l'athérosclérose et a une corrélation positive avec les

MCV (Tang et al., 2006).

L’athérosclérose, considéré comme une inflammation chronique de l’intima des

vaisseaux, fait partie des premières causes de mortalité dans les pays industrialisés (Skalicky

et al., 2008). Elle est globalement associée à un risque augmenté de coronaropathies et se

caractérise par une dérégulation de l’homéostasie du cholestérol au niveau plasmatique et des

cellules vasculaires notamment les macrophages de la paroi artérielle (Maxfield et al., 2002 ;

Vainio et al., 2003 ; Gussekloo et al., 2004).

Chez le rat, la supplémentation en cholestérol d’un régime standard induit une

augmentation de la peroxydation lipidique favorisant ainsi la formation des plaques

d’athérome (Hsu et al., 2001 ; Hennekens et al., 2007; Naughton et al., 2009). Par ailleurs,

chez les animaux consommant des régimes enrichis en cholestérol, l’hypercholestérolémie

induit des altérations microvasculaires caractéristiques d’un stress oxydant et représente un

facteur de risque dans la progression de l'athérosclérose et de la réponse inflammatoire

(Deepa et al., 2006 ; Dimitrova-Sumkovska et al., 2006). Chez les lapins

hypercholestérolémiques l'hypercholestérolémie diminue les capacités de relaxation

vasculaire (Moroe & Honda, 2006).

La formation et la présence des produits d'oxydation sont déterminantes pour conduire

à un dysfonctionnement de l'endothélium et le déclenchement d’un stress oxydatif. Les LDL

oxydées (LDLox) augmentent la perméabilité vasculaire endothéliale, favorisant le passage des

monocytes sous l'endothélium vasculaire, permettant la formation de la plaque athéromateuse

et induisant une activation et une agrégation plaquettaires (Berglund, 2006 ; Korporaal et

al., 2007 ; Brack, 2008). Par ailleurs, d’autres travaux ont montré que l’endocytose et

l’accumulation des LDLox induisent un stress oxydant et une apoptose (Salvayre et al., 2002 ;

Galle et al., 2006).


6

II. STRESS OXYDANT- RADICAUX LIBRES Le stress oxydant est défini comme un déséquilibre entre les processus biochimiques

de production des radicaux libres et les défenses antioxydantes (Bloomer et al., 2008 ;

Browne et al., 2008 ; Powers et al., 2010).

Les espèces actives de l’oxygène (EAO) sont des radicaux libres (RL) ou des

molécules. Un radical libre est une espèce chimique, neutre ou chargée, qui a la particularité

de porter un électron célibataire (ou non apparié) sur sa couche externe, ce qui le rend

généralement instable et capable de réagir plus ou moins rapidement avec d’autres molécules

chimiques environnantes. Les réactions de transfert d’électrons qu’il produit (réactions

d’oxydoréduction, redox) conduisent souvent à la formation d’un nouveau radical, ce

phénomène pouvant se propager par des réactions en chaîne.

Les réductions mono-électroniques successives de l’oxygène donnent naissance à

différentes EAO : l’anion superoxyde (O-2), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical

hydroxyle (.OH). Au sein de la cellule, tous les processus utilisant de l’oxygène dans les

différents compartiments subcellulaires sont capables de produire des EAO. Lorsque ces EAO

ne sont pas contrôlés, ils entraînent nombreux dommages cellulaires et tissulaires (Fig. 1).

Lorsque l’un des systèmes de défense de l’organisme contre la toxicité des EAO montre un

échec, l’action des radicaux libres devient incontrôlable, ce qui conduit à des dommages au

niveau des molécules, des cellules, des organes et potentiellement à la mort de l’organisme

(Durackova, 2008).

La conséquence des effets nocifs des EAO et des métabolites réactifs est dite «stress

oxydant». Ce terme est défini initialement comme étant «Un déséquilibre profond de la

balance entre les prooxydants et les antioxydants en faveur des premiers» (Barouki, 2006 ;

Jenkins et al., 2007). De plus, les EAO représentent la plus importante classe d’espèces

réactives générées dans les organismes vivants à cause de l’importance de leur métabolisme

aérobique (Valko, 2007; Leibfritz et al., 2007), leur productions régule ainsi plusieurs

réponses physiologiques comme l’angiogenèse, le tonus vasculaire, la croissance, la

différenciation et la migration cellulaire (Martinon, 2010 ; Van de Veerdonk et al., 2010 ;

Meissner et al., 2010).


7

Fig. 1. Formation des radicaux libres et leurs conséquences (Pincimail, 2008).

Les EAO ont pendant longtemps été connus comme produits secondaires du transport

des électrons par la chaîne des cytochromes. Dans les cellules phagocytaires les NADPH

oxydases sont à l’origine de divers EAO intervenant dans l’élimination de pathogènes (Yang

et al., 2011).

L’augmentation des ERO stimule la production de peroxydes lipidiques qui se traduit

par une élévation du malondialdéhyde (MDA) (Roy et al., 2008). Cette peroxydation est

suivie d’un changement structural des membranes biologiques ou d’autres éléments contenant

des lipides (Stark 2005 ; Al-Mutairi et al., 2007). Par ailleurs, Tweeddale et al., 2007

indiquent que la peroxydation lipidique est un mécanisme en chaîne de dégradation des acides

gras membranaires qui conduit à la formation d'hydroperoxydes instables, responsables de la

diminution de la fluidité membranaire.

La production d’hydroperoxydes lipidiques est due à l’action enzymatique des

lipoxygénases (LOX) (Feussner, 2011). Les LOX catalysent l’insertion d’une molécule

d’oxygène en 9ème et 13ème position sur les AGPI libres 18:2 (acide linoléique) et 18:3 (acide

linolénique), et forment des hydroperoxydes lipidiques. Lors d’un stress, la part de cette

production enzymatique dans la production totale d’hydroperoxydes est très importante. Dans

le cas de la réaction hypersensible, elle peut atteindre 30 à 50 % (Montillet et al., 2005).


8

Les deux voies de peroxydation (enzymatique ou non) conduisent à la formation de

nombreux aldéhydes comme le MDA ou le 4 Hydroxynonénal (4HNE) interagissant avec les

macromolécules, et en particulier l’ADN (Weber et al., 2004 ; Chehab et al., 2007) (Fig. 2).

HPL , hydroperoxyde lyase ; HPOD, acide hydroperoxy-octadecadienoique ; HPOT, acide hydroperoxy

octadecatrienoique ; POX, peroxygénase.

II.1. Le Potentiel redox intracellulaire

Les organismes aérobies les plus évolués ont dû développer des systèmes de

conduction des nutriments mais également de l’oxygène, pour s’assurer de sa distribution

dans l’ensemble de l’organisme (systèmes vasculaires).

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Fig. 2. Mécanisme enzymatiques ou non enzymatiques à la suite de la peroxydation lipidique

(Chehab et al., 2007).


9

Le potentiel redox intracellulaire, ou statut redox, est la résultante de l’état redox des

couples oxydo-réducteurs présents dans la cellule. Les conditions redox régnant dans la

cellule sont évaluées par le rapport des concentrations des formes oxydées et réduites des

couples redox prépondérants, comme ceux du glutathion et de l’ascorbate (Noctor, 2006).

Du fait de leurs fortes concentrations cellulaires, les deux couples GSSG/GSH et

DHA/ASC agissent comme des tampons redox, à l’instar des tampons acido-basiques. Il

existe une très forte interconnexion entre les ERO et les molécules réductrices. Par exemple,

le GSH et l’ascorbate sont capables de réduire directement l’anion superoxyde et le peroxyde

d’hydrogène. Ils servent également de co-substrats aux enzymes antioxydantes détoxiquant

les ERO.

Le potentiel redox cellulaire détermine les proportions relatives des espèces oxydées

ou réduites de chaque couple redox. Ces proportions dépendent des potentiels redox de ces

couples. Cette fonction du potentiel redox cellulaire est particulièrement importante, car

l’activité de nombreuses protéines, et en particulier de nombreux facteurs de transcription, est

régulée par leur état redox (Foyer & Noctor, 2005 ; Noctor, 2006). Ainsi, dans des

conditions normales, le cytoplasme cellulaire est un milieu très réducteur, ce qui a pour

conséquence de maintenir la grande majorité des groupements thiols à l’état réduit (Foyer &

Noctor, 2005).

II.2. Les mécanismes antioxydants

Peut être considérée comme antioxydante une molécule qui, étant présente en une

faible concentration par rapport à celle d’un substrat oxydable, retarde ou empêche

significativement l’oxydation de ce substrat (Halliwell & Whiteman, 2004). Les systèmes

antioxydants sont de deux types, soit des molécules qui captent rapidement les ERO, soit des

systèmes enzymatiques catalysant la conversion des molécules prooxydantes (Salvayre et al.,

2005).

Les principaux systèmes antioxydants comprennent les enzymes antioxydantes tels

que les superoxydes dismutases, la catalase et plusieurs formes de peroxydases à glutathion, et

les antioxydants non enzymatiques tels que la transferrine, l’albumine, la vitamine C, la

vitamine E, le glutathion et l’acide urique (Menon et al., 2007 ; Tessier et al., 2008 ;

Suryanarayana et al., 2007 ; Krzystek-Korpacka M et al., 2011) (Fig 3).


10

2222

22 OOHOO HSOD,oo + →++−−

GSSHOHGSHOH PxGSH 22 2,

22 + →+

II.2.1. Les enzymes antioxydantes

Les enzymes antioxydantes ont une signification négligeable dans l’espace

extracellulaire alors qu’ils jouent un rôle très significatif dans l’espace intracellulaire

(Durackova et al., 2008).

II.2.1.1. Superoxyde dismutase (SOD) :

La superoxyde dismutase (SOD, EC: 1.15.1.1), est une métalloprotéine avec une

activité enzymatique et qui catalyse de la dismutation du superoxyde en oxygène et peroxyde

d'hydrogène (Chandel & Budinger, 2007), selon la réaction :

Pour cette raison, cette enzyme est une partie importante du système de défense contre

les radicaux libres. Elle est présente dans presque tous les organismes aérobies. Deux SODs à

cuivre et à zinc (Cu,Zn-SOD) sont présents dans les cellules animales dont une est

intracellulaire située dans le cytoplasme et dans l’espace intermembranaire des mitochondries,

alors que l’autre est extracellulaire et se trouve surtout dans la matrice extracellulaire des

tissus et à un degré moindre dans les liquides extracellulaires des tissus (plasma, lymphe)

(Behrend et al., 2003 ; Delattre et al., 2005).

II.2.1.2. Glutathion peroxydase (GSH-Px) :

La glutathion peroxydase (GSH-Px, EC: 1.11.1.9), est une enzyme formée de quatre

sous-unités contenant chacune un atome de sélénium incorporé dans une molécule de

sélénocystéine (dans laquelle le soufre du groupement thiol de la cystéine est remplacé par le

sélénium). La glutathion peroxydase est présente dans les liquides extracellulaires et dans les

cellules au niveau du cytosol et des mitochondries.

Les GSH-Px sont des enzymes à sélénium qui se présentent sous 5 formes. Les GSH-

Px permettent la réduction du H2O2 selon la réaction :


11

222222 2 OOHOHOH catalase + →+

Elles permettent aussi la détoxication des cellules de certains hydroperoxydes (ROOH)

qui sont les ROOH des esters de cholestérol, des phospholipides des membranes cellulaires,

des lipoprotéines et de l’ADN. Les GSH-Px peuvent être inhibées par O-2. Le maintien de

l'activité de la GSH-Px nécessite la régénération du GSH par la glutathion réductase (Delattre

et al., 2005 ; Schrader et al., 2006 ; Valko et al., 2007).

II.2.1.3. Catalase (CAT) :

La catalase est une enzyme (CAT, EC: 1.11.1.6) catalysant la dismutation de l'eau

oxygénée (peroxyde d'hydrogène), selon la réaction suivante :

Son activité enzymatique est importante quand les quantités d’H2O2 sont élevées

(Finaud et al., 2006 ; Sayre et al. 2008). Elle prévient les cellules de l’accumulation de H2O2

qui est toxique en forte concentration du fait qu’il soit un précurseur d’autres métabolites de

l’oxygène beaucoup plus réactifs tels que les radicaux ·OH. Quatre molécules de NADPH,

liées à la catalase, confèrent à cette enzyme une protection contre l’attaque du H2O2 ou

comme source de NADPH pour la glutathion peroxydase. Son activité est particulièrement

abondante dans les globules rouges, le foie et les reins. Par ailleurs, la catalase joue un rôle

important dans la détoxication de H2O2 dans les peroxysomes (Schrader et al., 2006).


12

Tableau 1 : Les enzymes antioxydantes.

Localisation Mode d’action

Superoxyde dismutase (SOD)

- Cytoplasme (Cu/Zn-SOD, cuivre-zinc) (Rahman et al., 2006). - Mitochondries (Mn-SOD, manganèse) (Behrend et al., 2003). - Erythrocytes

-Maintient la concentration d’anion O2°- à

des niveaux faibles, en collaboration avec la glutathion peroxydase (GSH-Px), elle constitue la première ligne de défense contre les oxydants (Rahman et al., 2006). -Elles accélèrent la vitesse de dismutation de l’anion O2°

- en H2O2 (Garrel et al., 2007, Rahman et al., 2006).

Catalase (CAT)

- Intracellulaire - Erythrocytes

-Catalyse la réaction de détoxification du H2O2 (généralement produit par les SOD) en H2O et enO2 (Valko et al., 2006). -L’H 2O2 produit par les SOD doit être rapidement métabolisé par la catalase et la GSH-Px pour que la protection apportée par les SODs soit effective (Rahman et al., 2006).

Glutathion peroxydase (GSH-Px)

- Cytosol - Mitochondries - Erythrocytes

-Décompose les hydroperoxydes organiques et l’ H2O2. -L’enzyme possède une grande spécificité pour la (GSH-Red) qui est utilisé comme donneur d’hydrogène au cours des réactions de décomposition ; il s’en suit la formation du glutathion oxydé (GSSG). -La GSH-Px est en compétition avec la catalase pour le substrat H2O2 et est la source majeure de protection contre les faibles niveaux de stress oxydant (Valko et al., 2006, 2007).

Glutathion réductase (GSH-Red)

- Cytosol en majeur partie - Erythrocytes

-Catalyse irréversiblement la réduction de GSSG en GSH (Jaspard, 2003). -Elimination d’ERO tel que le H2O2 selon la réaction suivante) (Valko et al., 2004): 2 GSH + H2O2 -----> GSSG + 2 H2O. -Le rapport de GSH/GSSG est un indicateur dynamique du stress oxydant (Al-Mutairi et al., 2007).

II.2.2. Principaux antioxydants endogènes non enzymatiques

II.2.2.1. Glutathion réduit (GSH) :

Le glutathion (GSH) est un tripeptide (acide glutamique-cystéine-glycine) connu par

son puissant pouvoir antioxydant (Menon & Goswami, 2007 ; Douris et al. 2009).


13

Le glutathion est principalement synthétisé par le foie et représente le premier système

de défense antioxydant non enzymatique des cellules. Il intervient dans la synthèse

d’importantes macromolécules et avec la glutathion peroxydase dans la protection contre les

EAO (Yu et al., 2003).

Le GSH est très abondant dans le cytosol, dans le noyau et dans la mitochondrie ou il

est l’antioxydant soluble majeur de ces compartiments cellulaires (Masella et al., 2005). La

forme réduite du glutathion est le GSH et la forme oxydée est le glutathion désulfure (GSSG).

Un environnement oxydatif entraine une modification rapide des groupements thiols des

protéines (protéine-SH). Des réactions d’oxydation aboutissent à des acides sulféniques

(protéine-SOH) et a des radicaux thiyls (protéine-S•). Ces produits partiellement oxydes

réagissent avec le GSH et forment des protéines S-glutathiolées (protéine-SSG) (Valko et al.,

2006) (Fig. 3). Ces protéines-SSG entrent dans le cycle du GSH ou elles sont réduites, par la

glutathion réductase, la glutarédoxine et la thiorédoxine, en groupements thiols protéiques

(protéine-SH). Cependant, si le processus d’oxydation des groupements thiols n’est pas piégé

par le GSH, on assiste a la formation irréversible d’acides sulfiniques (protéine-SO2H) et

d’acides sulfoniques (protéine-SO3H) (Valko et al., 2006).

II.2.2.2. L’acide urique :

L’acide urique comme produit final du métabolisme des purines, augmente dans le

plasma lors d’efforts physiques intenses (Baillie et al., 2007). Il a été proposé comme un des

Fig. 3. Rôle du GSH dans l'oxydation des groupements thiols des protéines

(Valko et al., 2006).


14

meilleurs antioxydants du plasma in vivo, où il pourrait contribuer à 35-60% de la capacité

antioxydante totale (Finaud et al., 2006 ; Johnson et al., 2009). L’acide urique peut être

oxydé en différents produits (Hellsten et al., 2001), puis est régénéré par la vitamine C

(Vasconselos et al., 2007). Il subsiste certains doutes quant à une réelle fonctionnalité

antioxydante de l’acide urique, dont l’augmentation peut aussi bien avoir des conséquences

pro que antioxydantes (Baillie et al., 2007 ; Gersch et al., 2009 ; Johnson et al., 2009).

III. EFFET DES PLANTES MEDICINALES SUR LE METABOLIS ME DES LIPIDES

ET LE STATUT ANTIOXYDANT

L’utilisation des plantes en thérapeutique (phytothérapie) est très ancienne et connaît

actuellement un regain d’intérêt auprès du public. Par ailleurs, l’automédication (médecine

traditionnelle) à partir d’extraits de plante en infusion est pratiquée dans tous les continents

(Abayomi et al., 2010). Il est possible d’utiliser les plantes entières ou les produits

d’extraction qu’elles fournissent (Marc, 2001).

De nombreuses études ont porté sur les effets cytoprotecteurs de certains composés

végétaux en l’occurrence les polyphénols au niveau des cellules du système nerveux

(Labieniec et al., 2006; Kim et al., 2005 ; Lee et al., 2006).

Le traitement avec l’extrait de Moringa pterygosperma ou Moringa oleifera Lam

(1mg/kg PC) pendant 30 jours entraine une réduction du cholestérol au niveau sérique (14%),

hépatique (6%) et rénal (11%) (Ghasi et al., 2000). Par ailleurs, les travaux de Choudhary et

al., (2005) ont montré que l’administration de l’extrait de Iris germanica rhizome (400mg/kg),

chez le rat soumis à un régime enrichis en lipides pendant 10 semaines réduit le C-LDL et

augmente le C-HDL, mais de façon non significative.

Chez le lapin, l’administration de 500 mg/kg PC de Capparis decidua réduit les

teneurs sériques en CT (-64%), TG (-32%), PL (-25%), C-LDL (-71%) et le cholestérol de

l’aorte (-44%) (Purohit & Vyas, 2005).


15

Chez des lapins soumis à un régime enrichi en cholestérol (100mg/kg de PC) et

supplémenté ou non avec un extrait de Ficus bengalensis (mg/kg de PC), Shukla et al., 2005

montrent une augmentation des concentrations des TBARS sériques. Par ailleurs, chez le

groupe traité par cet extrait comparé au groupe non traité, les activités des enzymes

antioxydantes SOD, Catalase, GSH-Px et le contenu en GSH érythrocytaire sont augmentés

(Shukla et al., 2005).

Chez la souris, la supplémentation de différentes doses (40, 80 ou 160 mg/kg PC) d’un

extrait butanolique d’Asparagus officinalis à un régime hyperlipidique, durant 8 semaines,

entraine une réduction des teneurs du malondialdéhyde (MDA), et inversement une

augmentation de l'activité de la SOD au niveau hépatique (Zhu et al., 2011).

Chez les rats rendus hypercholestérolémiques avec des régimes supplémentés en

cholestérol, le traitement avec des flavonoïdes extraits de Emblica officinalis et Mangifera

indica, entraîne une élévation des activités de la glutathion peroxydase (GSH-Px) et de la

glutathion réductase (GSH-Red) (Anila & Vijayalakshmi, 2003). Par ailleurs, chez le même

modèle de rat, Bouderballa et al., 2009 ont montré que le traitement avec l'extrait aqueux

d'Ajuga iva stimule la défense antiradicalaire en augmentant les activités enzymatiques de la

SOD, la GSH-Px et GSH-Red érythrocytaires d'une part, et celles de la catalase du foie, de la

GSH-Red du tissu adipeux et de la SOD du muscle, d' autre part.

MATERIELS ET MATERIELS ET MATERIELS ET MATERIELS ET

METHODESMETHODESMETHODESMETHODES

Matériel et Méthodes

16

1. Matériel végétal

1.1 Présentation de Globularia alypum

La globulaire buissonnante (Globularia alypum), parfois appelée turbith, est une plante

qui appartient au genre Globularia et à la famille des Plantaginacées. Caractéristique des

régions méditerranéennes, elle forme dans la garrigue d'importants buissons aux fleurs bleues

de 30-60 cm de hauteur, aux fleurs bleues très ramifiées. Ses feuilles sont toutes éparses sur le

rameau, coriaces et persistantes. Elles sont de formes elliptiques-ovales-obovales. L'odeur de la

Globulaire est très prononcée et son goût est très amer. La saison de reproduction de l’espèce

s’étale de novembre à mai.

Photo 1. Buisson et fleurs de Globularia alypum

1.2. Description Botanique.

1.2.1. Taxonomie

FAMILLE Plantaginaceae

SOUS-FAMILLE Globularioideae

GENRE Globularia

ENBRANCHEMENT Angiosperme

CLASSE Magnoliopsida

SOUS-CLASSE Asteridae

ORDRE Scrophulariale


17

1.2.2. Aspect botanique et répartition géographique

Les plantes du genre Globularia sont vivaces, à feuilles alternes, dont les fleurs sont

groupées en capitules plus ou moins globuleux entourés de bractées. Les fleurs ont une corolle

à deux lèvres, la supérieure bilobée souvent atrophiée, l’inférieure trilobée. Elles sont en

général bleues. Le fruit est un akène entouré par le calice persistant. On trouve en Algérie,

Globularia alypum, G. vesceritensis Batt. et G. eriocephala Pomel. Les deux dernières sont

présentes dans le Sahara central (Hoggar, Tassili) (Sarkhail et al., 2003 ; Kirmizibekmez et al

., 2004).

Elle est utilisée en médecine traditionnelle pour ses nombreuses vertus essentiellement

purgative, diurétique, rhumatismale, ainsi que pour ses propriétés antidiabétiques ((Ziyyat et

al., 1997 ; Skim et al., 1999 ; Jouad et al., 2001 ; Jouad et al., 2002 ; Zennaki et al., 2009).

Les composés actifs de la globulaire sont des iridoïdes : un composé glucoside iridoïde chloruré

le globularioside et cinq autres glucosides iridoïdes (globularin, globularicisin, globularidin,

globularinin et globularimin) (Es-Safi et al., 2006). De plus, sa richesse en composés

phénoliques pourrait être responsable de ses effets antioxydants (Khlifi et al., 2005). Les

feuilles de Globularia alypum n’ont aucun effet toxique connu sur les rats, la dose létale 50

(DL50) est supérieure à 10 g/kg de poids corporel (Skim et al., 1998).

1.3. Préparation de l’extrait aqueux de Globularia alypum

La plante Globularia alypum (Ga) a été récoltée dans la wilaya de Bejaïa (commune

d’Akbou, Douar Belayel) au cours de la période de floraison. Après récupération de la plante et

son identification au niveau du laboratoire de biochimie et physiologie végétale de

l’université d’Oran, les échantillons de feuilles sont nettoyés puis mis à sécher à température

ambiante dans un endroit aéré et à l’ombre pendant une semaine pour mieux conserver les

molécules sensibles à la chaleurs et à la lumière. Les feuilles séchées, sont ensuite sont

finement broyées (Fig. 4).


18

50g de poudre de Globularia alypum mélangée à 500ml d’eau distillée subissent une

décoction durant 45min. La décoction est ensuite refroidie, filtrée, congelée à -70 ºC pour être

ensuite lyophilisée (lyophilisateur CHRIST, ALPHA 1-2 LD, Germany). L’extrait obtenu est

une poudre verdâtre au goût amère, le rendement de l’extraction est de 30%.

Fig. 4. Préparation de l’extrait aqueux lyophilisé Ga.

Feuilles 50g de Ga+500mL d’eau distillée

Extrait lyophilisé de Ga Congélation (-70°C) Lyophilisation

Filtration

Broyage Feuilles

Décoction (Frémissement, 45min)


19

2. Animaux et régimes

Les expériences ont été effectuées sur des rats mâles de souche Wistar (n=24), âgés de

14 semaines, fournis par IFFA CREDO (l’Arbresle, France). Ces animaux sont répartis en

quatre groupes homogènes de 6 rats chacun et consomment durant 28 jours soit :

- un régime standard à 20% de caséine : groupe témoin (C)

- un régime enrichi en cholestérol (1%) et contenant 0,5% d’acide cholique : groupe

rendu hypercholestérolémique (HC)

- un régime standard supplémenté avec l’extrait aqueux de Ga : groupe CGa

- un régime enrichi en cholestérol (1%) supplémenté avec l’extrait aqueux de Ga : groupe

HCGa

La composition pondérale des régimes est présentée dans le (Tableau 1). Tout au long

de l’expérimentation, les rats reçoivent l’eau et la nourriture ad libitum renouvelées une fois par

jour en fin d'après-midi. Le poids corporel et la quantité de nourriture ingérée sont mesurés

quotidiennement. Les animaux sont maintenus dans une animalerie à une température de

22±2°C, une hygrométrie de 50±10% et un éclairage artificiel de 07-19h. Les urines sont

recueillies dans des tubes à essai contenant du thymol-isopropanol (10%). Les conseils

généraux pour l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivis (Council of European

Communities, 1989).

3. Prélèvement des échantillons sanguins et des organes

Au 28ème jour de l’expérimentation, après 12 heures de jeûne les rats de chaque groupe

(HC, HCGa, C et CGa) sont pesés, puis anesthésiés après injection intrapéritonéale d’une

solution de chloral (0,1 mg/100 g de poids corporel).

Le sang est prélevé par ponction au niveau de l’aorte abdominale, puis recueilli dans des

tubes contenant de l’éthylène-diamine-tétra-acétique, sel disodique (Na2-EDTA) à 0,1%. Les

échantillons sanguins sont ensuite centrifugés à 1000 x g pendant 20 min à -4 ºC (centrifugeuse

Sigma, 4K10 Bioblock Scientific, Germany) et le plasma est conservé à -70°C jusqu’à son

utilisation.


20

Les érythrocytes sont immédiatement lavés avec du tampon PBS (Na2HPO4: 1,44g.L-1 ;

NaCl: 8g.L-1; KCl: 0,2g.L-1 eau distillée qsp 50ml). Les différents organes (foie, cœur, tissu

adipeux épididymaire et rein) sont prélevés, rincés avec une solution de NaCl à 0,9% (P/V) à

froid, excisés, séchés et pesés. Les érythrocytes et les organes sont conservés à -70°C.

Tableau 2. Composition des régimes en g/100 g de régime1.

1Les régimes sont isoénérgétiques (17,780 MJ/kg de régime) et sont donnés sous forme de poudre. 2Prolabo-Paris, France. 3,4,5Sigma-Aldrich Chemie, Germany. 6ONAB, Sidi Bel Abbès, Algérie. 7Sucre cristallisé, ENASUCRE, Sfisef, Algérie. 8Cévital, SPA, Bejaїa, Algérie: Huile de tournesol (13% AGS, 22% AGMI, 65% AGPI). 9Prolabo-Paris, France. 10UAR 205 B (Villemoisson, 1360, Epinay/S/Orge, France), mélange minéral (mg/kg de régime) CaHPO4, 17200; KCl, 4000; NaCl, 4000; MgO2, 420; MgSO4, 2000; Fe2O3, 120; FeSO4, 7H2O, 200; MnSO4, H2SO4, H2O, 98; CuSO4, 5H2O, 20; ZnSO4, 80; CuSO4, 80; CuSO4, 7H2O; KI, 0,32. 11UAR 200 (Villemoisson,91360, Epinay/S/Orge, France), mélange vitaminique (mg/kg de régime) : Vit A, 39600 UI; Vit D3, 5000UI, Vit B1, 40; Vit B2, 30; Vit B3, 140; Vit B6, 20; Vit B7, 300; Vit B12, 0,1; Vit C, 1600; Vit E, 340; Vit K, 3,80; Vit PP, 200; choline, 2720; Acide folique, 10; Acide para-aminobenzoїque (PAB), 180; Biotine, 0,6; cellulose, qsp, 20g.

Constituants C CGa HC HCGa

Caséine2 20 20 20 20

Cholestérol3 - - 1 1

Méthionine4 0,3 0,3 0,3 0,3

Acide cholique5 0,5 0,5

Amidon de maïs6 60,8 60,8 0,1 59,8

Saccharose7 4,4 4,4 4,4 4,4

Huile8 5 5 5 5

Cellulose9 5 5 5 5

Mélange minéral10 3,5 3,5 3,5 3,5

Mélange vitaminique11 1 1 1 1

Extrait aqueux de Ga - 1,66 - 1,66


21

4. Analyses biochimiques

4.1. Détermination des teneurs en hémoglobine (Hb)

Le dosage de l’Hb est réalisé dans du sang total par une méthode chimique et

colorimétrique. L’hémoglobine est oxydée par le ferricyanure de potassium en methémoglobine

qui est ensuite transformée en cyanomethémoglobine par le cyanure de potassium (Kit Biocon

Diagnostik, Vöhl-Marienhagen, Germany). La lecture se fait à une longueur d’onde λ=415nm.

4.2. Détermination des teneurs plasmatiques en albumine, acide urique et activités enzymatiques des transaminases 4.2.1. Dosage de l’albumine

L’albumine sérique est déterminée par une méthode colorimétrique (Kit Spinreact,

Spain). L’albumine présente dans l’échantillon donne après sa liaison avec le vert de

bromocrésol un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie. L’intensité de la

coloration est proportionnelle à la concentration d'albumine dans l'échantillon. La lecture se fait

à une longueur d’onde λ= 630 nm.

4.2.2. Dosage de l’acide urique

L’analyse de l`acide urique est effectuée par une méthode colorimétrique enzymatique

(Kit Biocon, Germany). L’acide urique présent dans l’échantillon donne en présence d’uricase

un indophénol coloré quantifiable par spectrophotométrie. La lecture se fait à une longueur

d’onde λ=510nm.

4.2.3. Détermination de l’activité des transaminases plasmatiques

L’alanine aminotransférase (ALT) est une transaminase connue sous le nom de

glutamate-pyruvate-transaminase (GTP). L’ALT catalyse le transfert du groupe aminé de la L-

alanine vers l’α-cétoglutarate pour donner du L-glutamate. La détermination de l’activité de

l’ALT s’effectue par une méthode cinétique (Kit Biocon, Germany). La lecture se fait par

spectrophotométrie à une longueur d’onde λ=340 nm.


22

L’aspartate aminotransférase (AST) connue sous le nom de glutamate-oxalo-acetate-

transaminase (GOT) est une transaminase qui catalyse le transfert du groupe aminé du L-

aspartate vers l’α-cétoglutarate pour donner du L-glutamate. La détermination de l’activité de

l’AST s’effectue par une méthode cinétique (Kit Biocon, Germany). La lecture se fait par

spectrophotométrie à une longueur d’onde λ=340 nm.

4.3. Détermination des teneurs en lipides du foie et du plasma

4.3.1. Extraction des lipides totaux hépatiques

Les lipides sont extraits par un mélange chloroforme:méthanol (4:1, V:V). Les solvants

sont évaporés sous vide (Rotavapor Buchi) à une température de 48 °C. Après séchage du

ballon, la quantité de lipides totaux de l’échantillon exprimé en % est déterminée par différence

entre le poids final et le poids initial du ballon.

4.3.2. Dosage du cholestérol total

Le cholestérol total (CT) de l’extrait lipidique hépatique et plasmatique est déterminé

par une méthode enzymatique colorimétrique (Kit Biocon, Germany). Le cholestérol libre et le

cholestérol estérifié présents dans l’échantillon donnent après hydrolyse enzymatique et

oxydation un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie. L’indicateur, la

quinonéimine est formée à partir du peroxyde d’hydrogène et du 4-amino-antipyrine en

présence de phénol et de la peroxydase. La lecture se fait à une longueur d’onde λ=520 nm.

4.3.3. Dosage des triglycérides

Les triglycérides (TG) du foie et du plasma sont déterminés par une méthode

enzymatique colorimétrique (Kit Biocon, Germany). Les TG présents dans l’échantillon

donnent après hydrolyse enzymatique et oxydation un complexe coloré quantifiable par

spectrophotométrie. L’indicateur, la quinonéimine est formée à partir du peroxyde d’hydrogène

et du 4-amino-antipyrine et du chlorophénol sous l’action de la peroxydase. La lecture se fait à

une longueur d’onde λ=500 nm.


23

5. Evaluation de certains paramètres du statut redox

5.1. Détermination de la peroxydation lipidique par le dosage des substances réactives

à l’acide thiobarbiturique (TBARS)

5.1.1. Au niveau plasmatique et urinaire

La détermination des TBARS repose sur la réaction en milieu acide et à chaud du

malondialdéhyde (MDA) avec deux molécules d'acide thiobarbiturique (TBA) et la formation

d’un pigment absorbant à 532 nm (Quantanilha et al., 1982). La réaction colorée, observée

avec l'acide thiobarbiturique, mesure non seulement le malondialdéhyde préexistant, mais aussi

le malondialdéhyde formé par décomposition thermique des peroxydes, et de ceux générés au

cours même de la réaction (Favier, 1997). La concentration des TBARS est déduite à partir

d’une gamme étalon établie dans les mêmes conditions avec 1, 1, 3,3 tétraétoxypropane qui

donne le MDA après son hydrolyse en solution.

5.1.2. Au niveau des érythrocytes

La susceptibilité des hématies à la peroxydation est déterminée sur 100µl d’hématies

fraichement lavées (3 fois) avec du tampon PBS (pH =7,4). Ces hématies sont diluées dans

900µl de tampon PBS contenant 2 mmol.L-1d’azide de sodium et ensuite incubées avec 100µl

de H2O2 (1,15%) pendant 1 h à 37°C (Brown et al., 1997). Cette réaction est inhibée avec 1 ml

d’acide trichloroacétique (TCA) à 20% et le surnageant est récupéré. 100µl de

butylhydroxytoluène (BHT) à 2% sont ajoutés au surnageant. La peroxydation lipidique est

déterminée par la méthode de Quantanilha et al., (1982).

5.1.3. Au niveau des érythrocytes et des différents tissus

Les homogénats tissulaires sont préparés à raison de 100 mg de tissu broyé dans 0,9 ml

de tampon. 200 µl d’homogénat sont déposés dans des tubes Sovirel, puis 200 µl de SDS à

8,1%, 1500 µl d’acide acétique à 20% (pH=3,5) et 1500 µl d’une solution aqueuse d’acide

thiobarbiturique (TBA) à 0,8 % sont ajoutés. Le volume final du milieu réactionnel est ajusté à

4 ml avec de l’eau distillée. Les tubes sont incubés à 100° C pendant 60 min, puis placés dans

un bain glacé (5 min) afin de stopper la réaction. 1 ml d’eau distillée et 4 ml de butanol sont

additionnés.


24

Les tubes sont vigoureusement agités, centrifugés à 1000x g, pendant 10 min (Ohkawa

et al., 1978). La lecture de la phase organique (supérieure) est effectuée à une longueur d’onde

λ=532nm.

5.1.4. Au niveau des lipoprotéines plasmatiques (VLDL-LDL et HDL)

La séparation des lipoprotéines plasmatiques est réalisée par précipitation, selon la

technique de Burstein et al., (1970 ; 1989). Les lipoprotéines de faible densité (VLDL-LDL)

sont précipitées par du phosphotungstate (Sigma-Aldrich Chemie, Germany) et du MgCl2

(Merck, Germany) et les lipoprotéines de haute densité (HDL) sont précipitées par du sulfate de

dextran (Wt 500 000) (Sigma Chemical Company, St Louis) et du MgCl2. Toutes les

centrifugations sont effectuées à 1000 x g pendant 30 min à 20 °C.

La peroxydation lipidique des VLDL-LDL et des HDL est déterminée selon la

technique de Frémont et al., (1998). 100 µl (250mg de protéines) de VLDL-LDL ou HDL sont

incubés pendant 24h à 37°C en présence de 900 µl de tampon phosphate (10 mmol.L-1) et de 20

µl CuSO4 (0,25 mmol.L-1). La production des substances réactives avec l’acide thiobarbiturique

(TBARS) est déterminée par spectrophotométrie à 535 nm selon la méthode de Quantanilha et

al., (1982).

5.2. Détermination défenses antioxydantes

5.2.1. Estimation de l’activité des enzymes antioxydantes au niveau des

différents tissus et des érythrocytes

5.2.1.1. Superoxyde dismutase (SOD)

L’activité de la SOD est mesurée en utilisant un chromogène le nitroblue tetrazolium

(NTB) afin de détecter les anions superoxydes générés suite à l’action de la xanthine oxydase et

l’hypoxanthine (Kit Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Cette méthode consiste à

déterminer la capacité de l’enzyme à inhiber la réduction des anions superoxydes par le NTB.

Une unité SOD est définie comme étant la quantité nécessaire à l’inhibition de 50% de la

dismutation du radical superoxyde. La lecture se fait à une longueur d’onde λ= 560 nm.


25

5.2.1.2. Glutathion peroxydase (GSH-Px) Le dosage de la GSH-Px s’effectue selon une méthode qui permet de mesurer

indirectement l’activité de la GSH-Px par une réaction couplée à la glutathion réductase

(GSSG-Red). Le glutathion oxydé (GSSG), produit après réduction de l’hydoxyperoxide par la

GSH-Px est recyclé sous sa forme réduite par la GSSG-Red et le NADPH. L’oxydation du NADPH

en NADP+ se traduit par une diminution de l’absorbance à λ=340 nm. Cette réduction est

directement proportionnelle à l’activité de la GSH-Px de l’échantillon (Kit Cayman Chemical,

Ann Arbor, MI, USA).

5.2.1.3. Catalase (CAT)

L’activité de la catalase est réalisée selon la méthode décrite par Bergmeyer, (1974) par

la mesure du taux de décomposition du H2O2. Le dosage s’effectue sur 250 µl de surnageant

pour les érythrocytes et 250 µl d’homogénat tissulaire (100 mg de tissu broyé dans 0,9 ml de

KCl). 250 µl d’H2O2 (30 mmol dans du tampon phosphate à 50 mmol.L-1) et 250 µL de tampon

phosphate sont rajoutés, la solution est ensuite agitée et incubée pendant 5 min. Après addition

de titanium sulfate (TiOSO4), la lecture est réalisée par spectrophotométrie à une longueur

d’onde λ=420 nm.

5.2.2. Dosage du glutathion réduit (GSH) au niveau des différents tissus et

des érythrocytes

Le dosage du GSH est basé sur la méthode colorimétrique d’Ellman (1959). Le principe

est basé sur la réaction d’oxydation du GSH par l’acide 5, 5’- Dithiobis 2-nitrobenzoïque

(DTNB) libérant ainsi l’acide thionitrobenzoïque (TNB).

A 1 ml d`homogénat sont rajoutés 800 µl d’eau distillée glacée et 200 µl de TCA à

50%. Le mélange est agité pendant 10 min et centrifugé à 1200 × g pendant 15 min. Après

centrifugation, 400 µl de surnageant sont mélangés avec 800 µl de tampon Tris (0,4 mol.L-1,

pH 8,9) et 20 µl de DTNB (0,01 mol.L-1). Après 5 min d’incubation, la lecture de l’absorbance

s’effectue à λ= 412 mn. Les concentrations sont déduites à partir d’une gamme étalon établie

dans les mêmes conditions avec le glutathion réduit.


26

6. Analyse statistique

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard (M ±ES) de 6 rats par

groupe. L’analyse statistique est effectuée en utilisant le logiciel STATISTICA (version 9.0,

Statsoft, Tulska, Oklahoma, USA). Après analyse de variance (two-way ANOVA), la

comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey‐Kramer pour les comparaisons

multiples. Les moyennes portant les indices (*, $, #, Ŧ) sont significativement différentes

(P<0,05) : Effet cholestérol : *HC vs C ; Ŧ HCGa vs CGa

Effet Globularia alypum : $CGa vs C ; #HCGa vs HC

RESULTATSRESULTATSRESULTATSRESULTATS

Résultats

27

1. Evolution du poids corporel et de la nourriture ingérée (Fig. 5)

Durant toute la durée de notre expérimentation, le poids corporel et la nourriture

ingérée des rats restent similaires chez les 4 groupes expérimentaux (C, CGa, HC et

HCGa). A J28, les valeurs du poids corporel moyen des animaux est de 299,2±8,7 g. De

même, la quantité de nourriture ingérée est identique chez les quatre groupes et

représente en moyenne 25 g/j/rat.

2. Teneurs des lipides hépatiques et plasmatiques

Chez le groupe témoin, la supplémentation de l’extrait de Globularia alypum (Ga)

n’induit pas de variation des concentrations des triglycérides (TG), cholestérol total (CT)

et phospholipides (PL) du foie et du plasma. Cependant, les teneurs en TG hépatiques

sont 4,2-fois plus augmentées chez le groupe hypercholestérolémique (HC) comparé au

groupe témoin (C), et inversement elles sont 4,9-fois plus faibles chez le groupe

hypercholestérolémique traité (HCGa) par rapport à HC. Au niveau plasmatique, les

valeurs des TG sont 2,2-fois plus élevées chez le groupe HC vs C, et diminuent de 2,1-

fois chez le groupe HCGa vs HC (Tableau 3).

Au niveau du foie, les teneurs en CT sont 3,4-fois plus importantes chez le

groupe HC vs C, et 3-fois plus faibles chez le groupe HCGa comparé à HC, alors qu’au

niveau plasmatique les concentrations du CT sont 2,2-fois plus faibles chez le groupe

HCGa vs HC, et 1,2-fois plus élevées chez le groupe HCGa vs C.

Les teneurs des PL hépatiques sont respectivement 2,7-, 2,8-, et 5,5-fois plus

élevée chez les groupes HCGa vs C, HCGa vs CGa et HC vs C, et 1,9-fois plus faibles

chez le groupe HCGa comparé à HC. Cependant, au niveau plasmatique, les

concentrations des PL sont 1,7-fois plus élevées chez le groupe HC vs C, et réduites de

1,5-fois chez le groupe HCGa vs HC.

Résultats

28

Fig. 5. Croissance pondérale et nourriture ingérée. Chaque valeur représente la moyenne±ES de six rats par groupe. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne±erreur standard de six rats par groupe. C : groupe témoin ; CGa : groupe témoin supplémenté avec l’extrait de Ga. HC : groupe soumis au régime enrichi en cholestérol ; HCGa : groupe soumis au régime enrichi en cholestérol et supplémenté avec l’extrait aqueux de Ga. Après analyse de variance (2-way ANOVA), la comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer.

Nourriture ingérée

0

20

40g

TT-Ga

HCHC-Ga

J28

Poids corporel

180

270

360

0 7 14 21 28Jours

g

CCGa

HCHCGa

HCHCGa

CCGa

HCHCGa

CCGa

g/j/ /rat

Résultats

29

Tableau 3. Teneurs des lipides hépatiques (µmol/g) et plasmatiques (mmo/L).

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± ES de six rats par groupe. C : groupe témoin ; CGa :

groupe témoin supplémenté avec l’extrait de Ga. HC : groupe soumis au régime enrichi en cholestérol ;

HCGa : groupe soumis au régime enrichi en cholestérol et supplémenté avec l’extrait aqueux de Ga. Après

analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer pour des

comparaisons multiples. Effet cholestérol :*HC vs C ; ŦHCGa vs CGa. Effet Globularia alypum : $CGa vs

C ;*HCGa vs HC, (P<0,05).

TG CT PL C 8,91±3,01 6,11±1,53 10,21±0,77

CGa 9,36±1,03 6,99±1,48 10,18±4,05

HC 37,76±5,33* 20,91±3,28* 56,50±2,81*

Foie

HCGa 7,64±1,09# 6,77±2,12# 28,53±6,86‡,#,§

C 0,73±0,13 1,62±0,71 0,87±0,14

Plasma CGa 0,59±0,19 1,43±0,29 0,85±0,16

HC 1,66±0,26* 4,43±0,46* 1,49±0,14*

HCGa 0,76±0,17# 2,01±0,14#,§ 0,95±0,18#

Résultats

30

3. Teneurs de certains marqueurs du stress oxydant au niveau sanguin (Tableau 4)

Aucune différence significative de l'albumine n'est notée chez les quatre groupes

expérimentaux, alors que les teneurs en hémoglobine sont augmentées de +50℅ chez le

groupe HC vs C, et diminuent de -28% chez le groupe hypercholestérolémique traité par

l’extrait de Ga comparé au non traité.

Les concentrations de l'acide urique sont diminuées respectivement de -22℅ et

-41% chez les groupes CGa vs C et HCGa vs HC, inversement elles augmentent de

+25%, chez le groupe HC vs C (Tableau 4).

L’activité enzymatique de l'aspartate aminotransférase (AST) est augmentée de

+71% chez le groupe HC vs C, par contre elle est réduite de -71% chez le groupe HCGa

vs HC. De même, l’activité de l'alanine aminotransférase (ALT) s’élève de +70% chez le

groupe HC vs C, et diminue de -64℅ chez le groupe HCGa vs HC.

4. Détermination de la peroxydation lipidique (Tableau 5)

4.1. Au niveau plasmatique

Au niveau plasmatique, les concentrations des TBARS sont augmentées de +45%

et +53%, chez le groupe HCGa vs CGa, et HC vs C. Par contre, elles sont réduites de

-55% chez le groupe HCGa comparé à HC.

4.2. Au niveau des fractions de lipoprotéines (VLDL-LDL et HDL)

Alors que les teneurs des TBARS-VLDL-LDL sont augmentées de 1,7- et 1,8-

fois chez les groupes HCGa vs CGa et HC vs C, respectivement. Inversement, elles sont

1,2 et 2,2-fois plus faibles, chez les groupes HCGa vs C et HCGa vs HC.

Les valeurs des TBARS-HDL sont respectivement 1,6-, 1,6- et 1,7-fois plus

importantes chez les groupes HCGa vs CGa, HC vs C et HCGa vs C. Par contre, elles

sont 1,8-fois plus faibles chez le groupe HCGa vs HC.

Résultats

31

Tableau 4. Concentrations de certains marqueurs du stress oxydant au niveau sanguin.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne±erreur standard de six rats par groupe. Après


comparaisons multiples. *HC vs C ; ‡HCGa vs CGa ; $CGa vs C ; #HCGa vs HC, (P<0,05).

Tableau 5. Concentrations des TBARS au niveau plasmatique, lipoprotéique et urinaire.

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard de six rats par groupe. Après analyse de

variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer pour des comparaisons

multiples. *HC vs C ; ‡HCGa vs CGa ; $CGa vs C ; #HCGa vs HC ; §HCGa vs C, (P<0,05).

C CGa HC HCGa

Hb (g/Dl) 7,63±1,59 7,37±1,79 15,31±1,60* 11,04±1,64#

Albumine (g/L) 35,47±5,93 39,66±2,46 41,94±4,28 38,47±5,31

Acide urique (g/L) 22,78±1,36 17,65±0,98$ 30,57±2,62* 21,59±2,01#

AST (UI/L) 27,49±3,36 25,42±2,55 96,17±7,82* 28,09±3,16#

ALT (UI/L) 28,79±5,16 33,59±3,17 94,85±4,11* 33,68±3,69#

C CGa HC HCGa

Plasma (nmol/mL)

6,15±0,24

3,23±0,44$ 13,33±0,68* 5,88±0,72#,‡

Lipoprotéines (µµµµmol/mL/24h)

VLDL-LDL 6,95±0,13 3,16±0,12$ 12,56±0,34*

5,53±0,17#,‡,§

HDL 3,69±0,22 2,13±0,11$ 6,42±0,10*

3,48±0,13#,‡

Urines (µµµµmol/mL/24h)

2,81±0,17 3,08±0,15

14,50±0,25* 4,48±0,10#,‡,§

Résultats

32

4.3. Au niveau des urines

Les teneurs des TBARS urinaires sont augmentées de +31%, +37% et +80% chez

les groupe HCGa vs CGa , HCGa vs C et HC vs C. Inversement, elles sont diminuées de

-69% chez le groupe HCGa vs HC.

5. Concentrations des TBARS et du GSH tissulaires

5.1. TBARS tissulaires (Tableau 6)

Les teneurs des TBARS hépatiques sont 4,1-fois plus élevées chez le groupe HC

vs C. Inversement, elles sont 3,7-fois plus faibles chez le groupe HCGa comparé à HC.

Au niveau cardiaque, les concentrations des TBARS sont 1,6-fois plus

importantes chez le groupe HC vs C ; cependant, après supplémentation de l’extrait

aqueux de Ga une diminution significative est notée (P<0,05).

Les valeurs des TBARS du rein sont 1,5-fois plus augmentées chez le groupe HC

vs C, et 1,4-fois plus faibles chez le groupe HCGa vs HC.

Au niveau du tissu adipeux les teneurs des TBARS sont 4,1-fois plus élevées chez

le groupe HC vs C, inversement chez le groupe HCGa vs HC, elles sont 3,5-fois plus

faible.

5.2. GSH tissulaire (Tableau 7)

A J28, les concentrations du GSH ne sont influencées, ni par le régime, ni par la

supplémentation ou non de l’extrait aqueux de Ga au niveau du cœur et des reins. En

effet, les valeurs au niveau cardiaque et rénal représentent en moyenne 1,13±0,28 et

3,16±0,37 nmol.g-1 tissu, respectivement.

Au niveau du foie les teneurs du GSH sont diminuées -48%, chez le groupe HC

vs C, elles augmentent de +56% chez le groupe HCGa comparé à HC.

Au niveau du tissu adipeux, les concentrations du GSH sont réduites de -67%

chez le groupe HC par rapport à C, alors qu’elles augmentent de +66 %, chez le groupe

HCGa vs HC.

Résultats

33

Tableau 6. Teneurs des TBARS tissulaires (nmol/g tissue).

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard de six rats par groupe. Après analyse

de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer pour des

comparaisons multiples. *HC vs C ; #HCGa vs HC, (P<0,05).

Tableau 7. Concentrations du GSH au niveau des différents tissus (exprimées en nmol/g de tissu).

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne±erreur standard de six rats par groupe. Après


comparaisons multiples. *HC vs C ; #HCGa vs HC, (P<0,05).

C CGa HC HCGa

Foie 207,64±29,8 212,23±26,4 864,35±23,2* 232,44±22,5#

Cœur 188,21±12,7 191,27±15,3 306,27±10,69* 208,07±8,11#

Reins

Tissu adipeux

237,33±22,8

142,77±11,1

245,23±21,4

155,48±13,5

366,38±17,3*

595,09±25,6*

247,10±16,7#

167,15±10,9#

C CGa HC HCGa

Foie 12,21±1,02 13,22±1,07 6,24±1,06* 14,47±1,33#

Cœur 1,25±0,21 0,96±0,38 0,88±0,36 1,43±0,20

Reins 2,74±0,52 3,48±0,23 2,88±0,51 3,55±0,23

Tissu adipeux 6,49±0,53 7,27±0,36 2,11±0,35* 6,28±0,75#

Résultats

34

6. Activité des enzymes antioxydantes tissulaires

6.1. Activité de la superoxyde dismutase (SOD) tissulaire

Au niveau du cœur et des reins, l’activité de la SOD n’est influencée ni par le

régime, ni par la supplémentation ou non de l’extrait aqueux de Ga. En effet, les valeurs

obtenues au niveau du cœur et du rein représentent en moyenne 27,81±1,71 et

13,61±1,22 U.g-1 tissu, respectivement.

Par contre, au niveau du foie, l'activité de la SOD est 1,6-fois plus faible chez le

groupe HC vs C, alors qu’elle est 1,9-fois plus élevée chez le groupe HCGa comparé à

HC (Fig. 6).

Au niveau du tissu adipeux, l’activité SOD est diminuée de 1,7-fois chez le

groupe HC vs C, inversement, elle est 1,7-fois plus importante chez le groupe HCGa

comparé à HC.

6.2. Activité de la glutathion peroxydase (GSH-Px) tissulaire

Aucune différence significative de l’activité de la glutathion peroxydase n’est

notée au niveau cardiaque et rénal. En effet, les valeurs de l’activité GSH-Px au niveau

des ces deux organes représente en moyenne 8,87±0,54 et 14,97±2,03 nmol.g-1 tissu,

respectivement (Fig. 7).

Au niveau hépatique, l’activité GSH-Px est augmentée de +36% chez le groupe

HCGa comparé à HC. Cependant, aucune différence significative n’est notée entre les

autres groupes (P<0,05).

Au niveau du tissu adipeux, l'activité de GSH-Px est réduite de -51% chez le

groupe HC comparé à C. Inversement, chez le groupe hypercholestérolémique, la

supplémentation avec l’extrait de Ga entraine une augmentation de la GSH-Px de +47%.

Résultats

35

Foie

*

#

0

30

60

U/g

de

tissu

Coeur

0

30

60

U/g

de

tissu

CCGa

HCHCGa

Rein

0

30

60

U/g

de

tissu

Tissu adipeux

*

#

0

30

60

U/g

de

tissu

SOD

Fig. 6. Activité de la superoxyde dismutase tissulaire.

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Après analyse de variance, la

comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer pour des comparaisons

multiples :*HC vs C ; #HCGa vs HC, (P<0,05).

Résultats

36

GSH-Px

Fig. 7. Activité de la glutathion peroxydase tissulaire.



multiples : *HC vs C ; #HCGa vs HC, (P<0,05).

Foie

*

#

0

15

30

U/g

de

tissu

Coeur

0

15

30

U/g

de

tissu

CCGa

HCHCGa

Rein

0

15

30

U/g

de

tissu

Tissu adipeux

*

#

0

15

30

U/g

de

tissu

Résultats

37

6.3. Activité de la catalase tissulaire

Au niveau hépatique, l'activité de la catalase (CAT) est diminuée de -50% chez le

groupe HC vs C, et augmente de +44% chez le groupe HCGa vs HC.

Au niveau du cœur, elle est réduite de -53% chez le groupe HC comparé à C

(Fig. 8), alors qu'elle augmente de +43% chez le groupe HCGa vs HC. Par ailleurs,

l’activité enzymatique de la CAT au niveau rénal est diminuée de -40% chez le groupe

HC vs C, et inversement elle s’élève de +48% chez le groupe HCGa vs HC.

Au niveau du tissu adipeux, une réduction (-63%) de l’activité CAT est notée

chez le groupe HC comparé à C, par contre elle augmente de +59% chez le groupe

HCGa vs HC.

7. Peroxydation lipidique et teneurs du glutathion réduit (GSH)

érythrocytaire

Au niveau des érythrocytes, les concentrations des TBARS varient en fonction de

la nature du régime et de la supplémentation de l’extrait aqueux de Ga. En effet, les

valeurs sont augmentées de 2,3-fois chez le groupe HC vs C, et diminuées de 2,2-fois

chez le groupe HCGa vs HC (Fig. 9).

Les concentrations du glutathion sont augmentées de +43% chez le groupe HCGa

vs HC, et réduites de -51% chez le groupe HC vs C.

Résultats

38

CAT

Fig. 8. Activité de la catalase tissulaire.




Foie

*

#

0

20

40

U/g

de

tissu

Coeur

*

#

0

20

40

U/g

de

tissu

CCGa

HCHCGa

Rein

*

#

0

20

40

U/g

de

tissu

Tissu adipeux

*

#

0

20

40

U/g

de

tissu

Résultats

39

7. Peroxydation lipidique et teneurs du glutathion réduit (GSH)

érythrocytaire

Au niveau des érythrocytes, les concentrations des TBARS varient en fonction de

la nature du régime et de la supplémentation de l’extrait aqueux de Ga. En effet, les

valeurs sont augmentées de 2,3-fois chez le groupe HC vs C, et diminuées de 2,2-fois

chez le groupe HCGa vs HC (Fig. 9).

Les concentrations du glutathion sont augmentées de +43% chez le groupe HCGa

vs HC, et réduites de -51% chez le groupe HC vs C.

8. Activités des enzymes antioxydantes au niveau des érythrocytes

L’activité enzymatique de la SOD varie en fonction de la nature du régime et la

supplémentation de l’extrait aqueux lyophilisé de Ga. En effet, l’activité de la SOD est

1,8-fois plus faible chez le groupe HC vs C, et inversement 2,1-fois plus importante,

chez le groupe HCGa vs HC.

L’activité de GPx est 1,9-fois plus faible chez le groupe HC vs C, alors qu’elle est

2-fois plus élevée, chez le groupe HCGa comparé à HC. La supplémentation de l’extrait

de Ga dans le régime standard montre une augmentation de la GPx comparé au régime

non supplémenté (Fig. 9).

Les valeurs de l’activité CAT sont réduites de 1,7-fois chez le groupe HC vs C.

Cependant, elles sont 1,2-fois plus élevée, chez le groupe HCGa comparé à HC.

Résultats

40

Fig. 9. Peroxydation lipidique et défense antioxydante enzymatique et non enzymatique

au niveau érythrocytaire.

Chaque valeur représente la moyenne±ES de six rats par groupe. Après analyse de variance, la



TBARS*

#

0

80

160

µm

ol/m

L H

b

SOD

*

#

0

600

1200

U/m

L H

b

CCGa

HCHCGa

GSH

*

#

0

15

30

µm

ol/m

L H

b

GSH-Px

*

#

0

600

1200

U/m

L H

b

CAT

*

#

0

60

120

U/m

L H

b

DISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSION

Discussion

41

La présente étude a pour but de mettre en évidence l’effet d’un extrait aqueux

lyophilisé de Globulara alypum (Ga) sur les teneurs des lipides hépatiques et

plasmatiques d’une part, et le statut redox d’autre part, chez des rats soumis à un régime

enrichi en cholestérol (1%). A notre connaissance, il n’existe pas d’études sur l’effet de

cet extrait et/ou ses constituants sur le profil des lipides et le statut redox au cours de

l’hypercholestérolémie.

Notre premier objectif est de voir si l’extrait aqueux lyophilisé de Globularia

alypum (Ga) pourrait atténuer la dyslipidémie, en particulier l’hypercholestérolémie

provoquée expérimentalement par l’enrichissement du régime en cholestérol, chez le rat

adulte de souche Wistar.

Après 28 jours d’expérimentation, les résultats de notre étude montrent que la

consommation des régimes standards (20% caséine) ou enrichis en cholestérol (1%),

supplémentés ou non avec l’extrait aqueux lyophilisé de Globularia alypum (Ga) entraîne

chez le rat Wistar une croissance pondérale progressive et similaire. De plus, la

consommation alimentaire reste inchangée chez les quatre groupes de rats. Ces résultats

sont en accord avec ceux de E1-Beshbishy et al., 2006 qui ont montré qu’il n’existe

aucune différence significative du poids corporel et de la nourriture ingérée, chez des rats

soumis à un régime supplémenté en cholestérol (2%) et traités avec 500 mg d'un extrait

de Monts alba L, administré par voie orale. De même, des résultats similaires ont été

notés après 4 semaines de traitement avec l’extrait de Thymbra spicata chez des rats

soumis à un régime enrichi en cholestérol (Akkol et al., 2009).

Il ressort que les rat Wistar soumis soit à un régime standard, soit enrichi en

cholestérol, supplémenté ou non avec l’extrait aqueux de Ga présentent une évolution

progressive et régulière du poids corporel tout au long de l’expérimentation.

Au vu de ces résultats, qu'en est-il de l’effet de ces régimes sur le profil des

lipides hépatiques et plasmatiques ? L’extrait aqueux lyophilisé de Ga pourrait-il moduler

l’effet hyperlipémiant induit par la supplémentation du régime en cholestérol ?

Discussion

42

De nombreuses études expérimentales réalisées sur le métabolisme des lipides ont

utilisé le rat Wistar comme modèle pour l’étude des effets des régimes nutritionnels. Par

ailleurs, ces travaux ont montré que l’enrichissement des régimes en cholestérol (1%)

induit une élévation des teneurs du cholestérol total hépatique et plasmatique

(Minhajuddin et al., 2005 ; Chenni et al., 2007 ; Bouderbala et al., 2009).

De nombreuses études ont rapporté les effets bénéfiques des produits naturels tels

que les plantes et/ou leurs extraits dans la réduction des lipides plasmatiques, en

particulier le cholestérol total (CT) et les triglycérides (TG) (Livrea & Tesoriere, 2006 ;

Cassiana, 2007 ; Garjani et al., 2009). A J28, nos résultats indiquent que l’extrait

aqueux lyophilisé de Ga exerce des effets hypocholestérolémiants et

hypotriglycéridémiants qui sont concomitants avec la réduction des teneurs en CT et TG

hépatiques, chez le groupe hypercholestérolémique traité, et les valeurs obtenues sont

similaires à celles des groupes témoins traités ou non avec cet extrait.

Le foie joue un rôle central dans l’homéostasie du cholestérol autant dans sa

synthèse que dans son excrétion. De plus, une alimentation riche en cholestérol peut

compromettre l’équilibre entre la production de cholestérol endogène (organique) et

l’apport de cholestérol exogène (alimentaire). Les récentes expériences menées au niveau

de notre laboratoire sur des modèles de rats rendus diabétiques par injection de

streptozotocine ou consommant un régime enrichi en fructose montrent que les extraits

lyophilisés Globularia alypum exercent des effets hypolipémiants, et réduisent

considérablement les teneurs des TG et CT plasmatiques (Zennaki et al., 2009 ; Taleb-

Dida et al., 2011).

Dans notre travail, l’effet hypolipémiant noté avec l’extrait Globularia alypum

serait probablement directement lié à son activité antioxydante. En effet, l’étude

phytochimique de l’extrait aqueux de Ga révèle la présence d’une quantité importante de

polyphénols (120mg/g d’extrait) (Khlifi et al., 2005) et la séparation de ses constituant a

permis l’identification de composés, tels que le syringin, les phenyléthanoïdes, quatre

flavonoïdes et six iridoides (Es-Safi et al., 2006). Par ailleurs, la diminution du

Discussion

43

cholestérol plasmatique chez le groupe HCGa comparé à HC peut être traduite par une

utilisation efficace du cholestérol et par sa répartition favorable au niveau des HDLs.

Bonomini et al., 2008 indiquent que les dépôts lipidiques riches en cholestérol, en

particulier au niveau des artères coronaires caractérisent les maladies coronariennes et la

majorité du cholestérol est transportée par les HDL2 (fraction antiathérogène). Par

ailleurs, la diminution des teneurs du cholestérol hépatique chez le groupe

hypercholestérolémique traité par l’extrait par rapport au non traité, laisse suggérer que

l’extrait lyophilisé de Ga pourrait stimuler l’activité de l’enzyme impliqué dans la

conversion du cholestérol en acides biliaires, la 7α-hydroxylase et/ou inhibé l’enzyme

permettant la synthèse du cholestérol endogène, l’Hydroxy-Méthyl-Glutaryl-CoA (HMG-

CoA) réductase. Ces résultats sont en accord avec ceux de Kim et al., 2010 qui ont

montré un effet similaire avec Curcuma longa chez des rats soumis à un régime

hypercholestérolémique durant 8 semaines.

A J28, l’effet hypotriglycéridémiant observé chez le groupe HCGa vs. HC serait

probablement le résultat d’une réduction de la synthèse des TGs hépatiques à partir des

acides gras et du glycérol. Ces résultats corroborent avec ceux de Hirunpanich et al.,

2006 qui montrent que chez le rat hypercholestérolémique, le traitement avec 500 et 1000

mg de l'extrait aqueux de Hibiscus samarifla L. (roselle) pendant 6 semaines entraîne une

diminution des teneurs sériques en TG.

Chenni et al., (2007) a montré que la supplémentation de l’extrait aqueux

d’Ajuga iva à un régime enrichi en cholestérol chez le rat induit une réduction des teneurs

plasmatiques en TG et TG-VLDL et suggère que cet effet hypotriglycéridémiant pourrait

aussi être le résultat d’une importante activité de la lipoprotéine lipase (LPL), enzyme

responsable de l’hydrolyse des TG-VLDL. Tsutsumi et al., (2003) ont montré que la

diminution de l’activité enzymatique de la LPL au niveau sérique est associée à une

augmentation des teneurs en TG sériques et à une réduction du C-HDL, tous deux facteur

de risque des maladies cardiovasculaires. De plus, l'augmentation des TG sériques peut

Discussion

44

être due à la diminution de la synthèse des récepteurs des lipoprotéines de faible densité

(LDL), lorsque le régime est supplémenté en cholestérol (Calleja et al., 2000).

Notre étude révèle que l'extrait aqueux lyophilisé de Globularia alypum (Ga)

administré aux rats rendus hypercholesterolémiques agit favorablement sur le profil

des lipides hépatiques et plasmatiques.

Le deuxième objectif de l’étude est de savoir si cet extrait pourrait avoir des effets

bénéfiques sur les marqueurs du stress oxydant au niveau sanguin ?

A J28, une augmentation des valeurs de l’hémoglobine est notée chez le groupe

hypercholestérolémique (HC) par rapport au groupe témoin (C), inversement une

réduction est observée chez le groupe HC traité par l’extrait de Ga comparé au non traité

(HCGa). L’hémoglobine possède un fort pouvoir oxydant lié au groupement hème

qu’elle contient favorisant l’oxydation des lipoprotéines (Yuan et al., 1995), et peut aussi

exercer un effet cytotoxique direct (Ogihara et al., 2000).

De plus, nos résultats montrent que l’excès de cholestérol dans le régime induit

une augmentation significative de l’uricémie (P<0.05). Inversement, la supplémentation

avec l’extrait aqueux lyophilisé de Ga entraîne sa réduction chez les groupes

hypercholestérolémique et témoin, montrant ainsi un effet antioxydant qui peut être

expliqué par la réduction du métabolisme de l’adénosine ou à une stimulation de

l’activité de la xanthine oxydase (XO), enzyme qui catalyse l'oxydation de l'hypoxanthine

en xanthine et qui de plus catalyse l'oxydation de la xanthine en acide urique. Par ailleurs,

l’acide urique est l’un des plus importants antioxydants, capable d’éliminer jusqu’à 60 %

des radicaux libres produits (Oliver, 2007 ; Madero et al., 2009). Bien que l'acide urique

puisse agir comme un antioxydant, l'excès au niveau plasmatique est souvent associé aux

MCV, et agirait dans ce cas comme prooxydant (Heinig et al., 2006).

Discussion

45

Chez l’homme, Masuo et al., (2003) indiquent que l’augmentation de l’uricémie

favorise le développement de l’obésité et de l’hypertension artérielle (HTA). Par ailleurs,

chez les patients à haut risque de MCV, l’élévation des teneurs en acide urique

contribuent à l’apparition de l’athérosclérose (Strazzullo & Puig, 2007, Ioachimescu et

al., 2008).

A J28, une importante activité alanine aminotransférase (ALT) et aspartate

aminotransférase (AST) est notée chez le groupe HC par rapport à HCGa, ces résultats

corroborent avec ceux de Arafa, 2005 qui montrent une élévation des activités

transaminasiques chez des rats rendus hypercholesterolémiques et traités pendant 7 jours

avec 0,5% d’extrait de curcumin (Arafa, 2005). L'ALT et 1'AST sont des marqueurs

importants du fonctionnement hépatique et sont évaluées afin de déterminer les

éventuelles perturbations causées par l'hypercholestérolémie. Ces enzymes se trouvent en

grande quantité dans le foie et sont libérées dans le sérum lorsque les hépatocytes ou bien

leurs membranes cellulaires sont atteintes (Kew, 2000).

L’extrait aqueux de Globularia alypum agit favorablement sur le fonctionnement rénal

probablement par son effet protecteur contre les troubles causés par le régime enrichi

en cholestérol.

. Le 3éme objectif de ce travail est de voir si l’extrait aqueux lyophilisé de Globularia

alypum pourrait améliorer le statut redox, chez le rat ingérant un régime enrichi en

cholestérol.

L’hypercholestérolémie, le cholestérol alimentaire et le stress oxydatif

augmentent les teneurs sérique en CT et surtout en C-LDL (Hakimoglu et al., 2007). Ce

stress oxydant est défini comme un déséquilibre de la balance entre la production de

dérivés instables de l’oxygène (radicaux libres) (Barbosa, 2008), et/ou une neutralisation

insuffisante par les antioxydants (vitamines, oligoéléments, enzymes) (Koechlin-

Ramonatxo, 2006). Chez les rats consommant des régimes enrichis en cholestérol,

l’hypercholestérolémie provoque un stress oxydant et un état inflammatoire conduisant à

des altérations microvasculaires (Deepa & Varalakshmi, 2006).

Discussion

46

La surproduction de radicaux libres induite par l’hypercholestérolémie, entraîne

une augmentation anormale de la peroxydation lipidique chez les patients et les animaux

hypercholestérolémiques ou consommant des régimes supplémentés en cholestérol

(Hennekens et al., 2009, Naughton et al., 2009), favorisant ainsi la formation des

plaques athéromateuses. Ces résultats corroborent avec ceux obtenus dans notre étude et

qui montrent que le régime enrichi en cholestérol (1%) entraîne une augmentation

significative des valeurs des TBARS plasmatiques. Ces derniers sont les marqueurs les

plus utilisés pour évaluer in-vivo la présence d’une peroxydation lipidique qui peut créer

des altérations de la membrane telles que la modification de sa fluidité, mais aussi

l’inactivation de récepteurs ou d’enzymes (Meagher & Fitz Gerald, 2000). Par ailleurs,

les aldéhydes constituent des produits stables comparativement aux espèces radicalaires,

susceptibles de diffuser hors de la cellule et d’attaquer des cibles relativement éloignées

de leur lieu de formation primaire (Dalle-Donne et al., 2006).

La supplémentation de l’extrait de aqueux de Ga induit une diminution de la

peroxydation lipidique chez les rats hypercholestérolémiques qui peut être le résultat

d’une réduction des concentrations des TBARS du plasma, des lipoprotéines (VLDL-

LDL, HDL) et des urines, et ceci est probablement dû au rôle antioxydant de la plante et

aussi à son effet hypotriglycéridémiant, principalement. De plus, la réduction des

TBARS-HDL est concomitante avec la diminution des teneurs des PL plasmatiques et qui

sont principalement transportées par les particules HDL.

En utilisant la même dose d’extrait méthanolique lyophilisé de Ga chez des rats

rendus diabétiques par la streptozotocine, Zennaki et al., (2009) ont montré une

réduction des teneurs des TBARS au niveau des VLDL-LDL, alors que les TBARS-HDL

restent inchangés. Les LDL sont des particules athérogènes et deviennent susceptibles à

l’oxydation ce qui augmente le risque de lésions athérosclérotiques, car

l’hypercholestérolémie induit une production accrue de radicaux libres (Yokozawa et al.,

2006). En revanche, les HDL ont un rôle protecteur à deux niveaux, lors du transport

inverse du cholestérol et lors de l’oxydation des LDL, en les protégeant (Yokozawa et al.

Discussion

47

2006), quoique, les HDL ont des effets délétères (rôle athérogène quand elles sont

oxydées).

Par ailleurs, la détermination des teneurs des TBARS au niveau des différents

organes (foie, coeur, reins, tissu adipeux) révèle que l’enrichissement du régime en

cholestérol provoque une augmentation de la peroxydation lipidique au niveau de tous

ces organes, cependant, les valeurs plus importantes sont observées au niveau du foie et

du tissu adipeux comparées aux autres organes. La supplémentation avec l’extrait aqueux

de Ga entraîne une réduction de la peroxydation lipidique au niveau des organes étudiés.

Cette diminution est très marquée au niveau hépatique et adipocytaire (-72%).

Chez les rats rendus hypercholestérolémiques l’extrait aqueux lyophilisé Globularia

alypum Ga induit un effet bénéfique sur le stress oxydant en réduisant la peroxydation

lipidique au niveau du foie, cœur, reins et tissu adipeux.

Le dernier objectif de l’étude est de savoir comment agit l’extrait aqueux lyophilisé de

Globularia alypum sur les défenses antioxydantes du rat Wistar consommant un régime

enrichi en cholestérol ?

In vivo, les ERO peuvent être évaluées indirectement en mesurant les activités des

enzymes antioxydantes (SOD, GSH-Px et CAT) (Kuloglu et al., 2002, Gomes et al.,

2005). Ces enzymes et le glutathion réduit (GSH) jouent un rôle clé dans la protection des

cellules (Benavides, 2005, Koyu et al., 2006, Choi et al., 2007).

A J28, chez le groupe hypecholestérolémique comparé au témoin, l'activité

enzymatique de la SOD et les teneurs du GSH sont réduites au niveau hépatique,

inversement ; chez le groupe hypercholestérolémique traité comparé au non traité, une

augmentation du contenu en GSH et des activités antioxydantes de la SOD et GSH-Px,

est notée. Par ailleurs, l’extrait aqueux lyophilisé de Ga induit une élévation de l'activité

de la CAT au niveau tous les organes étudiés. En effet, l'élévation des concentrations en

GSH pourrait protéger contre l'oxydation et l'accumulation des lipides dans le foie et leur

Discussion

48

sécrétion dans la circulation sous forme de lipoprotéines. Ces réactions enzymatiques

constituent un ensemble soutenu de lutte contre les ROS (Venukumar & Latha, 2002,

Halliwell & Gutteridge, 2007) et peuvent expliquer l’effet bénéfique du traitement par

Globularia alypum. De plus, lorsque le niveau de stress oxydatif est élevé, la catalase a

pour unique effet la réduction du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en H2O et en O2

(Lushchak & Gospodaryov, 2005, Valko et al., 2006 ; Badu, 2006).

Nos résultats indiquent que Globularia alypum entraine une réduction du stress

oxydatif au niveau tissulaire en stimulant l’activité de la SOD et en augmentant les

teneurs en GSH, principal substrat de la GSH-Px, cela serait probablement dû à

l’influence des composés bioactifs présents dans la plante, tels que les flavonoïdes et les

iridoides, et leurs pouvoir antioxydant. Ces résultats corroborent avec ceux de Pari &

Latha, (2004) qui ont noté que le traitement par l’extrait de Scoparia dulcis induit une

réduction de la peroxydation lipidique et une augmentation de l’activité de la SOD. De

plus, les travaux de Resmi et al., 2006 ont montré une augmentation des activités

enzymatiques de la SOD et de la CAT avec Terminalia arjun. Le constat tiré de des

résultats de la présente étude est que l'extrait de Ga administré a maintenu l’équilibre de

la balance antioxydant/prooxydant des cellules.

La supplémentation avec l’extrait aqueux de Ga, chez le rat consommant le

régime enrichi en cholestérol, entraîne, une réduction de la peroxydation lipidique au

niveau érythrocytaire avec une augmentation importante de la SOD, GSH-Px ainsi que la

CAT. Toutefois, des teneurs élevés en GSH sont notées. L'augmentation de la SOD

pourrait constituer une protection contre l'élévation de l'anion superoxyde (Gumsulu et

al., 2002). Et l'augmentation de la GSH-Px cela est peut être due à une importante

synthèse du GSH, substrat de cette enzyme (Girard et al., 2006 ; Huet & Duranteau,

2008). Par ailleurs, l'estimation des activités enzymatiques des érythrocytes montre que

la supplémentation du cholestérol alimentaire au régime a un effet prooxydant. Par

contre, l’extrait Globularia alypum exerce un effet antioxydant.

Discussion

49

Plusieurs travaux ont montré que les érythrocytes sont susceptibles à l'oxydation

par le radical de l'oxygène car elles sont riches en fer et contiennent des molécules, en

particulier, l'hémoglobine (Subah et al., 2004). Les résultats de Mahfouz &

Kummerow, (2000) ne montrent aucune différence significative de l'activité

antioxydante érythrocytaire de la GSH-Px, CAT ou SOD, chez les rats consommant des

régimes supplémentés ou non en cholestérol. Par contre, Vasil et al., (2005) ont observé

une diminution de de la peroxydation lipidique et une augmentation du contenu en GSH,

au niveau des érythrocytes, chez le rat soumis a un régime supplémenté en cholestérol et

traité avec l'extrait aqueux d'Enicostemma littorale (une petite herbe de la famille

Gentianaceae). Ces résultats expliquent les propriétés antioxydantes démontrées dans

plusieurs travaux (Favier, 2003 ; Marfak, 2003 ; Servais, 2004 ; Halliwell &

Gutteridge, 2005) indiquant que Globularia alypum réduit le stress oxydatif au niveau

des érythrocytes en stimulant les activités enzymatiques SOD et GSH-Px.

De plus de son effet hypocholestérolémiant et hypotriglycéridémiant, l’extrait aqueux

lyophilisé de Globularia alypum exerce un effet bénéfique sur le stress oxydant. Il

pourrait protéger le foie, le cœur, les reins et le tissu adipeux d’une attaque radicalaire

en augmentant les activités des enzymes antioxydantes (SOD, GSH-Px et CAT) et en

stimulant la production d’une importante quantité de GSH, ce qui explique la

diminution de la peroxydation lipidique au niveau de ces tissus.

CONCLUSIONCONCLUSIONCONCLUSIONCONCLUSION

Conclusion

50

L’objectif de ce travail est d’étudier l’effet d’un extrait aqueux lyophilisé de Globularia

alypum (Ga) sur le profil des lipides hépatiques et plasmatiques d’une part, et le statut redox

d’autre part, chez des rats rendus hypercholestérolémique par un régime enrichi en cholestérol

(1%).

Chez les rats consommant le régime enrichi en cholestérol, il a été noté en plus de

l’hypercholestérolémie due au régime supplémenté en cholestérol, une hypertriglycéridémie

comparé au témoin. L’effet hypotriglycéridémiant de l’extrait aqueux lyophilisé de Globularia

alypum résulte des faibles teneurs en TG au niveau du foie. La diminution des teneurs des TG

plasmatiques chez le groupe hypercholestérolémique traité comparé au non traité est

probablement due à une réduction de leur synthèse hépatique et/ou de leur important

catabolisme sous l’action de la lipoprotéine lipase (LPL).

Le foie est généralement considéré comme l’organe primaire responsable du maintien de

l’homéostasie du cholestérol, la réduction des concentrations du cholestérol total plasmatique

après supplémentation de l’extrait aqueux lyophilisé de Globularia alypum serait probablement

dû à une diminution de la synthèse du cholestérol puisque le contenu en cholestérol du foie est

réduit.

L’extrait aqueux lyophilisé de Ga aurait un effet protecteur sur la cellule hépatique

contre les altérations fonctionnelles causées par le régime enrichi en cholestérol. En effet, le

traitement de l’hypercholestérolémie par cet extrait entraîne une diminution des

concentrations des lipides du foie et du plasma.

En dépit de la résistance du rat Wistar à l’athérosclérose, il s’avère que

l’hypercholestérolémie induite par l’enrichissement du régime en cholestérol influence le statut

redox. En effet, l’excès de cholestérol (1%) dans le régime induit un important stress oxydatif

qui se traduit par une augmentation des teneurs de l’hémoglobine (Hb), de l’acide urique et des

activités enzymatiques des transaminases plasmatiques (ALT et AST). De plus, il augmente la

peroxydation lipidique (TBARS) au niveau des tissus (foie, cœur, reins et tissu adipeux), des

érythrocytes, du plasma, des lipoprotéines et des urines. Inversement, il provoque une

diminution des activités des enzymes antioxydantes (SOD, GSH-Px et CAT) au niveau des

différents tissus et des érythrocytes.

Conclusion

51

L’extrait aqueux lyophilisé de Globularia alypum améliore le statut redox en agissant

favorablement sur les marqueurs du stress oxydatif en réduisant les concentrations de l’Hb, de

l’acide urique et les activités ALT et GPT. De plus, il réduit la peroxydation lipidique et stimule

les défenses antioxydantes enzymatiques tissulaires et érythrocytaires.

En stimulant les enzymes antioxydantes l’extrait aqueux lyophilisé de Globularia

alypum réduit la peroxydation lipidique, et par conséquent protège les tissus, les érythrocytes

et le plasma des effets délétères des espèces actives de l’oxygène (EAO).

Les substances naturelles occupent de plus en plus une place de choix en thérapeutique.

En effet, les plantes constituent de véritables usines chimiques dont il faut tirer le maximum de

profit. Par conséquent, d’autres études plus approfondies sont nécessaires pour mieux

comprendre les mécanismes impliqués dans les différents effets observés. Par conséquent, notre

étude peut être complétée par :

• L'isolement et l'identification des composés actifs de cette plante responsables de ses

effets hypolipémiants et antioxydants.

• L’évaluation de l’activité des enzymes impliquées dans la régulation du métabolisme des

lipides tels que la lipoprotéine lipase (LPL), la triglycéride lipase hépatique (HTGL),

l’HMG-CoA réductase (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA réductase) et la 7α-

hydroxylase.

• La détermination des marqueurs de l’oxydation protéique par le dosage des carbonyls et

des sulfhydryls.

• Le dosage des molécules biologiques antioxydantes comme les oligoéléments

(zinc, sélénium, cuivre) et les vitamines (vit E, vit C et les caroténoïdes).

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ANNEXESANNEXESANNEXESANNEXES

Annexes

72

Tableau 8. Evolution du poids corporel (exprimée en g).

J0 J7 J14 J21 J28

HC 251,7±12,3 260,8±14,9 270,5±16,7 281,3±18,7 307,5±10,8

HCGa 237,6±16,1 257,4±11,2 262,7±16,1 275,0±4,9 310,1±10,5

CGa 255,1±10,1 259,0±9,6 262,0±12,6 269,1±12,8 270,2±10,3

C 258,2±11,3 270,0±5,7 283,0±10,1 294,2±7,0 310,4±4,2

Après analyse de variance (2-way ANOVA), la comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey- Kramer.

Tableau 9. Nourriture ingérée (exprimée en g/j/rat).

C CGa HC HCGa

23±1

26±1

26±1

28±1

Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer.

Annexes

73

Tableau 10. Activités tissulaires des enzymes antioxydantes (exprimées en U/g tissu).

C CGa HC HCGa

SOD 17,93 ±0,95 20,65±1,35 11,03±0,62* 22,01±1,02#

Foie GSH-PX 12,55±1,30 10,37±1,22 11,59±0,12* 18,15±1,44#

CAT 31,08±3,13 28,58±3,44 15,5±2,22* 27,69±3,77#

SOD 27,15±1,07 29,32±3,21 26,21±1,07 28,35±1,52

Cœur GSH-PX 9,11±0,33 8,55±0,51 8,22±0,78 9,63±0,55

CAT 22,17±2,55 20,56±3,26 10,28±1,49* 18,11±1,82#

SOD 14,42±1,12 12,51±1,11 12,02±1,42 23,62±0,80

Rein GSH-PX 16,55±1,28 14,67±2,44 17,26±2,33 15,42±2,07

CAT 10,33±1,25 11,57±1,39 6,11±1,06* 11,98±1,32#

SOD 33,55±3,30 29,65±2,72 18,83±2,22* 33,32±2,41#

Tissu adipeux GSH-PX 13,17±0,59 11,37±0,22 6,35±0,11* 12,11±0,31#

CAT 12,55±1,58 10,44±1,87 4,58±0,94* 11,33±1,22#


comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer pour des comparaisons multiples :

*HC vs C ; #HCGa vs HC, (P<0,05).

Annexes

74

Tableau 11. Concentrations en TBARS, GSH et activité des enzymes antioxydantes au niveau des érythrocytes


comparaison des moyennes est effectuée par le test de Tukey-Kramer pour des comparaisons multiples :

*HC vs C ; #HCGa vs HC, (P<0,05).

C CGa HC HCGa

TBARS (µmol/mL Hb) 60,26±6,31 55,15±4,28 144,1±7,1* 65,5±6,55#

GSH (µmol/mL Hb) 17,32±1,03 16,15±2,22 8,44±1,37* 19,31±1,55#

SOD (U/mL Hb) 877,5±42 907,3±33 333,3±23* 955±47#

GPx (U/mL Hb) 783,2±31 733,6±27 408,9±28* 843,5±33,1#

CAT (U/mL Hb) 72,54±3,46 44,84±6,11 25,44±4,24* 78,93±5,20#

Résumé Le but de cette étude est de mettre en évidence l’effet de l’extrait aqueux de Globularia alypum (Ga) sur le métabolisme lipidique et le statut redox, chez des rats soumis à un régime enrichi en cholestérol (1%). Pour cela, vingt quatre rats mâles de souche Wistar, âgés de 14 semaines et pesant 232±10 g sont répartis en quatre groupes de 6 rats chacun soumis durant 28 jours soit un régime standard à 20% de caséine (T), soit un régime enrichi en cholestérol (1%) (HC), chaque régime est supplémenté ou non avec l’extrait aqueux de Ga (1,66g/kg) (CGa et HCGa). Après 4 semaines de consommation du régime enrichi en cholestérol, le poids corporel des animaux ainsi que la nourriture ingérée ne présentent aucune différence significative Les teneurs plasmatiques en albumine, urée et créatinine ne sont influencées, ni par la nature du régime, ni par la supplémentation ou non de l’extrait aqueux de Ga. Toutefois, les activités transaminasiques de l’alanine amino-transférase (ALT) et de l’aspartate amino-transférase (AST), qui sont marqueurs du fonctionnement hépatique, sont réduites de -64% et -71%, chez le groupe HCGa comparé à HC. Inversement, chez le groupe HC vs C, elles augmentent de +70 et +71%, respectivement, alors qu’elles sont similaires chez les groupes HCGa vs CGa et CGa vs C. La détermination des paramètres lipidiques montre que la cholestérolémie est augmentée de +63% et +28%, chez les groupes HC vs C et HCGa vs CGa, respectivement, alors qu’elle est diminuée de -54% et -12%, chez les groupes HCGa vs HC et CGa vs C, respectivement. Comparé au groupe HC, le régime enrichi en cholestérol supplémenté avec l’extrait aqueux de Ga entraîne une diminution des teneurs en triglycérides (TG) et phospholipides (PL), respectivement de -54%, et -36% au niveau plasmatique et de -79% et -50% au niveau hépatique. Cependant, chez le groupe CGa vs C, les teneurs hépatiques en TG et PL restent similaires, alors qu’elles sont réduites de -19%, au niveau plasmatique. L’évaluation du statut redox montre une importante peroxydation lipidique (TBARS) au niveau de tous les organes étudiés (foie, cœur, reins et tissus adipeux), chez le groupe HC vs C. Inversement, elle diminue significativement après traitement avec l’extrait aqueux de Ga, excepté niveau rénal (P<0,05). Par ailleurs, cet extrait entraine une augmentation de la production du glutathion réduit (GSH) au niveau du foie (+56%) et du tissu adipeux (+66%). La défense antioxydante enzymatique montre que l’activité de la superoxyde dismutase (SOD) est réduite dans le foie (-38%) et le tissu adipeux (-43%), chez le groupe HC comparé à C, inversement elle est augmentée au niveau hépatique après supplémentation de l’extrait aqueux de Ga. Par ailleurs, chez le groupe hypercholestérolémique traité comparé au hypercholestérolémique, une importante activité de la glutathion peroxydase (GSH-Px) est notée au niveau du tissu adipeux (+47%). L’activité de la catalase (CAT) est augmentée dans le cœur (+43%), le foie (+44%) et le rein (+48%), chez le groupe HCGa comparé à HC. Au niveau du tissu adipeux, une réduction de cette activité est notée chez le groupe HC vs C, alors que la supplémentation de l’extrait aqueux de Ga induit une augmentation de cette activité. Au niveau des érythrocytes les teneurs des TBARS sont 1,5- et 2,3-fois plus élevées chez les groupes HCGa et HC par rapport aux groupes CGa et C, respectivement. Cependant, elles sont 2,2-fois plus faibles chez les groupes HCGa vs HC et CGa vs C. L’activité de la SOD est 1,2- et 2,1-fois plus élevée chez les groupes CGa et HCGa comparés aux groupes C et HC, respectivement. Inversement, elle est 1,2- et 1,8-fois plus faible chez les groupes HCGa vs CGa et HC vs C. L’activité de la GSH-Px est augmentée de +52% chez le groupe HCGa vs HC. De plus, les concentrations en GSH sont significativement augmentées (P<0,05). Par l’activité de la CAT est 1,2-fois plus importante chez le groupe HCGa comparé à HC. Inversement, elle est significativement réduite chez les groupes HCGa vs CGa et HC vs C (P<0,05). En conclusion, le régime enrichi en cholestérol entraîne une augmentation de la cholestérolémie, une hypertriglycéridémie et une importante peroxydation lipidique. L’extrait aqueux de Globularia alypum L. exerce un effet hypocholestérolémiant, hypotriglycéridémiant et antioxydant par une protection contre l’attaque radicalaire qui se manifeste par une réduction de la peroxydation lipidique et une stimulation des systèmes de défense antioxydante (enzymatique et non enzymatique), chez les rats soumis au régime enrichi en cholestérol. Mots Clés : Rat - Extrait aqueux - Globularia alypum - Cholestérol - Triglycérides - GSH - TBARS - SOD - GSH-Px - CAT.

Abstract

The aim of the present study was to investigate the effects of Globularia alypum (Ga) lyophilized aqueous extract on lipid metabolism and redox status, in rats fed a high cholesterol diet (1%). Male Wistar rats (n=24) aged 14 weeks and weighing 232±10 g were divided into 4 groups(n=6) and fed during 28 days either a standard diet at 20% casein (T) or high-cholesterol diet (1%) (HC) supplemented or not with 1.66% of Ga extract (HCGa) and (CGa). Diets consumption for 4 weeks induced a similar body weight and food intakes in the both groups. In addition, Plasma levels of albumin, urea and creatinine were not sensitive to the origin diets or Ga extract supplementation. Enzymatic activities of alanine-amino-transferase (ALT) and aspartate-aminotransferase (AST), markers of liver function, were reduced by -64% and -71%, in HCGa compared to HC group. In contrast, in HC vs C group, this activities were increased by +70 % and +71%, respectively, whereas, similar values were noted in HCGa vs CGa and CGa vs C groups. Cholesterolemia was increased respectively by +28% and +63% in HC vs C and HCGa vs CGa, and inversely, it was diminished by -54% and -12% in HCGa vs HC and CGa vs C groups. Moreover, plasma and liver triglycerides (TG) and phospholipids (PL) levels were significantly reduced after Ga extract supplementation (P<0.05). In CGa compared to C group, TG and PL contents remained similar in liver, while they were decreased by -19% in plasma. In HC vs C group, the evaluation of the redox status showed that the high-cholesterol diet leads to increase the lipid peroxidation (LPO) in all studied organs (liver, heart, kidney and adipose tussue), while Ga extract supplementation reduced significantly LPO in these organs, excepted in kidneys (P<0, 05). In HC vs C group, liver and adipose tissue superoxide dismutase (SOD) activities were decreased by -38% and -43%, respectively, whereas these activities were increased after Ga extract supplementation. In addition, a higher glutathione peroxidase (GSH-Px) activity was noted in adipose tissue (+47%). In HCGa compared to HC group, catalase (CAT) activity in the liver, heart and kidneys was increased by +43% +44% and+48%, respectively. Furthermore, in adipose tissue, this activity was decreased in compared HC to C, while Ga extract supplementation significantly increased CAT activity (P<0.05). In red blood cells (RBCs), TBARS concentrations were 1.5- and 2.3-fold higher in HCGa HC groups compared with CGa and C, respectively. Whereas, there were 2.2-fold lower in HCGa vs HC and CGa vs C groups. RBC-SOD activity was 1.2- and 2.1-fold higher in CGa vs C and HCGa vs HC, respectively. Nevertheless; it was 1.2- and 1.8-fold lower in HCGa vs CGa and HC vs C, respectively. GSH-Px activity was increased by +52% in HCGa vs HC group. In addition, GSH concentrations were increased significantly (P<0.05). CAT activity was 1.2-fold higher in HCGa compared to HC group. Inversely, it was reduced significantly in HCGa vs CGa and HC vs C groups (P<0.05). In conclusion, a high cholesterol diet leads to increase cholesterolemia, triglyceridemia and lipid peroxidation. It seems that Globularia alypum L. lyophilised aqueous extract possesses hypocholesterolemic, hypotriglyceridemic and antioxidant effects. This extract prevents against free radicals by reducing the lipid peroxidation and enhancing the non-enzymatic (GSH) and enzymatic antioxidant defense systems (SOD, GSH-Px and CAT), in rats fed high cholesterol diet. Keywords: Rat - aqueous extract - Globularia alypum - Cholesterol - Triglycerides – GSH; TBARS – SOD - GSH-Px - CAT.

THESE BOUHAOUS Latifa - univ-oran1.dz · 2015. 5. 5. · Remerciements Cette thèse est...

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