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Sérodiagnostic de la Toxoplasmose

(Réaction d’hémagglutination indirecte) 

Par : S / Abdessemed

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• La toxoplasmose est l'une des affections parasitaires les plus fréquentes. Si elle est généralement bénigne, sa survenue pendant la grossesse peut être grave en raison du risque de lésions du système nerveux central du fœtus.

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1. Principe :• Des hématies de mouton traitées par le

glutaraldéhyde et sensibilisées par un lysat de toxoplasmes (antigène soluble) sont agglutinées lorsqu’elles sont mises en présence de dilutions de sérum contenant des anticorps homologues.

• TOXO-HA KIT permet la détermination du taux d’anticorps anti-toxoplasmique par la réaction d’hémagglutination indirecte d’une très grande sensibilité.

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2. Réactifs : Réactif n°1 : Hématies- Antigène à

1% A diluer au moment de l’emploi au 1/5 en tampon PBS pH 7.2 pour obtenir la suspension de travail à 0.2 %.  Réactif n°2 : Hématies –Témoin à

0.2 % (Suspension prête à l’emploi) 

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Réactif no3 : Hématies à 50% Cette suspension est utilisée pour l’adsorption des agglutinines naturelles anti-moutons que peuvent contenir certains sérums.• Remarque : Les différentes préparations

d’hématies doivent être remises en suspension homogène avant l’emploi par agitation vigoureuse. 

Réactifs n°4 : diluant Solution de NaCl à 8.5 g/l additionnée de sérum de veau fœtal et d’azide de sodium.

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Toxo-trol « A » : Sérum témoin positif pour hémagglutination indirecte • Reprendre le contenu d’un flacon par

0.5 ml d’eau distillée » »e. Ce produit ne contenant pas de conservateur, il est recommandé de le manipuler le plus stérilement possible.

• Conservation après reprise : -quelque jours à +4°C. -plusieurs mois à –20°C.

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• Le titre de ce sérum est indiqué sur la notice contenue dans le coffret. Il correspond à l’inverse de la dernière dilution hémagglutinante prise par convention à ++.

• Tampon PBS pH 7.2

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Solution 0.2M de 2-Mercaptoéthanol (2-ME)

• 2Mercaptoéthanol………14 ml• Tampon PBS PH 7,2 q.s.p…………1000

ml Ce réactif se conserve un mois à +4°

C (flacon brun). Le 2-ME pur sera également conservé à cette température.

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Sérums à tester :• Ils ne doivent pas être inactivés. Il

est possible de les conserver à –20° C si l’on ne peut pas les tester immédiatement.

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3. Matériel :o Auto pipette manuelle avec adapter

50µl o Pipettes compte-gouttes calibrées à

50µlo Plaques pour microtitration à fond

rond o Feuilles autocollantes.

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4. Mode opératoire :1. Traitement des sérums :• Cette opération a pour but de réduire

les immunoglobulines IgM et d’adsorber les hémagglutinines naturelles anti-mouton.

• Engager simultanément dans la réaction le sérum traité au 2-ME et le même sérum non traité.

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  Tube 1 Tube2Sérum………………..Solution 0.2 M de 2-ME…Tampon PBS pH 7.2…    

200µl200µl --                                     

200µl--200µl 

Placer au Bain –Marie 1 heure à 37 °C.Dans deux autres tubes à hémolyse répartir :  Tube 3 Tube 4

Sérum traité (tube 1)…….Sérum non traité (tube 2)Diluant (réactif n°4)…….Hématies à 50%…………. 

200µl--800µl100µl

--200µl800µl100µl

Mettre dans deux tubes à hémolyse :

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-- Placer au minimum 2 heures à +4°C en agitant de temps en temps. --Centrifuger 10 mn à 2500 tours/minute. --Décanter les surnageant (dilution initiale du sérum au 1/10).• Ils peuvent être conservés quelques jours à

+4°C. --Engager dans la réaction Toxo-trol « A », sérum témoin positif de titre connu, dans les mêmes conditions que les sérums à tester.

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2 Détermination du titre en anticorps des sérums à tester :• Diluer la quantité nécessaire d’hématies

sensibilisées (réactif n°1) au 1/5.• Par exemple, pour une micro plaque (4

sérums) 5 ml sont nécessaires : --Hématies sensibilisées à 1% (Remise en suspension homogène par agitation)…………………..1ml --Tampon PBS pH 7.2……………………4ml

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• La suspension de travail à 0.2 % ainsi obtenue peut se conserver quelques jours à 4°C.

• Exécuter la réaction en parallèle sur le sérum traitée au 2-ME et sur le même sérum non traité, en tenant compte de la dilution initiale au 1/10 :

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N° des tubes  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Dilutions Témoin 

sérum1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 1/20480

Diluant………… Sérum traité ou non traité…………. Hématies-Antigène à 0,2%.. Hématies témoin à 0,2%.. 

--  50  --

 50   

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

50  50  50

 --

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Témoin antigène : Diluant…………………………………………50 µL Hématies- Antigène à 0.2%………….50 µL Placer sur un agitateur de Kline pendant 5

minutes.Laisser 16 à 18 heures à la température

du laboratoire, l’abri de la dessiccation (feuilles autocollante).

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• Remarque : La réaction peut être réalisée dans la journée si le traitement des sérums a été effectué la veille ; lecture après 6 à 8 heures.

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5. Lecture :• Sur fond blanc, ou en transillumination

oblique.• Une réaction d’hémagglutination

positive se traduit par un voile tapissant plus ou moins complètement la cupule.

• Le seuil de positivité est un voile dont le diamètre doit être supérieur à la moitié de la cupule. L’hémagglutination étant quantifié de ++++ à 0, ce seuil correspond à ++.

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++++ Voile tapissant la totalité du fond de la cupule, pouvant parfois avoir un aspect rétracté (rétraction partielle en bordure). +++ Voile homogène recouvrant les 2/3 du fond de la cupule. ++ Voile recouvrant la moitié du fond de la cupule. + une ligne de sédimentation périphérique nette apparaît sur le pourtour du voile dont le diamètre est inférieur à la moitié du diamètre. ± un culot de sédimentation apparaît. 0 bouton central net. 

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Les «  témoins sérums » et « témoin antigène » doivent montrer une réaction négative.

Le titre du sérum est l’inverse de la dernière dilution présentant une hémagglutination à ++.

 

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6. Interprétation :• La réaction d’hémagglutination

indirecte avec l’antigène toxoplasmique soluble est très sensible aux immunoglobulines (igG et igA).

• Elle est également sensible aux immunoglobulines (igM) lorsqu’elles sont pures mais n’est pas influencée par les anticorps dits  »AC naturels ».

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• Le test au 2-ME permet de déceler une infection en début d’évolution ;un sérum dont le titre chute de plus de deux dilutions après traitement au 2-ME contient vraisemblablement des igM spécifiques.

• Le seuil de spécificité de la réaction est voisin du 1/20. Un sérum sera considéré comme positif si le titre obtenu est supérieure ou égal à 1/40.

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• Comme pour toute réaction sérologique, il est souhaitable de ne pas pratiquer cette réaction isolément mais de l’associer à une réaction autre, susceptible de fournir des éléments différents ; c’est le cas de l’agglutination directe dont on connaît la très grande sensibilité aux igM.

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• Cet examen est imposé par les textes réglementaires lors de l’examen prénuptial et il doit être prescrit chez toute femme enceinte ou désirant le devenir si celle-ci ne possède pas la preuve d’une immunité acquise.

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• Chez la femme enceinte, un résultat négatif entraine la nécessité d’un contrôle mensuel jusqu'à la fin de la grossesse.

• Un résultat modérément positif sans igM confirmé par un deuxième examen trois semaines plus tard, permet de conclure à la présence d’anticorps résiduels considérés comme protecteurs.

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• La présence d igM peut être notée pendant une longue période après la séroconversion en raison de la sensibilité des nouvelles techniques (jusqu'à 2 ans en ISAGA igM)

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• Chez l’enfant né de mère ayant fait une séroconversion pendant la grossesse, on retrouve les igG transmises.

• Celles-ci disparaissent en 6 à 9 mois. après cette période, la persistance des igG ou leur réapparition confirme la contamination de l’enfant.

 

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Merci pour votre attention