ANTIGÈNES ASPERGILLUSAspergillus antigens 52942Aspergillus fumigatus antigens 52962Aspergillus fumigatus positive control serum 61681Aspergillus positive control sera 61682

SÉRODIAGNOSTIC DES ASPERGILLOSES PAR IMMUNOPRECIPITATION

IVD

1- INTÉRÊT CLINIQUEBio-Rad prépare différents antigènes aspergillaires pour le sérodiagnostic desaspergilloses par immunoprécipitation.Le diagnostic des aspergilloses par la mise en évidence, dans le sérum desmalades, des anticorps spécifiques de ces champignons, est souvent plusfacile à réaliser que le diagnostic par identification directe.

2- PRINCIPELes antigènes Bio-Rad sont adaptés à la réalisation de différentes techniquesd'immunoprécipitation.Deux techniques sont particulièrement recommandées :• IMMUNOELECTROPHORESE (IEP)• ELECTROSYNERESE (ES)Les techniques d’immunoprécipitation permettent de compléter lediagnostic des aspergilloses par la caractérisation des anticorpsspécifiques de deux enzymes présents dans les extraits antigéniques :chymotrypsine et catalase, en mettant en évidence leur activitéenzymatique au niveau des arcs de précipitation.

3- PRÉSENTATION• Aspergillus fumigatus antigens (antigènes Aspergillus fumigatus),

code 529622 flacons d’antigènes lyophilisés à reconstituer dans 1 ml d'eau distilléestérile (environ 10 réactions).- Aspergillus fumigatus metabolic antigen- Aspergillus fumigatus somatic antigen

• Aspergillus antigens (antigènes Aspergillus), code 529424 flacons d’antigènes lyophilisés à reconstituer dans 1 ml d'eaudistillée stérile (environ 10 réactions).- Aspergillus flavus metabolic antigen- Aspergillus nidulans metabolic antigen - Aspergillus niger metabolic antigen- Aspergillus terreus metabolic antigen

• Aspergillus fumigatus positive control serum (sérum de controle positifanti-Aspergillus fumigatus), code 616811 flacon de sérum de lapin anti-Aspergillus fumigatus lyophilisé àreconstituer dans 1 ml d'eau distillée stérile .

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• Aspergillus positive control sera (sérums de controle positif anti-Aspergillus),code 616824 flacons de sérum de lapin anti-Aspergillus lyophilisé à reconstituerdans 1 ml d'eau distillée stérile .- Aspergillus flavus positive control serum- Aspergillus nidulans positive control serum- Aspergillus niger positive control serum- Aspergillus terreus positive control serum

4- COMPOSITIONLes antigènes sont de deux types :Les antigènes métaboliques sont obtenus à partir de filtrat de culturesaprès 10 jours d'incubation à +30°C.Les antigènes somatiques ou cellulaires sont obtenus à partir de broyatsmycéliens de cultures jeunes (3 jours, sans spores) agitées à 30°C.

5- CONSERVATIONSous forme lyophilisée : les réactifs conservés à +2-8°C sont stablesjusqu'à la date de péremption indiquée sur le coffret.Après reconstitution : les réactifs se conservent plusieurs mois à –20°C enaliquots fractionnés. Ne pas congeler/décongeler les réactifs plusieurs fois.

6- ECHANTILLONS1. Les tests sont effectués sur des échantillons de sérum prélevé sur tube

sec uniquement2. Respecter les consignes suivantes pour le prélèvement, le traitement et

la conservation de ces échantillons de sang:- Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage.- Laisser le caillot se former complètement avant centrifugation.- Conserver les tubes fermés- Après centrifugation, extraire le sérum et le conserver en tube fermé.- Les échantillons seront conservés à +2-8°C si le test est effectué dans

les 24 heures. Si le test n’est pas effectué dans les 24 heures, ou,pour tout envoi, les échantillons seront de préférence congelés à -20°C(ou plus froid).

- Il est recommandé de ne congeler / décongeler les échantillonsqu’une fois. Les échantillons devront être soigneusement homogénéisés(vortex) après décongélation avant le test.

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3. Les interférences liées à une surcharge en albumine, lipide, hémoglobineet bilirubine n'ont pas été testées.

4. Ne pas chauffer les échantillons.

7- MODE OPÉRATOIRE

A) MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI• Barbital sodique• Acide chlorhydrique • Eau distillée• Barbital• Glycine• Tampon Tris 0,05M pH7• Agarose • H2O2 à 30%, • N-acétyl-DL phénylalanine naphtyl ester• Diméthylformamide• Diazoblue B

B) IMMUNO-ÉLECTROPHORESE (photo 1)L'immuno-électrophorèse (Grabar) peut être réalisée sur lames de verreporte-objet pour microscope.• Couler un gel de gélose purifiée ou d'agarose à 1% dans du tampon

véronal pH 8,2 (additionné de merthiolate 1/10 000).• Tracer à l'emporte-pièce une gouttière de 60 mm x 2 mm et deux puits

de 2 mm de diamètre de part et d'autre de la gouttière à 4 mm decelle-ci (voir schéma).

• Déposer dans les puits 20 µl des antigènes purs.• Effectuer une migration de 1h30 sous une différence de potentiel de 5

volts/cm aux extrémités des lames.• Déposer le sérum dans la gouttière et laisser diffuser en atmosphère

humide à la température ambiante pendant 48 heures.• Le 3e jour, immerger les lames pendant 24 heures dans une solution de

lavage.• Faire la lecture au 4e jour. Une coloration au Bleu de Coomassie peut

être nécessaire pour faire apparaître des traits particulièrement fins.

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C) ÉLECTROSYNERESE (fig. 1)L'électrosynérèse (Bussard) ou immuno-électrodiffusion peut être réaliséesur gel d'agarose, ou sur acétate de cellulose. C'est une techniquesimple, très sensible et rapide, adaptée à l'examen de dépistage desgrandes séries.• Pour une technique sur gel d'agarose, on peut utiliser des lames porte-

objet pour microscope où des puits sont percés selon le schéma :antigènes du côté de la cathode (-), sérums du côté de l'anode (+). Cesrangées de puits sont séparées de 6 mm, et les puits mesurent 2 mm dediamètre.

• Distribuer les antigènes purs, dilués au 1/2 et au 1/4 et les sérums àraison de 20 µl par puits.

• Effectuer une migration pendant 1h30 sous une tension de 5 volts/cm.• La lecture est généralement faite immédiatement après la migration.• Lorsqu'il faut colorer par le Bleu de Coomassie, la coloration doit être

précédée par deux lavages successifs : dans le sérum physiologique (1nuit), dans l'eau distillée (24 heures), et d'un séchage.

Il est recommandé de tester en parallèle les témoins positifs en suivant lamême procédure que pour les antigènes.

D) CARACTÉRISATION DES ACTIVITÉS ENZYMATIQUES DE CERTAINSARCS DE PRÉCIPITATION

Les arcs les plus fréquemment rencontrés après immuno-électrophorèsesont désignés C et j (schéma) et sont les supports d’activité enzymatique(C : chymotrypsine et j : catalasique) qui peuvent être révélés par lesréactions spéciales (BIGUET et al.). (Voir annexe.)

E) PRÉPARATION DES RÉACTIFS

1) TamponsVERONAL pH 8,2

Barbital sodique 15,85 gHCl 1N 23 mlH2O q.s.p. 1000 ml

BARBITAL- BARBITAL sodique TRIS GLYCINE (BBNa-TG) pH 8,8A. Barbital Na 65 g

Barbital 10,35 gEau q.s.p 5000 ml

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B. Glycine 281 gTris 226 gH2O q.s.p 5000 ml

Après mélange à volumes égaux des solutions a et b, on obtient un tamponà pH 8,8 de force ionique 0,08.

2) Agarose 1% (poids/volume)Agarose 10 gEau 500 ml

Porter à ébullition, après refroidissement (env. 60°C). Ajouter :

Tampon véronal pH 8,2 500 mlOu

Tampon BBNa TG pH 8,8 500 ml(dilué au 1/2 en eau distillée).

3) CatalaseH2O2 30%, diluée dans un tampon TRIS 0,05M pH7 (0,3 ml H2O2 + 50 mlde tampon) déposée sur le gel d'immuno-électrophorèse.Réaction positive : présence de bulles au niveau de l'arc spécifique.

4) Chymotrypsine

SOLUTION AN-acétyl-DL phénylalanine naphtyl ester 5 mgDiméthylformamide 2 ml

SOLUTION BDiazoblue B 10 mgTampon Tris 0,05 M pH 7,4 18 ml

Mélanger extemporanément A* et B*, incuber la membrane d'électro-synérèse 30 minutes à 37°C dans ce mélange.Eliminer le mélange, incuber une nuit à 37°C dans 18 ml de réactif B.Laver les menbranes à l'eau.Réaction positive : les arcs colorés en violet correspondent à l'activitéchymotrypsique.

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F) TABLEAU SYNTHÉTIQUE P.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS,FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. EDITORS: EXELSEN KROLL-WEEXE.ASPERGILLUS ANTIGENS analysis (Tableau).

* Voir 6- Mode opératoire (E- Préparation des réactifs)

8- INTERPRÉTATIONL’obtention d’arcs de précipitation spécifiques par une techniqued’immunoprécipitation contre un antigène d’Aspergillus indique uneinfection aspergillaire.L’électrosynérèse est une technique plus rapide que l'immuno-électrophorèsedonc adaptée au dépistage. Mais les sérums trouvés positifs par cettetechnique doivent être contrôlés en immuno-électrophorèse. La caracté-risation des activités enzymatiques chymotrypsique et catalasique auniveau de certains arcs est une preuve supplémentaire de spécifité des arcs.

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Tampons ddp Durée Colorationcaractérisation

Immuno-électrophorèse Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mnTampon véronal 8,2 Bleu de

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mn CoomassieTampon BBNa-TG pH 8,8

Electrosynérèse Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mnTampon véronal 8,2 Bleu de

Agarose 1%/ 10 V / cm 60 mn CoomassieTampon BBNa-TG pH 8,8

Catalase Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn H2O2 diluée*Tampon véronal 8,2 Réaction positive :

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mnprésence de bulles

Tampon BBNa-TG pH 8,8au niveau de

l'arc spécifique

Chymotrypsine Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn Réactifs A* et B*Tampon véronal 8,2 Réaction positive :

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mn coloration en violet Tampon BBNa-TG pH 8,8 l'arc spécifique C

Pur O O O O O O1/2 O O O O O O1/4 O O O O O O

1 S 2 S 1 ou 2 Sr

photo 1

1 et 2 : antigènesS : sérum à étudierSr : sérum de contrôle

Fig. 1

photo 2

photo 3

Dans les aspergilloses bronchopulmonaires et les aspergilloses diffuses,les réponses sont positives dans 80 à 90% des cas et les arcs spécifiquessont le plus souvents présents. Dans les aspergillomes, les réactions sont très positives : on observefréquemment 5 à 10 arcs et la présence de l'arc C.Dans les bronchites aspergillaires allergiques, la réponse est positivedans 50% des cas. Les précipitines apparaissent tardivement au cours de l'infection : danscertains cas, elles ne sont révélées que lors d'un deuxième exameneffectué à un mois d'intervalle.

9- PERFORMANCES / CONTRÔLE QUALITÉ DU TEST

A) MISE EN ÉVIDENCE DES ARCS DE PRÉCIPITATIONLes performances des antigènes aspergillaires sont contrôlées à l’aide desérums de contrôle positif en aspergillose (sérums de contrôle positifs anti-Aspergillus, obtenus par immunisation de l'animal à l'aide d'antigènesstandardisés mixtes pour A. fumigatus et à l'aide d'antigènes métaboliquespour A. flavus, A. niger, A. nidulans et A. terreus).

Mise en évidence des arcs de précipitation par Immuno-électrophorèse (pH = 8,2)

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Sérum de contrôle positif :anti- A. fumigatus anti- A. flavus anti- A. nidulans anti- A. niger anti- A. terreus

Ag somatique +A. fumigatus présence de - - - -

4 à 8 arcs

Ag métabolique +A. fumigatus présence de - - - -

3 à 5 arcs

Ag métabolique - +A. flavus présence de - - -

3 à 5 arcs

Ag métabolique - - +A. nidulans présence de - -

3 à 5 arcs

Ag métabolique - - - + -A. niger présence de

3 à 5 arcs

Ag métabolique - - - - +A. terreus présence de

3 à 5 arcs

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B) MISE EN ÉVIDENCE DES ACTIVITÉS ENZYAMTIQUES DES ARCS DEPRÉCIPITATION

10-CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANTTous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sontplacés sous un système d'assurance qualité de la réception des matièrespremières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot deproduit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé ques'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative àla production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

11-LIMITES D'UTILISATIONLe diagnostic d'aspergillose ne peut être établi qu'après confrontation desarguments cliniques, radiologiques et biologiques (microbiologique,histologique, sérologique), chaque élément pris isolément devant êtreinterprété avec circonspection.

Immuno-électrophorèse (pH = 8,2) Electro-synérèse (pH 8,2)Mise en évidence de +l'activité enzymatique après addition d'H2O2,catalasique présence de bulles au

niveau de l'arc j, supportde l'activité catalasique

Mise en évidence de +l'activité enzymatique après incubation avec les réactifs A et B,chymotrypsique coloration en violet de l'arc C,

support de l'activité chymotrypsique

12-RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification

d’une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables del’extrait antigénique d’Aspergillus fumigatus. Répercussion sur lediagnostic immunologique de l’Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967)31, pp. 317-328.

2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l’immunoprécipitationet de l’immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses broncho-pulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395.

3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires aucours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24,pp. 99-116.

4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergydue to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217.

5. SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire enmycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150pages.

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- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnosticin vitro)

- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnósticoin vitro)

- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

- For in vitro diagnostic use - Catalogue number- Pour diagnostic in vitro - Référence catalogue- Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro-Diagnostikum - Bestellnummer- Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo- Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro diagnostik - Katalognummer- In vitro diagnose - Katalognummer

- Manufacturer - Authorised Representative- Fabricant - Représentant agréé- Fabricante - Representante autorizado- Hersteller - Bevollmächtigter- Produttore - Distributore autorizzato- Fabricante - Representante Autorizado- Tillverkad av - Auktoriserad representant- Fremstillet af - Autoriseret repræsentant

- Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD- Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ- Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD- Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT- Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG- Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD- Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag- Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

- Storage temperature limitation - Consult Instruction for use- Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi- Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso- Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung- Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso- Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo- Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning- Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug

LOT

IVD

EC REP

REF

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The other languages which are required in conformity to the EuropeanDirective can be obtained from your local Bio-Rad agent.

Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponiblesauprès de votre représentant Bio-Rad local.

Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la DirectivaEuropea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.

Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVDDirektive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-RadNiederlassung.

Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europeepossono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.

As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a DirectivaEuropeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próximade si.

Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från dinlokala Bio-Rad-representant.

De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås vedhenvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.

Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2003Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880011